石斑鱼神经坏死病毒Coat基因、在大肠杆菌中表达方法及应用技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种石斑鱼神经坏死病毒Coat基因、在
大肠杆菌中表达方法及应用。
背景技术
鱼类病毒性神经坏死病(viral nervous necrosis，VNN)，是世界范围的一种鱼类
流行性传染病，对仔鱼和幼鱼危害极大，严重者在一周内死亡率可达100％。由于其极高的
传染性和危害性，被国际兽医组织(OIE)列为重要的鱼类病害(OIE，2001)。目前，该病在除
非洲以外的国家和地区迅速蔓延，受感染的鱼类已达40余种，给各国海水养殖业造成了巨
大的危害。导致该传染病的致病原为神经坏死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)，它属
于诺达病毒科(Nodaviridae)中的β-诺达病毒属，是一种小RNA病毒。
石斑鱼是目前海水养殖鱼类中的高档优质鱼类。随着我国石斑鱼人工育苗技术的
成熟和斜带石斑鱼苗种产业化大规模生产，成为重要的海水鱼类养殖品种。但这几年石斑
鱼苗种期频繁发生神经坏死病毒病，引发苗种大量死亡，育苗成活率只有3～5％，有时不到
1％，甚至全军覆没，造成巨大的经济损失外还常常导致苗种供不应求，影响养成生产。国内
外学者从化学药物、生物疫苗、RNA干扰(RNAi)及养殖模式等方面对该病的防治进行了大量
的研究，但是到目前为止仍然没有找到有效的防治措施。
对于鱼类的病毒病，最有效、安全且无环境副作用的首选免疫保护方法即疫苗的
使用。经过疫苗的保护，养殖鱼类抵抗了各种病毒的侵染，使得集约化和工厂化的高密度水
产养殖的持续稳定发展成为可能。目前进口水产疫苗产品多来源于真核表达系统生产亚单
位疫苗，价格昂贵，生产能力和销售价格远远不能满足中国市场需求，不适合于我国海水养
殖生产中推广，而国内目前还没有可用的石斑鱼神经坏死病毒的疫苗产品。
传统疫苗(减毒疫苗、灭活疫苗)存在安全性和保护效果差的缺点。
发明内容
本发明针对传统疫苗的不足，提供一种通过基因工程手段研发的重组蛋白和重组
DNA技术的新一代疫苗克服了传统疫苗的种种缺陷，本发明旨在提出一种石斑鱼神经坏死
病毒Coat基因、在大肠杆菌中表达方法及应用。
本发明的技术方案是：
一种石斑鱼神经坏死病毒Coat基因，其序列全长为1433bp，核苷酸序列如SIDNO:
1。
本发明的再一个目的在于公开了一种石斑鱼神经坏死病毒Coat蛋白，其氨基酸序
列如SID NO:2，全长为338aa，由上述的石斑鱼神经坏死病毒Coat基因通过大肠杆菌表达系
统表达得到。
石斑鱼神经坏死病毒Coat基因全长1433bp，包括26bp的5’非翻译区(1-26bp)、
1017bp的开放阅读框(27-1043bp)和390bp的3’非翻译区(1044-1433bp)，编码338个氨基
酸；，序列中双下划线标示的atg为起始密码子，单下划线标示的taa为终止密码子。
本发明又一个目的在于上述的Coat蛋白在大肠杆菌系统中表达的方法，包括重组
载体的构建、重组载体转化感受态细胞、菌种保存、诱导表达与鉴定。
优选的，所述表达载体为pET30a，所述感受态细胞为BL21(DE3)。
优选的，所述诱导表达的具体方法如下：
步骤1：取阳性克隆按1：100比例接种到含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基中，于
摇床中37℃*200rpm生长过夜；
步骤2：第二天将上述菌液按1:100比例接种到含50μg/mL硫酸卡那霉素抗性的2L
TB培养基中，放入摇床中37℃*200rpm生长至OD600＝0.6-0.8时，将摇床温度降至15-25℃，
1-3h后加入终浓度0.10-0.30mM IPTG诱导生长16h；
步骤3：将诱导后的菌液于4℃*8000rpm离心15min弃上清，收集菌体，用磷酸盐缓
冲液PBS重悬并重复离心过程以清洗菌体；放置于-20℃保存。
优选的，所的重组载体转化的具体方法如下：
步骤1：从-80℃冰箱中取出感受态细胞BL21(DE3)，并将其迅速置于冰水中，在冰
上融化2-5min；
步骤2：融解后轻弹管壁1-2次以重悬细胞；将约100ng的表达载体质粒DNA直接加
入感受态细胞中，轻微摇动混和随后置于冰水浴上30min；
步骤3：取出后放入水浴锅中：42℃，热激90s，热激完迅速放回冰水浴中3min；拿出
后取200μL无抗性的LB液体培养基加入到已转化的感受态细胞中；
步骤4：放入摇床中37℃*195rpm生长1h，吸取50μL-80μL悬液均匀涂布含有50μg/
mL硫酸卡那霉素的LB平板上，倒置、37℃培养过夜。
优选的，所述的菌株的保存及诱导表达的具体方法如下：
步骤1：从转化平板中挑取单克隆，加入4mL含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基
中；
步骤2：37℃*200rpm培养至OD600为0.5-0.8，2-3小时；无菌条件下取出生长过程中
样品测定OD600值；
步骤3：取管中0.9mL的菌液与0.1mL80％无菌甘油混合，存于－80℃冰箱中；
步骤4：向试管培养液中加入终浓度0.375mM IPTG，放置37℃诱导4h。
优选的，所述鉴定采用SDS-PAGE和电镜观察法。
本发明的再一个目的在于公开一种抗石斑鱼神经坏死病毒的疫苗，含有上述石斑
鱼神经坏死病毒Coat蛋白或其任意混合物。
本发明的最好一个目的在于公开一种上述的石斑鱼神经坏死病毒Coat基因在抗
石斑鱼神经坏死病毒中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明通过石斑鱼神经坏死病毒Coat基因的获得，填补了石斑鱼神经坏死病毒
Coat基因研究的空缺。同时根据石斑鱼神经坏死病毒Coat基因序列可以人工合成或转基因
生物合成具有生物活性的重组蛋白，有助于我们了解石斑鱼神经坏死病毒基因制备疫苗，
基因工程疫苗使用还可以大幅度降低养殖生产中药物的使用量，从根本上消除水产品的药
物残留隐患，为消费者提供健康优质的绿色水产品。
本发明蛋白的诱导表达过程中对温度、转速、IPTG的浓度和时间进行了优化，诱导
时温度为15-25℃、IPTG浓度为0.10-0.30mM、诱导时间为16h，可增加重组蛋白的溶解性，有
利于蛋白折叠形成正确的构型，从而具有生物学活性。
附图说明
附图1为SDS-PAGE分析Coat蛋白于BL21(DE3)表达情况；
Lane M：SDS-PAGEProtein marker；Lane 0：对照；Lane 1:15℃诱导过夜；Lane 2:
37℃诱导4h；
附图2为电镜观察比较VLP与NNV病毒结构，(A)为NNV病毒结构，(B)为VLP蛋白结
构；
附图3为SDS-PAGE分析Coat蛋白上清纯化结果；
Lane M：SDS-PAGEProtein marker；Lane 1：全菌破菌离心后上清；Lane 2：上清同
Ni-IDA孵育后流出液；Lane 3-4：50mM咪唑的BufferA(不含TritonX-100)洗脱液；Lane 5-
6：100mM咪唑的BufferA(不含TritonX-100)洗脱液；Lane 7-10：300mM咪唑的BufferA(不含
TritonX-100)洗脱液；Lane 11-12：500mM咪唑的BufferA(不含TritonX-100)洗脱液；
附图4为Coat蛋白浓度测定标准曲线；
附图5为抗体检测效果曲线。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施
例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通
技术
人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护
的范围。实施例1：石斑鱼神经坏死病毒Coat基因设计与优化采用德泰生物最新开发的密码
子优化软件Max Codon TMO ptimization Program(V13)，目标蛋白Coat最终优化的结果，
其序列全长为1433bp，其核苷酸序列如SIDNO:1。
实施例2：石斑鱼神经坏死病毒Coat蛋白表达与纯化
1、Coat蛋白表达与鉴定
1.1表达载体的转化
步骤1：从-80℃冰箱中取出感受态细胞BL21(DE3)，并将其迅速置于冰水中，在冰
上融化2-5min。
步骤2：融解后轻弹管壁1-2次以重悬细胞。将约100ng的表达载体质粒DNA直接加
入感受态细胞中，轻微摇动混和随后置于冰水浴上30min(此时可以准备42℃水浴锅)。
步骤3：取出后放入水浴锅中(42℃)，热激90s；热激完迅速放回冰水浴中3min；拿
出后取200μL无抗性的LB液体培养基加入到已转化的感受态细胞中。
步骤4：放入摇床(37℃*195rpm)中生长1h，吸取50μL-80μL悬液均匀涂布含有50μ
g/mL硫酸卡那霉素的LB平板中，倒置、37℃培养过夜。
1.2菌株的保存及诱导表达
步骤1：从转化平板中挑取3个单克隆，加入4mL含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养
基中，编号为标记为“0”“1”“2”。
步骤2：37℃*200rpm培养至OD600约为0.5-0.8(通常需要2－3小时)。生长过程中无
菌条件下取出样品测定OD600值。
步骤3：取“1”“2”号管中各0.9mL的菌液与0.1mL80％无菌甘油混合，存于－80℃冰
箱中。
步骤4：向试管培养液中加入终浓度0.375mM IPTG(“0”对照组不加IPTG)，通常“0”
“1”放置15℃诱导过夜，“2”放置37℃诱导4h。
1.3SDS-PAGE鉴定诱导表达结果
步骤1.分别取“0”“1”“2”试管中各400-600μL培养液12000rpm*10min*4℃离心，去
除上清液，加入500μL ddH2O重悬菌体，并再次12000rpm*10min*4℃离心，去除上清液。
步骤2.加入50μL的磷酸盐缓冲液(PBS)混合以重悬沉淀。
步骤3.加入50μL的2×SDS上样缓冲液迅速在100℃加热样品15min使蛋白变性，然
后12000rpm*5min*4℃离心取上清电泳。电泳前10min100V稳压电泳，待溴酚蓝指示剂进入
分离胶后，200V稳压电泳至溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1cm，取出凝胶用考马斯亮兰染色液
染色，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰。如图1所述。
1.4电镜观察蛋白形态
取神经坏死病毒NNV与表达出的蛋白VLP制片，并于电镜下观察两者形态如图2，结
果发现两者大小和形态极为相似。
1.5Coat蛋白放大培养
步骤1：取“1”和“2”保种的菌种按1:100比例接种到含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB
培养基中，于摇床中(37℃*200rpm)生长过夜
步骤2：第二天将上述菌液按1:100比例接种到含50μg/mL卡那霉素抗性的2L TB培
养基中，放入摇床中(37℃*200rpm)生长至OD600＝0.6～0.8时，将摇床温度降至15-25℃，约
1-3h后加入终浓度0.10-0.30mM IPTG诱导生长16h
步骤3：将诱导后的菌液于4℃*8000rpm离心15min弃上清，收集菌体，用磷酸盐缓
冲液PBS重悬并重复离心过程以清洗菌体；放置于-20℃保存。(如果收菌当天不纯化的话，
放置于-20℃)
2、Coat蛋白纯化
2.1Coat蛋白上清纯化(整个纯化过程在低温下操作)
步骤1：用BufferA：50mMTris，150mM NaC，1mM DTT，1％TritonX-100，1μg/mL
Pepstatin A，1μg/mL Leupeptin，20mM咪唑，pH8.0重悬菌泥(通常裂解液用量为10-15mL/g
菌泥)
步骤2：超声裂解，用500W功率，在冰浴中进行超声，每超声3s，间歇6s，总计15min，
结束在显微镜下观察破碎结果。(根据破碎结果可适当调节破碎时间)
步骤3：13000rpm*30min*4℃离心保留上清，并用0.45um滤膜过滤
步骤4：用BufferB:50mM Tris，150mM NaCl，20mM咪唑，pH8.0平衡3mL Ni-IDA柱，
平衡约5-10CV直至紫外示数达到基线
步骤5：将3步过滤的上清同平衡后的Ni-IDA柱混合后置于旋转混合仪上于4℃孵
育60-80min
步骤6：用一空的层析柱截留含有Coat蛋白的Ni-IDA柱，并用Buffer B冲洗10-
20CV，流速控制在1.0mL/min，直至紫外示数达到基线
步骤7：用分别含有50mM、100Mm、300mM咪唑以及500mM咪唑的Buffer B洗脱目标蛋
白，流速控制在1.5mL/min，并收集每个咪唑梯度的洗脱液组分
步骤8：取每个组分20μL加入20μL的2×SDS上样缓冲液迅速在100℃加热样品
10min使蛋白变性，然后12000rpm*5min*4℃离心取上清电泳。电泳前10min100V稳压电泳，
之后溴酚蓝指示剂进入分离胶200V稳压电泳至溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1cm,取出凝胶
用考马斯亮兰染色液染色,随后转入脱色液中，脱色至背景清晰。(在平衡Coat蛋白得率和
纯度的时，可通过适当地减少Ni-IDA柱体积以获得高纯度的目标蛋白)如图3所述。
3Coat蛋白透析分装
3.1将上述收集的目标蛋白用3.5kDa透析袋透析到500mL Buffer C：1×PBS，10％
Glycerol，pH 7.4中，用磁力搅拌器4℃旋转，每隔2h换液一次，总计换液4次。
3.2透析结束后用0.22um膜过滤，并分装冻于-80℃。
4.Coat蛋白质检
4.1Coat蛋白稳定性测试(冻融实验)
取一支分装后冻于-80℃的Coat蛋白，放置于冰水混合物中待其缓慢融化，融化后
无明显悬浮物并且13000rpm*30min*4℃离心亦无沉淀，说明Coat蛋白冻融实验是正常的。
4.2Coat蛋白浓度测定
测定蛋白浓度采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。其标准曲线如图4所示。测得其
OD＝0.275，最终换算浓度为0.380mg/mL。
实施例3：
将实施例2获得石斑鱼神经坏死病毒Coat蛋白制成疫苗VLP直接注射鱼体，选择大
小为4-6cm的鱼体。
注射方式为肌肉注射；VLP注射量为0.2-8.5μg/g鱼；
VLP7D代表VLP注射后鱼体7天取血检测抗体水平，VLP14D代表14天后取血检测抗
体水平，NNV7D代表鱼体注射神经坏死病毒(NNV)7天后取血检测抗体水平，NNV14D代表鱼体
注射神经坏死病毒(NNV)14天后取血检测抗体水平(NNV相当于阳性对照)，对照7d代表注射
生理盐水7天取血，对照14d代表注射生理盐水14天取血检测抗体水体。
抗体检测效如图5所示：注射VLP跟NNV病毒液抗体效价都达到几万，对照组抗体效
价为90左右，说明本发明制备的VLP疫苗能够和病毒原液产生几乎相同的效价。