制备单体卡利许霉素衍生物/载体的共轭物的方法.pdf

本发明提供制备有较高药物负荷量/得率和减少凝集量的单体卡利许霉素衍生物/载体共轭物的方法。共轭物的制备是在溶液中约25℃至37℃培育卡利许霉素衍生物和蛋白质载体约15分钟至24小时,溶液包括非亲核,蛋白质相容的缓冲液,选自丙二醇,乙醇,DMSO,及其组合的助溶剂和至少包括一个C6－C18羧酸的添加剂,其pH范围约为4.0至8.5,和回收单体卡利许霉素衍生物/载体共轭物。共轭物还可在包括非亲核,蛋白质相容的缓冲液和助溶剂叔丁醇的溶液中培育卡利许霉素衍生物和蛋白质载体。

1： 一种制备有较高药物负荷量/得率和减少凝集量的单体卡利许霉素衍生物 /载体共轭物的方法，共轭物有化学式 Pr(-X-S-S-W) m 其中： Pr为一种蛋白质载体， X是一种连接剂，它包括有任何可与蛋白质载体反应的活性反应基团的产 物， W是通过除去天然存在的甲基三硫化物基团后形成的卡利许霉素基团；m 是0.5至15的数， 所述方法包括步骤： (1)使卡利许霉素衍生物和蛋白质载体在一个非亲核的，蛋白质相容的，pH 范围约为4.0至8.5的缓冲液中培育，溶液还包括(a)一种选自丙二醇，乙醇， DMSO，及其组合的助溶剂，和(b)一种至少包括一个C 6 -C 18 羧酸的添加剂，其中 培育在约25℃至约37℃进行约15分钟至约24小时；和 (2)纯化步骤(1)生成的共轭物以生产单体共轭物。
2： 根据权利要求1所述的方法，其中X有化学式Z-Sp，其中： Sp是直链或支链的二价或三价(C 1 -C 18 )基团，二价或三价芳基或杂芳基团， 二价或三价(C 3 -C 18 )的环烷基或杂环烷基基团，二价或三价的芳基-芳基或杂芳基- 芳基(C 1 -C 18 )基团，二价或三价的环烷基-烷基或杂环烷基-烷基(C 1 -C 18 )基团或二价 或三价(C 2 -C 18 )不饱和烷基基团，其中杂芳基最好是呋喃基，噻嗯基，N-甲基吡 咯基，吡啶基，N-甲基咪唑基，噁唑基，嘧啶基，喹啉基，异喹啉基，N-甲基 咔唑基，氨基香豆素基，或吩嗪基和其中如果Sp是三价基团，Sp还可被低碳 (C 1 -C 5 )二烷基氨基，低碳(C 1 -C 5 )烷氧基，羟基，或低碳(C 1 -C 5 )硫代烷基基团替代； 和 Z是-NHC(＝O)-，-CH＝NNHC(＝O)-，-CH 2 NHNHC(＝O)-，-CH＝NNHC(＝O)NH-， -CH 2 NHNHC(＝O)NH-，-CH＝NNHC(＝S)NH-，-CH 2 NHNHC(＝S)NH-，-CH＝N-， -CH 2 NH-，-OC(＝O)-，-SS-，
3： 根据权利要求1所述的方法，其中X有化学式 (CO-Alk 1 -Sp 1 -Ar-Sp 2 -Alk 2 -C(Z 1 )＝Q-Sp) 其中 Alk 1 和Alk 2 各自代表一个键或有支链或无支链的(C 1 -C 10 )的亚烷基链； Sp 1 是一个键，-S-，-O-，-CONH-，-NHCO-，-NR′-，-N(CH 2 CH 2 ) 2 N-，或-X-Ar′-Y-(CH 2 ) n -Z 其中X，Y，和Z各自为一个键，-NR′-，-S-或-O-，限制条件是当n＝0时， Y和Z中的至少一个须是一个键，且Ar′是1，2-，1，3-，或1，4-亚苯基，它可任意被 (C 1 -C 5 )烷基，(C 1 -C 4 )烷氧基，(C 1 -C 4 )硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′， -O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′，-O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一 个，两个或三个基团取代，限制条件是当Alk 1 是一个键时，Sp 1 是一个键； n是0至5间的整数； R′是有支链或无支链的(C 1 -C 5 )链，它可任意被-OH，(C 1 -C 4 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，(C 1 -C 3 )二烷基氨基，或(C 1 -C 3 )三烷基铵-A - 中的一个或 两个基团取代，其中A - 是药物学上可接受的成盐阴离子； Ar是1，2-，1，3-，或1，4-亚苯基，它可任意被(C 1 -C 6 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个或三个基团取代，其中n 和R′是如上述所确定的，或Ar为1，2-，1，3-，1，4-，1，5-，1，6-，1，7-，1，8-，2，3-，2，6-，或 2，7-亚萘基或 每个亚萘基或吩噻嗪可任意被(C 1 -C 6 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 )硫代烷氧 基，卤素，硝基，-COOR′-，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′，或 -S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个，三个或四个基团取代，其中n和R′是如上述所 确定的，限制条件是当Ar是吩噻嗪时，Sp 1 是一个仅与氮连接的键； Sp 2 是一个键-S-，或-O-，限制条件是当Alk 2 是一个键时，Sp 2 是一个键； Z 1 是H，(C 1 -C 5 )烷基或苯基，它可任意被(C 1 -C 5 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′， -S(CH 2 ) n COOR′，-O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个或三个基 团取代，其中n和R′是如上； Sp是直链或支链的二价或三价(C 1 -C 18 )基团，二价或三价芳基或杂芳基基 团，二价或三价(C 3 -C 18 )的环烷基或杂环烷基基团，二价或三价的芳基-芳基或杂 芳基-芳基(C 1 -C 18 )基团，二价或三价的环烷基-烷基或杂环烷基-烷基(C 1 -C 18 )基团 或二价或三价(C 2 -C 18 )不饱和烷基基团，其中杂芳基最好是呋喃基，噻嗯基，N- 甲基吡咯基，吡啶基，N-甲基咪唑基，噁唑基，嘧啶基，喹啉基，异喹啉基， N-甲基咔唑基，氨基香豆素基或吩嗪基，其中如果Sp是三价基团，Sp还可被低 碳(C 1 -C 5 )二烷基氨基，低碳(C 1 -C 5 )烷氧基，羟基，或低碳(C 1 -C 5 )硫代烷基基团替 代；和 Q是＝NHNCO-，＝NHNCS-，＝NHNCONH-，＝NHNCSNH-，或＝NHO-。 4.根据权利要求3所述的方法，其中 Sp是一个键，-S-，-O-，-CONH-，-NHCO-或-NR′，其中n和R 1 如权利要求3所 确定的，限制条件是当Alk 1 是一个键时，Sp 1 是一个键； Ar是1，2-，1，3-，或1，4-亚苯基，它可任意被(C 1 -C 6 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个或三个基团取代，其中n 和R′是如权利要求3所确定的，或Ar为1，2-，1，3-，1，4-，1，5-，1，6-，1，7-，1，8-，2，3-，2，6-， 或2，7-亚萘基，每个亚萘基可任意被(C 1 -C 6 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 )硫代烷 氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个，三个或四个基团取代； Alk 1 是有支链或无支链(C 1 -C 10 )亚烷基链； Z 1 是(C 1 -C 5 )烷基或苯基，它可任意被(C 1 -C 5 )烷基，(C 1 -C 4 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个或三个基团取代；和 Alk 2 和Sp 2 同为一个键。 5.根据权利要求4所述的方法，其中Sp 1 为-O-，Alk 1 为C 3 亚烷基，Ar是1，4- 亚苯基，和Z 1 是C 1 烷基。 6.根据权利要求3所述的方法，其中Q是＝NHNCO-和Sp是-CH 2 C(CH 3 ) 2 -。 7.根据权利要求2所述的方法，其中Z是-NHC(＝O)-和Sp是 -CH 2 CH 2 C(CH 3 ) 2 -。 8.根据权利要求2所述的方法，其中Z是-CH＝NNHC(＝O)-和Sp是 -CH 2 C(CH 3 ) 2 -。 9.根据权利要求1所述的方法，其中卡利许霉素衍生物包括一种γ卡利许霉 素或一种N-乙酰基γ卡利许霉素衍生物。 10.根据权利要求9所述的方法，其中卡利许霉素衍生物在步骤(1)中含量为 约0.025mg/ml至约1.0mg/ml。 11.根据权利要求1所述的方法，其中蛋白质载体包括一种人化的单克隆抗 体。 12.根据权利要求11所述的方法，其中人化的单克隆抗体在步骤(1)中的含 量为约1mg/ml至约15mg/ml。 13.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的添加剂的量为20至 300mM。 14.根据权利要求1所述的方法，其中助溶剂包括丙二醇，其含量为溶液体 积的约10％至约60％。 15.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的添加剂包括辛酸，其含量 为约20mM至约100mM。 16.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的助溶剂是丙二醇，其含量 为溶液体积的30％，步骤(1)中的添加剂包括辛酸，其含量为60mM。 17.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的助溶剂含量为溶液体积的 xq1％至xq10％，步骤(1)中的添加剂包括辛酸，其含量为约150mM至约 300mM。 18.根据权利要求17所述的方法，其中助溶剂是乙醇。 19.根据权利要求18所述的方法，其中乙醇在步骤(1)中的含量为溶液体积 的5％，步骤(1)中的添加剂辛酸的含量为200mM。 20.根据权利要求17所述的方法，其中步骤(1)中的助溶剂为丙二醇，其含 量为溶液体积的5％，步骤(1)中的添加剂辛酸的含量为200mM。 21.一种制备有较高药物负荷量/得率和减少凝集量的单体卡利许霉素衍生 物/载体共轭物的方法，共轭物有化学式 Pr(-X-S-S-W) m 其中： Pr为一种蛋白质载体， X是一种连接剂，它包括有任何可与蛋白质载体反应的活性反应基团的产 物， W是通过除去天然存在的甲基三硫化物基团后形成的卡利许霉素基团；m 是0.5至15间的数， 所述方法包括步骤： (1)使卡利许霉素衍生物和蛋白质载体在一个非亲核的，蛋白质相容的，pH 范围约为4.0至8.5的缓冲液中培育，溶液还包括叔丁醇助溶剂，其中培育在约 25℃至约37℃进行约15分钟至约24小时；和 (2)纯化步骤(1)生成的共轭物以生产单体共轭物。 22.根据权利要求21所述的方法，其中X有化学式Z-Sp，其中： Sp是直链或支链的二价或三价(C 1 -C 18 )基团，二价或三价芳基或杂芳基团， 二价或三价(C 3 -C 18 )的环烷基或杂环烷基基团，二价或三价的芳基-芳基或杂芳基- 芳基(C 1 -C 18 )基团，二价或三价的环烷基-烷基或杂环烷基-烷基(C 1 -C 18 )基团或二价 或三价(C 2 -C 18 )不饱和烷基基团，其中杂芳基最好是呋喃基，噻嗯基，N-甲基吡 咯基，吡啶基，N-甲基咪唑基，噁唑基，嘧啶基，喹啉基，异喹啉基，N-甲基 咔唑基，氨基香豆素基，或吩嗪基和其中如果Sp是三价基团，Sp还可被低碳 (C 1 -C 5 )二烷基氨基，低碳(C 1 -C 5 )烷氧基，羟基，或低碳(C 1 -C 5 )硫代烷基基团替代； 和 Z是-NHC(＝O)-，-CH＝NNHC(＝O)-，-CH 2 NHNHC(＝O)-，-CH＝NNHC(＝O)NH-， -CH 2 NHNHC(＝O)NH-，-CH＝NNHC(＝S)NH-，-CH 2 NHNHC(＝S)NH-，-CH＝N-， -CH 2 NH-，-OC(＝O)-，-SS-， 23.根据权利要求21所述的方法，其中X有化学式 (CO-Alk 1 -Sp 1 -Ar-Sp 2 -Alk 2 -C(Z 1 )＝Q-Sp) 其中 Alk 1 和Alk 2 各自代表一个键或有支链或无支链的(C 1 -C 10 )的亚烷基链； Sp 1 是一个键，-S-，-O-，-CONH-，-NHCO-，-NR′-，-N(CH 2 CH 2 ) 2 N-，或-X-Ar′-Y-(CH 2 ) n -Z ，其中X，Y，和Z各自为一个键，-NR′-，-S-或-O-，限制条件是当n＝ 0时，Y和Z中的至少一个须为一个键，且Ar′是1，2-，1，3-，或1，4-亚苯基，其可 任意被(C 1 -C 5 )烷基，(C 1 -C 4 )烷氧基，(C 1 -C 4 )硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′， -CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′，-O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′ 中的一个，两个或三个基团取代，限制条件是当Alk 1 是一个键时，Sp 1 是一个键； n是0至5间的整数； R′是有支链或无支链的(C 1 -C 5 )链，它可任意被-OH，(C 1 -C 4 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，(C 1 -C 3 )二烷基氨基，或(C 1 -C 3 )三烷基铵-A - 中的一个或 两个基团取代，其中A - 是药物学上可接受的成盐阴离子； Ar是1，2-，1，3-，或1，4-亚苯基，它可任意被(C 1 -C 6 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个或三个基团取代，其中n 和R′是如上所确定的，或Ar为1，2-，1，3-，1，4-，1，5-，1，6-，1，7-，1，8-，2，3-，2，6-，或2，7- 亚萘基或 每个亚萘基或吩噻嗪可任意被(C 1 -C 6 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 )硫代烷氧 基，卤素，硝基，-COOR′-，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′，或 -S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个，三个或四个基团取代，其中n和R′是如上所确 定的，限制条件是当Ar是亚萘基时，Z 1 不是氢，当Ar是吩噻嗪时，Sp 1 是一个 仅与氮连接的键； Sp 2 是一个键-S-，或-O-，限制条件是当Alk 2 是一个键时，Sp 2 是一个键； Z 1 是H，(C 1 -C 5 )烷基或苯基，其可任意被(C 1 -C 5 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 5 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个或三个基团取代，其中n 和R′是如上所确定； Sp是直链或支链的二价或三价(C 1 -C 18 )基团，二价或三价芳基或杂芳基基 团，二价或三价(C 3 -C 18 )的环烷基或杂环烷基基团，二价或三价的芳基-芳基或杂 芳基-芳基(C 1 -C 18 )基团，二价或三价的环烷基-烷基或杂环烷基-烷基(C 1 -C 18 )基团 或二价或三价(C 2 -C 18 )不饱和烷基基团，其中杂芳基最好是呋喃基，噻嗯基，N- 甲基吡咯基，吡啶基，N-甲基咪唑基，噁唑基，嘧啶基，喹啉基，异喹啉基， N-甲基咔唑基，氨基香豆素基或吩嗪基，其中如果Sp是三价基团，Sp还可被低 碳(C 1 -C 5 )二烷基氨基，低碳(C 1 -C 5 )烷氧基，羟基，或低碳(C 1 -C 5 )硫代烷基基团替 代；和 Q是＝NHNCO-，＝NHNCS-，＝NHNCONH-，＝NHNCSNH-，或＝NHO-。 24.根据权利要求23所述的方法，其中 Sp′是一个键，-S-，-O-，-CONH-，-NHCO-或-NR′，其中n和R′如权利要求23 所确定的，限制条件是当Alk 1 是一个键时，Sp 1 是一个键； Ar是1，2-，1，3-，或1，4-亚苯基，它可任意被(C 1 -C 6 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个或三个基团取代，其中n 和R′是如权利要求23所确定的，或Ar为1，2-，1，3-，1，4-，1，5-，1，6-，1，7-，1，8-，2，3-， 2，6-，或2，7-亚萘基，每个亚萘基可任意被(C 1 -C 6 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个，三个或四个基团取代； Alk 1 是有支链或无支链(C 1 -C 10 )亚烷基链； Z 1 是(C 1 -C 5 )烷基或苯基，它可任意被(C 1 -C 5 )烷基，(C 1 -C 4 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个或三个基团取代；和 Alk 2 和Sp 2 同为一个键。 25.根据权利要求24所述的方法，其中Sp 1 为-O-，Alk 1 为C 3 亚烷基，Ar是 1，4-亚苯基，和Z 1 是C 1 烷基。 26.根据权利要求23所述的方法，其中Q是＝NHNCO-和Sp是 -CH 2 C(CH 3 ) 2 -。 27.根据权利要求22所述的方法，其中Z是-NHC(＝O)-和Sp是 -CH 2 CH 2 C(CH 3 ) 2 -。 28.根据权利要求22所述的方法，其中Z是-CH＝NNHC(＝O)-和Sp是 -CH 2 C(CH 3 ) 2 -。 29.根据权利要求21所述的方法，其中卡利许霉素衍生物包括一种γ卡利许 霉素或一种N-乙酰基γ卡利许霉素衍生物。 30.根据权利要求29所述的方法，其中卡利许霉素衍生物在步骤(1)中的含 量为约0.025mg/ml至约1.0mg/ml。 31.根据权利要求21所述的方法，其中蛋白质载体包括一种人化的单克隆抗 体。 32.根据权利要求31所述的方法，其中人化的单克隆抗体在步骤(1)中的含 量为约1mg/ml至约15mg/ml。 33.根据权利要求21所述的方法，其中步骤(1)中叔丁醇的含量为溶液体积 的约10％至约25％。 34.根据权利要求21所述的方法，其中步骤(1)中的叔丁醇的含量为溶液体 积的15％。
4： 0至8.5的缓冲液中培育，溶液还包括(a)一种选自丙二醇，乙醇， DMSO，及其组合的助溶剂，和(b)一种至少包括一个C 6 -C 18 羧酸的添加剂，其中 培育在约25℃至约37℃进行约15分钟至约24小时；和 (2)纯化步骤(1)生成的共轭物以生产单体共轭物。 2.根据权利要求1所述的方法，其中X有化学式Z-Sp，其中： Sp是直链或支链的二价或三价(C 1 -C 18 )基团，二价或三价芳基或杂芳基团， 二价或三价(C 3 -C 18 )的环烷基或杂环烷基基团，二价或三价的芳基-芳基或杂芳基- 芳基(C 1 -C 18 )基团，二价或三价的环烷基-烷基或杂环烷基-烷基(C 1 -C 18 )基团或二价 或三价(C 2 -C 18 )不饱和烷基基团，其中杂芳基最好是呋喃基，噻嗯基，N-甲基吡 咯基，吡啶基，N-甲基咪唑基，噁唑基，嘧啶基，喹啉基，异喹啉基，N-甲基 咔唑基，氨基香豆素基，或吩嗪基和其中如果Sp是三价基团，Sp还可被低碳 (C 1 -C 5 )二烷基氨基，低碳(C 1 -C 5 )烷氧基，羟基，或低碳(C 1 -C 5 )硫代烷基基团替代； 和 Z是-NHC(＝O)-，-CH＝NNHC(＝O)-，-CH 2 NHNHC(＝O)-，-CH＝NNHC(＝O)NH-， -CH 2 NHNHC(＝O)NH-，-CH＝NNHC(＝S)NH-，-CH 2 NHNHC(＝S)NH-，-CH＝N-， -CH 2 NH-，-OC(＝O)-，-SS-， 3.根据权利要求1所述的方法，其中X有化学式 (CO-Alk 1 -Sp 1 -Ar-Sp 2 -Alk 2 -C(Z 1 )＝Q-Sp) 其中 Alk 1 和Alk 2 各自代表一个键或有支链或无支链的(C 1 -C 10 )的亚烷基链； Sp 1 是一个键，-S-，-O-，-CONH-，-NHCO-，-NR′-，-N(CH 2 CH 2 ) 2 N-，或-X-Ar′-Y-(CH 2 ) n -Z 其中X，Y，和Z各自为一个键，-NR′-，-S-或-O-，限制条件是当n＝0时， Y和Z中的至少一个须是一个键，且Ar′是1，2-，1，3-，或1，4-亚苯基，它可任意被 (C 1 -C 5 )烷基，(C 1 -C 4 )烷氧基，(C 1 -C 4 )硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′， -O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′，-O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一 个，两个或三个基团取代，限制条件是当Alk 1 是一个键时，Sp 1 是一个键； n是0至5间的整数； R′是有支链或无支链的(C 1 -C 5 )链，它可任意被-OH，(C 1 -C 4 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，(C 1 -C 3 )二烷基氨基，或(C 1 -C 3 )三烷基铵-A - 中的一个或 两个基团取代，其中A - 是药物学上可接受的成盐阴离子； Ar是1，2-，1，3-，或1，4-亚苯基，它可任意被(C 1 -C 6 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个或三个基团取代，其中n 和R′是如上述所确定的，或Ar为1，2-，1，3-，1，4-，1，5-，1，6-，1，7-，1，8-，2，3-，2，6-，或 2，7-亚萘基或 每个亚萘基或吩噻嗪可任意被(C 1 -C 6 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 )硫代烷氧 基，卤素，硝基，-COOR′-，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′，或 -S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个，三个或四个基团取代，其中n和R′是如上述所 确定的，限制条件是当Ar是吩噻嗪时，Sp 1 是一个仅与氮连接的键； Sp 2 是一个键-S-，或-O-，限制条件是当Alk 2 是一个键时，Sp 2 是一个键； Z 1 是H，(C 1 -C 5 )烷基或苯基，它可任意被(C 1 -C 5 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′， -S(CH 2 ) n COOR′，-O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个或三个基 团取代，其中n和R′是如上； Sp是直链或支链的二价或三价(C 1 -C 18 )基团，二价或三价芳基或杂芳基基 团，二价或三价(C 3 -C 18 )的环烷基或杂环烷基基团，二价或三价的芳基-芳基或杂 芳基-芳基(C 1 -C 18 )基团，二价或三价的环烷基-烷基或杂环烷基-烷基(C 1 -C 18 )基团 或二价或三价(C 2 -C 18 )不饱和烷基基团，其中杂芳基最好是呋喃基，噻嗯基，N- 甲基吡咯基，吡啶基，N-甲基咪唑基，噁唑基，嘧啶基，喹啉基，异喹啉基， N-甲基咔唑基，氨基香豆素基或吩嗪基，其中如果Sp是三价基团，Sp还可被低 碳(C 1 -C 5 )二烷基氨基，低碳(C 1 -C 5 )烷氧基，羟基，或低碳(C 1 -C 5 )硫代烷基基团替 代；和 Q是＝NHNCO-，＝NHNCS-，＝NHNCONH-，＝NHNCSNH-，或＝NHO-。 4.根据权利要求3所述的方法，其中 Sp是一个键，-S-，-O-，-CONH-，-NHCO-或-NR′，其中n和R 1 如权利要求3所 确定的，限制条件是当Alk 1 是一个键时，Sp 1 是一个键； Ar是1，2-，1，3-，或1，4-亚苯基，它可任意被(C 1 -C 6 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个或三个基团取代，其中n 和R′是如权利要求3所确定的，或Ar为1，2-，1，3-，1，4-，1，5-，1，6-，1，7-，1，8-，2，3-，2，6-， 或2，7-亚萘基，每个亚萘基可任意被(C 1 -C 6 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 )硫代烷 氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个，三个或四个基团取代； Alk 1 是有支链或无支链(C 1 -C 10 )亚烷基链； Z 1 是(C 1 -C 5 )烷基或苯基，它可任意被(C 1 -C 5 )烷基，(C 1 -C 4 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个或三个基团取代；和 Alk 2 和Sp 2 同为一个键。
5： 根据权利要求4所述的方法，其中Sp 1 为-O-，Alk 1 为C 3 亚烷基，Ar是1，4- 亚苯基，和Z 1 是C 1 烷基。
6： 根据权利要求3所述的方法，其中Q是＝NHNCO-和Sp是-CH 2 C(CH 3 ) 2 -。
7： 根据权利要求2所述的方法，其中Z是-NHC(＝O)-和Sp是 -CH 2 CH 2 C(CH 3 ) 2 -。 8.根据权利要求2所述的方法，其中Z是-CH＝NNHC(＝O)-和Sp是 -CH 2 C(CH 3 ) 2 -。 9.根据权利要求1所述的方法，其中卡利许霉素衍生物包括一种γ卡利许霉 素或一种N-乙酰基γ卡利许霉素衍生物。 10.根据权利要求9所述的方法，其中卡利许霉素衍生物在步骤(1)中含量为 约0.025mg/ml至约1.0mg/ml。 11.根据权利要求1所述的方法，其中蛋白质载体包括一种人化的单克隆抗 体。 12.根据权利要求11所述的方法，其中人化的单克隆抗体在步骤(1)中的含 量为约1mg/ml至约15mg/ml。 13.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的添加剂的量为20至 300mM。 14.根据权利要求1所述的方法，其中助溶剂包括丙二醇，其含量为溶液体 积的约10％至约60％。 15.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的添加剂包括辛酸，其含量 为约20mM至约100mM。 16.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的助溶剂是丙二醇，其含量 为溶液体积的30％，步骤(1)中的添加剂包括辛酸，其含量为60mM。 17.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的助溶剂含量为溶液体积的 xq1％至xq10％，步骤(1)中的添加剂包括辛酸，其含量为约150mM至约 300mM。 18.根据权利要求17所述的方法，其中助溶剂是乙醇。 19.根据权利要求18所述的方法，其中乙醇在步骤(1)中的含量为溶液体积 的5％，步骤(1)中的添加剂辛酸的含量为200mM。 20.根据权利要求17所述的方法，其中步骤(1)中的助溶剂为丙二醇，其含 量为溶液体积的5％，步骤(1)中的添加剂辛酸的含量为200mM。 21.一种制备有较高药物负荷量/得率和减少凝集量的单体卡利许霉素衍生 物/载体共轭物的方法，共轭物有化学式 Pr(-X-S-S-W) m 其中： Pr为一种蛋白质载体， X是一种连接剂，它包括有任何可与蛋白质载体反应的活性反应基团的产 物， W是通过除去天然存在的甲基三硫化物基团后形成的卡利许霉素基团；m 是0.5至15间的数， 所述方法包括步骤： (1)使卡利许霉素衍生物和蛋白质载体在一个非亲核的，蛋白质相容的，pH 范围约为4.0至8.5的缓冲液中培育，溶液还包括叔丁醇助溶剂，其中培育在约 25℃至约37℃进行约15分钟至约24小时；和 (2)纯化步骤(1)生成的共轭物以生产单体共轭物。 22.根据权利要求21所述的方法，其中X有化学式Z-Sp，其中： Sp是直链或支链的二价或三价(C 1 -C 18 )基团，二价或三价芳基或杂芳基团， 二价或三价(C 3 -C 18 )的环烷基或杂环烷基基团，二价或三价的芳基-芳基或杂芳基- 芳基(C 1 -C 18 )基团，二价或三价的环烷基-烷基或杂环烷基-烷基(C 1 -C 18 )基团或二价 或三价(C 2 -C 18 )不饱和烷基基团，其中杂芳基最好是呋喃基，噻嗯基，N-甲基吡 咯基，吡啶基，N-甲基咪唑基，噁唑基，嘧啶基，喹啉基，异喹啉基，N-甲基 咔唑基，氨基香豆素基，或吩嗪基和其中如果Sp是三价基团，Sp还可被低碳 (C 1 -C 5 )二烷基氨基，低碳(C 1 -C 5 )烷氧基，羟基，或低碳(C 1 -C 5 )硫代烷基基团替代； 和 Z是-NHC(＝O)-，-CH＝NNHC(＝O)-，-CH 2 NHNHC(＝O)-，-CH＝NNHC(＝O)NH-， -CH 2 NHNHC(＝O)NH-，-CH＝NNHC(＝S)NH-，-CH 2 NHNHC(＝S)NH-，-CH＝N-， -CH 2 NH-，-OC(＝O)-，-SS-， 23.根据权利要求21所述的方法，其中X有化学式 (CO-Alk 1 -Sp 1 -Ar-Sp 2 -Alk 2 -C(Z 1 )＝Q-Sp) 其中 Alk 1 和Alk 2 各自代表一个键或有支链或无支链的(C 1 -C 10 )的亚烷基链； Sp 1 是一个键，-S-，-O-，-CONH-，-NHCO-，-NR′-，-N(CH 2 CH 2 ) 2 N-，或-X-Ar′-Y-(CH 2 ) n -Z ，其中X，Y，和Z各自为一个键，-NR′-，-S-或-O-，限制条件是当n＝ 0时，Y和Z中的至少一个须为一个键，且Ar′是1，2-，1，3-，或1，4-亚苯基，其可 任意被(C 1 -C 5 )烷基，(C 1 -C 4 )烷氧基，(C 1 -C 4 )硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′， -CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′，-O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′ 中的一个，两个或三个基团取代，限制条件是当Alk 1 是一个键时，Sp 1 是一个键； n是0至5间的整数； R′是有支链或无支链的(C 1 -C 5 )链，它可任意被-OH，(C 1 -C 4 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，(C 1 -C 3 )二烷基氨基，或(C 1 -C 3 )三烷基铵-A - 中的一个或 两个基团取代，其中A - 是药物学上可接受的成盐阴离子； Ar是1，2-，1，3-，或1，4-亚苯基，它可任意被(C 1 -C 6 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个或三个基团取代，其中n 和R′是如上所确定的，或Ar为1，2-，1，3-，1，4-，1，5-，1，6-，1，7-，1，8-，2，3-，2，6-，或2，7- 亚萘基或 每个亚萘基或吩噻嗪可任意被(C 1 -C 6 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 )硫代烷氧 基，卤素，硝基，-COOR′-，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′，或 -S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个，三个或四个基团取代，其中n和R′是如上所确 定的，限制条件是当Ar是亚萘基时，Z 1 不是氢，当Ar是吩噻嗪时，Sp 1 是一个 仅与氮连接的键； Sp 2 是一个键-S-，或-O-，限制条件是当Alk 2 是一个键时，Sp 2 是一个键； Z 1 是H，(C 1 -C 5 )烷基或苯基，其可任意被(C 1 -C 5 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 5 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个或三个基团取代，其中n 和R′是如上所确定； Sp是直链或支链的二价或三价(C 1 -C 18 )基团，二价或三价芳基或杂芳基基 团，二价或三价(C 3 -C 18 )的环烷基或杂环烷基基团，二价或三价的芳基-芳基或杂 芳基-芳基(C 1 -C 18 )基团，二价或三价的环烷基-烷基或杂环烷基-烷基(C 1 -C 18 )基团 或二价或三价(C 2 -C 18 )不饱和烷基基团，其中杂芳基最好是呋喃基，噻嗯基，N- 甲基吡咯基，吡啶基，N-甲基咪唑基，噁唑基，嘧啶基，喹啉基，异喹啉基， N-甲基咔唑基，氨基香豆素基或吩嗪基，其中如果Sp是三价基团，Sp还可被低 碳(C 1 -C 5 )二烷基氨基，低碳(C 1 -C 5 )烷氧基，羟基，或低碳(C 1 -C 5 )硫代烷基基团替 代；和 Q是＝NHNCO-，＝NHNCS-，＝NHNCONH-，＝NHNCSNH-，或＝NHO-。 24.根据权利要求23所述的方法，其中 Sp′是一个键，-S-，-O-，-CONH-，-NHCO-或-NR′，其中n和R′如权利要求23 所确定的，限制条件是当Alk 1 是一个键时，Sp 1 是一个键； Ar是1，2-，1，3-，或1，4-亚苯基，它可任意被(C 1 -C 6 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个或三个基团取代，其中n 和R′是如权利要求23所确定的，或Ar为1，2-，1，3-，1，4-，1，5-，1，6-，1，7-，1，8-，2，3-， 2，6-，或2，7-亚萘基，每个亚萘基可任意被(C 1 -C 6 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个，三个或四个基团取代； Alk 1 是有支链或无支链(C 1 -C 10 )亚烷基链； Z 1 是(C 1 -C 5 )烷基或苯基，它可任意被(C 1 -C 5 )烷基，(C 1 -C 4 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个或三个基团取代；和 Alk 2 和Sp 2 同为一个键。 25.根据权利要求24所述的方法，其中Sp 1 为-O-，Alk 1 为C 3 亚烷基，Ar是 1，4-亚苯基，和Z 1 是C 1 烷基。 26.根据权利要求23所述的方法，其中Q是＝NHNCO-和Sp是 -CH 2 C(CH 3 ) 2 -。 27.根据权利要求22所述的方法，其中Z是-NHC(＝O)-和Sp是 -CH 2 CH 2 C(CH 3 ) 2 -。 28.根据权利要求22所述的方法，其中Z是-CH＝NNHC(＝O)-和Sp是 -CH 2 C(CH 3 ) 2 -。 29.根据权利要求21所述的方法，其中卡利许霉素衍生物包括一种γ卡利许 霉素或一种N-乙酰基γ卡利许霉素衍生物。 30.根据权利要求29所述的方法，其中卡利许霉素衍生物在步骤(1)中的含 量为约0.025mg/ml至约1.0mg/ml。 31.根据权利要求21所述的方法，其中蛋白质载体包括一种人化的单克隆抗 体。 32.根据权利要求31所述的方法，其中人化的单克隆抗体在步骤(1)中的含 量为约1mg/ml至约15mg/ml。 33.根据权利要求21所述的方法，其中步骤(1)中叔丁醇的含量为溶液体积 的约10％至约25％。 34.根据权利要求21所述的方法，其中步骤(1)中的叔丁醇的含量为溶液体 积的15％。
8： 5的缓冲液中培育，溶液还包括(a)一种选自丙二醇，乙醇， DMSO，及其组合的助溶剂，和(b)一种至少包括一个C 6 -C 18 羧酸的添加剂，其中 培育在约25℃至约37℃进行约15分钟至约24小时；和 (2)纯化步骤(1)生成的共轭物以生产单体共轭物。 2.根据权利要求1所述的方法，其中X有化学式Z-Sp，其中： Sp是直链或支链的二价或三价(C 1 -C 18 )基团，二价或三价芳基或杂芳基团， 二价或三价(C 3 -C 18 )的环烷基或杂环烷基基团，二价或三价的芳基-芳基或杂芳基- 芳基(C 1 -C 18 )基团，二价或三价的环烷基-烷基或杂环烷基-烷基(C 1 -C 18 )基团或二价 或三价(C 2 -C 18 )不饱和烷基基团，其中杂芳基最好是呋喃基，噻嗯基，N-甲基吡 咯基，吡啶基，N-甲基咪唑基，噁唑基，嘧啶基，喹啉基，异喹啉基，N-甲基 咔唑基，氨基香豆素基，或吩嗪基和其中如果Sp是三价基团，Sp还可被低碳 (C 1 -C 5 )二烷基氨基，低碳(C 1 -C 5 )烷氧基，羟基，或低碳(C 1 -C 5 )硫代烷基基团替代； 和 Z是-NHC(＝O)-，-CH＝NNHC(＝O)-，-CH 2 NHNHC(＝O)-，-CH＝NNHC(＝O)NH-， -CH 2 NHNHC(＝O)NH-，-CH＝NNHC(＝S)NH-，-CH 2 NHNHC(＝S)NH-，-CH＝N-， -CH 2 NH-，-OC(＝O)-，-SS-， 3.根据权利要求1所述的方法，其中X有化学式 (CO-Alk 1 -Sp 1 -Ar-Sp 2 -Alk 2 -C(Z 1 )＝Q-Sp) 其中 Alk 1 和Alk 2 各自代表一个键或有支链或无支链的(C 1 -C 10 )的亚烷基链； Sp 1 是一个键，-S-，-O-，-CONH-，-NHCO-，-NR′-，-N(CH 2 CH 2 ) 2 N-，或-X-Ar′-Y-(CH 2 ) n -Z 其中X，Y，和Z各自为一个键，-NR′-，-S-或-O-，限制条件是当n＝0时， Y和Z中的至少一个须是一个键，且Ar′是1，2-，1，3-，或1，4-亚苯基，它可任意被 (C 1 -C 5 )烷基，(C 1 -C 4 )烷氧基，(C 1 -C 4 )硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′， -O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′，-O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一 个，两个或三个基团取代，限制条件是当Alk 1 是一个键时，Sp 1 是一个键； n是0至5间的整数； R′是有支链或无支链的(C 1 -C 5 )链，它可任意被-OH，(C 1 -C 4 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，(C 1 -C 3 )二烷基氨基，或(C 1 -C 3 )三烷基铵-A - 中的一个或 两个基团取代，其中A - 是药物学上可接受的成盐阴离子； Ar是1，2-，1，3-，或1，4-亚苯基，它可任意被(C 1 -C 6 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个或三个基团取代，其中n 和R′是如上述所确定的，或Ar为1，2-，1，3-，1，4-，1，5-，1，6-，1，7-，1，8-，2，3-，2，6-，或 2，7-亚萘基或 每个亚萘基或吩噻嗪可任意被(C 1 -C 6 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 )硫代烷氧 基，卤素，硝基，-COOR′-，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′，或 -S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个，三个或四个基团取代，其中n和R′是如上述所 确定的，限制条件是当Ar是吩噻嗪时，Sp 1 是一个仅与氮连接的键； Sp 2 是一个键-S-，或-O-，限制条件是当Alk 2 是一个键时，Sp 2 是一个键； Z 1 是H，(C 1 -C 5 )烷基或苯基，它可任意被(C 1 -C 5 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′， -S(CH 2 ) n COOR′，-O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个或三个基 团取代，其中n和R′是如上； Sp是直链或支链的二价或三价(C 1 -C 18 )基团，二价或三价芳基或杂芳基基 团，二价或三价(C 3 -C 18 )的环烷基或杂环烷基基团，二价或三价的芳基-芳基或杂 芳基-芳基(C 1 -C 18 )基团，二价或三价的环烷基-烷基或杂环烷基-烷基(C 1 -C 18 )基团 或二价或三价(C 2 -C 18 )不饱和烷基基团，其中杂芳基最好是呋喃基，噻嗯基，N- 甲基吡咯基，吡啶基，N-甲基咪唑基，噁唑基，嘧啶基，喹啉基，异喹啉基， N-甲基咔唑基，氨基香豆素基或吩嗪基，其中如果Sp是三价基团，Sp还可被低 碳(C 1 -C 5 )二烷基氨基，低碳(C 1 -C 5 )烷氧基，羟基，或低碳(C 1 -C 5 )硫代烷基基团替 代；和 Q是＝NHNCO-，＝NHNCS-，＝NHNCONH-，＝NHNCSNH-，或＝NHO-。 4.根据权利要求3所述的方法，其中 Sp是一个键，-S-，-O-，-CONH-，-NHCO-或-NR′，其中n和R 1 如权利要求3所 确定的，限制条件是当Alk 1 是一个键时，Sp 1 是一个键； Ar是1，2-，1，3-，或1，4-亚苯基，它可任意被(C 1 -C 6 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个或三个基团取代，其中n 和R′是如权利要求3所确定的，或Ar为1，2-，1，3-，1，4-，1，5-，1，6-，1，7-，1，8-，2，3-，2，6-， 或2，7-亚萘基，每个亚萘基可任意被(C 1 -C 6 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 )硫代烷 氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个，三个或四个基团取代； Alk 1 是有支链或无支链(C 1 -C 10 )亚烷基链； Z 1 是(C 1 -C 5 )烷基或苯基，它可任意被(C 1 -C 5 )烷基，(C 1 -C 4 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个或三个基团取代；和 Alk 2 和Sp 2 同为一个键。 5.根据权利要求4所述的方法，其中Sp 1 为-O-，Alk 1 为C 3 亚烷基，Ar是1，4- 亚苯基，和Z 1 是C 1 烷基。 6.根据权利要求3所述的方法，其中Q是＝NHNCO-和Sp是-CH 2 C(CH 3 ) 2 -。 7.根据权利要求2所述的方法，其中Z是-NHC(＝O)-和Sp是 -CH 2 CH 2 C(CH 3 ) 2 -。 8.根据权利要求2所述的方法，其中Z是-CH＝NNHC(＝O)-和Sp是 -CH 2 C(CH 3 ) 2 -。
9： 根据权利要求1所述的方法，其中卡利许霉素衍生物包括一种γ卡利许霉 素或一种N-乙酰基γ卡利许霉素衍生物。
10： 根据权利要求9所述的方法，其中卡利许霉素衍生物在步骤(1)中含量为 约0.025mg/ml至约1.0mg/ml。
11： 根据权利要求1所述的方法，其中蛋白质载体包括一种人化的单克隆抗 体。
12： 根据权利要求11所述的方法，其中人化的单克隆抗体在步骤(1)中的含 量为约1mg/ml至约15mg/ml。
13： 根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的添加剂的量为20至 300mM。
14： 根据权利要求1所述的方法，其中助溶剂包括丙二醇，其含量为溶液体 积的约10％至约60％。
15： 根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的添加剂包括辛酸，其含量 为约20mM至约100mM。
16： 根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的助溶剂是丙二醇，其含量 为溶液体积的30％，步骤(1)中的添加剂包括辛酸，其含量为60mM。
17： 根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的助溶剂含量为溶液体积的 xq1％至xq10％，步骤(1)中的添加剂包括辛酸，其含量为约150mM至约 300mM。
18： 根据权利要求17所述的方法，其中助溶剂是乙醇。
19： 根据权利要求18所述的方法，其中乙醇在步骤(1)中的含量为溶液体积 的5％，步骤(1)中的添加剂辛酸的含量为200mM。
20： 根据权利要求17所述的方法，其中步骤(1)中的助溶剂为丙二醇，其含 量为溶液体积的5％，步骤(1)中的添加剂辛酸的含量为200mM。
21： 一种制备有较高药物负荷量/得率和减少凝集量的单体卡利许霉素衍生 物/载体共轭物的方法，共轭物有化学式 Pr(-X-S-S-W) m 其中： Pr为一种蛋白质载体， X是一种连接剂，它包括有任何可与蛋白质载体反应的活性反应基团的产 物， W是通过除去天然存在的甲基三硫化物基团后形成的卡利许霉素基团；m 是0.5至15间的数， 所述方法包括步骤： (1)使卡利许霉素衍生物和蛋白质载体在一个非亲核的，蛋白质相容的，pH 范围约为4.0至8.5的缓冲液中培育，溶液还包括叔丁醇助溶剂，其中培育在约 25℃至约37℃进行约15分钟至约24小时；和 (2)纯化步骤(1)生成的共轭物以生产单体共轭物。
22： 根据权利要求21所述的方法，其中X有化学式Z-Sp，其中： Sp是直链或支链的二价或三价(C 1 -C 18 )基团，二价或三价芳基或杂芳基团， 二价或三价(C 3 -C 18 )的环烷基或杂环烷基基团，二价或三价的芳基-芳基或杂芳基- 芳基(C 1 -C 18 )基团，二价或三价的环烷基-烷基或杂环烷基-烷基(C 1 -C 18 )基团或二价 或三价(C 2 -C 18 )不饱和烷基基团，其中杂芳基最好是呋喃基，噻嗯基，N-甲基吡 咯基，吡啶基，N-甲基咪唑基，噁唑基，嘧啶基，喹啉基，异喹啉基，N-甲基 咔唑基，氨基香豆素基，或吩嗪基和其中如果Sp是三价基团，Sp还可被低碳 (C 1 -C 5 )二烷基氨基，低碳(C 1 -C 5 )烷氧基，羟基，或低碳(C 1 -C 5 )硫代烷基基团替代； 和 Z是-NHC(＝O)-，-CH＝NNHC(＝O)-，-CH 2 NHNHC(＝O)-，-CH＝NNHC(＝O)NH-， -CH 2 NHNHC(＝O)NH-，-CH＝NNHC(＝S)NH-，-CH 2 NHNHC(＝S)NH-，-CH＝N-， -CH 2 NH-，-OC(＝O)-，-SS-，
23： 根据权利要求21所述的方法，其中X有化学式 (CO-Alk 1 -Sp 1 -Ar-Sp 2 -Alk 2 -C(Z 1 )＝Q-Sp) 其中 Alk 1 和Alk 2 各自代表一个键或有支链或无支链的(C 1 -C 10 )的亚烷基链； Sp 1 是一个键，-S-，-O-，-CONH-，-NHCO-，-NR′-，-N(CH 2 CH 2 ) 2 N-，或-X-Ar′-Y-(CH 2 ) n -Z ，其中X，Y，和Z各自为一个键，-NR′-，-S-或-O-，限制条件是当n＝ 0时，Y和Z中的至少一个须为一个键，且Ar′是1，2-，1，3-，或1，4-亚苯基，其可 任意被(C 1 -C 5 )烷基，(C 1 -C 4 )烷氧基，(C 1 -C 4 )硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′， -CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′，-O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′ 中的一个，两个或三个基团取代，限制条件是当Alk 1 是一个键时，Sp 1 是一个键； n是0至5间的整数； R′是有支链或无支链的(C 1 -C 5 )链，它可任意被-OH，(C 1 -C 4 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，(C 1 -C 3 )二烷基氨基，或(C 1 -C 3 )三烷基铵-A - 中的一个或 两个基团取代，其中A - 是药物学上可接受的成盐阴离子； Ar是1，2-，1，3-，或1，4-亚苯基，它可任意被(C 1 -C 6 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个或三个基团取代，其中n 和R′是如上所确定的，或Ar为1，2-，1，3-，1，4-，1，5-，1，6-，1，7-，1，8-，2，3-，2，6-，或2，7- 亚萘基或 每个亚萘基或吩噻嗪可任意被(C 1 -C 6 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 )硫代烷氧 基，卤素，硝基，-COOR′-，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′，或 -S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个，三个或四个基团取代，其中n和R′是如上所确 定的，限制条件是当Ar是亚萘基时，Z 1 不是氢，当Ar是吩噻嗪时，Sp 1 是一个 仅与氮连接的键； Sp 2 是一个键-S-，或-O-，限制条件是当Alk 2 是一个键时，Sp 2 是一个键； Z 1 是H，(C 1 -C 5 )烷基或苯基，其可任意被(C 1 -C 5 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 5 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个或三个基团取代，其中n 和R′是如上所确定； Sp是直链或支链的二价或三价(C 1 -C 18 )基团，二价或三价芳基或杂芳基基 团，二价或三价(C 3 -C 18 )的环烷基或杂环烷基基团，二价或三价的芳基-芳基或杂 芳基-芳基(C 1 -C 18 )基团，二价或三价的环烷基-烷基或杂环烷基-烷基(C 1 -C 18 )基团 或二价或三价(C 2 -C 18 )不饱和烷基基团，其中杂芳基最好是呋喃基，噻嗯基，N- 甲基吡咯基，吡啶基，N-甲基咪唑基，噁唑基，嘧啶基，喹啉基，异喹啉基， N-甲基咔唑基，氨基香豆素基或吩嗪基，其中如果Sp是三价基团，Sp还可被低 碳(C 1 -C 5 )二烷基氨基，低碳(C 1 -C 5 )烷氧基，羟基，或低碳(C 1 -C 5 )硫代烷基基团替 代；和 Q是＝NHNCO-，＝NHNCS-，＝NHNCONH-，＝NHNCSNH-，或＝NHO-。
24： 根据权利要求23所述的方法，其中 Sp′是一个键，-S-，-O-，-CONH-，-NHCO-或-NR′，其中n和R′如权利要求23 所确定的，限制条件是当Alk 1 是一个键时，Sp 1 是一个键； Ar是1，2-，1，3-，或1，4-亚苯基，它可任意被(C 1 -C 6 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个或三个基团取代，其中n 和R′是如权利要求23所确定的，或Ar为1，2-，1，3-，1，4-，1，5-，1，6-，1，7-，1，8-，2，3-， 2，6-，或2，7-亚萘基，每个亚萘基可任意被(C 1 -C 6 )烷基，(C 1 -C 5 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个，三个或四个基团取代； Alk 1 是有支链或无支链(C 1 -C 10 )亚烷基链； Z 1 是(C 1 -C 5 )烷基或苯基，它可任意被(C 1 -C 5 )烷基，(C 1 -C 4 )烷氧基，(C 1 -C 4 ) 硫代烷氧基，卤素，硝基，-COOR′，-CONHR′，-O(CH 2 ) n COOR′，-S(CH 2 ) n COOR′， -O(CH 2 ) n CONHR′，或-S(CH 2 ) n CONHR′中的一个，两个或三个基团取代；和 Alk 2 和Sp 2 同为一个键。
25： 根据权利要求24所述的方法，其中Sp 1 为-O-，Alk 1 为C 3 亚烷基，Ar是 1，4-亚苯基，和Z 1 是C 1 烷基。
26： 根据权利要求23所述的方法，其中Q是＝NHNCO-和Sp是 -CH 2 C(CH 3 ) 2 -。
27： 根据权利要求22所述的方法，其中Z是-NHC(＝O)-和Sp是 -CH 2 CH 2 C(CH 3 ) 2 -。
28： 根据权利要求22所述的方法，其中Z是-CH＝NNHC(＝O)-和Sp是 -CH 2 C(CH 3 ) 2 -。
29： 根据权利要求21所述的方法，其中卡利许霉素衍生物包括一种γ卡利许 霉素或一种N-乙酰基γ卡利许霉素衍生物。
30： 根据权利要求29所述的方法，其中卡利许霉素衍生物在步骤(1)中的含 量为约0.025mg/ml至约1.0mg/ml。
31： 根据权利要求21所述的方法，其中蛋白质载体包括一种人化的单克隆抗 体。
32： 根据权利要求31所述的方法，其中人化的单克隆抗体在步骤(1)中的含 量为约1mg/ml至约15mg/ml。
33： 根据权利要求21所述的方法，其中步骤(1)中叔丁醇的含量为溶液体积 的约10％至约25％。
34： 根据权利要求21所述的方法，其中步骤(1)中的叔丁醇的含量为溶液体 积的15％。