一种从牛初乳中提取的糖尿病药及其制备 本发明涉及一种从牛初乳提取短链类胰岛素生长因子(-3N：IGF-1)与类胰岛素生长因子结合蛋白(IGFBP)的混合物以及进一步从中提取出短链类胰岛素生长因子(-3N：IGF-1)的方法并将其分别制成口服型和针剂型治疗糖尿病的药物。
糖尿病是危害人类健康的常见病，部分患者为胰岛素抵抗型，机体内存在着胰岛素受体和/或受体后水平作用的缺陷，尽管胰岛素分泌显著增高，但仍出现高血糖状态，而且对外源胰岛素治疗无适当反应，这已成为目前治疗糖尿病的难题。
现有研究表明，应用类胰岛素生长因子-1(缩写IGF-1)，可纠正胰岛素抵抗患者高血糖状态。类胰岛素生长因子-1是一种由70个氨基酸组成的单链多肽，目前较为明确的生理作用有(1)介导生长激素的促生长作用；(2)通过增加脂肪，蛋白质、糖元的合成，减少其分解；通过增加葡萄糖的摄取和利用等途径降低血糖；(3)促进细胞增殖和促进红细胞生成等。目前已能重组类胰岛素生长因子-1，小部分用于临床治疗糖尿病、侏儒症、神经系统损伤等疾病。然而重组的类胰岛素生长因子-1价格十分昂贵，根据西格玛公司(Sigma)1996年报价，这种由基因工程制成的完整型类胰岛素生长因子每50微克137.50美元，而且经动物试验表明其虽然能降低血糖，但被怀疑有损害肾和心脏的副作用，并且，贮藏也十分困难，因此，人们希望能提供一种价格便宜，效果显著，且副作用少的治疗糖尿病新药。
人们发现机体内除存在完整型的类胰岛素生长因子-1之外，还存在生物活性较其高10倍的短链类胰岛素生长因子，此种短链类胰岛素生长因子系在它的N端缺少三个氨基酸，它与类胰岛素生长因子结合蛋白(IGFBP)的结合力较低，能否用它制成糖尿病治疗药，这是本发明人多年来为之开拓研究的课题。
早在1986年，澳大利亚学者FRANCIS在生物化学杂志(The Biochemical Journal)发表了有关牛初乳短链类胰岛素生长因子(-3N：IGF-1)的研究论文，包括从牛初乳中提取短链类胰岛素生长因子的实验方法，虽然该提取步骤可获得高纯度的短链类胰岛素生长因子，但费用较高，产量较低，难以形成规模生产。尤其是该实验步骤特别强调了对牛初乳的高浓度酸化处理(pH2.8)，以使短链类胰岛素生长因子从类胰岛素生长因子结合蛋白中分离出来，从而对分离要求，分离仪器及实验环境提出了很苛刻的标准。数据还表明短链类胰岛素生长因子若过早地从类胰岛素生长因子结合蛋白游离，其生物活性容易丧失。
本发明的目地是提供一种从牛初乳提炼糖尿病治疗药及其方法。
根据本发明人最近几年对牛初乳的成份分析，发现：
1、牛初乳中的类胰岛素生长因子结合蛋白(IGFBP)的分子量为45～50千道尔顿(45～50kd)，其不同于血清中的IGFBP分子量160kd；
2、牛初乳中短链类胰岛素生长因子一旦与类胰岛素生长因子结合蛋白结合，稳定性增强，对牛初乳无论是短时间加热到60℃的处理，还是重复冻融，初乳中的短链类胰岛素生长因子含量基本未改变。
所以本发明的技术方案是：
采用酸制剂调整脱脂初乳pH值，使便于去除与类胰岛素生长因子结合蛋白分子量相似的大量酪蛋白，用加热和离心析出酪蛋白，再对离心提取的上清液超滤，截留初乳中游离的和与类胰岛素生长因子结合蛋白结合的短链类胰岛素生长因子，制成干粉作为口服糖尿病治疗药。再对制成的干粉进行低pH酸处理和柱层析，得到高纯度短链类胰岛素生长因子-1，将其制成针剂糖尿病治疗药。
即，本发明方法，其步骤依次如下：
1、先对正常初乳脱脂，2、用酸制剂将脱脂初乳pH值调到4.5～4.8，3、将已调整pH值的脱脂初乳，加热并离心提取上清液，4、超滤上清液，截留保存初乳中的游离的和与类胰岛素生长因子结合蛋白结合的短链类胰岛素生长因子，5、将超滤截留物冷冻干燥成粉末，6、将冷冻干燥粉末进行低pH酸处理，游离出短链类胰岛素生长因子，7、再进行柱层析，提纯短链类胰岛素生长因子。
将上述方法中步骤之5，超滤截留物冷冻干燥成粉末，即可制成口服型糖尿病治疗药。
将步骤之7所提纯的短链类胰岛素生长因子，制成注射剂型糖尿病治疗药。
十分明显，本发明的口服治疗糖尿病药，其主要包括提炼的牛初乳游离的短链类胰岛素生长因子和其与类胰岛素生长因子结合蛋白相结合的混合物。
本发明的注射剂型治疗糖尿病药，主要包括短链类胰岛素生长因子。
进一步，本发明方法，其用酸制剂调整脱脂牛初乳的pH值，以pH＝4.7为最佳。
又其对离心所得的上清液的超过滤的截留物，其分子量大于5000，小于60000，且超滤分二次进行，第一次分离膜型号为PS700，第二次为PS40。
本发明的优点是：1、提取短链类胰岛素生长因子制成注射剂型糖尿病药的成本大为降低，这是由于其是从超滤粗提物进行低pH酸处理，而不是直接从脱脂牛初乳进行低pH酸处理，因此，得率大大提高，在去脂初乳中总蛋白每毫升为46.08毫克，而超滤液中为每毫升为10.95毫克，且短链类胰岛素生长因子则分别为每升67微克和275微克；2、由于先从超滤制成粗提物，即保存短链类胰岛素生长因子和其与类胰岛素生长因子结合蛋白结合的混合物，能保持其化学稳定，保藏容易，无需苛刻的环境条件，这就达到既降低成本，使用又方便的目的；3、药物效果好，动物实验表明，短链类胰岛素生长因子不仅与人工制造的完整类胰岛素生长因子一样能明显降低血糖，而且用量少，还能保护肾和心脏，即其比完整类胰岛素生长因子的药用更好。 下面我们列举本发明的四个实施例，并分别予以详细描述，以便更进一步提供本发明的技术细节或其药用性能。
实施例1
收集母牛分娩后当日分泌的初乳10千克，冷冻离心3000转/分，共30分钟，去脂肪，在室温条件下，边搅拌，边滴入2N HCl，致使脱脂乳pH为4.7。然后升温至50℃直至乳水明显分离。低温(4～10℃)条件下过夜。第二日，5000转/分离心15分钟，去沉淀物，其上清液经200目滤网过滤后，放入HP板框式超滤器内，分离膜型号PS700，进口压为3千克/(厘米)2，出口压0.3千克/(厘米)2，料液温度小于35℃。收集滤过液，紧接再作膜型号PS40的分离，弃去滤过液，收集浓缩液。样品，经冷冻干燥成白色粉末。经类胰岛素生长因子放射免疫药盒测试每克干粉含0.3微克类胰岛素生长因子。
实施例2
收集母牛分娩后二日以内分泌的初乳，经脱脂后将初乳加热至50℃，边搅拌，边滴入乙酸，直至可见到明显的白色颗粒产生。离心去沉淀物，取上清液作超滤分离。截留住分子量大于5000以上，小于60000以下的物质。经无菌过滤后，冷冻干燥成粉末。糖尿病大鼠服用此干粉一周血糖浓度从原来的391±216毫克/100毫升下降至261±134毫克/100毫升，给药组饮水量为95毫升/日，摄食量24克/日，空白组饮水量131毫升/日，摄食量33克/日，症状有明显改善。
实施例3
按实施例1或2所示方法，获得短链类胰岛素生长因子粗制品干份，以1.5克干粉，10毫升生理盐水的比例溶解。再按1份溶解液4份酸乙醇的配比混匀。酸乙醇配方为12.5份2N HCl＋87.5份95％乙醇。在4℃条件下，搅拌。离心后收集上清液作葡聚糖(Sephadex-G50)柱层析，(洗脱液为1摩尔乙酸pH3.8)收集层析液，再作脱盐，无菌处理。电泳图谱和放射免疫药盒测定样品短链类胰岛素生长因子含量。该无菌的短链类胰岛素生长因子经腹腔注射250毫微克/千克/日治疗糖尿病大鼠，2小时后可测得血糖浓度下降。用药后电镜及光镜检查肾脏和心脏细胞结构基本完好，明显好于对照组。
实施例4
按实施例1或2所示方法获得短链类胰岛素生长因子粗制品干粉，按1克∶10毫升生理盐水比例溶解，再以饱和(NH4)2SO4分级沉淀，最终获得(NH4)2SO4饱和度在80％的沉淀物。溶解后，再以葡聚糖的柱层析，脱盐，去小分子物质收集洗脱液，灭菌过滤后，制成短链类胰岛素生长因子冻干粉，冷藏。待需要时，再以生理盐水溶解用作注射剂。选购健康实验大鼠，体重在100～200克之间，按55毫克/千克体重的剂量腹腔注射链脲佐菌素溶液，一周后，测定血糖，选择血糖在(13.5～25毫摩尔/升)的大鼠为适用的糖尿病大鼠模型。将24只糖尿病大鼠随机分为对照组和注射组，对照组不用任何药物，注射组每日晨腹腔注射牛初乳短链类胰岛素生长因子50毫微克，共4周，实验开始前及第四周同时测定血糖、血胆固醇和甘油三酯水平(表)。
表.用药前后糖尿病大鼠测试值(毫摩尔/升) 血糖 胆固醇 甘油三酯
用药前 用药后 用药前 用药后 用药前 用药后注射组 21.4±2.30 11.37±4.5 1.80±0.43 1.68±0.47 1.45±0.28 0.79±0.69对照组 20.38±3.49 27.65±3.89 1.80±0.43 3.65±3.65 1.45±0.28 1.54±0.51