活性药剂控制释放的多泡 脂质体的制备 发明的背景
1.发明的所属领域
本发明涉及包裹生物活性物质之脂质体的多泡脂质体组合物。更具体地说，本发明涉及生产和使用被包裹物质具有可控制之释放速率的多泡脂质体的方法。
2.相关现有技术
用许多药物进引最佳治疗时常常要求长时间地保持药物水平。例如，用细胞周期特异性抗代谢物进行最佳抗肿瘤治疗时需要长时间地维持细胞毒性药物的水平。阿糖胞苷是一种高疗程依赖性抗肿瘤药物。因为这种药物只在细胞合成DNA时才杀伤之，所以为获得最佳细胞杀伤效果，需要使细胞长时间暴露于治疗浓度的药物中。又鉴于这类药剂在静脉内或皮下给药后地半寿期可能短至几个小时，所以它们的治疗效果也就很成问题。为了使象阿糖胞苷这样的细胞周期特异性药物达到最佳肿瘤细胞杀伤效果。有两个主要要求：首先，必须使肿瘤细胞接触到对宿主没有明显不可逆损害的高浓度药物；其次，必须使肿瘤长时间接触到药物，以保证有最大数目的肿瘤细胞处于细胞增殖的敏感性DNA合成期。
另一类疗程依赖性药物的实例是氨基糖苷类抗生素。例如，丁胺卡那霉素是一种对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌菌株有显著临床抑制活性的氨基糖苷类抗生素。按照现有治疗程序，该药物的给药方法是每天静脉内或肌肉内给药一次或两次。最常用的临床使用剂量是15mg/kg/天，此相当于每天1克的最大推荐剂量。然而，这种给药方法将导致病人对药物的依赖，增加全身用药的毒付作用。因此，用于治疗感染的局部贮存慢释放制剂，例如局限于软组织或骨骼局部区域的药物制剂，与全身治疗用药相比，在增加局部组织药物水平，同时降低或避免游离药物的全身毒性方面应是有其优点的。
特别有用的是受控制的释放制剂，它可用于在几小时，几天、甚至几周时间内释放治疗量的药物。
已被用于提供控制药物释放之组合物的一个手段是脂质体包裹。在几种主要类型的脂质体中，多泡脂质体(Kim，等，Biochim，Biophys.Acta；728：339-348，1983)完全不同于单层脂质体(Huang，Biochemistry，8：334-352，1969；Kim，等，Biochim，Biophys.Acta；646：1-10，1981)、多层脂质体(Bangham，等J.Mol.Biol.，13：238-252，1965)和稳定的多层脂质体(美国专利No.4,522,803)。与单层脂质体相反，多泡脂质体含有多个水性内腔。与多层脂质体不同，多泡脂质体的多个水性腔是不同心的。现有技术中描述了许多生产各种类型单层和多层脂质体的技术；例如，美国专利No.4,522,803(Lenk)；4,310,506(Baldeschwieler)；4,235,871(Papahadjopoulos)；4,224,179(Schneider)；4,078,052(Papahadjopoulos)；4,394,372(Taylor)；4,308,166(Marchetti)；4,485,054(Mezei)和4,508,703(Redziniak)；Szoka，等，1980，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，2：465-508；Liposomes，Marc J.Ostro，Ed.，Marcel-Dekker，Inc.，New York.1983，第一章；Poznansky和Juliano.Pharmacol.Rev.，36：277-236，1984。现有技术也描述了生产多泡脂质体的方法(Kim等，Biochim，Biophys.Acta；728：339-348，1983)。
在Kim等人(Biochim，Biophys.Acta；728：339-348，1983)的方法中，某些小分子例如阿糖胞苷(也简写为Ara-C)的包裹率相对较低，并且被包入囊泡内的分子在生物体液中的释放速率较高。因此，发展了一种使用盐酸化物来减慢被包裹分子在生物体液中之释放速率的组合物(Kim的于1993年2月21日提交的申请序号为No.08/020,483的美国专利部分后读申请)。
进一步的研究显示，可以在制成多泡脂质体之前，借助改变溶解有被封装物质之酸性溶液的性质来控制这些物质在人血浆中从多泡脂质体内释放的速率(Sankavam和Kim的1993年11月1 6日提交的美国专利申请序号No.08/153,657)。在这些研究工作中，发现某些无机酸例如盐酸、硝酸和高氯酸产生了最慢的释放速率，而其他一些酸例如乙酸、三氟乙酸和三氯乙酸则产生中等程度的释放速率。使用二元和三元酸例如硫酸和磷酸可获得最快的释放速率。以这种方法产生的脂质体组合物具有必须使用酸来产生有预期之药物释放动力性质的多泡脂质体的缺点。此外，某些可能提供多泡脂质体中的预期药物释放速率的酸也存在有药物加工方面的问题，例如腐蚀金属容器和生产中所使用的部件。另外，如果不使用酸即可产生在体内环境下实际应用的多泡脂质体，将可能避免潜在的对酸不稳定物质之稳定性方面的问题。
研究已经表明，可以在脂质体中引入质子载体或离子载体以产生膜电位，以调节被包裹之生物学物质从脂质体中向水性环境中释放的速率(美国专利No.5,077,056)。另外，欧洲专利申请EP 0126580中公开了控制药物从囊泡组合物中释放的速率的方法。在后一种方法中，所提供的组合物包括封装在囊泡中的治疗剂的溶液，囊泡则悬浮于含有足够溶质以提供一定克分子渗压浓度的溶液内。这一克分子渗压浓度至少是基本上与囊泡内溶液的克分子渗压浓度呈等渗的，其中溶液的克分子渗压浓度大于生理盐水。囊泡内溶液的克分子渗压浓度保持恒定，而用来悬浮囊泡的溶液的克分子渗压浓度则是可变的。在这些条件下，释放速率随着悬浮介质接近等渗，或者就囊泡内溶液来说仍处于高渗时即逐渐降低。但这种方法的缺点是为了控制释放的速率必须改变向其中释放治疗剂之介质的克分子渗压浓度。这样，就使得这些组合物在实际应用中(例如在医药应用中)受到很大限制，因为在投用药物释放体系的部位，生物体液的克分子渗压浓度实质上是固定的，并且是不能改变的。例如，生物体液如血浆的克分子渗压浓度几乎是与生理盐水(0.9 wt％NaCl水溶液)等渗的，后者克分子渗压浓度为310mOsm。因此，悬浮介质的克分子渗压浓度在理论上应接近于310mOsm。
鉴于已有脂质体组合物及生产方法学的上述限制，有必要发展不依赖于使用酸即可生产稳定的多泡脂质体的技术。本发明旨在实现这一目的。
发明概要
本发明提供生物活性物质控制释放的多泡脂质体(MVL)。通过改变包裹在脂质体内之第一水性组分的克分子渗压浓度来控制生物活性物质向生理环境例如人体内组织中释放的速率。在这种情况下，本发明的MVL因当其被导入体内部位时能提供延迟的治疗药物释放，从而可达到更好的治疗效果。出乎意料的是，随着包裹在脂质体内之第一水性组分的克分子渗压浓度增加，其释放速率则降低。
可通过增加生物学活性物质的浓度，或加入渗透间隔团(osmoticspacer)来增加第一水性组分的克分子渗压浓度。
本发明还提供制造有控制释放特征之多泡脂质体的非酸性方法，从而延长了体内治疗方面的应用。本发明的多泡脂质体具有很高的包裹效率，被包裹物质的受控制的释放速率、明确限定的可再现的大小分布、球形形状、易于调整的平均大小和可调整的内腔大小及数目。
本发明生产多泡脂质囊泡或多泡脂质体的方法包括(a)将至少含有一种两亲性脂质和一种中性脂质的脂质组分溶解在一种或多种有机溶剂中，(b)使脂质组分与含有将被包裹之一种或多种生物学活性物质的不混溶性第一水性组分相混合，(c)由两种不混溶性组分形成油包水型乳剂，(d)将此油包水型乳剂转移并浸没在第二不混溶性水性组分中形成溶剂小球体，以及(e)例如借助蒸发从溶剂小球中除去有机溶剂。可从带有净负电荷的两亲性脂质、甾醇、和两性离子脂质中选择两亲性脂质。可通过增加生物学活性物质的浓度、使用渗透间隔团或联合使用这种两种办法来降低向生物体液中和体内释放被包裹分子的速率。优选实施方案的描述
本发明涉及可允许在生物体液中受控制地释放治疗活性物质的多泡脂质体(MVL)组合物。在这些组合物中，以新的方式控制被包裹之水相的克分子渗压浓度，以在没有氢氯化物或酸存在的情况下实现被包裹之治疗活性物质的延迟释放。通过利用本发明的方法，本领域技术人员可选择性地产生有宽范围治疗活性物质释放速率的MVL。
术语“多泡脂质体”是指人造的，包含多个非同心水性内腔的细微脂质囊泡。相反，以前描述的其他一些脂质体例如单层脂质体只有单一水性腔，而多层脂质体则有多个同心的“洋葱皮”样膜，膜之间是含有水性组分的空隙。
术语“溶剂小球”是指有机溶剂的细微球状小滴，在这些小滴内是多个含有生物学活性药剂之水性组分的更小的小滴。溶剂小球被悬浮并总体上浸没在第二水性组分中。
术语“中性脂质”是指本身没有形成囊泡能力的，并且缺少带电荷的或亲水的“头部”基团的油或脂肪。中性脂质的例子包括但不只限于缺少带电荷的或亲水的“头部”基团的甘油酯、二醇酯、生育酚酯、固醇酯，以及烷和鲨烷。
术语“两亲性脂质”是指那些具有亲水“头部”基团和疏水“尾部”基团，并可能具有膜形成能力的分子。本发明使用的两亲性脂质包括带有净的负电荷、净的正电荷的两亲性脂质、两性离子脂质及固醇。
术语“两性离子脂质”是指处于其等电点时带净零电荷的两亲性脂质。
本文中使用的术语“生物学活性”，当用于描述存在于多泡脂质体之内腔中的物质时，包括如呈现于囊泡中这种形式的具有生物学活性的物质，以及当从囊泡腔中释放后变为有活性的物质(即具有“静止”生物学活性)，例如在与酶相互作用后转变成有治疗活性之活性部分的前体药物。
另外，可被掺入的生物学活性物质包括发挥间接作用的物质。这类物质也可以作为如本文中所述的渗透间隔团。例如，可以存在各种赋形剂和稳定剂。这类物质例如可用于增加特定药物的贮存期限或生物利用度。有许多通常分为赋形剂一类的物质实际上可能具有从很小到相当明显的直接生物学活性。例如，常用的赋形剂甘露糖醇也可以有利尿剂的生物学作用，甚至水也可发挥影响脱水的生物学作用。这些间接活性物质包括水性或非水性溶液、悬浮液及乳液。非水性溶液的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，以及可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇的水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠道外载体包括氯化钠溶液；林格氏葡萄糖溶液、右旋糖溶液以及乳酸化的林格氏溶液。静脉内载体包括流体和营养补充剂。电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖溶液的补充剂)等。也可以存在防腐剂和抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂等其他添加剂，以及惰性气体等(参见RemingtonsPharmaceutical Sciences，16th Ed.，A.Oslo，ed.，Mark，Easton，PA.1980)。本领域普通技术人员可以在不经过过多实验的情况下，能很容易地确定和预计可用于本发明囊泡中的化合物的各种组合。
克分子渗压浓度定义为存在于水溶液中之溶质摩尔浓度的总和。如果溶质以解离的、离子化的或聚集的形式存在，则克分子渗压浓度定义为这些解离的、离子化的或聚集形式的物质之摩尔浓度的总和。溶质包括但不只限于生物学活性物质和渗透间隔团。
术语“渗透间隔团”是指水溶液中的，不是生物学活性物质的，生物学上相容的溶质分子。电解质和非电解质均可发挥渗透间隔团功能。在确定某种特定的分子是有作为渗透间隔团的功能时，或者在确定包裹在多泡脂质体内之渗透间隔团的浓度时，必须考虑在多泡脂质体所处于条件(例如pH)下，分子是否完全或部分地离子化，以及是否这些离子会透过脂质膜(参见The Bimolecular Lipid Bilayer Membrane，MahendraK.Jain van Nostrand Reinhold Co.，1972，pp 470)。本领域技术人员将会理解到，为了能够用于本发明，必须选择适当的渗透间隔团以避免使用证明对使用本发明的MVL进行治疗的病人有毒性或有损害的那些物质。本领域技术人员不须借助过多的实验即可很容易地估计用于本发明的给定之渗透间隔团的适用性。
术语“第一水性组分”是指用于制备多囊泡脂质体之方法中的含有生物学活性物质的水相，其中可存在有渗透间隔团。
术语“第一水性组分的克分子渗压浓度”是指用于制备多囊泡脂质体的含生物学活性物质之水性组分的克分子渗压浓度。
术语“生理上相关的水性环境”是指血浆、血清、脑脊髓液、肌肉内液、皮下液、腹腔液、眼内液或滑液等生物体液，以及与生物体液几乎等渗的0.9％(重量)的盐水或缓冲盐水等储存介质。
控制被包裹之生物学物质向水性环境中释放速率的现有方法均依赖于1)脂质体内酸性溶液的性质，或2)相对于脂质体内水性组分的克分子渗压浓度而言，增加导入了脂质体之外界水性环境的克分子渗压浓度。对后一种方法的逻辑推论是，被包裹物质的释放速率应随着第一水性组分之渗压浓度的增加而增加，同时保持其中导入了脂质体之水性介质克分子渗压浓度的恒定。然而，本发明的令人惊奇地发现却正好与基于现有技术所预期的情况相反，即尽管外部水性介质的克分子渗压浓度仍保持恒定，但实际上被包裹物质的释放速率随着MVL内的内部水性组分之克分子渗压浓度增加而降低。因此，本发明的方法利用被包裹在多囊泡脂质体内第一水性组分的克分子渗压浓度来控制释放速率，其中外部介质的渗透强度接近于生理状态。
此外，当以给定的生物学活性物质浓度生产包含渗透间隔团的MVL时，增加渗透间隔团的浓度将出乎预料地降低所述物质的释放速率。释放速率随着第一水性组分克分子渗压浓度的增加而降低提高了用于各种治疗之多泡脂质体的实用性，并因延长了治疗剂的释放而获得治疗益处。
为了降低被包裹的治疗剂或其他活性药剂从本发明多囊泡脂质体中释放的速率，可通过增加活性物质的浓度或使用渗透间隔团，使MVL内第一水性组分的克分子渗压浓度相对于储存MVL之生理相关水性环境(如0.9％(重量)盐水)或其中导入了MVL之水性环境(体内和体外)的克分子渗压浓度有所增加。相反，可通过降低活性物质的浓度，或者降低渗透间隔团的浓度，甚或不使用渗透间隔团来提高释放速率。第一水性组分的克分子渗压浓度相对于生理相关水性环境也可以是高渗的，这样可达到最适宜地降低脂质体中生物学活性物质之释放速率，同时脂质体包裹方法比在等渗条件下有更大产率。因此，在本发明范围内，就生物学活性剂将被释放入的储存介质或水性环境来说，第一水性组分可以是低渗压、等渗压的或高渗压的。从而本领域技术人员可以常规生产出具有预选择的最适于特定治疗目的的生物学活性物质释放速率的MVL。
因为生理盐水的克分子渗压浓度相似于人血浆或其他体内环境，例如脑脊液、滑液及皮下和肌肉内间隙的，所以可使用盐水作为MVL药物在这样的环境中释放的预测模型。本发明的MVL的优选使用方法是体内注射或植入组织或体腔内(例如作为药物贮库)，并且最好是将其贮存于生理盐水、磷酸盐缓冲盐水等介质或其他克分子渗压浓度相似的介质中。
在本发明的方法中，为了生产MVL，首先将两亲性脂质或中性脂质溶解在用于脂质组分的可挥发性有机溶剂中，向脂质组分中加入含有将被包裹之生物学活性物质的不混溶性第一水性组分，然后例如通过由混合、振荡、声处理、超声波、喷嘴雾化或者合用这些方法所造成的涡流乳化该混合物。然后将整个乳液浸入第二水性组分中并进行机械搅拌，以形成悬浮于第二水性组分中的溶剂小球。所得到的溶剂小球由多个含有生物学活性物质的水性液滴组成(水包油包水型双层乳剂(water-in-oil-water-double emulsion))。
例如使气流通过悬浮液蒸发溶剂，以从小球中除去挥发性有机溶剂。当溶剂被完全蒸发时，即形成多泡脂质体。适用于蒸发溶剂的有代表性的气体包括氮、氦、氩、氧、氢及二氧化碳。另外，也可以利用常用的溶剂排除系统除去有机溶剂，例如用上述气体喷射、于减压下蒸发及喷雾干燥等。
可以使用包括但不只限于葡萄糖、蔗糖、海藻糖、琥珀酸盐、环糊精、精氨酸、半乳糖、甘露糖、麦芽糖、甘露糖醇、甘氨酸、赖氨酸、柠檬酸盐、山梨醇、葡聚糖和其组合在内的渗透间隔团制成多泡脂质体，以控制被包裹之物质从多泡脂质体中释放的速率。被包裹之生物学活性物质的浓度可以从大约几个微微摩尔到大约几百个毫摩尔。生物学活性物质的浓度将依据被治疗的疾病、病人的年龄和一般状况，以及物质的特定性质而不同。在活性物质与其毒性等付作用相关的情况下，生产有较低浓度活性物质的MVL，并利用较高浓度的渗透间隔团可能是合乎需要的。在选择和生产特定的MVL组合物时，本领域技术人员无须进行过多实验即可很容易地判定这些不同参数间的相互关系。
可以使用许多不同类型挥发性疏水溶剂，例如醚、烃、卤代烃、包括但不只限于CO2、NH3及氟利昂在内的超临界液体作为脂质相溶剂。例如乙醚、异丙醚及其他醚、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、卤化醚、酯及其组合均为适用的溶剂。
各种类型的脂质均可用于制造多泡脂质体，条件是至少包括一种中性脂质和至少一种两亲性脂质。可以从(1)带有净的负电荷的两亲性脂质，和(2)固醇，以及(3)两性离子脂质中选择两亲性脂质。例如，脂质组分可包括中性脂质和带有净的负电荷的两亲性脂质。在一个可替代的实施方案中，脂质组分还包括固醇。在另一个实施方案中，脂质还包括固醇和两性离子脂类。
两性离子脂类的例子是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂及其组合。中性脂质的例子是甘油三酯例如三油精、三辛精，植物油例如大豆油、猪脂、牛脂肪、生育酚、角鲨烯和其组合。带净负电荷两亲性脂质的例子是心磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和磷脂酸。带净正电荷两亲性脂的例子是二酰基三甲铵丙烷、二酰基二甲铵丙烷和硬脂酰胺(stearylamine)。
经囊泡包裹将各种生物学活性物质掺入多泡脂质体内。这些物质包括药物、以及其他类型的医药材料例如DNA、RNA、各种类型蛋白质、蛋白质激素例如胰岛素、生长因子、细胞活素、单核因子、淋巴因子，以及作为疫苗接种之免疫原的蛋白质和碳水化合物。
也可以通过囊泡包裹将化妆品应用上有效的生物活性物质掺入到多泡脂质体中。这些活性物质包括润湿剂、维生素、酶及香精。另外，也可以将除草剂、农药、杀真菌剂等农业上应用的生物学活性物质包裹到多泡脂质体中。
表1中给出了可包裹在本发明多泡脂质体中的有代表性的几类生物学活性物质。
表1
抗心绞痛药 抗心律不齐剂 抗哮喘剂
抗生素 抗糖尿病剂 抗真菌剂
抗组胺剂 抗高血压药 抗寄生虫剂
抗肿瘤剂 抗病毒剂 强心苷
除草剂 激素 免疫调节剂
单克隆抗体 神经递质 核酸及类似物
农药 蛋白质和糖蛋白 放射对比剂
放射性核酸金属化物 镇静剂和镇痛剂 类固醇
安神药 疫苗 血管加压剂
香料 化妆品 润湿剂
杀真菌剂
在本发明的多泡脂质体中，适于人体内使用的生物学活性物质的剂量范围包括每平方米体表面积0.001-6,000mg这一范围。当剂量范围超出所给定的范围时，这一范围包括所有生物学活性物质的实际上使用宽度。但对于特定治疗剂来说，可按照前述的易确定其优选浓度。
可按任何一种所期望的途径投用多泡脂质体，例如肿瘤内、关节内、肌肉内、鞘膜内、腹腔内、皮下、静脉内、淋巴内、口腔和粘膜下。可使用本领域已知的方法对多泡脂质体进行修饰，例如借助间隔团分子或肽、靶特异性配体例如抗体和其他受体特异性蛋白质配体直接地或间接地与之连接，以赋予器官或细胞靶特异性(Malone，等，Proc.Nat’l.Acad.Sci，USA，86：6077，1989；Gregoriadis，Immunology Today，11(3)：89，1990；两文献均列为本文参考文献)。
下列实施例举例说明可实践本发明的方式。但应明确的是，这些实施例旨在举例说明本发明，而不是将本发明限制到任何特定材料和其中所用的条件上。
实施例1A.多泡脂质体的制备
步骤1：在干净的玻璃量筒(内径2.5cm×高10.0cm)中加入5mL含有溶于氯仿的46.5微摩尔二油酰磷脂酰胆碱(Avanti Polar Lipids，Birmingham，AL)、10.5微摩尔二棕榈酰磷脂酰甘油(Avanti Polar Lipids，Birmingham，AL)、75微摩尔胆固醇(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo)、9.0微摩尔三油精((Avanti Polar Lipids，Birmingham，AL)的溶液。该溶液称为脂质组分。
步骤2：将溶解于水中的5mL第一水性组分，阿糖胞苷(Upjohn，Kalamazoo，MI)，或硫酸丁胺卡那霉素(Bristol Myers Squibb，Syracuse，NY)加入上述含有脂质组分的玻璃量筒中。所加入的阿糖胞苷浓度为41mM、82mM、164mM、246mM、369mM和410mM。就硫酸丁胺卡那霉素来说，所用的浓度为13mM、26mM、52mM和88mM。硫酸丁胺卡那霉素中，每个丁胺卡那霉素分子相当于含1.8个硫酸根离子。因此，浓度乘上2.8即得到克分子渗压浓度。
步骤3：为了制得油包水型乳剂，用匀浆器(AutoHomoMixer，ModelM，Tokushu Kika，Osaka，Japan)将步骤2的混合物以9000rpm的速度搅拌8分钟。
步骤4：为了制得悬浮于水中的氯仿小球，将20mL含有4％右旋糖和40mM赖氨酸的溶液铺敷在油包水乳液的顶层上，然后以4000rpm的速度混合60秒钟，以形成氯仿小球。
步骤5：为了得到多泡脂质体，将玻璃量筒中的氯仿小球混悬液倒入含有30mL水，葡萄糖(3.5g/100mL)和游离碱赖氨酸(40mM)的1000mL Erlenmeyer烧瓶中。使氮气流以7L/分钟的速度通过烧瓶中的悬液，以于37℃下用20分钟缓慢蒸发氯仿。向烧瓶内加入60mL生理盐水(0.9％氯化钠)。然后以600×g离心10分钟分离脂质体，弃去上清，并将沉淀物再悬浮于50mL生理盐水中。以600×g离心10分钟分离脂质体。弃去上清液，并将沉淀物重新悬浮在盐水中。B.多泡脂质体平均直径的检测
使用Horiba公司(Irvine，CA)的LA-500型粒度大小分析仪，以激光衍射法检测按上述方法制备的多泡脂质体的平均直径。所得脂质体的平均直径为5至20μm。C.阿糖胞苷的血浆释放检测法
本实施例证明随着第一水性组分中药物浓度的增加，37℃人血浆中阿糖胞苷和丁胺卡那霉素的释放速率降低。
将500μL含有阿糖胞苷的多泡脂质体悬液加到1.2mL经过筛选的O型人血浆中，将混合物于37℃保温。以预定的时间间隔取出等分样品，以600×g离心分离作为沉淀物的多泡脂质体，将沉淀物溶解在异丙醇中，并以高压液相层析法检测沉淀部分中阿糖胞苷的量(例如参见U.S.Pharmacopeia XXII，p.376，1 990)。D.丁胺卡那霉素的血浆释放检测法
将500μL含有丁胺卡那霉素的多泡脂质体悬液加到1.2mL筛选的O型人血浆中。37℃保温该混合物并以预期的间隔时间取样。以600×g离心分离作为沉淀物的多泡脂质体。将沉淀物溶解在异丙醇中，并以聚苯乙烯球基荧光免疫检测法(Varma-Nelson，等，Therapeutic DrugMonitoning 13：260-262，1991)检测沉淀部分中的丁胺卡那霉素量。根据按此方法测量的量计算余留的丁胺卡那霉素百分含量。
如可从表2中看到的，以用于第一水性组分中之总药物的百分比表示的包裹率，对药物从在人血浆中保温的多泡脂质体中释放的速率(以半衰期表示)具有显著的影响。采用简单指数衰变模型计算药物释放的半衰期。表2中所示的数据是三次实验的平均值±标准差。相对于等渗条件来说，在高渗条件下阿糖胞苷向人血浆中释放的半衰期基本上没有改变。数据还表明，在生产过程中约高达246mOsm的情况下，随着包裹在多泡脂质体中的生物学活性物质浓度(以mOsm表示)的增加，阿糖胞苷和丁胺卡那霉素的半衰期也在增加。随着包裹在多泡囊泡内的第一水性组分之克分子渗压浓度的增高，不可预见地生产出可在人血浆中长时间内缓慢释放药物的，提高了实用性的脂质体。
表2
药物 克分子渗 平均直径 包裹产率 半衰期
压浓度 (μm) (天)
(mOsm) 阿糖胞苷 41 9.1±0.7 18±3 1.0±0.3
82 10.9±1.1 37±2 1.8±0.3
164 13.3±1.6 51±4 4.6±1.9
246 14.7±1.8 61±5 14.1±1.5
369 16.1±2.4 62±3 12.1±2.7
410 l3.4±2.3 57±2 13.0±3.6 硫酸丁胺 36 7.0±1.2 35±5 6.4±2.7 卡那霉素
73 7.1±1.2 42±5 23.9±1.4
146 7.6±1.1 50±6 39.6±2.9
246 8.3±1.7 66±6 47.3±4.0
实施例2
本实施例证明在一个固定的生物学活性物质浓度下，阿糖胞苷在血浆中的释放速率随着第一水性组分克分子渗压浓度的增加而降低。按照实施例1步骤1至步骤5中所述的方法制备多泡脂质体，但其中步骤2作了如下改动。
步骤2：将5ml水性组分，即以82mM的浓度溶解于水、或3％(重量)葡萄糖或5％(重量)葡萄糖中的阿糖胞苷加到上述含有脂质组分的玻璃量筒中。计算的所得溶液的克分子渗压浓度分别为82、220和335mOsm。
于37℃在人血浆中保温后，检测在不同葡萄糖浓度下，作为保温时间之函数的仍保留在多泡脂质体中的阿糖胞苷百分比。表3中显示含有0、3和5％(重量)葡萄糖的组合物的平均直径、阿糖胞苷的包裹率及在37℃血浆中释放的半衰期。所示数据均为三次实验的平均值±标准差。在生物学活性物质保持固定混度时混入不同浓度的渗透间隔团，葡萄糖，对在人血浆中保温的多泡脂质体释放活性物质的速率产生显著地影响。从表3中所示数据可以看出，阿糖胞苷从多泡脂质体中向人血浆中释放的半衰期随着第一水性组分之克分子渗压浓度的增加而增加。随着第一水性组分的克分子渗压浓度增加到高达约248mOsm，包裹率也得以增加。
表3 [葡萄糖] 克分子渗压 平均直径 包裹率 半衰期 (wt％) 浓度a (μm) (天)
(mOsm)
0 82 10.9±1.1 37±2 1.8±0.3
3 248 16.5±1.6 55±3 18.6±5.7
5 359 17.9±1.1 57±4 17.9±4.3
a克分子渗压浓度包括阿糖胞苷和葡萄糖两者。
实施例3
本实施例证明可在使用生理盐水溶液作为第二水性组分时制备多泡脂质体。按下述步骤制备多泡脂质体。
步骤1：在洁净的玻璃量筒(内径2.5cm×高10.0cm)中放入5mL含有溶于氯仿之46.5微摩尔二油酰基磷脂酰胆碱(Avanti Polar Lipids，Birmingham，AL)、10.5微摩尔二棕榈酰基磷脂酰甘油(Avanti PolarLipids，Birmingham，AL)、75微摩尔胆固醇(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo)、9.0微摩尔三油精(Avanti Polar Lipids，Birmningham，AL)的溶液。该溶液称为标准脂质组分。
步骤2：将5mL第一水性组分，以246mM的浓度溶解于水中的阿糖胞苷(Upjohn，Kalamazoo，MI)加入到上述含有标准脂质组分的玻璃量筒中。
步骤3：为了制取油包水型乳液，使用匀浆器(AutoHomoMixer，Model M，Tokushu Kika，Osaka，Japan)将上述混合物以9000rpm的速度混合8分钟。
步骤4：为了制得悬浮于水中的氯仿小球，将20mL生理盐水(0.9％氯化钠)铺敷在油包水乳液的顶层上，然后以4000rpm的速度混合60秒钟，以形成氯仿小球。如此构成水包油包水型双层乳剂。
步骤5：将玻璃量筒中的氯仿小球混悬液倒入含有30mL生理盐水(0.9％氯化钠)的1000mL Erlenmeyer烧瓶中。使氮气流以7L/分钟的速度通过烧瓶中的悬液，以于37℃下经20分钟蒸发掉氯仿。通过50μm滤器过滤脂质体。以600×g离心10分钟从悬浮液中分离脂质体，弃去上清液，将沉淀物重新悬浮在盐水中。
阿糖胞苷从使用246mOsm阿糖胞苷水溶液和用生理盐水作为第二水性组分制备的多泡脂质体中释放的半衰期为15.7±4.8天。这一数值相似于从使用246mOsm阿糖胞苷水溶液和以葡萄糖-赖氨酸溶液作为第二水性组分制备的多泡脂质体中释放的半衰期(14.1±1.5天，参见表2)。
实施例4
用小鼠进行药物动力学研究，以试验本发明多泡脂质体的体内慢释放性能。
按实施例1所述方法制备多泡脂质体。使用浓度为82mM或246mM的阿糖胞苷水溶液作为第一水性组分。用生理盐水将所得到的多泡脂质体洗两次，以600×g离心l0分钟，并以每mL悬浮液10mg阿糖胞苷的浓度将脂质体贮存于生理盐水中。
小鼠(CDlICR，远亲交配，雌性)腹腔内注射含有2.55±0.25mg阿糖胞苷的多泡脂质体。注射前，取准备注射的含有同样量阿糖胞苷的多泡脂质体悬液等分样品作为0时间样品。
注射后，在长达108小时的不同时间点上断颈处死动物。从腹腔内收集20μL未稀释的腹腔液，加入含有200μL生理盐水的样品试管中。在Eppendorf微量离心机(Brinkman Instruments Westbury，NY)中以最大速度将样品试管离心1分钟。分离上清液和沉淀物。在按上述方法回收20μL腹腔液后，用2～3mL 0.9％NaCl溶液彻底清洗腹腔。所有样品均贮存于-20℃下以备分析用。
用异丙醇溶解沉淀物和上清液部分，以及洗出部分。用高压液相层析法检测各溶解的部分中的阿糖胞苷量(例如参见U.S.Pharmacopeia，XXII：376，1990)。表4中给出沉淀部分中的阿糖胞苷浓度(μg/mL)。将沉淀物和20μL未稀释腹腔液样品之上清液部分中的量，以及腹腔洗出部分中的量加在一起，得到腹腔中阿糖胞苷的总量(μg)，这一数值也在表4中给出。
使用单间格模型和零称重，以RSTRIP程序(MicroMath ScientificSoftware，Salt Lake City，Utah)分析药物动力学数据，即沉淀部分和上清液部分中阿糖胞苷浓度及总量的时间依赖性降低。表4中给出了衰变半衰期。
将表4中所示的82mM(初始阿糖胞苷浓度)制剂与246mM(初始阿糖胞苷浓度)制剂的数据进行比较，表明82mM制剂的阿糖胞苷总量降低比246mM制剂更加迅速。82mM制剂的沉淀部分中的浓度降低也比246mM制剂的更为迅速。因此，这一研究显示，阿糖胞苷释放速率不仅在生理相关环境即如实施例1中所示的人血浆中，而且也在体内随着第一水性组分的克分子渗压浓度增加降低。
表4
在腹腔注射使用含有82mM阿糖胞苷或246mM阿糖胞苷的溶液制备的制剂后不同时间腹腔液的沉淀物部分中阿糖胞苷的浓度，以及腹腔中阿糖胞苷的总量。每组3只动物。 腹腔内 沉淀部分中的浓度 总量 注射后 (μg/mL) (μg) 小时数 82mM 246mM 82mM 246mM
制剂 制剂 制剂 制剂
0 9,380 9,685 2,372 2,791
0.5 9,925±371 6,896±1,083 1，108±67 1,202±48
4 1,115±1,108 13,360±761 150±14 1,493±132
15 1,015±922 11,493 76±58 790±419
64 ND 1,493±132 ND 388±191
108 ND 634±518 ND 58±34
t1/2(r2)1.7(0.974) 29.6(0.904) 0.64(0.989) 13.6(0.892)
ND，未测；t1/2，衰变半衰期(小时)。
虽然为了描述目的给出了本发明的优选实施方案，但可以作出属于本发明待批权利要求范围内的各种改动。