一种制备依非巴特的新工艺 一、技术领域
本发明涉及一种环肽的制备工艺，特别涉及一种利用Fmoc-策略固相法制备依非巴特的新工艺。
二、背景技术
Eptifibatide(依非巴特)是一种含有巯基丙酰及六个氨基酸残基的环肽，它是心血管药品Intergrelin的主要活性成分。分子式：C35H49N11O9S2。目前，世界上这一产品的生产厂家是瑞士的Bachem公司，他们采用的两条线路分别是：液相法和Boc-策略固相法。液相法制备工艺包括：1、Gly-OMe与Boc-Lys(Tfa)-OH缩合所得产物Boc-Lys(Tfa)-Gly-OMe与Mpa(Trt)-ONSu反应，得产物Mpa(Trt)-Lys(Tfa)-Gly-OMe，胍基化，皂化，得Mpa(Trt)-Har-Gly-OH(片段一)；2、Z-Asp(OtBu)-OH与Trp-Pro-OMe缩合反应，得产物Asp(OtBu)-Trp-Pro-OMe(片段二)；3、Mpa(Trt)-Har-Gly-OH(片段一)与Asp(OtBu)-Trp-Pro-OH(片段二)缩合、皂化，得产物Mpa(Trt)-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-OH；4、产物与Cys(Trt)-NH2缩合，得产物还原态粗品；5、粗品氧化、环化、纯化至最终产物；固相合成法基本原理：固相合成法是通过固相载体(固体树脂颗粒)结构中的一些具有反应活性的基团和反应物结合形成带有此反应物结构的载体，然后在固液多相反应条件下，将其它反应物逐一连接到载体上，最后采用一定的方法将目标产物从固相载体上解离下来，在经分离鉴定，得到产物。固相合成法的特点是反应结束后产品和试剂容易分离，产品纯度较高，特别适用于多步合成反应。Boc-策略固相法制备工艺包括：1、按照Boc-固相法接肽，依次接Boc-Cys(OMeBzl)-OH，Boc-Pro-OH，Boc-Trp-OH，，Boc-Lys(Fmoc)-OH，得到Boc-Cys(OMeBzl)-及连接后续保护氨基酸的树脂，其间依次脱去Boc-基团2、Piperdine脱Fmoc-保护，洗涤；与3，5-dimethyl Pyrazole carboxamidine反应得3、三氟乙酸(TFA)除Boc-保护，产物与S-Bzl(OMe)-Mpr缩合，反应得还原态粗品；4、粗品氧化、环化、纯化，得最终产品。液相法的优点是避开了使用较昂贵的树脂，但缺点是，每合成一步均需耗费大量的时间纯化，故而合成周期长，大致需要一个多月时间。而固相法克服了工时长的缺点，整个周期只需1-2天的时间。BOC策略固相法也存在二个缺点：1、在将精氨酸转化为高精氨酸过程中是在非均相条件下进行的，反应不易完全。而这种转化程度是否完全在树脂上无法检测跟踪，因此影响粗品的纯度，造成纯化难度加大，产率降低。2、多肽从树脂上洗落时用到了强腐蚀性、剧毒的氟化氢，易造成环境污染，产生一系列环境社会问题。
三、发明内容
本发明需要解决的技术问题：缩短合成周期，使得分离纯化容易进行、合成过程不使用氟化氢；提供一种制备依非巴特的新工艺。
为解决上述的技术问题，提供一种Fmoc-固相肽合成法基本原理：首先将一个用Fmoc基团对α-氨基进行保护的氨基酸通过一个支臂连结到一个不溶性载体上，随后将α-氨基脱保护，用溶液洗涤氨基酸-支臂-树脂.将第二个预先活化地α-氨基保护的氨基酸通过耦联反应连接上去.此外，也可以用α-N端及侧链保护的肽片断代替单个的氨基酸进行耦联反应，缩合反应完成后，用溶液洗涤，重复进行脱保护、耦联，直到得到目的肽.最后将肽-支臂-树脂裂解.这种延长肽链的固相合成法既可采用间断的方法，也可使用连续流动的方法.其工艺步骤是：
(1)C末端氨基酸与树脂结合
得到
(2)Na-Fmoc的脱除、洗涤得到
(3)加入Fmoc-氨基酸-进行耦联、洗涤得到
(4)重复(2)～(3)步骤得到
(5)脱保护基得到
(6)进行裂解后得到多肽
利用Fmoc-固相合成法的基本原理合成Eptifibatide的技术解决方案是：一种制备依非巴特的新工艺，包括以下步骤：
a)Fmoc-Rink Amide AM树脂脱Fmoc-保护后得到H2N-Rink Amide AM树脂；
b)按照固相合成的方法依次连接如下保护氨基酸：Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Asp(tBu)-OH；Fmoc-G1y-OH；得到Fmoc-Cys(Trt)-NH-Rinkd Amide AM树脂以及连接后续保护氨基酸的树脂；
c)其间脱去Fmoc-保护基团，用Kaiser test检测反应进程；
d)利用赖氨酸(H-Lys-OH)为其始原料，制备S-三苯基巯基丙酰-N，N-二叔丁氧羰基-高精氨酸(Mpr(Trt)-Har(Boc)2-OH)：采用H-Lys-OH为起始原料，依次经历：Z基团保护侧链氨基；甲酯化；连接Mpr(trt)；氢化；氨基侧链转换为呱基；去甲酯；得到Mpr(Trt)-Har(Boc)2-OH；
e)加接S-三苯基巯基丙酰-N，N-二叔丁氧羰基-高精氨酸：将Mpr(Trt)-Har(Boc)2-OH连接到NH2-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH-Rink AM树脂上得到Mpr(Trt)-Har(Boc)2-Gly-Asp(otBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH Rink Amide AM树脂；
f)脱切侧链保护基团及树脂得还原态粗品；
g)粗品进行环化反应，并用HPLC跟踪环化反应至完全，然后经HPLC制备即得纯品环七肽Eptifibatide。
本发明的有益效果是：
1、以三苯基巯基丙酸[Mpr(Trt)]保护赖氨酸的氨基部分后，在均相条件下将赖氨酸侧链上的氨基转变为呱基，即将赖氨酸转化为高精氨酸，由于是均相条件，转化过程容易跟踪，而起保护高精氨酸氨基的三苯基巯基丙氨酸中的巯基丙酸正是Eptifibatide的一部分。
2、本发明采用Fmoc-策略，在合成过程中避免了剧毒、强腐蚀性的氟化氢，使生产过程更安全，减轻了环保压力，并使整个合成过程条件更加温和。Fmoc-策略的本来缺点是，Fmoc-保护氨基酸价格高于相应的Boc-保护氨基酸，但大规模生产Fmoc-保护氨基酸，可使生产成本大大下降。
四、附图说明
附图为本发明工艺流程框图
五、具体实施方式
参照附图，一种制备依非巴特的新工艺，其制备工艺步骤是：
a.Fmoc-Rink Amide AM树脂在20％哌啶，DMF，室温20分钟下，脱Fmoc-保护后得到H2N-Rink Amide AM树脂；
b.按照固相合成的方法在H2N-Rink Amide AM树脂上依次进行缩合反应连接如下保护氨基酸：Fmoc-Cys(Trt)-OH；Fmoc-Pro-OH；Fmoc-Trp(Boc)-OH；Fmoc-Asp(tBu)-OH；Fmoc-Gly-OH；(图中未显示)得到Fmoc-Cys(Trt)-NH-Rink Amide AM树脂以及连接后续保护氨基酸的树脂，选择缩合剂为HBTU，HOBt，DMF，反应时间为室温下2小时。
c.其间利用哌啶脱去Fmoc-保护基团，得到NH2-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH-Rink AM树脂，用Kaiser test检测反应进程；
d.制备S-三苯基巯基丙酰-N，N-二叔丁氧羰基-高精氨酸，其步序是：
①H-Lys-OH侧端氨基加Z基团(苯甲氧羰基)保护：赖氨酸溶于碱式碳酸铜的水溶液中，回流30分钟后加入Z-Cl，并用2当量NaOH调PH值；反应1小时后得产物H-Lys(Z)-OH
②H-Lys(Z)-OH甲酯化：将H-Lys(Z)-OH加入CH3OH，滴加SOCl2，并回流4小时，分离纯化后得到H-Lys(Z)-OMe
③连接S-三苯基巯基丙酰：将H-Lys(Z)-OMe及加入Mpr(Trt)溶于DMF中，加入DCC及HOBt后，室温搅拌4小时，分离纯化得Mpr(Trt)-Lys(Z)-OMe。以钯碳为催化剂在室温下氢化12小时得Mpr(Trt)-Lys-OMe
④将赖氨酸侧链上氨基转变为呱基，即将赖氨酸转变为高精氨酸：在
Mpr(Trt)-Lys-OMe的DMF溶液中加入DCC，室温搅拌12小时，分离纯化得Mpr(Trt)-Har(Boc)2-OMe
⑤去甲酯：加入2当量NaOH/CH3OH，经室温，2小时，得到Mpr(Trt)-Har(Boc)2-OH
e.将Mpr(Trt)-Har(Boc)2-OH在HBTU，HOBt，DMF，室温，2小时条件下连接到NH2-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH-Rink AM树脂上得到Mpr(Trt)-Har(Boc)2-Gly-Asp(otBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-NH Rink Amide AM树脂。
f.用Reagent K脱去e中树脂，得还原态粗品Mpr-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys-NH2；
g.粗品加入碘进行氧化、环化反应，得到
并用高压液相色谱分析(HPLC)跟踪环化反应至完全，然后经HPLC制备即得纯品环七肽Eptifibatide。
步骤f中：Reagent K配比(体积比)TFA∶phenol∶H2O∶thioanisole∶1，2-ethanethiol＝82.5∶5∶5∶5∶2.5。