一种嗜硫小红卵菌菌株、菌剂、胞外蛋白及菌剂和胞外蛋白的制备方法及应用技术领域
本发明涉及生物农药技术领域，具体是一种嗜硫小红卵菌菌株、菌剂、胞外蛋白及
菌剂和胞外蛋白的制备方法及应用。
背景技术
辣椒炭疽病(Pepper Anthracnose)是辣椒、甜椒上的一种重要病害。在我国，辣椒
炭疽病主要由红色炭疽病菌(C.gloeosporioides＝Gloeosporiumpiperatum)、黑色炭疽病
菌(C.coccodes＝C.nigrum)、黑点炭疽病菌(C.capsici)和尖孢炭疽菌(C.acutatum
(Simmonds))4种病原菌引起。如果气候高温高湿，辣椒炭疽病流行扩展快、危害时间长，可
引起辣椒幼苗死亡、烂果，导致辣椒减产30％-50％，严重时甚至高达80％，对辣椒品质、产
量及成熟果的加工生产均具有很大影响，是辣椒生产的主要障碍之一。
控制和减少炭疽病对辣椒生产的危害，生产上一般采用化学防治等措施来控制。
但是随着化学杀菌剂的长期大量使用，不但导致病原物产生耐药性和抗药性，而且杀死有
益微生物；同时化学农药随大气循环和水循环扩散到环境中，从而造成环境的污染；再者辣
椒作为食用经济作物，对其外观和内在质量均有特殊的要求，农药残留及对食品卫生的影
响，限制了化学杀菌剂的大规模利用。随着当今世界对农作物数量和质量需求的不断提高、
各国对保护人类生存环境的日益重视、持续农业和持续植物保护观念的不断深入、对环境
问题与无公害食品的生产需求日益增加，利用生物防治辣椒炭疽病已势在必行。
随着生防菌研究的深入以及生防产品的日益更新，人们开始致力于抗菌活性物质
的挖掘。一般将生防菌产生抗菌活性物质的途径分为核糖体合成和非核糖体合成两种。核
糖体合成途径产生的抗菌物质有细菌素、酶类和其它活性蛋白类；非核糖体合成途径产生
的抗菌物质有脂肽类、抗菌肽及其它类别物质诸如大环内酯类、多烯类、酚类物质等产生的
抗菌物质，包括非核糖体合成的脂肽类抗生素、核糖体合成的细菌素等。而在众多活性物质
中，抗菌蛋白质作为生物体抵抗病原菌的入侵，维护生命活动的延续和运行的重要天然物
质，是重要的抗病资源，在防治辣椒炭疽病方面也将会获得广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种嗜硫小红卵菌菌株、菌剂、胞外蛋白及菌剂和胞外蛋
白的制备方法及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种嗜硫小红卵菌菌株，所述嗜硫小红卵菌菌株为嗜硫小红卵菌IV-1
(Rhodovulum sulfidophilum IV-1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC
M 2012369，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年9月26日。
一种嗜硫小红卵菌菌剂，所述嗜硫小红卵菌菌剂采用上述的嗜硫小红卵菌菌株经
活化、种子培养、生产培养、离心后制备得到。
一种上述的嗜硫小红卵菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：
第一步：活化：将嗜硫小红卵菌菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至
红色单菌落出现；
第二步：种子培养：将第一步中培养的红色单菌落接入至血清瓶中，在温度为30℃
～32℃、光照条件为2500Lx～4000Lx、pH为7.0条件下，用光合细菌液体培养基培养至对数
生长期得到菌液；
第三步：生产培养：将第二步中种子培养后得到的菌液接种到生产瓶中，用光合细
菌生产培养基进行生产培养，菌液的接种量为所述光合细菌菌株生产培养基总体积的5％，
在温度为30℃～32℃、光照条件为2500Lx～4000Lx、pH＝7.0条件下，培养至对数生长期；
第四步：离心：将第三步中生产培养得到的菌液进行8000rpm、4℃、15min离心后，
收集上清，然后用0.22μm滤膜进行抽滤得到滤液，即制得嗜硫小红卵菌菌剂。
一种胞外蛋白，所述胞外蛋白从上述的嗜硫小红卵菌菌剂或上述制备方法制备得
到的嗜硫小红卵菌菌剂中提取得到。
一种上述的胞外蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：
第一步：硫酸铵沉淀-盐析：向嗜硫小红卵菌菌剂中加入硫酸铵至85％饱和度，使
所述嗜硫小红卵菌菌剂中的蛋白析出，得到混合液；
第二步：离心：将所述第一步中得到的混合液以11000rpm转速离心30min得到沉
淀，将所述沉淀重悬于PBS缓冲液中得到蛋白重悬液；
第三步：ATKA蛋白纯化系统HiTrap Desalting 5mL脱盐柱脱盐：将所述第二步中
制备得到的蛋白重悬液低温冷冻浓缩后，采用HiTrap Desalting 5mL脱盐柱进行脱盐得到
蛋白粗品；
第四步：ATKA蛋白纯化系统Superdex 200 Increase 10/300GL层析柱层析分离：
将第三步中制得的蛋白粗品采用Superdex 200 Increase 10/300GL层析柱进行层析分离
得到胞外蛋白。
作为本发明再进一步的方案：所述第二步中PBS缓冲液的浓度为0.01M，pH为7.0。
作为本发明再进一步的方案：所述第三步中蛋白重悬液以15％的上样比例进行
HiTrap Desalting 5mL柱脱盐得到蛋白粗品，将所述蛋白粗品稀释至10mg/mL。
作为本发明再进一步的方案：所述第四步中蛋白粗品按2％的上样比例进行
Superdex 200 Increase 10/300GL层析柱层析分离。
作为本发明再进一步的方案：所述第四步中层析分离后获得的各个蛋白组分，然
后进行活性测定，合并活性组分，低温冷冻浓缩即得到胞外蛋白。
一种根据上述的胞外蛋白或权利要求5-9任一的提取方法提取得到的胞外蛋白的
应用，所述胞外蛋白应用于辣椒炭疽病防治。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明从嗜硫小红卵菌IV-1菌剂可以分泌出对辣椒炭疽病菌具有拮抗作用的
胞外蛋白，从而起到对辣椒炭疽病的抑制作用。
2、本发明首次从从嗜硫小红卵菌IV-1菌剂的胞外产物中提取胞外蛋白，其提取工
艺简单、流程短、成本低，提取过程对环境无污染。
3、本发明从嗜硫小红卵菌IV-1菌剂中提取获得的蛋白组分分子量在约50kD，热稳
定性高、耐储藏、对辣椒炭疽病的抑制作用明显。
附图说明
图1为本发明实例1中嗜硫小红卵菌IV-1菌株的菌落图片。
图2为本发明实施例4中辣椒炭疽菌丝平板测定试验图。
图3为本发明实例4中辣椒炭疽病产孢量测定试验图。
图4为本发明实例4中辣椒炭疽病原体果实生测试验图。
图5为本发明实例4中辣椒炭疽病温室生测试验图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
请参阅图1-4，一种嗜硫小红卵菌菌株，所述嗜硫小红卵菌菌株为嗜硫小红卵菌
IV-1(Rhodovulumsulfidophilum IV-1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为
CCTCC M 2012369，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2012年9月26日。
一种嗜硫小红卵菌菌剂，所述嗜硫小红卵菌菌剂采用上述的嗜硫小红卵菌菌株经
活化、种子培养、生产培养、离心后制备得到。
一种上述的嗜硫小红卵菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：
第一步：活化：将嗜硫小红卵菌菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至
红色单菌落出现；
第二步：种子培养：将第一步中培养的红色单菌落接入至血清瓶中，在温度为30℃
～32℃、光照条件为2500Lx～4000Lx、pH为7.0条件下，用光合细菌液体培养基培养至对数
生长期得到菌液；
第三步：生产培养：将第二步中种子培养后得到的菌液接种到生产瓶中，用光合细
菌生产培养基进行生产培养，菌液的接种量为所述光合细菌菌株生产培养基总体积的5％，
在温度为30℃～32℃、光照条件为2500Lx～4000Lx、pH＝7.0条件下，培养至对数生长期；
第四步：离心：将第三步中生产培养得到的菌液进行8000rpm、4℃、15min离心后，
收集上清，然后用0.22μm滤膜进行抽滤得到滤液，即制得嗜硫小红卵菌菌剂。
一种胞外蛋白，所述胞外蛋白从上述的嗜硫小红卵菌菌剂或上述制备方法制备得
到的嗜硫小红卵菌菌剂中提取得到。
一种上述的胞外蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：
第一步：硫酸铵沉淀-盐析：向嗜硫小红卵菌菌剂中加入硫酸铵至85％饱和度，使
所述嗜硫小红卵菌菌剂中的蛋白析出，得到混合液；
第二步：离心：将所述第一步中得到的混合液以11000rpm转速离心30min得到沉
淀，将所述沉淀重悬于PBS缓冲液中得到蛋白重悬液；
第三步：ATKA蛋白纯化系统HiTrap Desalting 5mL脱盐柱脱盐：将所述第二步中
制备得到的蛋白重悬液低温冷冻浓缩后，采用HiTrap Desalting 5mL脱盐柱进行脱盐得到
蛋白粗品；
第四步：ATKA蛋白纯化系统Superdex 200 Increase 10/300GL层析柱层析分离：
将第三步中制得的蛋白粗品采用Superdex 200 Increase 10/300GL层析柱进行层析分离
得到胞外蛋白。
作为本发明再进一步的方案：所述第二步中PBS缓冲液的浓度为0.01M，pH为7.0。
作为本发明再进一步的方案：所述第三步中蛋白重悬液以15％的上样比例进行
HiTrap Desalting 5mL柱脱盐得到蛋白粗品，将所述蛋白粗品稀释至10mg/mL。
作为本发明再进一步的方案：所述第四步中蛋白粗品按2％的上样比例进行
Superdex 200 Increase 10/300GL层析柱层析分离。
作为本发明再进一步的方案：所述第四步中层析分离后获得的各个蛋白组分，然
后进行活性测定，合并活性组分，低温冷冻浓缩即得到胞外蛋白。
一种根据上述的胞外蛋白或权利要求5-9任一的提取方法提取得到的胞外蛋白的
应用，所述胞外蛋白应用于辣椒炭疽病防治。
本发明从嗜硫小红卵菌IV-1菌剂可以分泌出对辣椒炭疽病菌具有拮抗作用的胞
外蛋白，从而对辣椒炭疽病起抑制作用；本发明首次从从嗜硫小红卵菌IV-1菌剂的胞外产
物中提取胞外蛋白，其提取工艺简单、流程短、成本低，提取过程对环境无污染；本发明从嗜
硫小红卵菌IV-1菌剂中提取获得的蛋白组分分子量约为50kD，热稳定性高、耐储藏、对辣椒
炭疽病的抑制作用效果好。
实施例1
一种嗜硫小红卵菌菌株为嗜硫小红卵菌IV-1(Rhodovulum sulfidophilum IV-
1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2012369，保藏单位地址位于中
国武汉大学，保藏日期为2012年9月26日，该菌株被命名为嗜硫小红卵菌IV-1(Rhodovulum
sulfidophilum IV-1)。
参见图1：本发明的嗜硫小红卵菌菌株IV-1，为革兰氏阴性菌，经生理生化鉴定和
分子生物学鉴定为嗜硫小红卵菌，主要生物学特征有：双层固体平板培养基上培养4d～8d，
形成红色的圆形菌落，菌落边缘整齐光滑、菌落直径0.2mm～0.60mm；液体培养基中培养7d
呈深红色；在厌氧和微氧条件下生长良好；生理化特性为V-P反应与甲基红反应阴性、H2S反
应、明胶液化、脲酶试验、吲哚试验均阳性，最适生长温度30℃～32℃，pH＝7。
实施例2
一种嗜硫小红卵菌菌剂，所述嗜硫小红卵菌菌剂采用实施例1的嗜硫小红卵菌菌
株经活化、种子培养、生产培养、离心后制备得到，具体的制备方法，包括以下步骤：
第一步：活化：将嗜硫小红卵菌菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至
红色单菌落出现；
第二步：种子培养：将第一步中培养的红色单菌落接入至血清瓶中，在温度为30℃
～32℃、光照条件为2500Lx～4000Lx、pH为7.0条件下，用光合细菌液体培养基培养至对数
生长期得到菌液；
第三步：生产培养：将第二步中种子培养后得到的菌液接种到生产瓶中，用光合细
菌生产培养基进行生产培养，菌液的接种量为所述光合细菌菌株生产培养基总体积的5％，
在温度为30℃～32℃、光照条件为2500Lx～4000Lx、pH＝7.0条件下，培养至对数生长期；
第四步：离心：将第三步中生产培养得到的菌液进行8000rpm、4℃、15min离心后，
收集上清，然后用0.22μm滤膜进行抽滤得到滤液，即制得嗜硫小红卵菌菌剂。
实施例3
一种胞外蛋白，胞外蛋白从实施例2的嗜硫小红卵菌菌剂提取得到，具体制备方
法，包括以下步骤：
第一步：硫酸铵沉淀-盐析：向嗜硫小红卵菌菌剂中加入硫酸铵至85％饱和度，使
所述嗜硫小红卵菌菌剂中的蛋白析出，得到混合液；
第二步：离心：将所述第一步中得到的混合液以11000rpm转速离心30min得到沉
淀，将所述沉淀重悬于PBS缓冲液中得到蛋白重悬液；PBS缓冲液的浓度为0.01M，pH为7.0；
第三步：ATKA蛋白纯化系统HiTrap Desalting 5mL脱盐柱脱盐：将所述第二步中
制备得到的蛋白重悬液低温冷冻浓缩后，采用HiTrap Desalting 5mL脱盐柱进行脱盐得到
蛋白粗品；蛋白重悬液以15％的上样比例进行HiTrap Desalting 5mL柱脱盐得到蛋白粗
品，将所述蛋白粗品稀释至10mg/mL；
第四步：ATKA蛋白纯化系统Superdex 200 Increase 10/300GL层析柱层析分离：
将第三步中制得的蛋白粗品采用Superdex 200 Increase 10/300GL层析柱进行层析分离
得到胞外蛋白；蛋白粗品按2％的上样比例进行Superdex 200 Increase 10/300GL层析柱
层析分离；层析分离后获得的各个蛋白组分，然后进行活性测定，合并活性组分，低温冷冻
浓缩即得到胞外蛋白。
实施例4：
一种实施例3的胞外蛋白在辣椒炭疽病病防治中的应用，具体的应用方法为：
辣椒炭疽菌丝平板测定试验：以辣椒胶孢炭疽病菌为靶标，采用平板法做抑菌试
验。将胞外蛋白加入10mLPDA培养基中，配制成含终浓度200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μ
g/mL的蛋白平板，并将200μg/mL进行100℃处理15min灭活为对照，接入培养7d的辣椒炭疽
病病菌，28℃培养，重复5次，28℃培养3d后计算蛋白液对炭疽病菌的抑制率。
抑制率＝(菌落直径对照菌落-菌落直径蛋白处理)/菌落直径对照菌落×100％。
参见图2，图2中编号1、2、3、4、5、6分别为灭活蛋白、牛血清蛋白200μg/mL、空白对
照和50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的胞外蛋白组分处理，从图中2中可以知道：胞外蛋白液
在浓度为50μg/mL仍具有一定活性；高温处理后的蛋白丧失对辣椒炭疽病的防治效果。当浓
度达到200μg/mL以上时，对辣椒炭疽病的防治效果达到72.53％。0.01M、pH＝7.0的PBS缓冲
液为空白对照。
辣椒炭疽病产孢量测定试验：以辣椒胶孢炭疽病菌为靶标，将胞外蛋白均匀混入
到20mL马铃薯液体培养基中，调整蛋白终浓度为200μg/mL，接入培养5d的辣椒炭疽病病菌
菌饼(6mm)、28℃、180rpm摇菌培养，培养8天后统计其产孢量。
参见图3，图3中编号1、2、3分别为100mg/mL嘧菌酯、胞外蛋白200μg/mL、空白对照
处理，从图3中可以知道：胞外蛋白处理的产孢量为4.1×104个/ml，与嘧菌酯处理后的产孢
量相当，而空白对照的产孢量达到3.6×106个/ml.。0.01M、pH＝7.0的PBS缓冲液为空白对
照。
辣椒炭疽病原体果实生测试验：采集成熟果，经表面消毒后，用HAMILTON微量注射
器的针头在果面上刺2个接种点，将辣椒叶煎液：胞外蛋白：孢子＝1：1：1比例配制的孢子悬
浮液(浓度为1×106个/mL)，每点注入10μL于果肉中，25～28℃、12h光照/d、RH≥95％的条
件下培养，第7天调查发病情况。病斑直径≥4mm的视为发病，统计发病率，即病斑数占总接
种点的百分率。设4次重复，每重复至少5个果。
参见图4，图4中编号1、2、3分别表示浓度为100mg/mL嘧菌酯、胞外蛋白200μg/mL、
空白对照处理，从图中4中可以发现：对照处理的辣椒炭疽病菌发病率为90％，而胞外蛋白
液处理后辣椒未发病，与嘧菌酯效果相当。0.01M、pH＝7.0的PBS缓冲液为空白对照。
辣椒炭疽病温室生测试验：用10％辣椒叶煎液配制孢子悬浮液(浓度为1×106个/
mL)喷雾接种苗龄为4～5叶期的幼苗，以叶面滴水为宜。接种后立即保湿24h，7d后再重复喷
水保湿24h。鉴定期间幼苗保持在26～28℃、10h光照/d条件下培养，14d后调查。病情分级标
准：0级，无症状病斑；1级，病斑直径1mm，1～2片叶发病；2级，病斑直径大于1mm，2片真叶发
病；3级，有许多大斑，产生孢子或2片以上真叶发病，植株畸形、矮化；4级，有许多大斑，产生
大量孢子，病株濒于枯死或已枯死。
参见图5，图5中编号1、2、3分别表示浓度为100mg/mL嘧菌酯、胞外蛋白200μg/mL、
空白对照处理，从图中4中可以发现：空白对照处理的辣椒已全枯死，胞外蛋白液处理后辣
椒炭疽病防效达75.63％。0.01M、pH＝7.0的PBS缓冲液为空白对照。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方
式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下
做出各种变化。