CaV2.1通道在Ca2+依赖性缺血模型中调节脑组织梗塞面积中的作用技术领域：
本发明涉及生物医药领域，特别是涉及CaV2.1通道在Ca2+依赖性缺血模型中调节
脑组织梗塞面积中的作用。
背景技术：
细胞膜去极化时，电压门控Ca2+(CaV)通道允许Ca2+进入到细胞内。在神经系统中，
CaV通道在通过提高细胞内Ca2+浓度调节不同的神经元功能中起到了重要的作用。CaV通道
是一种复杂的分子复合物，由α1，β，α2-δ和γ亚基组成。α1亚基主导通道本身的功能以及基
本特性。在突触前终端，有三大CaV2通道类型，CaV2.1(P/Q型)，CaV2.2(N型)和CaV2.3(R型)，这三
种类型广泛表达于中枢神经系统和参与Ca2+依赖的胞吐释放神经递质。鉴于CaV2通道的关
键作用在于控制特定神经递质的产生和释放，突触前CaV2通道的表达、定位、结构或调制发
生缺陷都可能会导致异常的突触信号和导致神经网络功能障碍的各种模式。
Ca2+浓度的增加在缺血性神经元损伤的发病机理中起着重要的作用，缺血时，Ca2+
浓度通过细胞外空间Ca2+的内流和细胞内存储Ca2+的释放而升高。CaV2通道作为重要的Ca2+
内流路线，他们参与缺血性神经元损伤，这在病理生理学方面至关重要的。
为了检测CaV2.1通道的功能以及与CaV2.1通道有关的疾病发生过程，小鼠遗传学
的研究可能是有用的。小鼠Cacna1a基因发生突变可编码出CaV2.1通道成孔的α1单元，突变
包括以CaV2.1电流缺乏的基因敲除菌株和包涵表现共济失调现象为常见症状的自发突变。
Rolling Nagoya小鼠在电压测量S4段第三重复突变，Leaner mice在剪接供体序列上发生
突变，从而改变C-末端序列。CaV2.1通道的Rolling Nagoya型突变激活时有一个更低的电
压灵敏度，导致小脑受损突触的传递。CaV2.1通道的leaner型突变导致了小脑中通道的低
密度表达。以往的研究也表明，leaner突变型(60％)小鼠的浦肯野细胞中P型Ca2+电流的下
降量比Rolling Nagoya(40％)突变型小鼠的要大。应用CaV2.1通道α1亚基(CaV2.1α1)基因
敲除小鼠来检测CaV2.1通道和缺血性神经损伤两者之间的关系是不可能的，因为大多数的
小鼠断奶不生存。尽管Rolling Nagoya和Leaner mice两种突变型小鼠表现出正常的寿命，
但是它们共济失调的严重程度显著不同，且Leaner mice要更严重些。由于Ca2+信号的精确
调节对于神经细胞突起是非常重要的，通过不同的CaV2.1通道突变体改变Ca2+离子流能够
引起神经元和电路不同的功能障碍。 因此，通过Rolling Nagoya，Leaner mice和野生型小
鼠的比较，可以阐明CaV2.1通道在缺血性神经元损伤中的生理作用。
发明内容：
在神经系统中，CaV通道在通过提高细胞内钙离子浓度以调节不用神经元功能中
起到了重要的作用。CaV2通道的关键作用在于控制特定的神经递质的产生和释放，突触前
CaV2通道的表达、定位或结构发生缺陷都可能会导致突触型号发生异常和神经网络功能的
障碍。钙离子浓度的增加在缺血性神经元损伤的发病机制中起着重要的作用，在缺血环境
中，钙离子浓度通过胞外空间内的钙离子内流和胞内储存的钙离子释放而获得调节。CaV2
通道作为重要的钙离子内流路线，参与缺血性神经损伤。
鉴于以上所述所有技术，本发明第一方面提供CaV2.1通道α亚基mRNA在小鼠大脑
内部的表达情况。
由于α亚基主导CaV2通道的功能和基本特性，CaV2通道的功能缺陷都可能会导致缺
血性神经元损伤。所以对CaV2.1通道α亚基mRNA在小鼠大脑内部表达情况的研究，对于我们
对CaV2.1通道在缺血性模型中所起作用的研究具有实际应用价值。
本发明第二方面提供在体内缺血模型中α亚基的突变能降低梗死体积。
CaV2通道的关键作用在于控制特定神经递质的产生和释放，CaV2通道的表达、定
位、结构发生缺陷都可能导致异常的突触型号和导致神经网络功能障碍。我们通过分析比
较Rolling Nagoya和Leaner mice体内缺血模型中脑损伤带来的影响，发现其梗死面积都
是要低于野生型的，这两种小鼠模型中都有明显的保护机制。
本发明第三方面提供CaV2.1通道α亚基突变小鼠在体外缺血模型中钙离子浓度的
变化。
细胞内钙离子过多的流入是导致大脑局部缺血所引起的神经细胞死亡的主要原
因。钙离子的内流是导致一系列重要的通道和转运蛋白所介导的。经OGD处理后，Rolling
Nagoya和Leaner mice的海马区域内钙离子浓度有明显的下降，也就意味着在这两种小鼠
模型中，CaV2通道介导梗死面积的降低可能与钙离子浓度有关。
综上所述，本发明发明人证实了脑梗死面积确实和CaV2通道有关。在Rolling
Nagoya和Leaner mice模型中，通过MCA处理，本发明发明人发现在缺血模型中钙离子的浓
度有所下降，α1亚基基因的突变能保护大脑在缺血性损伤中所受的伤害即CaV2.1通道在缺
血模型中有调节脑组织梗塞面积的作用。
附图说明：
图1：脑梗死的评价(A)大脑中动脉阻塞处理后的一系列的脑区域。分别用TTC处理
后的野生型小鼠(左)，Rolling Nagoya(中)，Leaner mice(右)。(B)和对照组相比，野生型
小鼠(n＝12)，Rolling Nagoya(n＝11)以及轻瘦型小鼠(n＝12)中对梗死区域体积的统计。
图2：海马切片经OGD诱导后钙离子增加的剖面图。经OGD处理后，取自野生型小鼠
(n＝14,closed square)，Rolling Nagoya(n＝14,open circle)，Leaner mice的(n＝14,
open triangle)的海马CA1区域的锥体细胞层的标准化曲线随着时间的变化而变化。标准
化曲线的数据是从OGD处理前5min开始搜集，到OGD处理结束后7min。水平黑色标线指OGD处
理组。
图3：缺血环境下CaV2.1通道突变体介导的神经保护作用机制。CaV2.1通道的重要
性和钙离子内流与调节谷氨酸释放一致。钙离子的升高在缺血性脑损伤的发生中起着至关
重要的作用。在局部缺血中，不同的CaV2.1通道突变体影响着不同的钙离子电流以及谷氨
酸的释放，最终导致神经元损伤。
具体实施方式：
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书
所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实
施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离
本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下
述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体
实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中
另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端
点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和
科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使 用的具体方法、设
备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与
本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来
实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领
域常规的原位杂交，实时定量反转录聚合酶链式反应，MCA闭塞处理，梗塞面积的评估，Ca2+
成像技术，统计分析及相关领域的常规技术。
在神经系统中，CaV通道在通过提高细胞内Ca2+浓度调节不同的神经元功能中起到
了重要的作用。CaV通道是一种复杂的分子复合物，由α1，β，α2-δ和γ亚基组成。在突触前终
端，有三大CaV2通道类型，CaV2.1(P/Q型)，CaV2.2(N型)和CaV2.3(R型)，这三种类型广泛表达于
中枢神经系统和参与Ca2+依赖的胞吐释放神经递质。鉴于CaV2通道的关键作用在于控制特
定神经递质的产生和释放，突触前CaV2通道的表达、定位、结构或调制发生缺陷都可能会导
致异常的突触信号和导致神经网络功能障碍的各种模式。Ca2+浓度的增加在缺血性神经元
损伤的发病机理中起着重要的作用，CaV2通道作为重要的Ca2+内流路线，他们参与缺血性神
经元损伤，这在病理生理学方面至关重要的。
各实施中所使用的动物程序由上海交通大学和RIKEN动物实验委员会批准，并依
照实验室动物使用要求进行实验。Rolling Nagoya小鼠由RIKEN生物资源中心提供，是
C57BL/6J的第14代杂交小鼠。Leaner mice由Jackson实验室提供，具有C57BL/6J的遗传背
景。这些小鼠被免费获得物颗粒和水，饲养温度为23±1℃，湿度为55±5％，光暗周期为12/
12-h(开灯时间为8：00到20:00)。所有分析均由技术成熟的实验人员在不了解小鼠基因型
的情况下完成。
原位杂交技术
用于原位杂交的16周龄雄性小鼠大脑的包埋蜡块和石蜡切片是从Genostaff有限
公司(日本东京)获得的。对小鼠进行灌注，然后解剖取出大脑，用组织固定液(Genostaff)
对其进行固定，然后根据专有程序进行石蜡包埋，最后进行切片，切片厚度为6um。杂交协议
按照之前报道的那样进行实施。我们设计了一个含有691个碱基片段的探针，从位置6068到
6748的CaV2.1α1亚基CDNA，用地高辛标记的RNA标记试剂盒(德国，Mannhein，罗氏诊断)进
行示踪。用NBT/BCIP染色液(美国Sigma)进行着色反应，过夜，然后用PBS洗。切片，
kernechtrot染色液复染和安装CC/安装(诊断生物系统公司，普莱森顿，CA，USA)。
实时定量反转录聚合酶链式反应
根据试剂说明书(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，分别从16周雄性小鼠的嗅球，
大脑皮层，尾状核，海马体，小脑和肝中利用Trizol试剂提取总RNA。使用ABI7700序列检测
系统，采用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)量化感兴趣基因的表达水平。确定野生
型和CaV2.1α1突变体基因表达的总量，我们所使用的引物是CT1F(5’-
CTGCGCTACTTCGAGATGTG-3’)和CT1R(5’-AACATAGTCAAAATATCGCAGCAC-3’)，所使用的探针是
MT-probe1(5’-ATCCTCATGGTCATTGCCATGAGCAGCATCGCTCTGGCCGCCGA-GGACCCGGTGC
AGCCCAACGCACC CC-3’)。为了确定等效荷载，每个样本中的18s核糖体RNA的量使用标准的
引物和Taq Man探针测定。所有的样本都进行了重复的分析，用平均值来表示基因表达的相
对量化。野生型小鼠中mRNA的表达水平的计算与CaV2.1α1 mRNA的表达水平是相关的。
MCA闭塞
用异氟烷对16周龄的雄性小鼠进行麻醉，使用一个水套加热垫来使小鼠的体温保
持在(36±0.5摄氏度)。切开皮肤，将左侧枕叶，甲状腺上动脉，外颈动脉的分支和翼腭动脉
暴露出来，电凝然后切开。用微型夹将颈总动脉结扎后，结扎并凝固左颈外动脉，切断远端
脑甲状腺动脉。将一条21mm的单丝尼龙线(5–0，哈佛仪器，霍利斯顿，MA，USA；热的直径圆
尖：0.2–0.3mm)插入到ECA中，轻轻地通过颈内动脉，直至其尖端闭塞MCA的起源。缝线的位
置如果正确，到左侧大脑中动脉区域局部脑血流量就会突然下降，我们可以用激光多普勒
血流仪来监测10–15％的基本流动监测。成功闭塞后，结扎固定到位，用手术夹闭合皮肤切
口。
梗塞面积的评估
大脑动脉闭塞24小时后，给小鼠注射过量的戊巴比妥钠进行麻醉处死。取出大脑，
然后用振动切片机(1000S，徕卡软体系统，韦茨拉尔，德国)连续切为5冠切片(厚1mm)。这些
部分浸泡在含有1％的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)的生理盐水中，然后在37℃的环境下
孵育30min。梗死图像和整个对侧大脑半球 均采用数码相机拍摄区域测量则使用图像软件
(Win Roof版本5.7，山谷公司，东京，日本)。减去面积非梗死侧大脑半球对侧组织测定心肌
梗死面积。梗死体积百分比通过将梗死体积的总和除以前面所述的总对侧半球体积求得。
缺氧和葡萄糖环境中海马切片内Ca2+离子成像技术
海马切片(350μm)是取自5周龄的雄性小鼠，利用振动切片机(1000S，徕卡软体系
统)在冰冷的人工脑脊液(ACSF)中获得的。ACSF是由137mM的NaCl，2.5mM KCl，21mM
NaHCO3，0.58mM NaH2PO4，2.5mM CaCl2,1.2mM MgCl2和10mM的葡萄糖组成，在95％O2/5％CO2
的饱和状态下PH为7.4。孵育2小时后，用Ca2+荧光指示剂Fura-PE3/AM和0.01％聚氧乙烯蓖
麻油在37℃对切片进行染色45min。然后将切片彻底清洗30分钟，以除去额外的细胞染料。
35℃时，在荧光倒置显微镜阶段对脑片进行灌流(4ml/min)，并分别在340nm和380nm的波长
下每分钟对荧光信号进行捕捉。从CA1椎体细胞层两个不同的区域对Ca2+浓度在CA1区荧光
比率的平均值进行估计(比＝F340/F380)。为了符合OGD的使用要求，用95％N2/5％CO2使
ACSF饱和，并用2-脱氧葡萄糖取代葡萄糖。规范OGD处理期间Ca2+浓度的非时间性增加，标准
化率等于基线比除以每一个得到的比例(应用OGD前五个值的平均值)。然后在3分钟的时间
间隔使用运算箱计算标准比率上升的最大速率。
统计分析
数据是由平均值±标准差的形式呈现，使用Excel 2006对行为的统计分析和免疫
细胞化学研究进行统计，采用重复测量的方差分析对数据进行分析，然后Tukey事后测试。
实施例1
CaV2.1α1亚基mRNA的表达模式
我们用原位杂交的方法来评估CaV2.1α1 mRNA在野生型小鼠(n＝6)、Rolling
Nagoya和(n＝5)和Leaner mice(n＝5)中的分布；在三种小鼠体内分布都一样(数据未显
示)。我们利用反义探针检测到α1亚基在这三种小鼠大脑内部都有一个广泛的表达，尤其是
在嗅球神经元细胞，大脑皮层神经元细胞，海马神经元细胞和小脑神经元细胞中有强烈的
表达。但是使用正义探针之后未检测到任何的信号。我们用real-time qRT-PCR来检测
CaV2.1α1 mRNA在这三种小鼠中的嗅球、 大脑皮层、尾状壳核、海马、小脑以及肝脏中的表
达水平。在这三种小鼠的嗅球、大脑皮层、尾状壳核、海马、小脑中，总CaV2.1α1的相对表达
水平并未有明显的不同(野生型小鼠，Rolling Nagoya和Leaner mice在嗅球中的值分别是
1.01±0.04,1.03±0.06,1.04±0.07，F(2,27)＝0.153,p>0.05；大脑皮层分别为1.03±
0.01,1.03±0.04,1.04±0.08，F(2,27)＝0.173,p>0.05；尾状壳壳中分别为1.02±0.05,
1.03±0.03,1.04±0.04,F(2,27)＝0.145,p>0.05；海马中分别为1.02±0.01,1.05±
0.08,and 1.02±0.07，F(2,27)＝0.166,p>0.05；小脑中分别为1.02±0.02,1.03±0.03,
and 1.06±0.03,F(2,27)＝0.182,p>0.05)。而在三种小鼠的肝脏部分未检测到任何的PCR
产物(数据未显示)。
实施例2
CaV2.1α1基因突变小鼠在体内缺血模型中梗死体积的降低
对野生型小鼠(n＝12)，Rolling Nagoya(n＝11)以及Leaner mice(n＝12)进行大
脑中动脉阻塞处理。我们从颜色上来辨别脑梗死，为白色未染色区域，周边是红色活体组
织。图1A是一组具有代表性的实验结果，它是梗死部分用TTC永久闭塞之后染色24h所得到
的结果。经大脑中动脉阻塞处理后，在这三种小鼠中的梗死区域有明显不同。梗死区域在
Rolling Nagoya中占大脑的总体积的比例为27.1±3.5％，Leaner mice中的比例为20.2±
3.5％，野生型小鼠为42.9±4.5％。
实施例3
CaV2.1α1基因突变小鼠在体外缺血模型中钙离子降低
为了调查在突变型小鼠中梗死体积的降低是否和神经元钙离子信号通路有关，我
们用海马切片来检测OGD处理后钙离子的变化，OGD处理后能使局部缺血。CaV2.1通道在海
马区域内的表达十分强烈。在OGD处理前，在这三种小鼠中CA1区的锥体细胞层的基础比率
并未有明显的区别(野生型：0.847±0.011；Rolling Nagoya：0.827±0.022；Leaner mice：
0.803±0.013)。一旦OGD开始处理，钙离子出现递增，处理后的4min内，野生型小鼠的标准
化指数要远远高于其他两组的小鼠。在这三种小鼠中增加的最大比率也都是不同的。
Rolling Nagoya中的增加速率为0.083±0.007/min(p<0.01)，Leaner mice为0.062±
0.006/min(p<0.01)，野生型小鼠为0.105±0.008/min。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟
悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因
此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完
成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。