使用人参皂苷R0或含有该皂苷的植物 提取物促进胶原蛋白合成 本发明涉及使用人参皂苷R0或其中存在有该皂苷的植物提取物制备化妆品或药物组合物，特别是皮肤科药物组合物，以刺激胶原蛋白特别是胶原蛋白I和胶原蛋白III的合成。另外还进一步涉及含有人参皂苷R0或其中存在有该皂苷之植物提取物的成纤维细胞培养基。
人参属植物的许多品种都是已知的，其中最好已知品种是：
—人参(panax ginseng(C.A.Meyer))，其为最常作为药用的人参属植物。
—三七(Panax notoginseng)，
—人参三七(Panax pseudo-ginseng)(himalaicus亚种)
—竹节人参(Panax japonicus)(major变种，angustifolius变种)，
—西洋参(Panax quinquefolium)，
—Panax trifolius
—Panax zingiberensis，和
—Panax stipuleanatus。
其中人参(Panax ginseng)似乎是最富含皂苷并最为有效的。
人参属植物主要原产于三个国家：
—日本
—中国
—朝鲜。
在这些不同地区培养的品种可能稍有差异并接触到不同的地理气候条件。
但发现例如品质最好的人参是产在中国的，其次是产自日本的。
人参块茎在4至6年内成熟。6年令块基达到最佳品质。
发现在植物的不同部分有完全不同的皂苷含量。最常用的根部，并且一般是有最大活性的。
发现在根的末端(日本语称为ninjin)和发根(日本语称为Ken-injin)中有最高的皂苷含量。
在人参属植物中最常遇到的皂苷达玛烷型的。但在人参皂苷中有一种具有下示齐墩果烷结构的特殊皂苷，即人参皂苷R0或称Chikusetsusaponin V：其中：第3位的取代基R1由两个连接在一起的糖，即由符号代表的β-D-葡糖醛酸吡喃糖苷和β-D-吡喃葡糖基组成，28位上的取代基R2是由符合Glc代表β-D-吡喃葡糖基。
如文献(MORITA T.，KASAI R.，KOHDA H.，TAHAKAO.，ZHOU J.，TSUNG-REN Yang，Chemical and Morphologicalstudy on Chinese Panax japonicus C.A.MEYER，Chem.Pharm.Bull.，1983，31，9-3205-2309)中所述，在Panax japonicus(日本产的)和中国产地竹节人参、以及P.japonicus var.mayor和P.japonicus var.angustifolius中有很高比例的这种人参皂苷。
在日本，竹节人参也称为Chikusetsu Ninjin。1979年KONDON.，MARUMOTOY.，和SHOJIJ.(Studies on the constituents ofPanacis Japonici Rhizoma IV，The structure of chikusetsusaponin V.，Chem.Pharm.Bull.(1971)19(6)，1103-1107)描述了Chikuset-susaponin V的结构。
可以按照J.SHOJI在Advances in Chinese Medicinal MaterialResearch 1985，p.455 et seq，中所述的方法提取这种天然分子。
下列文献中已描述了人参皂苷，特别是人参皂苷R0在医药领域中的应用：
—Li，Jingbo等人在白求恩医科大学学报1992，18(1)，24-26中描述了包括人参皂苷R0在内的不同人参皂苷的抗病毒活性；
—日本专利JP04 005 235(1992)中描述了使用人参皂苷治疗肝炎；
—日本专利JP55 122 721描述了使用人参皂苷R0作为抗糖尿病剂；
—Kuo S.C.等人(Planta Med.1990，56(2)，164-167)描述了其作为血小板凝集抑制剂的应用；
—Planta Med.1990，56(1)，19-23描述了其作为抗炎剂的应用。
另一些文献中还描述竹节人参提取物在化妆品领域中的应用。对此可列出下列文献：
—日本专利JP61 047 411中描述了使用这种提取物促进头发生长，
—日本专利JP62 093 217中描述了使用竹节人参提取物作毛发强壮剂；
—日本专利JP61 289 008涉及含竹节人参根之提取物连同粘多糖的化妆品组合物。
现已发现，人参皂苷R0和含有该皂苷的植物提取物对胶原蛋白，特别是I和III型胶原蛋白(以下分别缩写为“胶原蛋白I”和“胶原蛋白III”)的合成具有令人惊奇的刺激活性，因而使之特别适用于对抗皮肤老化作用以及强化皮肤或改善伤口愈合。
事实上，皮肤外观特别是皮肤机械性质的改变基本上是由于皮肤成分的改变所致。
现已知道，I型胶原蛋白占皮肤总胶原蛋白的80-90％，其余大约10-15％的皮肤总胶原蛋白主要是III型胶原蛋白。I型和III型胶原蛋白与皮肤内纤维的形成有着很密切的关系(BOREL J.P.，MONBOISSE J.C.，C.R.Soc Biol.(1993)，181，124-142；LAPIERE C.M.，Br.J.Dermatol.(1990)，122，5-11)。
已报导在人老化期间皮肤中胶原蛋白I和III的比例显著降低(DUMAS M.，CHAUDAGNE C.，BONTE F.，MEYBECK A.，Mech.Ageing Dev.(待出版)，VIEELLARO-ZUCCARELLUL.，GARBELLI R.，DAL POZZO ROSSI V.，Cell Tissue Res.，(1992)，268，505-511)。有人观察到，随着年令增长编码胶原蛋白的I和III之基因的表达降低，从而进一步证实了上述结果(CHENY.Q.，MAUVIER R.，TAN E.M.，VITTOJ.，J.Invest.Derma-tol.(1993)，100，535)。
局部应用糖皮质醇等治疗处理也可诱导皮肤中胶原蛋白I和III之比例的降低(OIKARINEN A.，AUTIO P.，KIISTALA U.，RISTELLI L.，RISTELI J.，J.Invest.Dermatol.，(1992)，98，220-225)。
因此，不管其初始原因如何，即不管是随天然老化发生的，还是因药物或紫外光照射等病理条件诱发的，均可按照本发明刺激胶原蛋白合成，以减缓甚至停止胶原蛋白I和III之比例的降低。
因此本发明的主要目的是解决技术问题，其在于提供一种在防止或治疗皮肤老化作用及强化皮肤或改善伤口愈合中具有良好效力的化妆品或药物组合物，特别是皮肤科药物组合物的新的配方。
根据第一个特征，本发明涉及使用人参皂苷R0或其中存在有该皂苷的植物提取物制备用刺激胶原蛋白，特别是胶原蛋白I和/或胶原蛋白III合成的化妆品或药物组合物，特别是皮肤科药物组合物。
根据一个附加特征，上述组合物可用于预防或治疗因光化学原因或自发(按年月顺序)发生的皮肤老化作用。
根据另一个附加特征，上述组合物可用于促进皮肤组织系统的形成。
根据再一个附加特征，该组合物可用于愈合皮肤伤口。
如果组合物包括含有人参皂苷R0的植物提取物，则该植物提取物较好得自日本的竹节人参、中国的竹节人参、竹节人参mayer变种或竹节人参angustifolius变种，特别是得自这些植物的根。
根据本发明的一个特别优越的附加特征，上述提取物是经用乙醇等极性溶剂在回流下提取而从根中制得的。
根据另一个附加特征，可经用石油醚提取，然后再次用极性溶剂如乙醇提取，并用丙酮沉淀而从根中制得植物提取物。
根据另一个附加特征，可用产生含至少1％人参皂苷R0之提取物的任何方法制得植物提取物。
可按照本发明使用的化妆品组合物可用于刺激胶原蛋白，特别是胶原蛋白I和/或胶原蛋白III的合成，并含有作为活性成分的化妆品有效量的人参皂苷R0或其中存在有该皂苷的植物提取物。
该组合物特别适用于促进皮肤组织系统的合成，强化皮肤及愈合皮肤伤口。
因此其特别适于阻止皮肤老化或坚固皮肤。
这种组合物可优先用作例如防正皱纹出现或降低皱纹深度的组合物。
可按照本发明使用的药物组合物可用于改善伤口愈合或治疗伴随有胶原蛋白不足的有害病理状态。
根据另一个特征，本发明进一步涉及化妆品处理或治疗处理，特别是对哺乳动物，尤其是人进行皮肤科处理的方法，所说方法的特征在于给所说的哺乳动物投用化妆或治疗有效量的人参皂苷或其中有该皂苷的植物提取物，以刺激胶原蛋白特别是胶原蛋白I和/或胶原蛋白的合成，特别是促进皮肤组织系统的合成或坚固皮肤。
根据该方法的一个优选实施方案，以改善愈合或治疗不同起因的胶原蛋白不足的有效量投用人参皂苷R0或其中有该皂苷的植物提取物。
本领域技术人员将从本说明书全文和权利要求中更清楚地了解到本发明方法的其他附加特征。
在下述各特征中，较好基于所说组合物之总重量以0.001至5％(重量)的浓度使用人参皂苷R0。
这一浓度较好为所说组合物总重量的0.001至1％(重量)。
根据本发明的一个特别有价值的附加特征，本发明的组合物还含有百(Centella asiatica)提取物、asiatic acid、madecassic acid或积雪草苷。
其中还最好包含马栗提取物、假叶树提取物、madecassoside、常春藤皂苷、sericoside，α-羟基酸、α-酮戊二酸、抗坏血酸、脯氨酸、L-羟基脯氨酸、赖氨酸、羟基赖氨酸、甘氨酸或forskolin，其衍生物或含有这些成分的植物提取物。
其中最好还包括胶原蛋白抑制剂或胶原蛋白酶生物合成的抑制剂，例如视黄酸。
在本发明的框架内，较好用对胶原蛋白合成提供刺激作用的常规方法投用人参皂苷或其中存在有该皂苷的植物提取物。给药的最简单的方法是局部给药，特别是当旨在合成皮肤组织系统，坚固皮肤和愈合皮肤伤口时。
根据本发明的一个优选附加方面，将人参皂苷R0或其中存在有该皂苷的植物提取物掺入到化妆品和药物上可接受的，特别是皮肤科可接受的赋形剂、载体中。这样的载体是本领域技术人员熟知的，并且也可见于如下述有通用范围的化妆品组合物或药物组合物，特别是皮肤科药物组合物的实施例中。
根据另一个特征，本发明涉及使用人参皂苷R0或其中存在有该皂苷的植物提取物作为刺激胶原蛋白I和/或胶原蛋白III合成的药剂。
本发明特别涉及使用人参皂苷R0或其中存在有该皂苷的植物提取物作为用于改善成纤维细胞培养物中胶原蛋白I和/或III合成之培养基的成分。
该药剂可用于任何成纤维细胞培养基中，特别是其中成纤维细胞被包含于基质，特别是聚合物基质中的培养基中。
本发明进一步涉及刺激胶原蛋白I和/或胶原蛋白III合成的方法，该方法包括将人参皂苷或含有该皂苷的植物提取物引入成纤维细胞培养基中。
在该方法中，最好将0.001至0.1％的人参皂苷R0导入由E199-C表示的培养基中，该培养基是将浓度为2mmol/L的L-谷氨酰胺加入E199培养基(GIBCO)中制得的。
上述含有人参皂苷R0的植物提取物也可用于制备上述培养基。
从下列几个实施例的解释性描述将会进一步了解本发明的其他目的、特征和优点，这些实施例只是举例说明本发明，因而不能以任何方式限制本发明的范围。
除非特别指出，实施例中的百分比都是重量百分比。就提取物来说，其量以干重表示。实施例1：提取物的制备
对竹节人参(C.A.Meyer)的根进行提取。
将根研碎后，在回流下用甲醇提取4小时以得到褐色浆状物。产率约为33％，人参皂苷的含量约为25％。实施例2：提取物的制备
使用竹节人参((C.A.Meyer)的根。
在Soxhlet装置中，用140ml石油醚将38.56g研碎的根提取12小时。
在Soxhlet装置中，用130ml甲醇将残留物再次提取20小时。
在旋转蒸发器上，将130ml甲醇真空浓缩到45ml。
冷却后，在孔隙度0.45微米的Millex SR上过滤溶液。
将所得到的溶液一次加到500ml无水丙酮中，滤出所得到的米色沉淀物，用无水丙酮洗并在烘箱中45℃干燥之。
结果得到13g浅米色粉末(产率15.9％)。人参皂苷的含量约为35％。
实施例3：证明对胶原蛋白I合成的刺激作用
a)方法
处理和不处理从—50岁妇女面部收集的成纤维细胞的培养物，用ELISA方法检测胶原蛋白I的合成。
a.1)成纤维细胞培养物
在由E199-C培养基和10％胎牛血清组成的培养基中，在含5％CO2的饱和湿度大气环境下，于37℃将成纤维细胞人工培养至单层融合。
用含有0.1％胰蛋白酶和0.02％EDTA，并缓冲至pH 7.2的等渗溶液使细胞脱粘附后，将细胞接种于96孔微滴定板(FALCON)中，在含2％血清的199-C培养基中每孔接种104个细胞。
24小进后换培养基，在有或没有试验产物的情况下，加入没有血清并含25μM抗坏血酸钠的同样培养基(保温培养基)，保温48小时。以不同的浓度将溶解于DMSO中的产物加到培养基中。
a.2)胶原蛋白I的检测：
借助ELISA(酶联免疫吸附法)检测在有或没有人参皂苷产物的情况下，保温48小时后分泌到培养基中的胶原蛋白I的量。
收集保温培养基并转移到含有蛋白酶抑制剂的微量滴定板(Nunc Immunoplate)小孔内。4℃保温24小时以使胶原蛋白粘附在塑料表面上。然后用PBS(磷酸盐缓冲盐水)洗平板。
加入血清白蛋白4℃下保温24小时以防止非特异性抗体—塑料结合，然后于22℃下经1.5小时加入抗人胶原蛋白I免抗体(In-stitut Pasteur，Lyon，France)。用PBS淋洗后，加入与碱性磷酸酶结合的抗兔IgG羊抗体(INTERCHIM，Montlucon，France)以显示结合的抗体，其中存在磷酸对位硝基苯酯时所说的碱性磷酸酶将催化产生在405nm有吸收的对位硝基苯酚。
使用在相同实验条件下用纯化的人胶原蛋白(Institut JacquesBoy，France)建立的标准曲线，将所得到的光密度转化成胶原蛋白毫微克数。
a.3)统计学说明：
借助Student t试验比较由经处理的未经处理的细胞分泌的胶原蛋白量(均值±标准差)。显著性水平定为0.05。
同时，借助MTT试验检验存活率。
2.4)细胞存活率试验：
在保温期结束时，除去培养基并进行MTT试验。于37℃将细胞与100μl含有(加在无酚红的E199-C培养基中)0.5mg/ml四唑鎓盐的溶液一起保温3小时。然后向各孔内加入100μl异丙醇，以溶解由活细胞的线粒体琥珀酸脱氢酶生成兰色甲衍生物。在540nm处检测所生成的该被溶解衍生物的光密度。
b)所得到的结果
b.1)应用上述方法研究人参皂苷R0浓度对胶原蛋白I合成之刺激作用的影响。
表1中给出了用分别含有每毫升0.1、2.5和10μg人参皂苷R0的组合物所测得的结果。
表1人参皂苷R0的浓度 (μg/ml) 存活率ng胶原蛋白I/104细胞/48小时合成刺激作用 0 100 2004±132 1 95 2172±88 +8％S 2.5 100 2599±163 +29％S 10 103 2889±74 +44％S
表1清楚地表明了对胶原蛋白I合成的刺激作用(S：显著性在0.05水平)。
b.2)从分别按照实施例1和实施例2所述方法制得的提取物开始，与用人参皂苷R0进行实验所得到的结果差不多。
这些结果总结于下列表2中。
表2 产物浓度μg/mlng胶原蛋白I/10,000HF/48h％刺激率/ 对照 p对照Asc.25μM+ DMSO0.1％ 2466±289 实施例1 1 2805±197 +14％ S(p＝0.021) 2.5 2888±405 +17％ S(p＝0.045) 10 3501±307 +42％ S(p＝0.003) 实施例2 1 3026±412 +23％ S(p＝0.0006) 2.5 3171±385 +28％ S(p＝0.0008) 10 3544±310 +44％ S(p＝0.0006) 人参皂苷R0 1 2482±276 +1％ NS 1.5 3529±516 +43％ S(p＝0.024) 10 4099±480 +66％ S(p＝0.002)实施例4：证明对胶原蛋白III合成的刺激作用
a)方法：
与上述刺激胶原蛋白I合成的实验方法相同，但其ELISA法针对胶原蛋白III(人)，培养基处理时间是72小时而不是48小时。
b)结果
在R0存在下，胶原蛋白III的合成受到刺激：
2.5μg/ml时：+33％
10μg/ml时：+81％
下面给出各种化妆品或药物组合物，特别是皮肤科药物组合物的实施例，但这些实施例同样不构成对本发明的限制。实施例5：促进皮肤组织系统形成的化妆品组合物
人参皂苷R0 0.3g
乙醇 2.0g
防腐剂 0.2g
1.25％Carbopol 940凝胶加至100g
应用：在需要防止或对抗皮肤“松驰”作用的部位每天敷用两次。实施例6：强化皮肤的化妆品组合物人参皂苷R0 0.6g透明质酸 0.1g百提取物 0.4g
赋形剂＋防腐剂 加至100g
应用：在待处理部位每天按摩两次，共4周。实施例7：用于愈合皮肤伤口的软膏
人参皂苷R0 1g
维生素A棕榈酸盐 0.05g
氧化锌 0.1g
甘油 1g
软膏赋形剂 加至100g实施例8：伤口愈合粉末
按照法国专利FR 2685 635中所述的方法制备包含复合固体颗粒的粉末。该粉末具有下列组成(重量比)：
—尼龙粉末(由平均直径约为20μm的颗粒组成的载体颗粒)：97
—蜕皮甾酮(ecdysterone)：1
—人参皂苷R0：2
在无菌清洁损伤组织后，将此粉末局部施用于溃疡型损伤部位，每天2至3次。实施例9：促进成纤维细胞的胶原蛋白产生量的培养基
人参皂苷R0 10mg
视黄酸 0.3mg
抗坏血酸 1.8mg
脯氨酸 25mg
甘氨酸 20mg
赖氨酸 20mg
E199-C培养基 加至100mg