用于治疗疟疾的氯氟菲醇游离碱及组合物 本发明涉及化合物氯氟菲醇在医药中的应用以及含此化合物的药物制剂。
氯氟菲醇盐酸盐，即下述结构的化合物：是当今世界许多国家市场上的抗疟疾化合物(HALFANTM-SmithKline & French Laboratories Limited)。尽管已经证明该化合物对于治疗疟疾感染病非常有效，但其口服后的吸收差且经常变化，所导致的无定的血浆分布限制了治疗效果，从而潜在地刺激了耐药性的发展。另外，氯氟菲醇盐酸盐的水溶性和脂溶性较差限制了注射制剂的开发，而注射制剂对于治疗严重性疟疾，特别是脑疟具有很高的价值。因此非常需要研制氯氟菲醇的更加始终如一且更有效吸收的制剂。
人们已经发现，游离碱形式的氯氟菲醇制剂(与当今使用的盐酸盐制剂不同)能够满足此要求，而且能够提供治疗疟疾的新的有效制剂。特别地，本发明的制剂含有游离碱形式的氯氟菲醇；可以相信：在所有现有报道中，本发明首次公开了在治疗疟疾感染病中使用其游离碱形式，而市场上只能购得盐酸盐形式。
因此本发明的第一方面是提供了用于非肠道或口服疗法中，特别是用于治疗疟疾感染病的游离碱形式的氯氟菲醇(“氯氟菲醇游离碱”)。
用于非肠道的适合的制剂包括通过静脉内(i.v.)和肌内(i.m.)注射给药的注射制剂。
特别地，这里提供的注射制剂为氯氟菲醇游离碱的类脂制剂。例如，通过静脉内给药的类脂制剂可通过使用Intralipid就地制备，其中将氯氟菲醇游离碱结合到下文描述的市售静脉乳剂地内部脂相中。更优选地，适用于静脉给药的类脂乳剂可从头制备，其中氯氟菲醇游离碱一开始就结合到内部脂相中，然后在适当的外部脂相中乳化。
其它基于类脂的载体包括如由短、中或长链三酸甘油酯(或二酸甘油酯或脂肪酸衍生物)制备的乳剂，所述三酸甘油酯的例子包括已由合成或者天然乳化剂(如卵磷脂)乳化的豆油。另外，这类组合物还可包含如吐温80的表面活性剂。
对于肌内给药，可由水不溶性溶剂制备制剂，所述溶剂包括中或长链的三酸甘油酯、苯甲酸苄酯(或其组合)或其它能在生理相容注射载体中溶解/分散游离碱形式的氯氟菲醇的溶剂。
另一方面，本发明涉及氯氟菲醇游离碱的口服制剂。优选地，制剂是能以软明胶或硬明胶胶囊制剂给药的液体或半固体游离碱制剂。这类制剂可利用常规方法制备，特别包括分散的类脂制剂、自乳化制剂、微乳剂和能分散的固体制剂。特别地，分散的类脂制剂可通过将游离碱溶解在适当的类脂载体中制得，该类脂载体可以包括或不包括能在口服后促进乳化的合成或天然表面活性剂。三酸甘油酯、二酸甘油酯、单酸甘油酯、脂肪酸或脂肪酸、单酸甘油酯、二酸甘油酯或三酸甘油酯的衍生物是可接受的载体。长链脂肪酸、中链和短链脂肪酸是适合的，而长和中链脂肪酸或其三酸甘油酯特别优选。更特别地，优选的制剂是含有氯氟菲醇游离碱、中/长链三酸甘油酯类脂、中/长链单酸/二酸甘油酯类脂和表面活性剂的那些制剂。
适合的中链单酸/二酸甘油酯类脂包括Capmul MCM(中链脂肪酸(辛酸和癸酸)的单酸和二酸甘油酯，可从Karlshamns Lipids，Columbus，Ohio，USA购得)。适合的长链单酸/二酸甘油酯类脂包括Maisine 35-1(由玉米油制得的长链脂肪酸的单酸和二酸甘油酯，可从Gattefosse s.a.，France购得)。
适合的中链三酸甘油酯包括Miglyol 810(分馏椰子油(C8辛酸和C10癸酸)的三酸甘油酯)、Miglyol 812(分馏椰子油(C8-C10脂肪酸)的三酸甘油酯)、Miglyol 818(分馏椰子油(C8-C10脂肪酸)与5％份亚油酸的三酸甘油酯)、Captex 300(辛酸/癸酸(C8-C10脂肪酸)的三酸甘油酯)、Captex 350(含C8-C10-C12脂肪酸的分馏椰子油三酸甘油酯)和Captex 355(辛酸/癸酸(C8-C10脂肪酸)的三酸甘油酯)。适合的长链三酸甘油酯包括花生油、红花油和豆油，其它适合的长链三酸甘油酯将是本领域技术人员熟知的。
适合的类脂自乳化/分散制剂包括：例如，溶解在如花生油或Captex 355以及一种或多种分散剂/表面活性剂中的氯氟菲醇游离碱，所述分散剂/表面活性剂包括多聚乙醇酰化的甘油酯、丙二醇酯、甘油酯、聚乙氧基甘油衍生物、脱水山梨醇酯衍生物、聚氧乙烯脱水山梨醇酯衍生物以及其它本领域技术人员公知的适合的分散剂/表面活性剂。
为了获得适当治疗的氯氟菲醇血浆浓度，更可靠或容易吸收的制剂允许使用单剂量制剂和急性治疗的多剂量制剂。
适合的半固体自乳化/分散制剂包括：例如，溶解在固体/半固体基质中的氯氟菲醇游离碱。所述基质在与水接触时分散或形成微乳液/胶团乳液(micellar)体系。
含游离碱的半固体或固体制剂可以通过将熔融游离碱(初始制备的非晶状或晶体形式)与适当的赋形剂混合而制备的，所述赋形剂在与水接触时分散或形成微乳液/胶团乳液。该方法的优点是能在单剂量中装载多量的药物，制剂的半固体/固体特性限制了潜在的物理变化，而这种变化能在液体制剂中发生。另外，这类制剂能充填到硬或软明胶胶囊中。
适于制备半固体/固体制剂的代表性基质包括但不限于聚乙二醇6000(PEG6000)、GelucireTM药物赋形剂(如含C8-C18甘油酯和C8-C18乙氧基化脂肪酸的氢的化食品级油的Gelucire 44/14，它可从Gattefosse S.A.，36 Chemin de Genas，F-69800，Saint Preist，France购得)或维生素E TPGS(d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯，它可从Eastman Chemicals，Kingsport，TN，USA购得)或其组合。这类制剂还可包括另外的试剂如表面活性剂/分散剂和标准的制剂赋形剂如二氧化硅、乳糖和淀粉以及聚乙烯吡咯烷酮。
另一种口服制剂是本领域技术人员熟知的，它包括：例如，用表面活性剂/共溶剂混合物制得的增溶制剂；喷雾干固体制剂，其中游离碱已被溶解在溶剂中，然后喷雾干燥成固体载体体系；基质制剂，其中基质体系慢慢地溶解/侵蚀，从而缓慢地释放游碱形式的氯氟菲醇。
下述数据和实例用来说明本发明。氯氟菲醇盐酸盐在如花生油三酸甘油酯类脂中的溶解度小于1mg/ml，而晶状氯氟菲醇游离碱却溶于三酸甘油酯，其浓度大于80mg/ml，非晶形式的碱与花生油可混溶，其浓度大于400mg/ml。(为了对比，氯氟菲醇盐酸盐在水溶液中的溶解度大约为1μg/ml)。制备晶状氯氟菲醇(Hf)碱
将4.3g Hf.HCl(相当于4g游离碱)溶解在200ml 100％乙醇中。然后在利用磁性搅拌器激烈搅拌乙醇溶液的同时，慢慢加入10ml 1M NaOH溶液(1.2摩尔当量的Hf)。再搅拌溶液10分钟，之后慢慢加入晶状碱晶种和10ml Milli-Q水。溶液搅拌过夜，然后滤出(Whatman#1滤纸)沉淀，用200ml乙醇/水(50∶50)洗涤。60℃下在P2O5上真空干燥固体24小时。产率一般为75-80％，m.p.81-84℃。
用于表征固体Hf碱的方法包括DSC(确定开始熔化的温度(一般为80-81℃)和熔化热涵(一般为62-64 J/g))、测定任何挥发性溶剂存在的热重分析(干燥至小于0.5％)、NMR、质谱以及HPLC来确定同一性和纯度。制备非晶状氯氟菲醇(Hf)碱
非晶体氯氟菲醇游离碱可由晶状材料制得。将4g晶状Hf碱溶解在大约150ml无水二氯甲烷中，滤进(Whatman#1滤纸)250ml的圆底烧瓶中。50-60℃下在旋转蒸发器上蒸去溶剂，然后60℃下在P2O5上真空干燥非晶状Hf碱。热重分析表明由30℃加热至200℃时的热失重小于0.5％。1.静脉制剂A.使用从市场购得的类脂乳剂(Intralipid，由Baxter Healthcare购 得)制备氯氟菲醇游离碱的静脉制剂。例如，在无菌条件下向 Intralipid中小心滴加适当量(大约为500μl)的氯氟菲醇游离碱 的二甲基甲酰胺溶液(120mg/ml)，与此同时在一清洁的硅烷化 过的玻璃烧杯中迅速旋涡搅拌乳剂，可以制得30ml的批量产品。 在偏光显微镜下检验乳剂以确认不存在任何沉淀物质。B.适用于静脉内给药的含氯氟菲醇游离碱的乳剂也可由下述方法制 备：首先将氯氟菲醇游离碱溶解在适当的类脂相中，然后再制备 乳剂。例如，以每克豆油含40mg Hf碱的浓度制备氯氟菲醇游离 碱，将1.2g蛋磷脂(由Pfanstiehl Laboratories Inc，I1，USA购得) 分散在大约70ml蒸馏水中，然后加入10g豆油(含Hf碱)，并 加入蒸馏水至制剂的最后质量为100g。利用高剪切Silverson实 验室混合乳化器(Silverson Machines Ltd，UK)，首先制备“阶段 性”乳剂，然后使该乳剂通过Model 110-Y Microfluidizer (Microfluidics Corp，MA，USA)循环，上述仪器在大约15,000psi 下工作。通过光子关联能谱法测定所制得的均匀乳剂(每克乳剂 含4mg Hf碱)的最终液滴尺寸大约为250nm。根据需要，可利 用适当试剂如甘油调节乳剂的渗透性并控制PH值。如果需要的 话，通过控制外相的PH或向外相中加入溶解的表面活性剂来防 止外相中不溶的氯氟菲醇盐酸盐的制剂。通过高压灭菌或使其经 过消毒过滤器，使乳剂灭菌。乳剂中Hf碱的浓度可通过改变乳 剂中油的比例和乳剂的药物浓度而优化，其中所述油的比例一般 为1-25％w/w，所述药物浓度为0.1至10mg/ml乳剂。 图1表示对三条禁食的雄性beagle狗通过静脉内施用如上文(A) 中描述的氯氟菲醇游离碱/Intralipid之后的平均氯氟菲醇血浆浓 度与时间的曲线图。氯氟菲醇剂量为1.6mg/kg，氯氟菲醇的血浆 浓度是利用认可的HPLC测定方法测量的。2.口服制剂 氯氟菲醇游离碱的令人惊奇的高脂溶性和混溶性使得能够研制许 多种不同形式的口服制剂。例如，氯氟菲醇可以制备成类脂溶液， 或与水接触时能容易分散的制剂。2.1类脂制剂 本发明制备了许多不同的氯氟菲醇制剂并在beagle狗中进行了 生物利用度评估研究。作为参考，在禁食beagle狗中，报道的 250mg氯氟菲醇盐酸盐片剂(HALFANTM)的绝对生物利用度 (平均±SD，n＝4)为7.1＋4.6％(Humberstone et al.，Pharm.Res.，11，S-292，1994)。例如，本发明进行了一项相对生物利用度交叉研究，与下述制剂进行了比较：(i)标准的市售250mg Hf.HCl片剂(HALFANTM)、(ii)Hf碱花生油溶液(233mg碱溶解在总体积为1ml的花生油中)、(iii)含有233mg Hf碱、400mg花生油和350mg Tagat TO(Th.Goldschmidt AG，Essen，Germany)的自乳化药物释放(SEDD)制剂以及(iv)含有233mg Hf碱、400mg Miglyol 812和350mg Tagat TO的自乳化药物释放(SEDD)制剂。Tagat TO是能提供制剂自乳化的聚乙氧基化的蓖麻油衍生物，Miglyol是中链三酸甘油酯。常规表面活性剂(具有GRAS状态)也可用于本目的。Miglyol 812是能从R.P.Scherer Pty.Ltd购得的常规中链三酸甘油酯。Hf游离碱的所有类脂制剂均装入椭圆形软明胶胶囊(尺寸22mm)。生物利用度研究是通过在4条雄性beagle狗中进行四次、四期、随机交叉研究而进行的。各次处理之间的清除期限是10天。狗在给药前禁食12小时，给药后禁食10小时，然后每间隔24小时喂一次食，而水是随时都有的。通过头部静脉的内在导管，分别在服药前(-15分钟)和服药后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、24、28、48、72、96、120、144和168小时取出静脉血液样品。将血样收集在含4.5mg乙二胺四乙酸二钾的无菌试管中，离心分离血浆并贮存-70℃的冷冻箱中直至分析使用。通过采用UV鉴测的认可HPLC测定方法(Humberstone and CO-workers，J.Pharm.Biomed.Anal.，in press，1995)，测量氯氟菲醇和脱丁基氯氟菲醇(主要代谢物)的血浆浓度。计算的药代动力学参数包括时间从零到无穷大的血浆浓度时间曲线下面的面积(AUC0→∞)，还有最大血浆浓度(Cmax)以及到达的时间Cmax(tmax)。AUC数据是通过下述方法计算的：利用线性梯形规则(linear trapezoidal rule)计算至最后测量的血浆浓度，再加上由最后的测量血浆浓度除以末端清除速率常数(theterminal elimination rate constant)计算得到的外推面积。图2表示对四条禁食的雄性beagle狗施用这些不同口服制剂后的平均(±SD，n＝4)Hf血浆浓度与时间的曲线图，剂量为233mg Hf碱。表1表示本研究总结的药代动力学参数(平均±SD，n＝4)以及相对于250mg Hf HCl片剂的Hf碱制剂的平均AUC比率值。
表1 参数 Hf.HCl 片剂 花生油溶液 Miglyol SEDD 花生油 SEDDCmax(ng/ml)Tmax(h)AUC比AUC比率范围 487±23 0 2.9±0.3 ---- 1467±650 3.4±1.3 3.2±0.9 (2.2-4.6) 1399±921 3.7±1.7 3.2±1.8 (0.4-4.3) 1950±306 2.4±0.7 4.6±1.6 (2.8-6.2)2.2 自乳化制剂
由下列组份制备三种自乳化制剂：
制剂A：中链自乳化制剂(颗粒大小0.1-1μm)
组成(w/w) 成分 有效范围(w/w)
20.0％ 氯氟菲醇碱 0-35％
23.3％ Capmul MCM 10-40％
46.7％ Captex 355 20-85％
10.0％ 吐温80 2-40％
制剂B：中链自微乳化制剂(颗粒大小：＜40nm)
组成(w/w) 成分 有效范围(w/w)
20.0％ 氯氟菲醇碱 10-30％
13.3％ Capmul MCM 10-20％
26.7％ Captex 355 20-40％
40.0％ 吐温80 30-40％
制剂C：长链自乳化制剂(颗粒大小：＜1μm)
组成(w/w) 成分 有效范围(w/w)
20.0％ 氯氟菲醇碱 0-30％
20.0％ Maisine 10-50％
40.0％ 花生油 20-80％
20.0％ 吐温80 10-40％
制剂的颗粒大小是通过制剂A、B和C的“溶出分析”测得的。溶出是在37℃下，利用400ml 0.1N HCl，在标准USP仪器中进行的，搅拌速度为100rpm。一般地，将300l制剂加入到400ml溶出介质中，利用光子关联能谱法(Photon correlation spectroscopy)进行样品的颗粒度分析。
在禁食beagle狗上进一步地测定这三种口服制剂的绝对口服生物利用度。治疗的制剂为(i)中链自乳化制剂(上述制剂A)、(ii)中链自微乳化制剂(上述制剂B)、(iii)长链自乳化制剂(上述制剂C)和(iv)如在上述实例1中描述的方法制得的静脉制剂。
口服剂量为每个软明胶胶囊含200mg氯氟菲醇游离碱，每个软明胶胶囊制剂与80ml水一起给药。氯氟菲醇碱的静脉内剂量(3mg/kg)是在15分钟时间内通过头部静脉的内在导管给药。
通过头部静脉的内在导管，分别在服药前(-15分钟)和静脉给药后0(注入结束)、15、30、60和90分钟以及2、3、4、6、8、10、24、28、32、48、72和96小时取出静脉血液样品；同样在口服给药的-10分钟以及0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、9、10、24、48、72和96小时取出静脉血液样品。将血样收集在含4.5mg乙二胺四乙酸二钾的无菌试管中，离心分离血浆并贮存在-70℃的冷冻箱中直至分析使用。通过利用UV鉴测的认可的HPLC测定方法(Humberstone and co-workers，J.Pharm.Biomed.Anal.，in press，1995)测量氯氟菲醇和脱丁基氯氟菲醇(主要代谢物)的血浆浓度。
计算的药代动力学参数包括静脉内给药时间从-15分钟(注入开始)到无穷大的血浆浓度时间曲线下的面积(AUC-15→∞)以及口服给药时间从零到无穷大的血浆浓度时间曲线下的面积(AUC0→ ∞)，还有最大血浆浓度(Cmax)以及到达该浓度的时间Cmax(tmax)。AUC数据是通过下述方法计算的：利用线性梯形规则计算至最后测量的血浆浓度，再加上由最后的测量血浆浓度除以末端清除速率常数计算得到的外推面积。根据常规方法，以口服和静脉内给药后剂量正规化的AUC值之比计算不同口服制剂的氯氟菲醇的绝对生物利用度。
图3表示口服三种原型脂类制剂后的平均血浆氯氟菲醇浓度与时间的曲线。
表2表示生物利用度研究相关的药物动力学参数，其中对三种口服制剂(各制剂含200mg氯氟菲醇游离碱)与静脉对照制剂进行了比较。
表2参数平均值SD(n＝4) 制剂A 中链自乳化 制剂B 中链自乳化 制剂C 长链自乳化Cmax(ng/ml)Tmax(h)AUC0→∞(ng.h/ml)绝对生物利用度(％) 1018±302 3.25±1.0 20289±2658 39.7±6.6 1856±542 2.4±0.5 33241±13028 63.9±19.9 2567±1074 1.9±0.8 29828±12765 57.1±19.6
相对于含氯氟菲醇盐酸盐并在禁食狗中的绝对生物药效率为7.1±4.6％的市售HALFAN片剂，含氯氟菲醇游离碱的这些脂类制剂的Hf吸收更多，因此单位剂量低一些的氯氟菲醇游离碱制剂将能够达到目前250mg Hf.HCl片剂的类似效果。2.3 半固体制剂
制备了溶解在固体/半固体基质中的氯氟菲醇游离碱半固体自乳化/分散制剂，该制剂在与水环境接触时分散或形成微乳化液/胶团乳液体系。
与均质溶液相比，Hf碱固体/半固体制剂具有更高的单位制剂药物填充的优点，这给服药量和每个治疗剂量的制剂单位的数量带来了潜在的优点。更进一步地，通过加入常规药物赋形剂可以控制半固体/固体制剂的溶出速度是众所周知的，这样可以利用制剂的制备方法来控制和优化口服半固体/固体制剂后Hf的Cmax和Tmax血浆值，因为降低Cmax值(它可能会引起Tmax值的增加)对减小由过高Cmax值引起的不需要的氯氟菲醇副作用是有利的。此种制剂的使用以及调节药物释放速率的方法是本领域熟知的。例如这些方法已在与Gelucire产品有关的技术文献中充分公开了。
典型的制剂含有20％(w/w)氯氟菲醇碱以及高达80％(w/w)的上文所述基质之一。制剂是通过熔化固体晶状氯氟菲醇碱，然后与所选择的基质混合而制备的，或者通过使用非晶状氯氟菲醇碱并在小心加热条件下与所选择的基质混合而制备；接着将熔融的物质装填到硬或软明胶胶囊壳中并迅速冷却。一旦固化，利用X射线衍射技术控制最终产品的晶体特征。这些制剂还可包括其它试剂如上文描述的表面活性剂/分散剂以及常规制剂赋形剂如二氧化硅、乳糖、淀粉和聚乙烯吡咯烷酮。
当在标准USP溶出仪器(在1000rpm搅拌速度、37℃条件下，使用400ml 0.1N HCl操作)中测定含200mg氯氟菲醇碱(1支填料中含80％w/w Gelucire 44/14或维生素E TPGS)的代表性制剂的分散特征时，在胶囊加入到溶解仪器30分钟内溶出仪器中产生清亮的溶液。通过光子关联能谱方法测量分散相的颗粒大小约为30-100nm。这类在加入到溶出仪器中能完全溶解形成的Hf碱且能产生估计颗粒大小为30-100nm的清亮胶团溶液的制剂在性质和功能上与上述能够提供高的Hf绝对口服生物利用度的制剂B(中链自微乳化制剂)类似。因此，这类半固体制剂有望在口服后产生高的药物生物利用度。