免疫刺激单克隆抗体 【发明领域】
本发明总的来说属于免疫治疗领域，更具体而言，本发明涉及治疗各种适应症如治疗癌症中所使用的单克隆抗体。
现有技术
下面列出的是作为现有技术的参考文献，这些文献与后面说明书所描述的内容相关：
1.Clark，E.A.，和Ledbetter，J.A.，兴奋性抗体对免疫反应的放大作用，Imunol.，Today，7：267-270，1986.
2.Meuer，S.C.，Huspey，R.E.，Cantrell，D.A.，Hodgdon，J.C.，Schlornman，F.，Smith，K.A.和Reinberg，E.L.，触发T3-T1抗原-受体复合物导致T细胞克隆通过白细胞介素2依赖型自分泌途径扩增，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，31：1509-1513，1984.
3.Van Wauve，J.P.，De Mey，J.R.，和Gooser，J.G.，OKT3：一种单克隆抗人T淋巴细胞抗体及强促有丝分裂特性，J.Immunol.，124：2708-2713，1980.
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5.Van Lier，R.，Blocmena，E.，Brouwer，M.，Van Heijm，J.，Weinreich，S.，和Aarden，L.，抗CD2抗原I和II区的单克隆抗体诱导的T细胞增殖的单核细胞依赖性的研究，Immunology，67：333-338，1989.
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这里引用的上述任一篇参考文献，是为了使读者获知现有技术的内容。但这种引用从任何意义上都不应被认为这些参考文献与后述权利要求所限定地本发明的专利性主题有关。
通过标明上面列举的参考文献的序号引用这些参考文献。发明背景
各种形式的癌症是引起人类死亡的一个主要原因。在美国有1/3的人患有癌症，20％的人死于癌症(1988年有494,000人)。
最广泛应用的治疗癌症的方法有外科手术、放射疗法和化学疗法。近年来，提出另一种治疗方法，其以使用生物反应调节物(BRM)为基础。所用的BRM主要包括细胞因子(例如白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-α(INF-α))、激活的单核细胞(如淋巴细胞活素激活的杀伤细胞(LAK))和抗体。这些BRM既直接作用于肿瘤也通过增强非特异性或特异性免疫机制和细胞毒性机制间接作用于肿瘤。
迄今为止，使用BRM没有获得临床方面的实质成功，这主要是因为BRM具有毒性和副作用。也曾提出使用抗肿瘤癌的活化免疫接种，但发现没有什么效果。并且，对癌症诊断和治疗中使用的几种单克隆抗体(mAb)进行评估但仍没有一种单克隆抗体在癌症病人的标准治疗程序中被证明是有效的。
人们已经发现能与T细胞表面决定簇结合的各种mAb能诱发这些细胞的增殖、活化或分化(1)。人们已经证明，抗T细胞上CD3/TCR复合物的mAb的结合(2-4)，抗T细胞上CD2(5)受体抗原的mAb的结合，以及上述这两种抗体同时与T细胞的结合会T使细胞增殖、IL-2受体得到表达，以及在T细胞中产生IL-2，由此增强这些细胞中的溶细胞过程。抗CD3mAb表明能在动物模型(6-7)中体内引发抗肿瘤活性。
人们还报道了定向抗T-淋巴细胞抗原的各种其它mAb，这些单抗在与细胞结合后，会使细胞活化。这种单抗的例子有定向抗CD5(8)的mAb，定向抗CD69(9)的mAb和定向抗CD28(10，11)的mAb。据报道，抗CD28mAb能减小鼠黑素瘤的生长速度，但并不能成功地从鼠体内彻底消除肿瘤(12)。
一种称为“Daudi”的定向抗人B淋巴母细胞系的单克隆抗体表明刺激鼠淋巴和人外周T细胞(13)。
发明概述
首先，本发明提供了一种单克隆免疫刺激抗体，该抗体与B淋巴母细胞结合，诱发外周血淋巴细胞的增殖和活化，该单克隆抗体的特征在于当被注射入长有肿瘤的动物体时，能引发抗肿瘤效果。
抗肿瘤效果是一种生物效果，通过肿瘤体积缩小、转移瘤数目减少、寿命延长或各种与癌症相关的生理症状的改善来体现这种效果。也可通过mAb在肿瘤首发位置抑制肿瘤发生的能力来体现抗肿瘤效果。本发明单克隆抗体由于具有这些性质，能用于癌症的治疗以及癌症的预防中。
首先用免疫原免疫动物，免疫原是B淋巴母细胞、裂解的B淋巴母细胞或其膜制备物。免疫接种并在免疫动物体内形成免疫反应后，从该动物体中提取出B淋巴细胞，形成细胞系并筛选出具有可以与免疫原结合的分泌抗体的细胞系。然后从所选的mAb中再进一步筛选出能诱发外周血细胞增殖和活化的单克隆抗体。
为获得本发明的mAb，对上述筛选出的抗体再进一步进行筛选，以使所选抗体能够达到抗肿瘤的效果。为筛选这种抗体，通常可使用癌症动物模型。有时也可以在各种体外模型中检测抗癌效果。例如，这种模型可以是实验室中任意一种已被诱发癌症的动物。特定相关地，特别选择鼠作为人类治疗应用的模型，其可以诱发出人源肿瘤。后一种类型的动物模型例子有免疫损害鼠，如SCID鼠或裸鼠，这些鼠注射了或植入了来自癌症病人的肿瘤细胞或组织。筛选时，通过与对照动物(没有以mAb处理的或以不相关的mAb处理的类似的长有肿瘤的动物)相比较，来确定本发明mAb减小肿瘤体积、延长存活时间等能力。
筛选也可包括在适当的动物模型中检测本发明mAb预防癌症发生的能力。例如，对具有癌症易发基因的动物可注射本发明mAb，然后将这种用mAb处理的组与用别的方法处理且同样地饲养的对照组进行比较，比较肿瘤发生率和动物存活率。不使用具有肿瘤易发基因的动物，可在各种以mAb处理的其它动物被实验性地给予动物恶性肿瘤细胞之前检测本发明mAb抑制癌症的能力。
为达到这种抗肿瘤效果，须给予实验对象有效量的本发明mAb。术语“有效量”应被理解为为达到治疗效果所需要的mAb的量。这种达到最终治疗结果所需的有效量取决于多种因素，包括例如肿瘤的类型、病人病症的严重程度(即癌症状态)以及该mAb是否与另一种试剂一同施用，该试剂以加和方式或协同方式(注意这种共同施用，如下所述)与该mAb共同起作用。
可通过各种实质上众所周知的方法获得分泌本发明mAb的无限增殖细胞系，如通过与无限增殖细胞系融合产生杂交瘤；通过EBV转化；通过基因工程化细胞系，如CHO细胞系这样的能以各种已知的方法获得的细胞系来实现。总之，今天获得无限增殖单克隆抗体分泌细胞系的方法是本领域技术人员所知的常规技术，这里不再进行描述。
通常，当mAb是用于治疗人类疾病时，免疫原应是来源于人的。然而，时常存在种间交叉反应性，有时也可能使用非人源的免疫原，如来源于灵长类的免疫原进行免疫接种后获得mAb，用于治疗人类疾病。
本发明抗体应理解为包括单克隆抗体，可以是IgG或IgM抗体、可以是该抗体的Fab片段、F(ab’)2片段、单链抗体等等。此外，来自非人源如来自鼠的抗体可以通过各种基因工程手段进行“人源化”(“人源化”抗体是一种抗体，其中主要部分被人源部分取代)。
本发明的抗体可用于多种适应症的治疗中，本发明优选实施方案可用于癌症治疗。我们发现本发明单克隆抗体在减少各种肿瘤的致瘤性方面是有活性的。
本发明典型的杂交瘤细胞系保藏于微生物培养物国家保藏中心(Collcction Nationalc de Cultures de Microorganismes(CNCM))，Institute Pasteur，25，Rucdu Docteur Rour，75724，巴黎，Ledex15，保藏号为No.I-1397，保藏时间为1994年1月28日。这里有时将此细胞系的细胞表示为“BAT-1细胞”，有时将相应的单克隆抗体表示为“BAT-1mAb”。
使用具有BAT-1mAb特性的单克隆抗体，特别是BAT-1mAb本身是本发明的优选实施方案。
根据其与Daudi人B淋巴母细胞系细胞的结合来筛选本发明BAT-1单克隆抗体。我们发现BAT-1mAb与一种蛋白物质(以下称“BAT-1结合蛋白”)结合，该蛋白质的表观分子量由SDS-PAGE测定为48-50K道尔顿。
本发明的另一方面是BAT-1结合蛋白。可通过各种已知方法使用本发明mAb分离BAT-1结合蛋白。BAT-1结合蛋白可用于动物的免疫接种，从该动物中可得到本发明mAb。
本发明也可提供一种药物组合物，组合物中包含有效量的作为活性成分的本发明mAb和生理上可接受的载体。
本发明另一方面是一种治疗疾病的方法，特别是癌症的治疗方法，包括给需要治疗的病人施用有效量的本发明mAb。通常以非肠道形式如静脉内(i.v.)、腹膜内(i.p.)或肌内(i.m.)形式施用mAb。用于施用的载体可以是任意一种已知的载体，如盐水溶液或任何其它合适的生理溶液。
如上所述，我们发现本发明mAb在减少各种肿瘤的致瘤性方面是有活性的。本发明mAb在减少致瘤性中的功效与其诱发淋巴细胞细胞毒活性的能力相关。为增强这种细胞毒活性，有时将本发明mAb与其它试剂一同施用是有利的，所述其它试剂能以加和方式或协同方式与mAb一同起作用。例子包括各种细胞因子如IL-1(白细胞介素-1)、IL-2、IL-6和IFN-α(干扰素-α)。
本发明mAb可用于多种非癌症疾病的治疗中，其中mAb对免疫系统细胞毒活性的激活作用或其它作用可能在如HIV感染(引起获得性免疫缺损-AIDS的病毒)早期，在各种自动免疫失调中，或在一些遗传性或获得性免疫缺损的情况中具有治疗效果。
在癌症治疗中，可在检测出初级或二级肿瘤之后对病人施用抗体，或者对患癌高危性人如放射环境中工作的人或具有遗传倾向的人进行预防治疗时施用抗体。相似地，对于AIDS病人，可对受感染个体在还未产生任何疾病症状时或对处于HIV感染过程早期的个体施用mAb。
下面将由各实施例通过描述证明抗癌治疗活性的实验来说明本发明。但应认为这些实施例仅用于说明目的而不起限制作用。
附图的简要描述
图1表明BAT单克隆抗体(mAb)与人纯化T-淋巴细胞结合的流动细胞计数分析结果。用第二种携带有荧光标记的抗体，FITC-山羊抗鼠抗体，评估BAT抗体的结合。
图1a-没有BAT抗体时背景读数；
图1b-抗CD3抗体；
图1c-BAT-1；
图1d-BAT-5；
图1e-BAT-2；
图1f-BAT-4。
图2表明了人外周血单核细胞(PBM)(左板)和Jurkat T细胞(右板)流动细胞计数分析结果，其中细胞以BAT mAb或抗CD3 mAb这种初级抗体和第二种偶联FITC的抗鼠IgG抗体进行双重标记。
图2A-未经门控的细胞；
图2A(a)-以BAT mAb处理的PBM细胞；
图2A(b)-以抗CD3 mAb处理的PBM细胞；
图2A(c)-以BAT mAb处理的Jurkat T细胞；
图2A(d)-以抗CD3处理的Jurkat细胞；
图2B-经门控的细胞；
图2B(a)-进入小细胞(R1)和大细胞(R2)的PBM细胞；
图2B(b)-以BAT mAb处理的(R1)细胞；
图2B(c)-以抗CD3处理的(R1)细胞；
图2B(d)-以抗BAT mAb处理的(R2)细胞；
图2B(e)-以抗CD3处理的(R2)细胞。
图3表明了流动细胞计数分析结果，显示了在以偶联FITC的BATMAB和偶联PE的抗CD3进行双重标记的人PBM上BAT结合蛋白和CD3的表面表达。
图3A-未经门控的细胞
图3A(a)-用作阴性对照的Becton-Dicklhson Simliltest对照
图3A(b)-单纯的PE-抗-CD3；
图3A(c)-单纯的FITC-BAT mAb；
图3A(d)-以FITC-BAT mAb和PE-抗CD3抗体进行双重标记；
图3B-经门控的细胞
图3B(a)-进入小细胞(R1)和大细胞(R2)的PBM细胞
图3B(b)-以FITC-BAT mAb和PE-抗CD3双重标记的(R1)细胞；
图3B(c)-以FITC-BAT mAb和PE-抗CD3双重标记的(R2)细胞；
图4为BAT-1抗体与Daudi细胞不同溶胞产物结合的Western印迹分析结果。
图4(1)-Daudi细胞(未处理的)的溶胞产物；
图4(2)-以神经氨酸苷酶(0.2u/ml)处理的溶胞产物；
图4(3)-以神经氨酸苷酶(0.4u/ml)处理的溶胞产物。
图5曲线表示掺入(3H)胸腺嘧啶核苷的细胞随一系列BAT mAb浓度增加培养6天的结果，BAT mAb为：BAT-1(-▲-)，BAT-2(-X-)，BAT-3(-●-)，BAT-5(-★-)，BAT-6(-◆-)，BAT-7(-■-)。
图6曲线所示实验是在与2.5mg/ml BAT mAb一起培养不同培养时间的PBM中测试的细胞毒活性的诱导作用。HT-29(左)或RC29(右)细胞用作靶细胞。效应细胞与靶细胞比率为20∶1。对照(-O-)，BAT-1(-●-)，BAT-2(-X-)，BAT-3(-▲-)。
图7显示了以B-16黑素瘤细胞接种的C57BL鼠的肺：上排显示的是仅以细胞接种，接种24天后的鼠肺；下排显示的是如上述以B-16细胞接种，14天后以10μg f BAT-1mAb静脉注射，接种24天后的鼠肺。
图8曲线是对图7所示各项实验的总结，显示出用肿瘤细胞B-16黑素瘤细胞、3LL Lewis肺癌细胞或MCA105纤维肉瘤细胞接种的鼠在接种后一个月肺中转移瘤的数目。这一结果对用每种肿瘤所做的3-4次实验进行了概括总结。接种肿瘤后两周，未用BAT-1处理的鼠(-)，用BAT-1(10μg/只)处理的鼠(+)。转移瘤(●)；没有转移瘤(○)。
图9表示以3LL Lewis肺癌细胞接种的鼠肺。与图7相似；上排是仅以肿瘤细胞接种的肺；下排是接种14天后用10μg BAT-1mAb静脉内注射的鼠肺。
图10所示实验与图9相似，其中肿瘤细胞为MCA105纤维肉瘤细胞。
材料和方法单克隆抗体的制备
用Daudi细胞的膜制剂免疫BALB/c鼠。用甘油灌注-低渗冲法(Jett，M.，Seed，T.M.，和Jamieson，G.A.，J.Biol.Chem.，252：2134.(1977))制备Daudi细胞膜。50-80×106个细胞悬浮于PBS中并于37℃温育，逐渐用30％甘油灌注。冰上温育5分钟后，将其离心并重新悬浮于冷的Tris溶胞缓冲液中(含10mM Tris-HCl，1mM MgCl2，1mM CaCl2，pH7.4)，4℃时混合5分钟，700g离心。分离出上清液并在3300g(10分钟，4℃)离心。将沉淀物再次洗涤，将含细胞膜部分的两种上清液合并。用260μl完全弗氏佐剂乳化260μl的细胞膜制剂(3mg/ml)，并腹膜内注射入BALB/c鼠。三周后，取出鼠脾脏，脾细胞与骨髓瘤细胞系NS-0以10∶1比例融合。根据Kohler和Milstein(Kohler，G.，和Milstein，C.，Nature，(London)256：495，(1975)的方法，使用聚乙二醇进行融合，并将杂交瘤生长于选择性培养基中。
细胞结合的酶联免疫吸附分析(ELISA)从生长的杂交瘤中筛选与Daudi细胞结合的上清液(Glassy，M.C.和Surh，C.D.，J.Immunol.Method，81：115(1985))。使用〔3H〕胸腺嘧啶核苷摄入分析，根据杂交瘤上清液诱导人PBM增殖的能力进一步筛选阳性杂交瘤上清液。用有限稀释法对阳性克隆进行亚克隆、重复测试、扩大培养成培养物。
用50％硫酸铵沉淀，随后进一步在PBS中透析从培养基中纯化的mAb。通过结合有抗鼠抗体的sepharose柱亲和层析完成进一步纯化。培养基
所有细胞均悬浮于补充有10％胎牛血清(FCS)、丙酮酸钠(1.1mg/ml)、L-谷氨酰胺(0.3mg/ml)和抗生素(青霉素200u/ml和链霉素10μg/ml)的RPMI1640培养基中，并于5％CO2湿度培养箱中温育。
所用IL-2单位为Cetus(1单位Cetus相当于3个国际单位)。细胞制备
通过ficoll-hypaque密度离心(Histopaque，Sigma)从健康成年人获取人外周血单核细胞(PBM)，用sephadex G10柱除尽PBM中的单核白细胞。通过SRBC玫瑰花结法分离T细胞。通过免疫磁性技术除尽CD3阳性细胞和Leu19阳性细胞。用PBS清洗PBM培养物或对照样品三次，其中PBM与BAT mAb共同温育了5-6天。未与CD3或Leu19(CD56)偶联的抗体被加入到完全RPMI培养基中的细胞中，并于4℃温育1小时，加入包被抗鼠抗体的磁珠30分钟。利用磁性除去吸附于珠上的细胞，对未吸附的细胞分析其细胞毒性并以流动细胞计数染色。细胞毒性分析测定
细胞毒性测定方法如下：2-4×106个靶细胞与200μCi的51Cr-铬酸盐在无血清培养基中混合1小时。细胞用完全培养基洗涤3次，并最终重新悬浮于RPMI-10％FCS中，以每孔104个细胞置于培养板上。培养效应细胞，从正常的外周血中制备的淋巴细胞与不同mAb、同族型对照IgG或IL-2共同温育不同时间。在测定之前，将细胞在RPMI培养基中洗涤三次，用1％台盼蓝对细胞活性染色，在圆底微量滴定板中以各种效应细胞-靶细胞比例将细胞与靶细胞混合，并于5％CO2中37℃温育3小时。收集培养物上清液并在β-闪烁计数仪上计数。通过靶细胞与triton x-100共同温育而达到最大同位素释放量(MR)。通过将靶细胞单独与培养基一起温育测定自发释放量(SR)。通过(ER-SR/MR-SR)×100计算细胞溶解的百分数，其中ER是实验测得的效应细胞释放量。人淋巴细胞亚群中细胞毒性的诱导作用
在BAT mAb存在情况下培养PBM细胞(4×106个/ml)6天。然后将细胞洗3次，并使用包被有抗鼠f(ab’)2的磁珠除尽CD3和Leu19细胞，测试抗K562和Daudi细胞的细胞毒性。流动细胞计数
使用FACS440(Becton-Dickinson)通过流动细胞计数法检测细胞表面抗原。每次测定使用106个细胞，通过与所生产的最适浓度的针对于人CD3、IL-2受体的鼠mAb或mAb BAT1-9连续温育对细胞进行染色。在这种间接染色过程中使用与FITC偶联的山羊抗鼠F(ab’)2作为第二种抗体。每次温育均在pH7.4含1％BSA和5％叠氮钠的PBS中4℃时进行30分钟，随后用同样的缓冲液洗涤3次。测定104个染色细胞。BAT mAb结合决定簇的检测
使用Western印迹法进行Daudi B淋巴母细胞溶解产物上BAT mAb结合决定簇的检测。简而言之，悬浮于PBS中的50×106细胞/ml以30％甘油逐渐灌注，通过连续离心分离出细胞膜。
用SDS-PAGE(12％)分离细胞膜制备样品，然后将细胞膜样品转移至浸泡于含1％低脂奶的PBS中的硝酸纤维素印迹膜上。室温下将该印迹膜与BAT mAb一起温育2小时，然后再与辣根过氧化物酶偶联的抗体70抗鼠IgG(Fab’)2一起温育30分钟，来检测硝酸纤维素印迹上的BAT mAb结合蛋白。然后浸洗细胞并以邻联茴香胺底物进行检测。鼠肿瘤模型
使用了三种鼠肿瘤模型：B16黑素瘤、Lewis肺癌(3LL)和甲胆蒽诱发的纤维肉瘤(MCA105)。向C57BL鼠(8周龄)静脉注射50-200×106个细胞。两周后，静脉注射BAT-1，注射量为1-10μg/只，10天后将鼠杀死并计数所生长的肺转移瘤。
实施例实施例1a.结合特性
对由B淋巴母细胞免疫接种得到的称为BAT1-9的9个单克隆抗体(mAb)进行筛选，首先与Daudi细胞结合，然后诱导人外周血淋巴细胞增殖。通过ELISA和Ochterlony分析确定BAT mAb的同族型。人们发现BAT1、2、3、6、7和9为IgG1类而BAT4和5为IgM类，BAT8为IgG2a。
使用间接免疫荧光染色通过FACS分析法来分析上述mAb与纯化的人外周T细胞的结合。图1显示了这一实验的FACS分析结果。正如所看到的，BAT mAb与外周血CD3+T细胞结合，结合程度各不相同，BAT-2为44％，BAT-5为38％，BAT-1为32％，BAT-4结合程度有些弱(13％)。来自同一供血者的纯化外周血B淋巴细胞不与这些mAb结合(数据未示出)。b.BAT-1与人淋巴细胞亚群的结合
正如图2所示，进一步的FACS分析表明，BAT-1与带CD3+的人PBM结合，还与Jurkat T-细胞系的细胞结合。使用双重标记细胞的FACS分析法(图3)更进一步证实了BAT-1与带CD3+的PBM细胞的结合。
如下表1所示，BAT-1除与带有CD3的细胞结合外，还与Leu19/NK细胞结合。
表1
BAT-1mAb与人淋巴样亚群的结合 阳性细胞(％) 细胞亚群富集： MAB CD3+ Leu19+ CD3 66.4(100％) - Leu19 - 59.5(100％) BAT-1 19.8(30％) 42.2(70％)C.BAT mAb与各种细胞类型的结合
测定了BAT mAb与各种类型细胞的结合。正如下表2所示，BAT除与Daudi和Jurkat T细胞系的PBL结合外，还与红白血病细胞系的K562结合，与人乳腺癌细胞系的MCF7结合。BAT mAb与所测试细胞类型间的结合程度各不相同。mAb2-9仅以很弱的亲和力与鼠肾癌(MR28)细胞结合。BAT-8与MEL(鼠红白血病)细胞的结合亲和性也很弱。
表2
BAT mAb与各种细胞类型的结合 BAT mAb 细胞 1 2 4 5 8 9 人 Daudi +++ ++ ++ +++ ± +++ Jurkat + ± +++ +++ - +++ PBL +++ ± + + ± ± K562 +++ + + +++ ± +++ MCF7 ± ++ +++ +++ + +++ 鼠 MR28 - ± + + ± ± MEL - - - - ± ±
使用ELISA鉴定结合情况，表示如下：
+(0.1-0.2OD)
++(0.2-0.3OD)
+++(ovcr0.3OD)实施例2 BAT mAb结合位点的分析和BAT-1结合蛋白的纯化
为测定与BAT-1 mAb相作用的膜蛋白分子量，将Daudi细胞膜制备物溶解，通过SDS-PAGE分离蛋白。硝酸纤维素转移印迹与BAT-1mAb一起温育，再进一步与辣根过氧化物酶偶联抗抗鼠IgG(Fab’)2抗体一起温育并使用邻联茴香胺作底物检测区带。发现BAT-1结合蛋白的分子量大小约为48-50KDa(图4)。
使用与Sepharose偶联的BAT mAb来纯化BAT mAb结合蛋白。也可使用分子生物学方法通过克隆来制备该结合蛋白，对鼠施用BAT-1的体内实验能导致BAT抗体的诱发。实施例3BAT mAb的功能特性a.BAT mAb诱导胸腺嘧啶核苷的掺入
在一系列浓度递增的BAT mAb存在情况下，对人外周血细胞培养6天，收获前20小时加入〔3H〕胸腺嘧啶核苷。
正如图5所示，BAT mAb浓度的逐渐增加，会使〔3H〕胸腺嘧啶核苷在PBM细胞中的掺入量稍有提高而非显著改变。但是，大剂量的抗体会使细胞摄入的胸腺嘧啶核苷量减少。在对照实验中，同族型匹配的抗体不会使PBL细胞中〔3H〕胸腺嘧啶核苷增加，这表明BAT mAb的激动效应取决于它们的结合特异性。例如，我们实验室所培养的抗卵巢癌细胞的IgG1同族型mAb不会引起〔3H〕胸腺嘧啶核苷摄入量的增加，与也属IgG1类的BAT 1，2，3，6，7和9mAb相反。b.BAT mAb诱发人PBM细胞毒性
对于BAT mAb一起温育不同时间的人外周血单核细胞培养物，测试其溶解肿瘤细胞系的能力。
正如下表3所示，与一系列BAT mAb一起温育一周的人PBM细胞，对人红白血病(NK敏感性的)的K562和肾癌细胞系(NK抗性的)细胞RC-29均有细胞毒性。
我们研究了由BAT mAb刺激的人PBM细胞毒活性增强的动力学性质。正如图6所示，在人PBM与BAT mAb一起温育7天后，可获得针对于人结肠癌(HT-29)和肾细胞癌(RC-29)的最大细胞毒性。
表3
BAT mAb诱发人PBM细胞毒性 特异性的51Cr释放(％) mAb K562 RC-29 无 11.0* 9.1 BRT-1 25.1 45.4 2 29.0 23.2 3 26.3 32.3 4 30.6 40.7 5 32.3 34.3 6 15.2 13.8 7 17.8 16.7 8 17.8 19.2 IL2 1000u/ml 57.6 36.9
*靶细胞溶解百分率，所用效应细胞：靶细胞比率为5∶1c.在BAT诱发的细胞毒性中的淋巴细胞亚群的特性
为评估BAT mAb诱发的人PBM细胞毒性的增加是否是由于NK细胞的激活、T细胞的激活或这两种细胞激活作用，对NK和T细胞进行纯化，并测定其BAT诱发的细胞毒性。为纯化NK和T细胞，将抗Leu19和抗CD3单克隆抗体与人PBM细胞一起温育，随后与包被有抗鼠IgG磁珠一起温育。这会导致与相应抗体结合的细胞亚群被完全除去。正如下表4所示，在除去CD3和Leu19的细胞培养物中，溶解单位的数增大，这些实验中使用BAT6和8，靶物为人红白血病(K562)和人淋巴瘤(Daudi)。
表4
BAT在人淋巴细胞亚群中诱发细胞毒性 溶解单位 靶细胞： K562 Daudi 效应细胞，除去： CD3 Leu19 CD3 Leu19 对照 8 4 10 3.8 BAT6 25 10 20 13 BAT8 28 12.5 26 20实施例4BAT mAb和IL-2在诱发细胞毒性中的协同作用
将BAT mAb和IL-2一起与PBM细胞温育，研究人PBM细胞毒性的诱发。将次最适浓度(1u/ml)的IL-2与浓度逐渐增高的BAT-2mAb一起加入。培养一周后，检测对K562和HT29肿瘤细胞系的细胞毒性。如下表5所示，低浓度的BAT-2在诱发PBM细胞抗两种靶细胞的细胞毒性中与IL-2具有协同作用。
前文已表明INF-α能增强MHC-I类抗原的表达。因此，施用INF-α可能会强化BAT的抗肿瘤效果，这是通过抗各种肿瘤细胞(带有MHCI类抗原)的细胞毒细胞的介导实现的。
表5
BAT-2mAb和IL2在诱导人PBL
细胞毒性中的协同作用 特异性51Cr释放(％) 靶细胞 BAT HT29 K562 (μg/ml) IL-2(1U/ml) - + - + 0 5.8±0.1 7.5±0.3 3.7±0.1 6.9±0.4 2 14.8±1.3 37.6±2.0 12.1±0.4 29.6±1.6 4 16.7±0.6 27.3±1.0 13.3±0.6 18.5±1.2 8 22.0±1.0 15.1±0.6 19.9±0.7 12.5±0.4实施例5BAT-1鼠的免疫刺激作用：a.体外实验
mAb BAT-1表现出在鼠脾细胞中具有类似于在人PBL中所表现的刺激性质。这些性质包括：(i)通过掺入〔3H〕胸腺嘧啶核苷测得，脾细胞在体外增殖加强(表6)；(ii)通过脾细胞与BAT-1和IL-2结合物一起温育得到协同刺激作用(表6)。
表6 cpm〔3H〕胸腺嘧啶核苷×103 BAT-1 IL2 (μg/ml) - 1U/ml 10u/ml - 1.5±0.07 16.0±0.9 67.5±1.6 10 11.0±0.4 32.1±1.5 241.6±17.1 1 12.9±0.8 35.9±3.3 247.8±1.9 0.1 18.1±0.9 51.0±7.3 255.1±18.0 0.001 10.5±0.1 34.1±0.5 215.1±20.8 0.0001 2.6±0.1 13.2±0.9 73.3±5.6
C57BL鼠脾细胞在体外与各种浓度BAT-1及白细胞介素-2(1u和10u/ml)一起温育5天。(iii)在BAT-1存在时鼠脾细胞培养物中细胞毒性增强，有IL-2存在的温育使细胞毒性进一步增强(表7)。
表7 特异性51Cr释放(％)a BAT-1 白细胞介素-2 (ng/ml) - 1u/ml 10u/ml - 7.4 10.0 31.1 100 24.9 31.3 52.4 10 17.4 26.7 52.8 1 12.3 23.9 46.8 0.1 12.2 21.7 45.5
在各种浓度BAT-1及低浓度IL-2存在时体外培养C57BL脾细胞5天诱发的细胞毒性。a.B16黑素瘤细胞用作靶物。效应细胞与靶细胞比率为50∶1
对BAT-1激活脾细胞产生的杀伤作用敏感的鼠肿瘤细胞包括：B16黑素瘤、Lewis肺癌(3LL)、纤维肉瘤(MCA105)、肾细胞癌(MR28)和淋巴瘤(YAC)细胞(表8)。
表8
BAT-1在脾细胞中诱导的
抗鼠肿瘤细胞的细胞毒性
(体外试验) 特异性51Cr释放％a 鼠种 肿瘤靶细胞 BAT-1 细胞 - + C57BL B16黑素瘤 Lewis肺癌(3LL) 纤维肉瘤(MCA105) 5.4 11.2 27.0 13.6 24.0 45.0 BALB/C 淋巴瘤(YAC) 肾细胞癌(MR28) 8 0.1 12.2 5.2a.在BAT-1mAb(1μg/ml)不存在时，体外培养脾细胞5天在效应细胞/靶细胞比率为60∶1时测定细胞毒性b.体内实验
正如下表9所示，BAT-1表现出体内施用时具有免疫刺激作用。这些作用包括：(i)刺激〔3H〕胸腺嘧啶核苷在鼠脾细胞中的掺入，鼠为十天前以BAT-1注射的鼠(表9A)。BAT施用剂量为10μg/只时可获得最大刺激作用(10倍)。(ii)在来自以BAT-1注射鼠的脾细胞中诱发细胞毒性(表9B)。在细胞毒性分析前10天以不同剂量施用BAI-1，诱发对鼠黑素瘤(B16-F10)细胞、肾细胞癌(MR-28)细胞和淋巴瘤(YAC)细胞的细胞毒性。在BAT施用剂量为10μg/只时，可获得最佳效果。
表9
注射BAT mAb的鼠的脾细胞
的增殖和细胞毒性 A[3H]胸腺嘧啶核 苷掺入 B特异性51Cr释放(％±SEM) cpm×10-3±SEM 靶细胞 BAT (μg/只) B16 MR-28 YAC 9.9±1.5 (n＝16) 0 3.9±1.4 (n＝10) 16.0±2.7 (n＝8) 3.3±0.4 (n＝6) 15.3±2.3 (n＝12) p＜0.1 1 13.2±1.4 (n＝6) p＜0.001 31.7±2.8 (n＝8) p＜0.01 16.7±1.6 (n＝6) p＜0.001 20.0±4.0 (n＝14) p＜0.05 10 14.0±1.2 (n＝6) p＜0.001 25.2±2.1 (n＝8) p＜0.02 19.0±2.6 (n＝6) p＜0.001
以不同浓度BAT mAb静脉注射鼠C57BL和BALB/c。10天后测定分离出的脾细胞的细胞毒性和〔3H〕胸腺嘧啶核苷的掺入。用来自C57BL鼠的脾细胞对B16黑素瘤靶细胞进行测试，用来自BALB/c鼠的脾细胞对MR-29和YAC细胞进行测试(效应细胞：靶细胞值为50∶1)。每组包括6-16只鼠，进行3-4次独立的实验。对每只鼠的细胞毒性和〔3H〕胸腺嘧啶核苷掺入测三次并且计算出平均值，结果以几只鼠的平均值±标准误差表示，给出的P值为对照鼠和以BAT处理的动物间的差值。实施例6抗鼠肿瘤的BAT-1的免疫治疗效果
正如表10所示，接种黑素瘤鼠在接种肿瘤细胞后14天施用BAT-1，可以使长有B16、3LL和MCA肿瘤的鼠肺中肺转移瘤数目减少：a.1.使用已建立的肺转移瘤模型，BAT-1在接种B16黑素瘤鼠中消除肺转移瘤
用50×103个B16黑素瘤细胞注射(i.v.)C57BL鼠(表10)。注射后24天在肺中生长有大量转移瘤(实际上已达到汇合)如图7上排所示。
与之相反，如图7下排所示，接种B16黑素瘤后两周以BAT-1(10μg/只)注射的鼠肺实际上没有转移瘤。
图8总结了在上述相似条件下所做的6个相互独立的实验结果。
表10
BAT mAB的抗肿瘤效果
BAT诱发的肺转移瘤减少 肿瘤a B16 3LL MCA 转移瘤数目c BAT处理b - (n＝24)d + (n＝27) - (n＝11) +(n＝11) - (n＝8) - (n＝9) 无 0 25 0 6 0 4 1-10 0 2 0 4 0 5 11-50 8 0 3 1 5 0 ＞250 16 0 8 0 3 0 肺重(gr) 0.803c ±0.26 0.315 ±0.66 1.014 ±0.21 0.364 ±0.06 0.836 ±0.31 0.328 ±0.06
a在第0天接种肿瘤
b在第14天静脉内注射BAT mAb(10μg/只)
c在肿瘤接种后24天，使用Zeiss立体显微镜计数肺转移瘤
d鼠数
e(n)只鼠肺重的平均值±SDa2.在与B16肿瘤接种相关的不同时间注射BAT-1mAb的抗肿瘤效果
正如表11所示，注射黑素瘤细胞的鼠，10-14天后施用BAT-1mAb，发现没有转移瘤且肺重正常。我们注意到，在肿瘤接种后5天及肿瘤施用后19天，鼠肺中转移瘤虽然没有完全消失但数目明显减少。在接种肿瘤细胞的同一天注射BAT-1，没有治疗效果。
表11
在与B16黑素瘤接种相关的
不同时间施用BAT 日期f 鼠数 转移瘤数 肺重(gr) 无 10 155.0±28 0.829±0.19 -6 3 61.0±0.8 0.983±0.1 0 7 148.0±36 0.425±0.05 5 4 0.8±0.5 0.243±0.07 10 4 0.0±0.0 0.240±0.08 14 7 0.0±0.0 0.286±0.03 19 4 2.2±1.3 0.338±0.01 23 4 75.4±44 0.840±0.24
f.施用BAT mAb的日期(天)，相对而言接种肿瘤的日期为第0天。b.使用已建立的肺转移瘤模型，在接种Lewis肺癌(3LL)的鼠中，BAT-1使肺转移瘤消除
除注射2×103个3LL细胞外，实验条件与使用B16黑素瘤的情况相似(见上所述)。图9上排显示了接种3LL的具有大量转移瘤的鼠肺。图9下排显示接种肿瘤细胞14天后以BAT-1处理的鼠肺，正如所看到的，几乎没有转移瘤。c.使用已建立的肺转移瘤模型，在接种MCA纤维肉瘤(MCA105)的鼠中，BAT使肺转移瘤消失
实验条件与上述3LL Lewis肺癌模型中的相似。图10上排显示出接种MCA105的鼠肺具有大量转移瘤。图10下排显示出接种肿瘤后以BAT-1处理的鼠肺，正如所示，几乎没有转移瘤。实施例7BAT-1治愈生长有B16和3LL肿瘤的鼠
如上所述接种B16黑素瘤细胞或3LL细胞的鼠，在接种肿瘤后25-35天死去。与此相反，正如图11所示，肿瘤接种后14天以BAT-1(10μg/只)注射的所有鼠均能生存100多天。大多数动物在随后5个月中没有表现出疾病征兆，且病理检查没有发现转移瘤。实施例8 以BAT-1mAb处理的鼠脾细胞的过继转移(adoptive transfer)
将来自单独以BAT-1mAb处理的鼠，或先注射有B16黑素瘤细胞再以BAT-1mAb处理的鼠的脾细胞转移入受体鼠。该受体鼠以B16黑素瘤细胞接种或以3LL肿瘤细胞接种。正如下表12所示，得自注射有BAT-1mAb鼠的脾细胞的过继转移，使接受该转移脾细胞的鼠的肿瘤消退。当108个鼠脾细胞被过继转移入长有肿瘤的受体鼠时，会获得最有效的治疗，其中脾细胞来自以B16黑素瘤细胞接种且14天后再注射BAT-1的鼠。正如表12所示，这种情况下，如转移瘤数目和肺重的结果所示，能从长有B16肿瘤的受体中完全消除黑素瘤细胞，使长有3LL肿瘤的受体中的肿瘤显著消退。
表12
过继转移诱发肿瘤消退a 接种肿瘤的鼠(受体) B16 3LL 转移脾细胞数 供体组 107 108 107 108 转移瘤数 肺重 转移瘤数 肺重 转移瘤数 肺重 转移瘤数 肺重 A.未处理 ＞250 1.09±0.9e ＞250 1.12±0.04 ＞250 1.05±0.16 ＞250 1.12±0.16 B.BAT-处理的 b 89±10d 0.67±0.04 28±4.3 0.41±0.19 134±15 0.87±0.29 134±19 0.77±0.31 C.注射B16c并用 BAT处理 4±4 0.32±0.01 0±0.0 0.31±0.01 3.6±2.9 0.34±0.06 2.6±1.1 0.36±0.03a向接种肿瘤后14天的受体鼠静脉注射来自三组鼠(A，B，C)的脾细胞b静脉注射BAT(10μg/只)后20天从鼠中转移脾细胞c条件与b相同，除了在BAT施用前14天以B16黑素瘤接种鼠d三只鼠的肺转移瘤平均值±标准误差SDe三只鼠的肺重(gr)平均值±SD
这些结果表明，来自B16接种和以BAT-1处理的鼠的单纯的脾细胞对B16和3LL肿瘤均呈现出抗肿瘤效果。因此，看来BAT-1增强非特异性的细胞效应机制。并且，肿瘤的存在会强化BAT-1诱导这种效应细胞产生的增加。