一种用LMH细胞系生产禽腺病毒灭活疫苗的方法技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种用LMH细胞系生产禽腺病毒灭
活疫苗的方法。
背景技术
禽I群腺病毒是家禽常见的感染病原体，呈世界性分布，目前发现所有年龄的家禽
均易感，只是鉴于家禽的品种、年龄所形成的致病力不同。目前发现禽I群腺病毒对鸡具有
强致病性，主要病变表现为包涵体肝炎及心包积液-肝炎综合征，该病可直接引发养鸡场20
～40天龄鸡只出现30％以上的死亡率，此外其临床上也常常与传染性支气管炎病毒，呼肠
孤病毒，H9亚型禽流感病毒等并发感染，导致种蛋鸡出现明显呼吸道病，关节炎，及严重的
产蛋下降及畸形蛋等问题。因此目前该病已经成为严重影响养鸡场生产性能的重大疫病之
一。
禽I群腺病毒中的禽腺病毒4型(FAV-4)目前是世界上的研究热点，其具备高致病
性，可直接引发的心包积液-肝炎综合征(或安卡拉病)，该病于1987年首发于巴基斯坦，在
不到一年的时间内殃及整个巴基斯坦肉鸡养殖企业，之后在科威特、伊朗、前苏联，日本，中
南美洲及墨西哥等地具有发生，甚至该病在鸽子也曾大面积爆发。目前已经证明，禽I群腺
病毒，特别是针对高致病性的FAV-4型可通过灭活疫苗进行有效防控，其中巴基斯坦采取感
染鸡的肝脏匀浆制备的甲醛灭活疫苗防控心包积液-肝炎综合征获得了显著成功。
现有技术对禽I群腺病毒灭活疫苗的制备多采用鸡胚成纤维细胞(CEF)、鸡胚肾细
胞(CEK)、雏鸡肾细胞(CK)、鸡胚肝细胞(CEL)4种原代细胞分离和增殖病毒。但原代肝肾细
胞制备繁琐、易污染、不易转染，且在制备细胞过程中易混入CEF，不利于实验操作。
鸡肝癌细胞系(LMH细胞系)是由一位日本学者在1981年所建立的。通过使用二乙
基亚硝胺对雄性来航鸡长期进行诱导，导致鸡体产生肝癌，再从肝癌组织中分离细胞而得
到的。LMH呈典型上皮细胞特征，该细胞系保持了鸡肝细胞分化的大量表型特征，主要用于
重组腺病毒的构建。公开号为CN 105420198 A的中国专利申请“鸡肝癌细胞系作为鸭瘟病
毒宿主的应用”以鸡肝癌细胞系作为鸭瘟病毒宿主，证明鸡肝癌细胞系适用于病毒培养。
目前虽然有相关研究表明LMH细胞系是禽I群腺病毒较适合的培养系统，但未见优
化LMH细胞系培养禽I群腺病毒条件以获得较高病毒滴度的灭活疫苗相关研究。采用传统的
胰酶-EDTA浓度消化细胞进行传代后细胞活性较差且容易老化，用此种状态下的细胞采取
不同的生产条件来制备禽腺病毒疫苗，进行动物免疫效力试验，得出的结论是疫苗的保护
率很低。此外，采用传统的细胞培养时间、病毒接种浓度、病毒收获时间，均存在病毒滴度不
高，制作的疫苗保护率较低的问题。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种用LMH细胞系生
产禽腺病毒灭活疫苗的方法。该方法生产工艺简单且稳定、易操作，病毒含量高，批间差异
小，质量易控，可显著提高疫苗产量和质量。
本发明提供的技术方案为如下：
本发明提供一种用LMH细胞系生产禽腺病毒灭活疫苗的方法，其包括以下步骤：
(1)传代细胞系LMH细胞的制备：将LMH细胞用胰酶-EDTA消化液进行消化分散传
代，加入DMEM培养液在37℃、5％CO2培养箱中培养，直至形成生长良好的细胞单层；
(2)种毒繁殖：用禽腺病毒4型毒种按终体积1:200接种到步骤(1)制备的LMH细胞
单层中，并在37℃吸附30分钟后吸弃病毒液，加入细胞维持液，于37℃、5％CO2培养58±2小
时，直至细胞病变CPE达80％以上，收获细胞毒液；
(3)病毒收集、浓缩和纯化：将收获的细胞毒液于-20℃反复冻融两次，5000rpm，4
℃离心10min后收集上清液，即病毒原液，将病毒原液通过50K的中空纤维柱超滤浓缩10倍，
即为制苗病毒液；
(4)疫苗成品的配制：往制苗病毒液中加入终浓度为0.1～0.2％(v/v)的福尔马林
进行灭活，即为疫苗抗原；然后将疫苗抗原乳化制成乳剂型灭活疫苗。
进一步地，上述步骤(1)的DMEM培养液中含5～10％(v/v)新生牛血清、1.0～1.2％
(v/v)双抗和0.5～2.5％(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸，所述的双抗为含100IU/mL的青霉素和
10mg/mL的链霉素溶液。
进一步地，上述步骤(1)中胰酶-EDTA消化液为含有0.025％(m/v)的胰酶，0.02％
(m/v)EDTA的Hank’s溶液。
进一步地，上述步骤(2)的细胞维持液为包含有0.5～1.5％(v/v)新生牛血清、0.2
～0.5％(m/v)谷氨酰胺、1.0～1.2％(v/v)双抗、1～3％(v/v)脂质体复合物和1～2％(m/v)
羟乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培养液，所述的双抗为含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的链霉素
溶液。
进一步地，所述步骤(2)的细胞维持液为还包含有0.05～0.2％(m/v)硫辛酸。
其中，所述的脂质体复合物为内部包含过氧化氢酶的复合物。所述的脂质体复合
物的制备包括以下步骤：
(1)称取0.2g磷脂酰胆碱、0.08g胆固醇、0.04g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于
50mL乙醇，超声处理5min；
(2)然后在28℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发，除去乙醇，静置30min，加入100mL pH
为7.4的磷酸盐缓冲溶液，该磷酸盐缓冲溶液中含0.2～0.6％(m/v)过氧化氢酶，在35℃水
浴中振荡水化反应约1h，得脂质体悬浮液；
(3)使用注射器式滤器调整脂质体悬浮液的粒径至150～200nm，得到内部包含有
过氧化氢酶的脂质体。
进一步地，所述步骤(3)中病毒原液经浓缩后，进行病毒含量的测定，测得每0.1mL
制苗病毒液含量为108.0TCID50以上，方可用于制备疫苗。
进一步地，所述步骤(4)将疫苗抗原乳化制成乳剂型灭活疫苗具体为：
(1)油相制备：取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司盘-80 4份，先将白油缓慢
加温，加入司盘-80和硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌
备用；
(2)水相制备：取疫苗抗原96份加入灭菌后的吐温-80 4份，开始搅拌，使吐温-80
完全溶解为止，制成水相；
(3)乳化：将水相加入到油相中，利用IKA乳化剂进行乳化，16000rpm，乳化5分钟即
可；
(4)分装：将制备的疫苗按照每瓶250mL进行分装。
本发明人在试验中发现，采用传统使用的胰酶-EDTA消化液(0.25％(m/v)胰酶-
0.02％(m/v)EDTA)对LMH细胞进行消化传代培养，传代后的细胞活性较差且容易老化，制得
的禽腺病毒疫苗效价较低，保护效果差。将消化液中胰酶的浓度降低10倍，即使用质量体积
比为0.025％胰酶-0.02％EDTA消化液，对LMH贴壁细胞消化更彻底，细胞传代既稳定又生长
良好。
同时，本发明人发现在LMH细胞单层进行禽腺病毒4型毒种接毒后，加入常规的细
胞维持液，LMH细胞很快出现死亡，导致最终制得的禽腺病毒疫苗效价较低。本发明人通过
大量的试验和筛选对细胞维持液的配方进行改进，发现在低含量新生牛血清的DMEM培养液
中加入一定量的过氧化氢酶脂质体复合物和硫辛酸，可显著改善LMH细胞的生长状态，避免
LMH细胞过早出现死亡，从而获得较高病毒滴度的制苗病毒液。经接毒后的细胞培养58±2
小时得到的病毒液中病毒的含量高达107.0TCID50以上，进一步经浓缩后，病毒的含量高达
108.0TCID50以上，远远高于采用常规鸡胚法及原代细胞法制备禽腺病毒疫苗的效价，取得了
意料不到的技术效果。
同时，采用的LMH细胞背景清楚，无外源病原，易增殖性，非常适用生物反应器进行
大规模培养，符合未来疫苗生产趋势，并且细胞活性高，半抗原高度澄清，容易进行浓缩处
理，非常适合进行高抗原滴度的优质灭活疫苗生产。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
(1)采用本发明疫苗制备方法可以稳定获得高滴度抗原，其制备的抗原半成品
TCID50可以稳定达到107/0.1mL，病毒滴度是常规鸡胚法及原代细胞法的10倍以上，如采用
生物反应器进行病毒增殖，其病毒滴度届时可以达到100倍水平。从经济效益角度评估，用
此生产工艺对以后规模化生产该疫苗不仅能大大降低生产成本，而且疫苗免疫效果远比传
统好。
(2)本发明通过优化细胞培养液的配方，创造性地添加过氧化氢酶脂质体复合物
和硫辛酸，使接毒后的LMH细胞在低含量新生牛血清的DMEM培养液中仍能保持良好的生长
状态，避免细胞过早出现死亡，从而提高制毒疫苗的效价，并在较短的培养时间58±2小时，
即可收获滴度较高的病毒液，大大节约了生产成本，提高生产效率。
(3)本发明制备的疫苗保护率高，在疫苗的保护试验中，分别按照三种剂量0.3mL/
只、0.5mL/只和1.0mL/只进行注射免疫，疫苗保护率均达到了100％，表明本发明生产的禽
腺病毒4型灭活疫苗免疫效力高，对禽腺病毒4型具有完全的免疫保护作用。
具体实施方式
以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。
实施例1 脂质体复合物的制备：
(1)称取0.2g磷脂酰胆碱、0.08g胆固醇、0.04g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于
50mL乙醇，超声处理5min；
(2)然后在28℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发，除去乙醇，静置30min，加入100mL pH
为7.4含0.5％(m/v)过氧化氢酶的磷酸盐缓冲溶液，在35℃水浴中振荡水化反应约1h，得脂
质体悬浮液；
(3)使用注射器式滤器调整脂质体悬浮液的粒径至150nm，得到内部包含有过氧化
氢酶的脂质体。
实施例2 消化LMH细胞最佳胰酶-EDTA浓度筛选和LMH细胞最佳培养时间的筛选
将LMH细胞(ATCC LMH-CRL-2117)，分别用质量体积比为0.25％、0.05％、0.025％
的胰酶-EDTA(0.02％)消化分散；加入含5～10％(v/v)新生牛血清、1.0～1.2％(v/v)双抗
和0.5～2.5％(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培养液在37℃、5％CO2培养箱中培养至细胞
单层，用于传代。
将三种不同浓度胰酶-EDTA消化得到的LMH细胞分别传代，不同代次细胞生长情况
见表1。用质量体积比为0.025％胰酶-EDTA(0.02％)消化LMH细胞于37℃、5％CO2培养箱中
培养不同时间，对其细胞用MTT法进行细胞活性测定和用红细胞计数板对细胞进行计数，结
果见表2。
表1 不同浓度胰酶-EDTA消化LMH细胞传代情况
表2 培养不同时间细胞活性和细胞计数
结果表明：(1)用质量体积比为0.025％胰酶-EDTA(0.02％)消化传代的细胞比传
统上常用的0.25％胰酶-EDTA(0.02％)消化传代生长良好，且传代稳定性要比传统的胰酶
浓度强。
(2)细胞活性和细胞计数结果表明，采用质量体积比为0.025％胰酶-EDTA
(0.02％)浓度消化传代的细胞在培养48～60h之间细胞活性最高，且细胞数量跟72h相差不
大。
实施例3 禽腺病毒4型的最佳接种浓度筛选
将铺满单层的LMH细胞按不同浓度稀释进行禽腺病毒4型接种，分别于接毒后至细
胞出现80％左右细胞病变时，收获细胞毒液于-20℃反复冻融两次，5000rpm，4℃离心10min
后收集上清液，即病毒原液，测定其TCID50，其结果见表3。
表3 禽腺病毒4型接种浓度的筛选
结果表明：采用不同稀释浓度的病毒液进行接种，细胞出现病变的时间有很大差
异且其细胞毒液的效价有很大差异，由上表可知采用200倍稀释病毒进行接种并培养58小
时，病毒的效价最高。
实施例4 禽腺病毒4型的最佳收获时间筛选
采用200倍稀释病毒液接种铺满单层的LMH细胞，不同时间收获其细胞病毒液，测
定不同时间收获的病毒液TCID50，从而确定其最佳收获病毒时间，结果见表4。
表4 不同时间收获的病毒液TCID50
结果表明：以相同稀释浓度的病毒液接种LMH细胞后，分不同时间收获细胞病毒
液，并对不同时间阶段收获的细胞病毒液进行TCID50病毒含量测定；同时根据细胞接毒后的
细胞病变程度，得出60h收获细胞毒液是最佳收获时间。
实施例5 禽腺病毒4型制苗病毒液的制备
(1)传代细胞系LMH细胞的制备：将LMH细胞用质量体积比为0.025％的胰酶-
0.02％的EDTA消化分散传代，加入含10％(v/v)新生牛血清、1.0％(v/v)双抗和2.0％(m/v)
羟乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培养液，在37℃、5％CO2培养箱中培养，直至形成生长良好的细胞
单层，所述的双抗为含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的链霉素溶液。
(2)种毒繁殖：用禽腺病毒4型毒种按终体积1:200接种到步骤(1)制备的LMH细胞
中，并在37℃吸附30分钟后吸弃病毒液，加入含有1.0％(v/v)新生牛血清、0.4％(m/v)谷氨
酰胺、1.0％(v/v)双抗、2.5％(v/v)脂质体复合物、0.15％(m/v)硫辛酸和2％(m/v)羟乙基
哌嗪乙磺酸的DMEM培养液，于37℃、5％CO2培养至60小时，此时，细胞病变CPE达80％以上，
收获细胞毒液。
(3)病毒收集、浓缩和纯化：将收获细胞毒液于-20℃反复冻融两次，5000rpm，4℃
离心10min后收集上清液，即病毒原液，将病毒原液通过50K的中空纤维柱超滤浓缩10倍，即
为制苗病毒液。
(4)病毒含量测定：将制苗病毒液用DMEM培养液做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10
-7、10-8、10-95个稀释度接种48孔铺满单层LMH细胞培养板，每个稀释度重复5孔，同时设立阴
性对照细胞孔；每孔0.1mL，37℃吸附30min后，补加细胞维持液0.3mL，于37℃、5％CO2培养
120小时，观察细胞病变(CPE)，计算TCID50，每0.1mL禽腺病毒4型病毒含量≥108.0TCID50方
可用于制备疫苗。
(5)禽腺病毒4型的灭活：将病毒含量符合要求的制苗病毒液导入灭活罐内，加入
福尔马林溶液，充分混合，福尔马林溶液的终浓度为0.1％(v/v)，37℃灭活16小时(以罐内
温度达到37℃开始计时)后取出，置6℃保存，应不超过1个月。
(6)禽腺病毒4型病毒灭活检验：取灭活检验的样品，用DMEM营养液以10-1、10-2、10
-3三个比例稀释待检样品，同时设立同样稀释比例的灭活前病毒样品用于阳性对照，分别接
种于48孔LMH细胞单层细胞，每组重复接种5孔，每孔0.4mL 37℃、5％CO2培养96小时。灭活
样品各组稀释度孔中均没有出现细胞病变，阳性对照组各稀释度孔中细胞病变均明显，达
80％以上，判定为灭活检验合格。
实施例6 疫苗成品的配制
本发明可用于配制灭活疫苗的条件为：每0.1mL禽腺病毒4型病毒含量≥
108.0TCID50方可用于制备疫苗，所述灭活疫苗的制备具体为：
(1)油相制备：取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司盘-80 4份，先将白油缓慢
加温，加入司盘-80和硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌
备用；
(2)水相制备：取实施例5制得的禽腺病毒4型灭活疫苗抗原96份加入灭菌后的吐
温-80 4份，开始搅拌，使吐温-80完全溶解为止，制成水相；
(3)乳化：将水相加入到油相中，利用IKA乳化剂进行乳化，16000rpm，乳化5分钟即
可；
(4)分装：将制备的疫苗按照每瓶250mL进行分装。
对比例1、2、3禽腺病毒4型制苗病毒液的制备
对比例1禽腺病毒4型制苗病毒液的制备步骤与实施例5基本相同，区别在于，所述
的步骤(2)种毒繁殖中，LMH细胞接入毒种后，加入的细胞维持液含有过氧化氢酶，而不是过
氧化氢酶脂质体，即将过氧化氢酶直接加入到细胞维持液中。
对比例2禽腺病毒4型制苗病毒液的制备步骤与实施例5基本相同，区别在于，所述
的步骤(2)种毒繁殖中，LMH细胞接入毒种后，加入的细胞维持液不含过氧化氢酶脂质体。
对比例3禽腺病毒4型制苗病毒液的制备步骤与实施例5基本相同，区别在于，所述
的步骤(2)种毒繁殖中，LMH细胞接入毒种后，加入的细胞维持液不含硫辛酸。
并观察按对比例1-3所述的方法制备禽腺病毒4型制苗病毒液，不同时间收获的病
毒液TCID50，并与实施例5的方法制备禽腺病毒4型制苗病毒液比较，见下表5。
表5 不同时间收获的病毒液TCID50
由对比例1可知，将过氧化氢酶直接加入到细胞维持液中，LMH细胞在较短时间内
出现病变，培养36h后，CPE比例达到65％，48h后达到95％，收获病毒液中病毒的含量远低于
实施例5制得病毒液中病毒的含量。由对比例2可知，细胞维持液中不含过氧化氢酶脂质体，
LMH细胞在最短时间内出现病变，培养36h后，CPE比例达到85％，收获病毒液的病毒的含量
最低。由对比例3可知，细胞维持液中不含硫辛酸，LMH细胞出现病变的时间与对比例1相当，
培养36h后，CPE比例达到60％，48h后达到85％。以上结果表明在细胞培养液中加入过氧化
氢酶脂质体和硫辛酸可显著改善LMH细胞接毒后的生长状态，延缓其出现细胞病变，提高病
毒疫苗的效价。
实施例7 灭活疫苗成品检验
(1)性状
①外观：为乳白色乳剂。
②剂型：油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第一滴外，均不扩
散。
③稳定性：吸取疫苗10毫升加入离心管中，以3000rpm离心15分钟，管底析出的水
相应≤0.5mL。
④粘度：用出口内径为1.2mm的1.0mL吸管，吸取25℃左右1.0mL，令其垂直自然流
出，记录流出0.4mL所需的时间，应不超过8秒。
(2)无菌检验：取成品接种硫乙醇酸盐培养基小管和酪胨琼脂各两支，每支0.2mL，
一支置37℃培养，一支置25℃培养，观察3～5日，应纯粹，无菌生长。
(3)安全检验：用7日龄SPF鸡10只，每只肌肉或颈部皮下注射疫苗1mL，观察14日，
结果试验鸡均健活，无任何局部和全身不良反应。
(4)甲醛含量测定：
①对照品溶液的制备：取已标定的甲醛溶液适量，配成每1.0mL含甲醛1.0mg的溶
液，精密量取5.0mL置50mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。
②被测样本的制备：用5.0mL刻度吸管量取被检品5.0mL，置50mL量瓶中，用20％吐
温-80乙醇溶液10mL，分次洗涤吸管，洗液并入50mL量瓶中，摇匀，加水稀释至刻度，强烈振
摇，静止分层，下层液如果不澄清，滤过，弃去初滤液，取澄清续滤液，即得。
③测定法：精密吸取对照品溶液和被检品溶液各0.5mL，分别加醋酸-醋酸铵缓冲
液10mL，乙酰丙酮试液10mL，置60℃恒温水浴15分钟，冷水冷却5分钟，放置20分钟后，按紫
外-可见分光光度计法，在410nm的波长处测定吸收度，计算即得。甲醛溶液(40％)含量％
(g/mL)＝0.25×(被检样品溶液的吸收度/对照样本溶液的吸收度)×100％。甲醛含量符合
国家标准，即检验合格。
(5)装量检查：取供试品3个，使之恢复至室温，开启时注意避免损失。参照装量检
查使用量取参考表，用经标化的吸管、注射器或量筒进行装量检查。
实施例8 疫苗效力试验
取4日龄清远麻黄鸡55只，试验组每组15只，分别用0.3mL/只(A组)、0.5mL/只(B
组)和1.0mL/只(C组)进行肌肉注射疫苗，剩余10只鸡进行肌肉注射生理盐水，作为对照组。
免疫后21日，用禽腺病毒4型病毒细胞液(约含106.5/0.1mL)进行攻毒，每只肌肉注射1.0mL。
观察7天，每天详细记录免疫鸡和对照鸡的发病情况。
结果显示：对照组鸡攻毒7天内全部发病，死亡8只，不同剂量免疫组攻毒7天内没
有出现任何症状；且死亡鸡及发病鸡(攻毒后7天进行剖检)剖检病理变化：均出现典型的心
包积液、肝脏肿大、典型的胰腺炎。攻毒7日后对免疫鸡只进行剖检，未出现由禽腺病毒4型
引起的一些病理变化，结果见表6。
表6 各组别攻毒结果
组别
数量
免疫途径
攻毒剂量
攻毒保护率
A
15
肌肉注射
1mL/只
15/15(100％)
B
15
肌肉注射
1mL/只
15/15(100％)
C
15
肌肉注射
1mL/只
15/15(100％)
对照组
10
/
1mL/只
10/10发病(100％)，8/10死亡(80％)
由上表可知，使用本发明制备的灭活疫苗分别按照三种剂量0.3mL/只、0.5mL/只
和1.0mL/只进行注射免疫，疫苗保护率均达到了100％，表明本发明生产的禽腺病毒4型灭
活疫苗免疫效力高，对禽腺病毒4型具有完全的免疫保护作用。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对
本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的
普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改
进和润饰也应视为本发明的保护范围。