用于治疗代谢异常的组合物和方法以引用的方式并入作为文本文件提供的序列表
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相关申请的交叉引用
本申请要求2014年7月30日提交的美国临时申请序列号62/031,063和2015年7月
23日提交的美国临时申请序列号62/195,908的优先权权益，所述申请是以全文引用的方式
并入本文中。
发明领域
本发明尤其涉及适用于治疗代谢相关病状的多肽及其组合物。
引言
肥胖的最常见原因为过度食物摄取伴随有限能量消耗和/或缺少身体锻炼。肥胖
使罹患各种疾病的可能性增加，所述疾病为诸如糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、冠状动脉
病、睡眠呼吸暂停、痛风、风湿病和关节炎。此外，死亡风险与肥胖直接相关，使得例如超过
40的身体质量指数导致平均预期寿命减少10年以上。
当前药理学治疗形态包括靶向诸多受体类别(例如CB1、5-HT2C和NPY)的食欲抑制
剂；下视丘中的食欲回路和饥饿素的分子作用的调节剂；和靶向脂肪酶的营养吸收抑制剂。
不幸的是，当前形态中无一者显示可有效地治疗肥胖而不导致不良反应，一些不良反应可
能非常严重。
高血糖水平刺激胰脏β细胞分泌胰岛素。胰岛素又刺激葡萄糖进入肌肉和脂肪细
胞中，导致糖原和甘油三酯的储存以及蛋白质的合成。各种细胞类型上的胰岛素受体的活
化通过增加葡萄糖摄取和利用以及通过减少肝脏葡萄糖输出而降低循环葡萄糖水平。此调
节网络内的破环会导致糖尿病和相关病理综合征，其所影响的人口百分比较大且不断增
长。
患有葡萄糖代谢异常的患者可能受高血糖症、高胰岛素血症和/或葡萄糖不耐受
困扰。通常与异常葡萄糖和/或胰岛素水平相关的异常的实例为胰岛素抗性，其中肝脏、脂
肪和肌肉细胞丧失其响应正常血液胰岛素水平的能力。
鉴于肥胖、糖尿病和相关代谢和非代谢异常的流行和严重性，在患者中调节例如
食欲、葡萄糖和/或胰岛素水平且增强对波动的葡萄糖水平的生物反应的治疗形态仍备受
关注。
已经将野生型GDF15，也称为MIC-1(巨噬细胞抑制性细胞因子-1)，与体重调节相
关联(Tsai VW等人,PLoS One 2013；8(2):e55174；US8,192,735)。
发明概要
提供了具有与成熟野生型人GDF15(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列具有至少90％同
一性的连续氨基酸序列的多肽。本发明的多肽涵盖GDF15突变蛋白、经修饰的GDF15和经修
饰的GDF15突变蛋白。还提供了这些多肽的组合物。本发明涵盖本文中所描述的多肽及其组
合物用于治疗或预防体重相关的异常和/或葡萄糖代谢异常的用途。
如以上所指出，提供包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％一致性的连
续氨基酸序列的多肽。所述连续氨基酸序列包含对SEQ ID NO:1中的相应氨基酸的以下成
对取代中的至少一个：i)D5T/S和R21N；ii)R16N和H18T/S；iii)S23N和E25T/S；iv)L24N和
D26T/S；v)S50N和F52T/S或F52N和A54T/S；vi)Q51N和R53T/S或R53N和A55T/S；vi)S64N和
H66T/S；vii)L65N和R67T/S；viii)S82N和N84T/S；ix)K91N和D93T/S或D93N和G95T/S；x)
T94N和V96T/S或V96N和L98T/S；xi)S97N和Q99T/S；以及xii)A106N和D108T/S。
举例来说，所述连续氨基酸序列可包含对SEQ ID NO:1中的相应氨基酸的以下成
对取代中的至少一个：i)D5T和R21N或D5S和R21N；ii)R16N和H18T或R16N和H18S；iii)S23N
和E25T或S23N和E25S；iv)L24N和D26T或L24N和D26S；v)S50N和F52T；S50N和F52S；F52N和
A54T；或F52N和A54S；vi)Q51N和R53T；Q51N和R53S；R53N和A55T；或R53N和A55S；vi)S64N和
H66T或S64N和H66S；vii)L65N和R67T或L65N和R67S；viii)S82N和N84T或S82N和N84S；ix)
K91N和D93T；K91N和D93S；D93N和G95T；或D93N和G95S；x)T94N和V96T；T94N和V96S；V96N和
L98T；或V96N和L98S；xi)S97N和Q99T或S97N和Q99S；以及xii)A106N和D108T或A106N和
D108S。
在某些实施方案中，所述多肽可包含对SEQ ID NO:1中的相应氨基酸的以下成对
取代中的至少一个：D5T和R21N；S23N和E25T/S；R53N和A55T/S；S64N和H66T/S；K91N和D93T/
S；D93N和G95T/S；S97N和Q99T/S；以及A106N和D108T/S。
在某些实施方案中，所述多肽可包含对SEQ ID NO:1中的相应氨基酸的以下成对
取代中的至少一个：D5T和R21N；D5S和R21N；S23N和E25T；S23N和E25S；R53N和A55T；R53N和
A55S；S64N和H66T；S64N和H66S；K91N和D93T；K91N和D93S；D93N和G95T；D93N和G95S；S97N和
Q99T；S97N和Q99S；A106N和D108T；以及A106N和D108S。
在某些实施方案中，所述多肽可包含对SEQ ID NO:1中的相应氨基酸的以下成对
取代中的至少一个：D5T和R21N；S64N和H66T/S；K91N和D93T/S；D93N和G95T/S；以及S97N和
Q99T/S。
在其它实施方案中，所述多肽可包含对SEQ ID NO:1中的相应氨基酸的以下成对
取代中的至少一个：K91N和D93T或K91N和D93S；以及D93N和G95T或D93N和G95S。在其它实施
方案中，所述多肽可包含对SEQ ID NO:1中的相应氨基酸的以下成对取代：K91N和D93T。
在例示性实施方案中，所述连续氨基酸序列可与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有
至少95％同一性。
在其它实施方案中，所述连续氨基酸序列可为至少98个氨基酸长，且可与SEQ ID
NO:1的氨基酸序列具有至少90％同一性，其中所述多肽的C端氨基酸对应于SEQ ID NO:1中
位置112上的异亮氨酸。
在其它实施方案中，所述连续氨基酸序列可为至少98个氨基酸长，且可与SEQ ID
NO:1的氨基酸序列具有至少95％同一性，其中所述多肽的C端氨基酸对应于SEQ ID NO:1中
的位置112上的异亮氨酸。
本文中所公开的例示性多肽包括至少98个氨基酸长、与SEQ ID NO:1的氨基酸序
列具有至少90％同一性且相对于SEQ ID NO:1具有氨基酸缺失的连续氨基酸序列。举例来
说，所述多肽相对于SEQ ID NO:1可具有N端截短。所述截短可为相对于SEQ ID NO:1的1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14个或更多个氨基酸，例如1至14个氨基酸、3至14个氨基酸、
6至14个氨基酸或3至6个氨基酸。
在某些情况下，所述连续氨基酸序列为至少98个氨基酸长、与SEQ ID NO:1的氨基
酸序列具有至少90％同一性，且不包括对应于SEQ ID NO:1的N末端上所存在的前三个氨基
酸的前三个氨基酸，其中所述C端氨基酸对应于SEQ ID NO:1中的位置112上的异亮氨酸。
在某些情况下，所述连续氨基酸序列为至少98个氨基酸长、与SEQ ID NO:1的氨基
酸序列具有至少90％同一性，且不包括对应于SEQ ID NO:1的N末端上所存在的前六个氨基
酸的前六个氨基酸，其中所述C端氨基酸对应于SEQ ID NO:1中的位置112上的异亮氨酸。
在某些情况下，所述连续氨基酸序列为至少98个氨基酸长、与SEQ ID NO:1的氨基
酸序列具有至少90％同一性，且不包括对应于SEQ ID NO:1的N末端上所存在的前十四个氨
基酸的前十四个氨基酸，其中所述C端氨基酸对应于SEQ ID NO:1中的位置112上的异亮氨
酸。
在某些情况下，所述多肽可包括N末端的信号序列，诸如IgK信号序列。所述信号序
列可经由接头与所述多肽缀合，所述接头可为可裂解接头。
本文中还提供从N末端至C末端连续包括以下各物的融合蛋白质：异源多肽-
[(G4S)]5-GDF15；异源多肽-[(G4S)]5-ΔN3-GDF15；或异源多肽-[(G4S)]5-ΔN6-GDF15。
在例示性实施方案中，所述异源多肽可为血清白蛋白、麦芽糖结合蛋白或免疫球
蛋白Fc多肽。所述血清白蛋白可为人血清白蛋白、食蟹猕猴血清白蛋白或牛血清白蛋白。所
述融合蛋白质可包括N末端的信号序列。所述信号序列可为IgK信号序列。
本文中还提供编码上述多肽或融合蛋白质的核酸分子。所述核酸分子可操作地连
接至可赋予编码所述多肽或所述融合蛋白质的核酸分子的体外或体内表达的表达控制元
件。还涵盖包含所述核酸分子的载体。所述载体可为病毒载体。
一些实施方案包括表达上述多肽中的一种或多种的转化细胞或宿主细胞。
在本发明的特定实施方案中，对上述多肽中的一种或多种进行配制以产生药物组
合物，其中所述组合物还包含一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。在某些实
施方案中，药物组合物还包含至少一种附加预防剂或治疗剂。
本发明的其它实施方案包含特异性结合至上述突变蛋白多肽之一的抗体。在一些
实施方案中，所述抗体包含独立多肽中或单一多肽中所存在的轻链可变区和重链可变区。
在某些实施方案中，本发明的抗体以约107M-1至约1012M-1的亲和力结合所述多肽。在其它实
施方案中，所述抗体包含同型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。在其它实施方案中，所
述抗体经可检测地标记，而在其它实施方案中，其为Fv、scFv、Fab、F(ab')2或Fab'。
本发明还涵盖包含共价连接的非多肽聚合物(例如聚(乙二醇)聚合物)的抗体。在
其它实施方案中，所述抗体包含选自脂质部分、脂肪酸部分、多糖部分和碳水化物部分的共
价连接的部分。
在一些实施方案中，所述抗体为单链Fv(scFv)抗体，且在其它实施方案中，所述
scFv经多聚。
本发明的抗体可为但不限于单株抗体、多株抗体或人源化抗体。
此外，本发明涵盖包含如上所描述的抗体与至少一种药学上可接受的赋形剂、载
体或稀释剂的制剂的药物组合物。此类药物组合物还可含有至少一种附加预防剂或治疗
剂。
本发明的某些实施方案涵盖含有以上所提及的药物组合物之一和任选一种或多
种其它组分的无菌容器。举例来说，但不具限制性，所述无菌容器可为注射器。在其它实施
方案中，所述无菌容器为试剂盒的一个组件；所述试剂盒还可含有例如含有至少一种预防
剂或治疗剂的第二无菌容器。
本文中还公开了制备上述多肽或融合蛋白质的方法。所述方法可包括对表达所述
多肽或所述融合蛋白质的宿主细胞进行培养；和对所表达的多肽或融合蛋白质进行纯化。
本发明还涵盖在受试者(例如人)中治疗或预防葡萄糖代谢异常的方法，所述方法
是通过向所述受试者施用治疗有效量的上述多肽或融合蛋白质。在一些方法中，所述治疗
或预防引起所述受试者的血浆葡萄糖降低、所述受试者的血浆胰岛素降低、所述受试者的
体重和/或食物摄取减少或葡萄糖耐受性增加。在特定实施方案中，所述葡萄糖代谢异常为
糖尿病。
还公开了治疗或预防受试者的体重异常的方法。所述方法可包括向所述受试者施
用本发明的多肽或融合蛋白质，其中所述多肽或所述融合蛋白质是以有效治疗或预防所述
受试者的体重异常的量施用。在一些方法中，所述治疗或预防引起受试者的体重和/或食物
摄取减少。
在一些实施方案中，所述受试者肥胖和/或存在体重异常。
尽管不限于任何特定施用途径或给药方案，但在一些实施方案中，所述施用是通
过肠胃外(例如皮下)注射。
附图简述
图1显示本文中所公开的GDF15突变蛋白的氨基酸序列与野生型(WT)成熟人GDF15
的氨基酸序列的比对。
图2显示本文中所公开的ΔN3-GDF15突变蛋白的氨基酸序列与WT成熟人GDF15的
氨基酸序列的比对。ΔN3-hGDF15突变蛋白缺少成熟hGDF15的N末端上所存在的前3个氨基
酸(ARN)。
图3描绘两种融合蛋白质(构建体M1和M2)，其从N末端至C末端连续包括：IgK信号
序列(小写字母)(IgK)-人血清白蛋白氨基酸(D25-L609)序列(HSA)-不可裂解(Gly-Gly-
Gly-Gly-Ser)3接头[(G4S)]3(加下划线)-成熟人GDF15氨基酸序列(hGDF15)(加粗)。构建体
M1(IgK-HSA-[(G4S)]3-hGDF15)含有全长成熟hGDF15，而构建体M2(IgK-HSA-[(G4S)]3-Δ
N3-hGDF15)含有ΔN3-hGDF15，其中缺失对应于成熟hGDF15的N末端上的氨基酸的前3个氨
基酸(ARN)。
图4描绘构建体M1和M2从CHOK1SV GSKO稳定细胞系培养基的非还原型考马斯蓝染
色SDS-PAGE表达凝胶。星号(*)表示M1中在从CHOK1SV分泌期间出现的剪切物质。对剪切位
点的LC/MS鉴别使得设计稳定性提高构建体(M2)，其含有成熟hGDF15的N末端上的3个氨基
酸截短(ΔARN或ΔN3)。
图5描绘含具有经由不可裂解[(G4S)]5接头(加下划线)与成熟人GDF15氨基酸序列
(加粗)的N末端融合的IgK信号序列(小写字母)的人血清白蛋白氨基酸(D25-L609)序列的
两种融合分子。构建体M3(IgK-HSA-[(G4S)]5-ΔN3-hGDF15)含有成熟hGDF15的N末端上的3
个氨基酸截短(ΔARN)；而构建体M4(IgK-HSA-[(G4S)]5-ΔN6-hGDF15)含有相对于成熟
hGDF15的N末端的6个氨基酸截短(ΔARNGDH)。
图6描绘单次快速皮下施用媒介物、M1、M3和M4融合分子(40nmol/kg)后对饮食诱
导型肥胖(DIO)小鼠的食物摄取的效应。如图中所指示，在给药后24小时和给药后7天测定
食物摄取参数。在各组小鼠中，n＝8且p值(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)是通过在各
规定时间点比较不同的剂量组与媒介物对照组的非配对T检定来确定。
图7描绘单次快速皮下施用媒介物、M1、M3和M4融合分子(40nmol/kg)后对DIO小鼠
的体重的效应。如图中所指示，在给药后24小时和给药后7天相对于给药前群组体重确定体
重参数。在各组小鼠中，n＝8且p值(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)是通过在各规定时
间点比较不同的剂量组与媒介物对照组的非配对T检定来确定。
图8A描绘通过引入N连接的糖基化一致位点而产生的单糖基化和二糖基化突变蛋
白的氨基酸序列(M5至M21)。这些序列包括与成熟人GDF15氨基酸序列(加粗)的N末端融合
的IgK信号序列(小写字母)。图8B描绘编码图8A中所描绘的氨基酸序列的核酸序列。图8C描
绘ΔN3-M16的氨基酸序列和编码ΔN3-M16的核酸序列。图8D描绘含有IgK信号序列的WT成
熟人GDF15氨基酸序列(IgK-WT-GDF15)的氨基酸序列和编码IgK-WT-GDF15的核酸序列。
图9提供图8A中和针对ΔN3-M16所阐述的各经工程改造的N-糖基化人GDF15突变
蛋白的分泌和二聚体形成的汇总以及相对溶解度的改善。
图10描绘单次皮下施用媒介物(PBS)、GDF15、M16、ΔN3-M16和M17多肽(1mg/kg
(40nmol/Kg))后对饮食诱导型肥胖(DIO)小鼠的食物摄取的效应。
图11描绘单次皮下施用媒介物(PBS)、GDF15、M16、ΔN3-M16和M17多肽(1mg/kg
(40nmol/Kg))后对DIO小鼠的体重的效应。
发明详述
在进一步描述本发明的方法和组合物之前，应理解本发明不限于本文中所阐述的
特定实施方案，且还应理解本文中所使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而不欲
具有限制性。
在提供值的范围的情况下，应理解，除非上下文另外清楚地指出，否则该范围的上
限与下限之间(直至下限单位的十分之一)的各居中值和该所阐述范围内的任何其它所阐
述值或居中值涵盖在本发明内。服从于所阐述范围中的任何明确排除的界限，这些较小范
围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，且也涵盖在本发明内。在所阐述范围包括界
限的一者或两者的情况下，排除那些所包括的界限中的任一者或两者的范围也包括在本发
明中。除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技
术人员通常所理解相同的含义。
必须注意，如本文中和所附权利要求书中所使用，除非上下文另外清楚地指示，否
则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述”包括多个参考物。因而，举例来说，对“所述突变多
肽”的提及包括对一种或多种突变多肽的提及等等。应进一步注意，可起草权利要求书以排
除任何可选要素。因而，此陈述意欲充当结合陈述权利要求书要素来使用此类排他性术语
(诸如“仅仅”、“仅”和类似术语)或使用“负”限制的前提条件。
提供本文中所论述的公开案仅仅由于其公开内容在本申请的提交日期之前。在本
文中不应理解为承认本发明由于先前发明而无权先于该公开案。此外，所提供的公开日期
可能与实际公开日期不同，由此可能需要独立地证实。
定义
术语“患者”或“受试者”可互换用于指人类或非人类动物(例如哺乳动物)。
术语“治疗(treat/treating/treatment)”及其类似术语是指在已诊断出、观测到
和类似地发现疾病、病症或病状或其症状之后开始以便暂时地或永久地消除、减轻、抑制、
缓解或改善困扰受试者的疾病、病症或病状的至少一个根本病因或与困扰受试者的疾病、
病症、病状相关的至少一种症状的动作过程(诸如施用药剂，例如多肽或包含多肽的药物组
合物)。因而，治疗包括抑制(即，阻遏疾病、病症或病状或与其相关的临床症状的发展或进
一步发展)活动性疾病(例如，以便降低血流中的胰岛素和/或葡萄糖的水平，增加葡萄糖耐
受性以便使葡萄糖水平波动最小化，和/或以便防止由破环葡萄糖体内平衡所致的疾病)。
如本文中所使用的术语“需要治疗”是指由医师或其它照护者判断受试者需要或
将受益于治疗。此判断是基于在医师或照护者的专长领域中的多种因素而作出。
术语“预防(prevent/preventing/prevention)”和类似术语是指一般在倾向于患
有特定疾病、病症或病状的受试者的情形下，以暂时地或永久地预防、遏制、抑制或减轻受
试者罹患疾病、病症、病状或其类似状况的风险(如通过例如不存在临床症状所确定)或延
迟其发作的方式(例如在疾病、病症、病状或其症状发作之前)开始的动作过程(诸如施用药
剂，例如多肽或包含多肽的药物组合物)。在某些情况下，所述术语还指减缓疾病、病症或病
状的进展，或抑制其进展至有害或非所需状态。
如本文中所使用的术语“需要预防”是指由医师或其它照护者判断受试者需要或
将受益于预防性照护。此判断是基于医师或照护者的专长领域中的多种因素而作出。
词组“治疗有效量”是指单独或作为药物组合物的一部分且以单次剂量或作为一
系列剂量的一部分施用受试者的药剂的量当施用患者时能够对疾病、病症或病状的任何症
状、方面或特征具有任何可检测的正面效应。治疗有效量可通过测量相关生理学效应来确
定。举例来说，在高血糖病状的情况下，可使用血糖的降低或减少或葡萄糖耐受性测试的改
善来确定药剂的量对治疗高血糖病状是否有效。举例来说，治疗有效量为足以减少或降低
空腹血浆葡萄糖(FPG)的任何水平(例如基线水平)的量，其中举例来说，所述量足以将大于
200mg/dl的FPG水平减至小于200mg/dl，其中所述量足以将介于175mg/dl与200mg/dl之间
的FPG水平减至小于起始水平，其中所述量足以将介于150mg/dl与175mg/dl之间的FPG水平
减至小于起始水平，其中所述量足以将介于125mg/dl与150mg/dl之间的FPG水平减至小于
起始水平，以此类推(例如将FPG水平减至小于125mg/dl、小于120mg/dl、小于115mg/dl、小
于110mg/dl等等)。在HbAIc水平的情况下，有效量为足以使水平减少或降低超过约10％至
9％、超过约9％至8％、超过约8％至7％、超过约7％至6％、超过约6％至5％的量，以此类推。
更特定地，本发明涵盖HbA1c水平减少或降低约0.1％、0.25％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、
0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、33％、35％、40％、45％、50％
或更多。可结合给药方案和对受试者病状的诊断分析和类似因素来调节治疗有效量。
词组“以足以实现某一变化的量”意谓在施用特定疗法之前(例如基线水平)和之
后所测量的指标水平之间存在可检测的差异。指标包括任何客观参数(例如葡萄糖或胰岛
素或食物摄取的水平)或主观参数(例如受试者对健康或食欲的感觉)。
如本文中所使用的词组“葡萄糖耐受性”是指当葡萄糖摄取波动时受试者控制血
浆葡萄糖和/或血浆胰岛素水平的能力。举例来说，葡萄糖耐受性涵盖受试者在约120分钟
内使血浆葡萄糖水平减至摄取葡萄糖之前所测定的水平的能力。
术语“糖尿病”是指涉及胰岛素产生或利用不足的进行性碳水化合物代谢疾病，通
常以高血糖和糖尿为特征。术语“糖尿病前期(pre-diabetes/pre-diabetic)”是指受试者
不具有在糖尿病中通常观测到的特征、症状和类似状态但具有如果不加以治疗则可能发展
成糖尿病的特征、症状和类似状态的状态。这些状况的存在可使用例如空腹血浆葡萄糖
(FPG)测试或口服葡萄糖耐受性测试(OGTT)来确定。两者通常皆需要受试者在开始测试之
前空腹至少8小时。在FPG测试中，在空腹结束之后测量受试者的血液葡萄糖；一般来说，受
试者空腹隔夜且在早晨受试者进食之前测量血液葡萄糖。健康受试者一般将具有介于约90
与约100mg/dl之间的FPG浓度，患有“糖尿病前期”的受试者一般将具有介于约100与约
125mg/dl之间的FPG浓度，且患有“糖尿病”的受试者一般将具有约126mg/dl以上的FPG水
平。在OGTT中，在空腹之后且在饮用富葡萄糖饮料之后两小时再次测量受试者的血液葡萄
糖。在消费富葡萄糖饮料之后两小时，健康受试者一般具有约140mg/dl以下的血液葡萄糖
浓度，糖尿病前期受试者一般具有约140至约199mg/dl的血液葡萄糖浓度，且糖尿病受试者
一般具有约200mg/dl或200mg/dl以上的血液葡萄糖浓度。尽管上述血糖值涉及人类受试
者，但在鼠类受试者中差异性地定标为正常高血糖、适度高血糖和明显高血糖。健康鼠类受
试者在四小时空腹之后一般将具有介于约100与约150mg/dl之间的FPG浓度，患有“糖尿病
前期”的鼠类受试者一般将具有介于约175与约250mg/dl之间的FPG浓度，且患有“糖尿病”
的鼠类受试者一般将具有约250mg/dl以上的FPG浓度。
如本文中所使用的术语“胰岛素抗性”是指正常量的胰岛素不能产生正常生理或
分子反应的病状。在一些情况下，内源产生或外源施用的高于生理量的胰岛素能够完全或
部分地克服胰岛素抗性且产生生物反应。
术语“代谢综合征”是指包括但不限于高胰岛素血症、异常葡萄糖耐受性、肥胖、脂
肪再分布于腹部或上体腔、高血压、异常纤维蛋白溶解和以高甘油三酯、低高密度脂蛋白
(HDL)-胆固醇和高小致密低密度脂蛋白(LDL)颗粒为特征的血脂异常的相关特质分群。患
有代谢综合征的受试者处在发展2型糖尿病和/或其它病症(例如动脉粥样硬化)的风险下。
词组“葡萄糖代谢异常”涵盖以与相对于健康个体，受试者葡萄糖水平升高和/或
胰岛素水平升高相关的临床症状或临床症状组合为特征的任何异常。葡萄糖和/或胰岛素
水平升高可尤其体现于以下疾病、病症和病状中：高血糖症、II型糖尿病、妊娠期糖尿病、I
型糖尿病、胰岛素抗性、葡萄糖耐受性不良、高胰岛素血症、葡萄糖代谢不良、糖尿病前期、
其它代谢异常(诸如代谢综合征，其也称为综合征X)和肥胖。本发明的多肽及其组合物可以
用于例如达成和/或维持葡萄糖体内平衡，例如使血流中的葡萄糖水平减少和/或使胰岛素
水平减少至健康受试者中所发现的范围。
如本文中所使用的术语“高血糖”是指相对于健康个体，升高量的葡萄糖在受试者
的血浆中循环的病状。高血糖可使用本领域中已知的方法来诊断，包括测量如本文中所描
述的空腹血糖水平。
如本文中所使用的术语“高胰岛素血症”是指当伴随血液葡萄糖水平升高或正常
时存在升高水平的循环胰岛素的病状。高胰岛素血症可由与以下各项相关的胰岛素抗性造
成：血脂异常，诸如高甘油三酯、高胆固醇、高低密度脂蛋白(LDL)和低高密度脂蛋白(HDL)；
高尿酸水平；多囊卵巢综合征；II型糖尿病；和肥胖。高胰岛素血症可诊断为具有高于约2μ
U/mL的血浆胰岛素水平。
如本文中所使用，词组“体重异常”是指与体重过度和/或食欲增强相关的病状。使
用各种参数来确定受试者与参考健康个体相比是否过重，包括受试者的年龄、身高、性别和
健康状态。举例来说，受试者可通过评定受试者的身体质量指数(BMI)而被视为过重或肥
胖，身体质量指数是通过受试者的体重(公斤)除以受试者身高(米)的平方来计算。具有在
约18.5至约24.9kg/m2范围内的BMI的成人被视为具有正常体重；具有介于约25与约
29.9kg/m2之间的BMI的成人被视为过重(肥胖前期)；且具有约30kg/m2或更高BMI的成人被
视为肥胖。食欲增强往往促成过度体重。存在若干种与食欲增强相关的病状，包括例如夜间
进食综合征，其特征在于往往与失眠相关的早晨厌食和傍晚贪食，但其可能与对下视丘的
损伤有关。
术语“活化剂”是指例如刺激、增加、活化、促进、增强活化、致敏或上调一种或多种
药剂的功能或活性的药剂，例如用于治疗或预防代谢异常的多肽。另外，活化剂包括通过与
本发明多肽相同的作用机制起作用(即，以类似于所述多肽的方式调节与所述多肽相同的
信号传导途径的药剂)且能够引发与所述多肽相当(或更大)的生物反应的药剂。活化剂的
实例包括激动剂，诸如小分子化合物。
术语“调节剂”总体上是指本发明多肽和活化剂。
术语“调节”和类似术语是指药剂(例如活化剂)直接或间接地增加一种或多种多
肽(或编码其的核酸分子)功能或活性的能力；或药剂产生与一种或多种多肽相当的效应的
能力。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换用于指任何长度的氨基酸的聚合形
式，其可包括基因编码和非基因编码的氨基酸、经化学或生物化学修饰或衍生化的氨基酸，
和具有经修饰的多肽主链的多肽。所述术语包括融合蛋白质，包括但不限于具有异源氨基
酸序列的融合蛋白质、具有异源和同源前导序列且有或无N末端甲硫氨酸残基的融合蛋白
质；经免疫标记的蛋白质；及其类似物。在特定实施方案中，所述术语是指任何长度的氨基
酸的多聚形式，所述氨基酸包括基因编码氨基酸。在特定实施方案中，所述术语是指任何长
度的氨基酸的多聚形式，所述氨基酸包括与异源氨基酸序列融合的基因编码氨基酸。在特
定实施方案中，所述术语是指任选地与异源序列融合的112个氨基酸长的氨基酸。在特定实
施方案中，任选地而定，当提及本文中所公开和描述的蛋白质和分子时，术语“多肽”、“肽”
和“蛋白质”是指如本文中所定义的多肽。
应了解，在本发明全文中，根据单字母或三字母代码参考氨基酸。为方便读者，以
下提供单字母和三字母氨基酸代码：
如本文中所使用，术语“变体”涵盖天然存在的变体(例如同系物和等位基因变体)
和非天然存在的变体(例如，经重组修饰)。天然存在的变体包括同系物，即，在一个物种与
另一物种之间分别在核苷酸或氨基酸序列方面不同的核酸和多肽。天然存在的变体包括等
位基因变体，即在某一物种内的一个个体与另一个个体之间分别在核苷酸或氨基酸序列方
面不同的核酸和多肽。非天然存在的变体包括分别在核苷酸或氨基酸序列中包含变化的核
酸和多肽，其中所述序列变化是人工引入，例如，所述变化是在实验室或其它设施中由人干
预(“人工”)而产生。
术语“天然”或“野生型”在参考GDF15时是指天然存在的生物学活性GDF15，包括天
然存在的生物学活性GDF15变体。所述术语包括112个氨基酸的人GDF15成熟序列(SEQ ID
NO:1)。
如本文中所使用的术语“突变蛋白”在广义上指重组蛋白，即，在氨基酸序列中包
含人工引入的变化，例如在实验室或其它设施中通过人干预("人工")在氨基酸序列中产生
的变化的多肽。这些多肽通常携带单个或多个氨基酸取代或缺失，且通常来源于已进行定
点诱变或随机诱变的克隆基因或来源于完全合成的基因。因而相对于参考多肽，例如相对
于成熟人GDF15(SEQ ID NO:1)，本发明的“GDF15突变蛋白”涵盖例如氨基酸取代和/或氨基
酸缺失(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个或更多个氨基酸的N端截短)。
如本文中参考天然人GDF15或GDF15突变蛋白所使用，术语“经修饰”、“修饰”和类
似术语是指改变人GDF15、天然存在的GDF15变体或GDF15突变蛋白的性质的一个或多个变
化，其中所述变化不改变GDF15的原生氨基酸序列。此种性质包括例如溶解度、循环半衰期、
稳定性、清除率、免疫原性或致过敏性和可制造性(例如成本和效率)。“修饰”包括不改变
GDF15多肽(天然或突变蛋白)本身的原生氨基酸序列的共价化学修饰。对人GDF15、天然存
在的GDF15变体或GDF15突变蛋白可进行的变化包括但不限于聚乙二醇化(一个或多个聚乙
二醇(PEG)分子或其衍生物的共价连接)；糖基化(例如N-糖基化)、聚唾液酸化和羟乙基淀
粉化；麦芽糖结合蛋白融合；白蛋白融合(例如HSA融合)；经由例如缀合的脂肪酸链的白蛋
白结合(酰化)；Fc融合；和与PEG模拟物融合。一些特定实施方案需要涉及聚乙二醇的修饰，
其它特定实施方案需要涉及白蛋白的修饰，且其它特定修饰需要涉及糖基化的修饰，或其
组合。
术语“DNA”、“核酸”、“核酸分子”、“聚核苷酸”和类似术语在本文中可互换用于指
任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式。聚核苷酸的非
限制性实例包括线性和环形核酸、信使RNA(mRNA)、互补DNA(cDNA)、重组聚核苷酸、载体、探
针、引物及其类似物。
术语“探针”是指对应于相关基因或序列的DNA或RNA片段，其中所述片段已经放射
性标记(例如，通过并入32P或35S)或一些其它可检测分子，诸如生物素、洋地黄毒苷
(digoxygenin)或荧光素。由于具有互补序列的DNA或RNA段将杂交，故可使用探针，例如，以
标记含有相关基因的病毒斑、细菌群落或凝胶谱带。探针可为克隆DNA，或其可为合成DNA
链；后者可用于通过例如对蛋白质的一部分进行微量测序、推断编码所述蛋白质的核酸序
列、合成携带所述序列的寡核苷酸、对所述序列进行放射性标记和使用其作为探针来筛选
cDNA文库或基因组文库而从分离的蛋白质获得cDNA或基因组克隆。
术语“异源”是指两种组分由来源于不同来源的结构限定。举例来说，在多肽的情
形下，“异源”多肽可包括来源于不同的多肽的可操作地连接的氨基酸序列(例如，第一组分
包含重组多肽，而第二组分来源于天然GDF15多肽)。类似地，在编码嵌合多肽的聚核苷酸的
情形下，“异源”聚核苷酸可包括可来源于不同的基因的可操作地连接的核酸序列(例如，第
一组分来自编码根据本文中所公开的一个实施方案的多肽的核酸，而第二组分来自编码载
体多肽的核酸)。其它例示性“异源”核酸包括包含编码序列的核酸可操作地连接至来自不
同于所述编码序列的基因来源(例如，以便在相关宿主细胞中表达，其可能属于不同于所述
启动子、所述编码序列或两者的基因来源)的调节元件(例如启动子)的表达构建体。举例来
说，可操作地连接至编码GDF15多肽或其结构域的聚核苷酸的T7启动子称为异源核酸。在重
组细胞的情形下，“异源”可指存在属于不同于其所存在的宿主细胞的基因来源的核酸(或
基因产物，诸如多肽)。
术语“可操作地连接”是指用于提供所要功能的分子间键联。举例来说，“可操作地
连接”在核酸的情形下是指核酸序列之间的功能键联。举例来说，核酸表达控制序列(诸如
启动子、信号序列或转录因子结合位点阵列)可能可操作地连接至第二聚核苷酸，其中所述
表达控制序列影响第二聚核苷酸的转录和/或转译。在多肽的情形下，“可操作地连接”是指
用于提供多肽的所描述活性的氨基酸序列(例如不同的结构域)间功能键联。
如本文中所使用，在多肽结构的情形下，“N末端”(或“氨基末端”)和“C末端”(或
“羧基末端”)分别是指最终氨基和羧基端，而术语“N端”和“C端”分别是指在多肽的氨基酸
序列中的相对位置接近N末端和C末端，且分别可包括N末端和C末端上的残基。“紧邻N端”或
“紧邻C端”是指第一氨基酸残基相对于第二氨基酸残基的位置，其中所述第一氨基酸残基
和所述第二氨基酸残基共价结合以提供连续氨基酸序列。
“来源于”在氨基酸序列或聚核苷酸序列的情形下(例如，“来源于”GDF15多肽的氨
基酸序列)意欲指示所述多肽或核酸具有基于参考多肽或核酸(例如，天然存在的GDF15多
肽或GDF15编码核酸)的序列，而不欲限制产生蛋白质或核酸的来源或方法。举例来说，术语
“来源于”包括参考氨基酸或DNA序列的同系物或变体。
在多肽的情形下，术语“经分离”是指如果天然存在则处在不同于其可天然存在的
环境中的相关多肽。“经分离”意欲包括基本上富含相关多肽和/或相关多肽部分地或基本
上经纯化的样品内的多肽。在多肽非天然存在的情况下，“经分离”指示所述多肽已与通过
合成或重组手段产生其的环境分离。
“富含”意谓样品经非天然处置(例如在实验室中，例如由科学家或临床医师)，使
得相关多肽以如下浓度存在：a)比起始样品，诸如生物样品(例如多肽天然存在或多肽在投
药后存在的样品)中的多肽浓度高(例如高至少3倍、高至少4倍、高至少8倍、高至少64倍或
更高)的浓度，或b)比产生多肽的环境(例如，如在细菌细胞中)高的浓度。
“基本上纯”指示组分(例如，多肽)组成组合物的总含量的约50％以上，且典型地
大于总多肽含量的约60％。更典型地，“基本上纯”是指总组合物的至少75％、至少85％、至
少90％或更多为相关组分的组合物。在一些情况下，所述多肽将组成组合物的总含量的大
于约90％或大于约95％。
术语“抗体”(Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)是指具有相同结构特征的糖蛋白。尽管抗体
对特定抗原展现结合特异性，但免疫球蛋白包括抗体和缺少抗原特异性的其它抗体样分
子。下文详细描述抗体。
术语“单株抗体”是指获自基本上同源的抗体群体的抗体，即，构成所述群体的个
别抗体为同一的，但可能存在微量的可能天然存在的突变。单克隆抗体具有高特异性，针对
单一抗原位点。与可包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多株抗体制剂相反，各单株
抗体针对抗原上的单一决定簇。
在抗体的情形下，术语“经分离”是指已与其天然环境的污染组分分离和/或从其
中回收的抗体；此种污染组分包括可能干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，且可包括酶、激
素和其它蛋白质或非蛋白质溶解物。
词组“保守氨基酸取代”是指对以下各组内的氨基酸残基的取代：1)L、I、M、V、F；2)
R、K；3)F、Y、H、W、R；4)G、A、T、S；5)Q、N；和6)D、E。保守氨基酸取代可通过以含具有类似酸度、
碱度、电荷、极性或侧链尺寸的侧链的氨基酸置换蛋白质中的氨基酸来保留蛋白质的活性。
对取代、插入或缺失的指导可基于对来自不同物种的不同变异蛋白质的氨基酸序列的比
对。
生长分化因子15(GDF15)
GDF15，也称为MIC-1(巨噬细胞抑制细胞因子-1)、PDF(前列腺分化因子)、PLAB(胎
盘骨形态发生蛋白)、NAG-1(非类固醇消炎药(NSAID)活化基因)、TGF-PL和PTGFB，为转化生
长因子β(TGF-β)超家族的成员。GDF15分泌为25kDa二硫连接的蛋白质，其合成为62kDa细胞
内前驱蛋白，随后由弗林蛋白酶样蛋白酶裂解。[参见例如Fairlie等人,J.Leukoc.Biol
65:2-5(1999)]。GDF15mRNA见于若干组织中，包括肝脏、肾脏、胰脏、结肠和胎盘，且肝脏中
的GDF15表达在诸如肝脏、肾脏、心脏和肺的器官损伤期间可显著上调。
GDF15前驱体为含有具有29个氨基酸的信号肽、具有167个氨基酸的前结构域和由
弗林蛋白酶样蛋白酶从前结构域切除的具有112个氨基酸的成熟结构域的具有308个氨基
酸的多肽(NCBI参考序列NP_004855.2)。308个氨基酸的GDF15多肽称为“全长”GDF15多肽；
112个氨基酸的GDF15多肽(“全长”GDF15多肽的氨基酸197至308)为“成熟”GDF15多肽(SEQ
ID NO:1)。除非另外指示，否则术语“GDF15”是指112个氨基酸的成熟人类序列。另外，参考
特定GDF15残基的数字是指112个氨基酸的成熟序列(即，残基1为Ala(A)，且残基112为Ile
(I)；参见SEQ ID NO:1)。值得注意的是，尽管GDF15前驱氨基酸序列预计三个切除位点，从
而产生“成熟”人GDF15的三种推定形式(即，110、112和115个氨基酸)，但112个氨基酸的成
熟序列被视为正确的。
本发明的范围包括来自其它哺乳动物物种的GDF15异种同源物及其经修饰形式及
其用途，包括小鼠(NP_035949)、黑猩猩(XP_524157)、猩猩(XP_002828972)、恒河猴
(EHH29815)、大猫熊(XP_002912774)、长臂猿(XP_003275874)、豚鼠(XP_003465238)、白鼬
(AER98997)、奶牛(NP_001193227)、猪(NP_001167527)、狗(XP_541938)和鸭嘴兽(鸭嘴兽
(Ornithorhynchus anatinus)；AFV61279)。人GDF15的成熟形式与小鼠异种同源物具有约
67％氨基酸同一性。
为方便起见，下文所描述的经修饰的人GDF15分子、GDF15变体(例如突变蛋白)和
经修饰的GDF15突变蛋白总体上称为“多肽”。应注意，结合本发明的多肽和核酸分子对“人”
的任何引用均不欲限制多肽或核酸的获得方式或来源，而是仅在其可能对应于天然存在的
人多肽或核酸分子的序列时参考所述序列。在特定实施方案中，所述经修饰的人GDF15分子
为N-糖基化二聚体。在特定实施方案中，所述经修饰的人GDF15分子为N-糖基化同源二聚
体。除人类多肽和编码其的核酸分子以外，本发明还涵盖GDF15相关多肽和来自其它物种的
相应核酸分子。
A.具有所要物理性质的多肽
本发明部分涵盖包含与SEQ ID NO:1(112个氨基酸长的成熟人GDF15)的氨基酸序
列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的连续氨基酸序
列的多肽。相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列，所述多肽可包括一个或多个氨基酸取代和/
或缺失。在某些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列，除氨基酸取代以外，本发明
的多肽还可包括氨基酸缺失。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列，本发
明的多肽可包括氨基酸缺失。
为方便和清楚起见，使用SEQ ID NO:1的氨基酸序列作为本文中所提供的多肽的
参考序列。因此，在本文中参考SEQ ID NO:1对氨基酸残基位置进行编号。以下提供SEQ ID
NO:1的序列：
ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLK
PDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
在一些实施方案中，本发明的多肽可包括一、二、三或更多个氨基酸取代、添加或
缺失从而在SEQ ID NO:1中不存在N连接的糖基化一致位点的位置上引入一个或多个此种
位点。N连接的糖基化一致位点包括序列NXS/T，其中N为Asn；X为除脯氨酸以外的氨基酸；随
后为Ser(S)或Thr(T)。
本发明多肽的实例包括在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中不存在糖基化一致位点
(例如，N连接的糖基化一致位点)的氨基酸位置上具有一、二、三、四个或更多个此种位点的
多肽。
在某些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1，所述多肽可包括氨基酸取代从而在取代
位置上提供一个N连接的糖基化一致位点(例如，可通过一个取代将SEQ ID NO:1中的NGD序
列变成NGT/S；取代位置加下划线)。在其它情况下，相对于SEQ ID NO:1，所述多肽可包括两
个氨基酸取代从而在取代位置上提供一个N连接的糖基化一致位点(例如，可通过两个取代
将SEQ ID NO:1中的KTD序列变成NTT/S；取代位置加下划线)。在一些实施方案中，相对于
SEQ ID NO:1，所述多肽可包括三个氨基酸取代从而在取代位置上提供一个N连接的糖基化
一致位点(例如，可通过三个取代将SEQ ID NO:1中的GPG序列变成NTT/S；取代位置加下划
线)。
在某些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1，所述多肽可包括一个或多个氨基酸缺失
从而在缺失位置上提供N连接的糖基化一致位点。举例来说，SEQ ID NO:1中的
NGDHCPLGPGRCCRLHT序列可通过缺失氨基酸D至H(加下划线)而得以改变，从而提供N连接的
糖基化一致位点：NGT。
在某些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1，所述多肽可包括一个或多个氨基酸添加
从而在添加位置上提供N连接的糖基化一致位点。通过添加一个氨基酸来引入N连接的糖基
化一致位点的实例包括向SEQ ID NO:1中的序列LHT添加N，从而产生序列LNHT，其中NHT为N
连接的糖基化一致位点。
如上所述，相对于SEQ ID NO:1，所述多肽可包括一个或多个取代且所述取代可编
号为SEQ ID NO:1中相应氨基酸的位置。
在某些实施方案中，所述多肽可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的连续氨基酸序列，其中相对于SEQ
ID NO:1中的相应氨基酸，所述连续氨基酸序列具有以下成对取代中的至少一个：
i)D5T和R21N或D5S和R21N；
ii)R16N和H18T或R16N和H18S；
iii)S23N和E25T或S23N和E25S；
iv)L24N和D26T或L24N和D26S；
v)S50N和F52T；S50N和F52S；F52N和A54T；或F52N和A54S；
vi)Q51N和R53T；Q51N和R53S；R53N和A55T；或R53N和A55S；
vi)S64N和H66T或S64N和H66S；
vii)L65N和R67T或L65N和R67S；
viii)S82N和N84T或S82N和N84S；
ix)K91N和D93T；K91N和D93S；D93N和G95T；或D93N和G95S；
x)T94N和V96T；T94N和V96S；V96N和L98T；或V96N和L98S；
xi)S97N和Q99T或S97N和Q99S；以及
xii)A106N和D108T或A106N和D108S。
举例来说，以上i)中的取代表示所述多肽在对应于SEQ ID NO:1中的氨基酸位置5
的氨基酸位置上具有苏氨酸(T)或丝氨酸(S)，其中在SEQ ID NO:1中，所述氨基酸位置5上
存在天冬酰胺(D)。以T或S取代位置5上的D可由D5T/S表示。相对于SEQ ID NO:1，多肽中的
相应氨基酸的位置可通过比对氨基酸序列来确定。
在某些实施方案中，所述多肽可包括在SEQ ID NO:1中不存在N-糖基化一致序列
的位置上提供单一N-糖基化一致序列的两个氨基酸取代(成对取代)。此类取代的实例包括
R16N和H18T/S；K91N和D93T/S；T94N和V96T/S；和以上列出的其它取代。R16N和H18T/S表示
所述多肽在对应于SEQ ID NO:1的位置16的位置上具有N，其中在SEQ ID NO:1中存在R，且
所述多肽在对应于SEQ ID NO:1的位置18的位置上具有T或S，其中存在H。由于SEQ ID NO:1
中的序列RXH(在位置16至18上)不包括N连接的糖基化一致序列的任何残基，故成对取代使
得引入N连接的糖基化一致序列。
在替代实施方案中，单一氨基酸取代可能足以提供N连接的糖基化一致序列，举例
来说，由于SEQ ID NO:1中存在序列NGD(在位置3至5上)，故以T或S对D进行单一取代分别产
生序列NGT或NGS，两者皆为N-糖基化一致序列。
在某些情况下，可向野生型GDF15中引入多于一个N-糖基化一致序列。举例来说，
野生型GDF15氨基酸序列可通过取代和/或缺失以提供一、二、三、四个或更多个N-糖基化一
致序列而经修饰。在某些实施方案中，所述多肽可包括112个连续氨基酸，其与SEQ ID NO:1
的112个氨基酸序列具有至少90％的序列同一性，其中所述112个连续氨基酸包括一、二、
三、四个或更多个N-糖基化一致序列，诸如1-12、1-10、1-8、1-6、1-4、1-3或1-2个N-糖基化
一致序列。
具有两个N-糖基化一致序列的多肽的一个实例包括在位置5上(相对于SEQ ID
NO:1)具有T/S且在位置21上(相对于SEQ ID NO:1)具有N的GDF15突变蛋白。
本发明的例示性多肽包括具有两个或更多个N连接的糖基化一致序列的多肽。举
例来说，所述多肽可包括以下成对取代中的两个或更多个的组合：
i)D5T和R21N或D5S和R21N；
ii)R16N和H18T或R16N和H18S；
iii)S23N和E25T或S23N和E25S；
iv)L24N和D26T或L24N和D26S；
v)S50N和F52T；S50N和F52S；或F52N和A54T；或F52N和A54S；
vi)Q51N和R53T；Q51N和R53S；或R53N和A55T；或R53N和A55S；
vi)S64N和H66T；或S64N和H66S；
vii)L65N和R67T；或L65N和R67S；
viii)S82N和N84T或S82N和N84S；
ix)K91N和D93T；K91N和D93S；或D93N和G95T；或D93N和G95S；
x)T94N和V96T；T94N和V96S；或V96N和L98T；或V96N和L98S；
xi)S97N和Q99T；或S97N和Q99S；和
xii)A106N和D108T或A106N和D108S。
在某些实施方案中，所述多肽可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的连续氨基酸序列，其中相对于SEQ
ID NO:1中的相应氨基酸，所述连续氨基酸序列具有以下成对取代中的至少一个：
i)D5T和R21N或D5S和R21N；
ii)R16N和H18T或R16N和H18S；
iii)S23N和E25T或S23N和E25S；
iv)S50N和F52T；S50N和F52S；F52N和A54T；或F52N和A54S；
v)Q51N和R53T；Q51N和R53S；R53N和A55T；或R53N和A55S；
vi)S64N和H66T；或S64N和H66S；
vii)K91N和D93T；K91N和D93S；D93N和G95T；或D93N和G95S；
viii)T94N和V96T；T94N和V96S；V96N和L98T；或V96N和L98S；
ix)S97N和Q99T；或S97N和Q99S；以及
x)A106N和D108T或A106N和D108S；
其中所述取代产生一个或多个具有序列NXS/T的N连接的糖基化一致位点，其中N
为Asn；X为除脯氨酸以外的氨基酸；随后为Ser(S)或Thr(T)，且此外其中一个或多个N连接
的糖基化一致位点连接至N聚糖。在另一个实施方案中，所述多肽形成二聚体。在另一个实
施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:1具有N端截短和/或C端截短。相对于参考多肽，例如
SEQ ID NO:1，所述截短可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多个氨基酸。在一个
特定实施方案中，所述多肽具有GDF15中前三个N端残基截短(ΔARN或ΔN3)。在另一个实施
方案中，所述多肽在缓冲溶液中具有至少0.5mg/ml，例如至少1mg/ml、至少2mg/ml、至少
3mg/ml、至少4mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、至少20mg/ml或
至少25mg/ml的溶解度，例如在0.5mg/ml至25mg/ml、0.5mg/ml至20mg/ml、1mg/ml至25mg/
ml、1mg/ml至20mg/ml、3mg/ml至25mg/ml、3mg/ml至20mg/ml、5mg/ml至25mg/ml、5mg/ml至
20mg/ml或5mg/ml至18mg/ml范围内的溶解度。在某些情况下，所述多肽在缓冲溶液中具有
至少0.5mg/ml，例如至少1mg/ml、至少2mg/ml、至少3mg/ml、至少4mg/ml、至少5mg/ml、至少
8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、至少20mg/ml或至少25mg/ml的溶解度，例如在0.5mg/
ml至25mg/ml、0.5mg/ml至20mg/ml、1mg/ml至25mg/ml、1mg/ml至20mg/ml、3mg/ml至25mg/
ml、3mg/ml至20mg/ml、5mg/ml至25mg/ml、5mg/ml至20mg/ml或5mg/ml至18mg/ml范围内的溶
解度。所述缓冲液可为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液、PIPES缓冲液
或类似缓冲液或其组合。在某些情况下，所述缓冲液可包括磷酸盐缓冲盐水。在某些情况
下，所述缓冲液可包括Tris、磷酸钾和氯化钠。在一些情况下，所述缓冲液可包括Tris、磷酸
钾、氯化钠和甲酸。举例来说，所述缓冲液可包括10mM至100mM Tris pH 7、1mM至50mM磷酸
钾、100mM至200mM氯化钠和10mS/cm至30mS/cm甲酸。在其它实施方案中，所述多肽使血液葡
萄糖水平、体重和/或食物摄取与施用所述多肽之前相比降低至少10％、20％、30％、50％、
60％、70％、80％或90％。
在某些实施方案中，所述多肽可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的连续氨基酸序列，其中相对于SEQ
ID NO:1中的相应氨基酸，所述连续氨基酸序列具有以下成对取代中的至少一个：
i)D5T和R21N；
ii)S23N和E25T；
iii)F52N和A54T；
iv)R53N和A55T；
v)S64N和H66T；
vi)K91N和D93T；
vii)D93N和G95T；
viii)S97N和Q99T；以及
ix)A106N和D108T；
其中所述取代产生一个或多个具有序列NXS/T的N连接的糖基化一致位点，其中N
为Asn；X为除脯氨酸以外的氨基酸；随后为Ser(S)或Thr(T)，且此外其中一个或多个N连接
的糖基化一致位点连接至N聚糖。在另一个实施方案中，所述多肽形成二聚体。在另一个实
施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:1具有N端截短和/或C端截短。相对于参考多肽，例如
SEQ ID NO:1，所述截短可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多个氨基酸。在一个
特定实施方案中，所述多肽具有GDF15中前三个N端残基截短(ΔARN或ΔN3)。在另一个实施
方案中，所述多肽在缓冲溶液中具有至少0.5mg/ml，例如至少1mg/ml、至少2mg/ml、至少
3mg/ml、至少4mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、至少20mg/ml或
至少25mg/ml的溶解度，例如在0.5mg/ml至25mg/ml、0.5mg/ml至20mg/ml、1mg/ml至25mg/
ml、1mg/ml至20mg/ml、3mg/ml至25mg/ml、3mg/ml至20mg/ml、5mg/ml至25mg/ml、5mg/ml至
20mg/ml或5mg/ml至18mg/ml范围内的溶解度。在某些情况下，所述多肽在缓冲溶液中具有
至少0.5mg/ml，例如至少1mg/ml、至少2mg/ml、至少3mg/ml、至少4mg/ml、至少5mg/ml、至少
8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、至少20mg/ml或至少25mg/ml的溶解度，例如在0.5mg/
ml至25mg/ml、0.5mg/ml至20mg/ml、1mg/ml至25mg/ml、1mg/ml至20mg/ml、3mg/ml至25mg/
ml、3mg/ml至20mg/ml、5mg/ml至25mg/ml、5mg/ml至20mg/ml或5mg/ml至18mg/ml范围内的溶
解度。所述缓冲液可为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液、PIPES缓冲液
或类似缓冲液或其组合。在某些情况下，所述缓冲液可包括磷酸盐缓冲盐水。在某些情况
下，所述缓冲液可包括Tris、磷酸钾和氯化钠。在一些情况下，所述缓冲液可包括Tris、磷酸
钾、氯化钠和甲酸。举例来说，所述缓冲液可包括10mM至100mM Tris pH 7、1mM至50mM磷酸
钾、100mM至200mM氯化钠和10mS/cm至30mS/cm甲酸。在其它实施方案中，所述多肽使血液葡
萄糖水平、体重和/或食物摄取与施用所述多肽之前相比降低至少10％、20％、30％、50％、
60％、70％、80％或90％。在特定实施方案中，所述多肽包含以下各项或基本上由其组成：
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ
ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:30。在特定实施方案中，所述多肽包
含以下各项或基本上由其组成：SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:
88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97或SEQ ID
NO:100。在某些实施方案中，所述多肽可包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少95％同
一性的连续氨基酸序列，其中相对于SEQ ID NO:1中的相应氨基酸，所述连续氨基酸序列具
有以下成对取代中的至少一个：
i)D5T和R21N；
ii)S64N和H66T；
iii)K91N和D93T；
iv)D93N和G95T；以及
v)S97N和Q99T；其中所述取代产生一个或多个具有序列NXS/T的N连接的糖基化一
致位点，其中N为Asn；X为除脯氨酸以外的氨基酸；随后为Ser(S)或Thr(T)，其中一个或多个
N连接的糖基化一致位点连接至N聚糖；此外，其中所述多肽形成二聚体；且此外，其中所述
多肽在缓冲溶液中具有至少1mg/ml的溶解度。
在其它实施方案中，所述多肽在缓冲溶液中具有至少5mg/ml的溶解度。所述缓冲
液可为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液、PIPES缓冲液或类似缓冲液
或其组合。在某些情况下，所述缓冲液可包括磷酸盐缓冲盐水。在某些情况下，所述缓冲液
可包括Tris、磷酸钾和氯化钠。在一些情况下，所述缓冲液可包括Tris、磷酸钾、氯化钠和甲
酸。举例来说，所述缓冲液可包括10mM至100mM Tris pH 7、1mM至50mM磷酸钾、100mM至
200mM氯化钠和10mS/cm至30mS/cm甲酸。在其它实施方案中，所述多肽使血液葡萄糖水平、
体重和/或食物摄取与施用所述多肽之前相比降低至少10％、20％、30％、50％、60％、70％、
80％或90％。在另一个实施方案中，所述多肽相对于SEQ ID NO:1具有N端截短和/或C端截
短。相对于参考多肽，例如SEQ ID NO:1，所述截短可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14或更多个氨基酸。在一个特定实施方案中，所述多肽具有GDF15中前三个N端残基截短(Δ
ARN或ΔN3)。在特定实施方案中，所述多肽包含以下各项或基本上由其组成：SEQ ID NO:2、
SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:30。在特定实施
方案中，所述多肽包含以下各项或基本上由其组成：SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:89、SEQ ID
NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:96或SEQ ID NO:100。
在某些实施方案中，所述多肽可包含与SEQ ID NO:1的112个氨基酸序列具有至少
90％的序列同一性的112个连续氨基酸，其中所述112个连续氨基酸包括上述成对取代中的
一种、两种、三种、四种或更多种。
图1描绘本发明涵盖的例示性多肽(编号1至17)的氨基酸序列与野生型成熟人
GDF15(WT hGDF15；SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的比对。在图1中，描绘包括两个N连接的糖
基化一致位点的多肽(编号为1的突变体；SEQ ID NO:2)以及包括一个N连接的糖基化一致
位点的多肽(编号为2至17的突变体；分别为SEQ ID NO:3至18)。
在某些实施方案中，本发明涵盖经修饰的GDF15N-糖基化二聚体，其中所述二聚体
包含彼此共价接合的本文中所公开的两个多肽。在特定实施方案中，所述两个多肽各自包
含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID
NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:30，或相
差至多5个氨基酸的氨基酸；其中所述多肽含有至少一个经N-糖基化的N-糖基化位点。在特
定实施方案中，所述两个多肽各自包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:
4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:
17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:30，或相差至多2个氨基酸的氨基酸；其中所述多肽含有至
少一个经N-糖基化的N-糖基化位点。在特定实施方案中，所述两个多肽各自由选自以下的
氨基酸序列组成：SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:
89、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97或SEQ ID NO:100，或相差
至多5个氨基酸的氨基酸；其中所述多肽含有至少一个经N-糖基化的N-糖基化位点。在特定
实施方案中，所述两个多肽各自由选自以下的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:
83、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID
NO:96、SEQ ID NO:97或SEQ ID NO:100，或相差至多2个氨基酸的氨基酸；其中所述多肽含
有至少一个经N-糖基化的N-糖基化位点。在其它实施方案中，所述经修饰的GDF15N-糖基化
二聚体为由链间二硫键接合的同源二聚体。在其它实施方案中，所述经修饰的GDF15N-糖基
化二聚体为具有两个如本文中所公开的多肽的同源二聚体，各多肽包含相同的氨基酸序
列，其中所述多肽含有至少一个经N-糖基化的N-糖基化位点。
本发明还涵盖作为上述多肽的活性片段(例如子序列)的多肽。活性片段或子序列
的长度可为40个氨基酸至111个氨基酸，例如40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、98、
106、109或直至111个氨基酸。
所述多肽与参考序列相比在所定义长度的连续氨基酸(例如“比较窗”)上具有所
定义的序列同一性。用于比较的序列比较方法在本领域中为熟知的。通过以下方式进行用
于比较的最佳序列比对，例如通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部
同源性算法、通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法、通过
Pearson和Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性检索法、通过计算
机实施这些算法(Wisconsin Genetics Software Package,Madison,Wis.)中的GAP、
BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过手工比对和直观检查(参见例如Current Protocols in
Molecular Biology(Ausubel等人编,1995年增刊))。
举例来说，适合的多肽可包含与SEQ ID NO:1中的40、45、50、55、60、65、70、75、80、
85或直至112个氨基酸的连续段具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至
少约95％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
本文中所公开的多肽的例示性片段包括相对于SEQ ID NO:1具有氨基酸缺失的多
肽。举例来说，所述多肽相对于SEQ ID NO:1可具有N端截短和/或C端截短。相对于参考多
肽，例如SEQ ID NO:1，所述截短可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多个氨基
酸。在某些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1，相关多肽可包括引入N连接的糖基化一致序列
(诸如本文中所公开的序列)的一个或多个取代和N端截短和/或C端截短。
在某些实施方案中，所述多肽可为至少98个氨基酸长且与SEQ ID NO:1中98个氨
基酸的相应段具有至少90％的氨基酸序列同一性。此多肽可能缺少SEQ ID NO:1的N末端上
所存在的前三个至前十四个氨基酸(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸)，而
保留SEQ ID NO:1的C末端上所存在的氨基酸。换句话说，所缺失的氨基酸对应于SEQ ID
NO:1的N末端氨基酸。
在某些实施方案中，所述GDF15突变蛋白可为至少106个氨基酸长且与SEQ ID NO:
1中106个氨基酸的相应段具有至少90％的氨基酸序列同一性。所述GDF15突变蛋白可能缺
少SEQ ID NO:1的N末端上所存在的前六个氨基酸。
在某些实施方案中，所述多肽可为至少109个氨基酸长且与SEQ ID NO:1中109个
氨基酸的相应段具有至少90％的氨基酸序列同一性。所述GDF15突变蛋白可能缺少SEQ ID
NO:1的N末端上所存在的前三个氨基酸。
本发明的例示性多肽描绘于图2中。图1中所描绘的例示性多肽(编号1至17)与WT
hGDF15具有相同长度。图2中所描绘的例示性多肽(编号18至34；SEQ ID NO:19-35)为109个
氨基酸长，因为相对于WT hGDF15，其包括三个N末端氨基酸缺失(ΔN3)。然而，当指代氨基
酸取代的位置时，所指示的残基编号为对应于WT成熟hGDF15(WT；SEQ ID NO:1)中的位置的
编号。因而，所述多肽的N端上的氨基酸G被称为残基4，但其为多肽氨基酸序列中的第一氨
基酸。
如上所述，相对于SEQ ID NO:1的序列，这些多肽片段可包括一个或多个引入N-糖
基化一致序列的氨基酸取代，诸如本文中所公开的一、二或更多个氨基酸取代。
如上文所指示且如下文更详细描述，本发明的多肽可通过例如以下方式而经修
饰：聚乙二醇化(一个或多个聚乙二醇(PEG)分子或其衍生物的共价连接)；糖基化(例如N-
糖基化)；聚唾液酸化；白蛋白融合分子，其包含血清白蛋白(例如，人血清白蛋白(HSA)、食
蟹猕猴血清白蛋白或牛血清白蛋白(BSA))；经由例如缀合的脂肪酸链的白蛋白结合(酰
化)；Fc融合；和与PEG模拟物融合。在某些实施方案中，以位点特异性方式引入修饰。在其它
实施方案中，所述修饰包括接头。所述接头可使修饰部分与所述多肽缀合。
在特定实施方案，本发明涵盖通过与白蛋白缀合对成熟人GDF15和GDF15突变蛋白
(诸如上述多肽)的修饰。在其它实施方案中，本发明涵盖经由N-糖基化或O-糖基化对多肽
的修饰。下文进一步描述白蛋白及其多肽缀合物(例如融合蛋白质)和糖基化多肽的特征。
用于修饰和/或模拟GDF15功能的特定修饰
多肽可包括一个或多个增强经配制以用于疗法的蛋白质所需的性质(例如血清半
衰期)、使得能够产生用于检测分析的抗体(例如表位标签)、容易进行蛋白质纯化的修饰。
此类修饰包括但不限于聚乙二醇化(一个或多个聚乙二醇(PEG)分子或其衍生物的共价连
接)；糖基化(N连接和O连接)；聚唾液酸化；白蛋白融合；经由例如缀合的脂肪酸链的白蛋白
结合(酰化)；Fc融合蛋白质；和与PEG模拟物融合。
如本文中所阐述，本发明涵盖包含成熟GDF15多肽(例如，成熟人GDF15)或GDF15突
变蛋白多肽(例如，成熟人GDF15的突变蛋白)的融合分子，其中所述成熟GDF15多肽或GDF15
突变蛋白多肽包含至少一个不改变其氨基酸序列的修饰，且其中所述修饰改善所述多肽或
所述突变蛋白多肽的至少一种物理性质。在一个实施方案中，所述GDF15多肽或GDF15突变
蛋白多肽修饰包含与血清白蛋白(例如，人血清白蛋白(HSA)、食蟹猕猴血清白蛋白或牛血
清白蛋白(BSA))缀合。在一些实施方案中，所述物理性质为溶解度。
在所述融合分子包含与白蛋白缀合的经修饰GDF15多肽或GDF15突变蛋白(诸如以
上所公开的多肽)的实施方案中，相对于未缀合的重组人GDF15，所述融合分子的溶解度一
般得以改善。在某些实施方案中，所述融合分子在pH 7.0的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中具
有至少1mg/mL的溶解度。在其它实施方案中，所述融合分子具有至少2mg/mL、至少3mg/mL、
至少4mg/mL或至少5mg/mL的溶解度。在其它实施方案中，所述融合分子在pH 7.0的磷酸盐
缓冲生理盐水(PBS)中具有至少6mg/mL、至少7mg/mL、至少8mg/mL、至少9mg/mL或至少10mg/
mL的溶解度。在特定实施方案中，所述融合分子具有大于10mg/mL的溶解度。
聚乙二醇化：蛋白质治疗剂的临床效果往往受短血浆半衰期和对蛋白酶降解的敏
感性限制。对各种治疗蛋白质(例如非格司亭(filgrastim))的研究已显示，此类困难可通
过各种修饰来克服，包括将所述多肽序列缀合或连接至多种非蛋白质聚合物中的任一种，
例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯(参见例如，典型地经由与蛋白质和非蛋白质聚
合物(例如PEG)共价结合的连接部分)。此类PEG缀合的生物分子已显示具有临床适用的性
质，包括较好的物理和热稳定性、针对酶促降解敏感性的保护、增加的溶解度、较长体内循
环半衰期和降低的清除率、降低的免疫原性和抗原性，和降低的毒性。
适合于与多肽序列缀合的PEG一般在室温下可溶于水，且具有通式R(O-CH2-CH2)
nO-R，其中R为氢或诸如烷基或烷醇基的保护基，且其中n为整数1至1000。当R为保护基时，
其一般具有1至8个碳。与多肽序列缀合的PEG可为线型或枝化的。本发明涵盖枝化PEG衍生
物“星形PEG”和多臂PEG。本发明中所使用的PEG的分子量不局限于任何特定范围，但某些实
施方案具有介于500与20,000之间的分子量，而其它实施方案具有介于4,000与10,000之间
的分子量。
本发明还涵盖其中PEG具有不同的n值且因而各种不同的PEG以特定比率存在的缀
合物的组合物。举例来说，一些组合物包含n＝1、2、3和4的缀合物的混合物。在一些组合物
中，n＝1的缀合物的百分比为18％至25％，n＝2的缀合物的百分比为50％至66％，n＝3的缀
合物的百分比为12％至16％，且n＝4的缀合物的百分比为至多5％。此类组合物可通过本领
域中已知的反应条件和纯化方法来制备。举例来说，可以使用阳离子交换色谱来分离缀合
物，且随后鉴别含有连接有例如所要数目的PEG的缀合物的级分，加以纯化使得不含未经修
饰的蛋白质序列和连接有其它数目的PEG的缀合物。
PEG可经由末端反应基团而结合于本发明的多肽。末端反应基团可介导一个或多
个多肽序列的自由氨基或羧基与聚乙二醇之间的键。末端反应基团可连接至离散长度的聚
乙二醇间隔基。这些PEG间隔基增加试剂和缀合物溶解度、与非PEG间隔基相比使毒性和免
疫学效应最小化，且提供若干选项以容纳PEG与多肽之间的特定交联距离。具有反应基团的
例示性PEG间隔基包括胺反应性聚乙二醇化交联剂(例如双(丁二酰亚胺基)五(乙二醇)BS
(PEG)5))；巯基反应性聚乙二醇化交联剂(1,11-双顺丁烯二酰亚胺基三乙二醇(BM
(PEG)3))；双官能聚乙二醇化交联剂(NHS-PEGn-顺丁烯二酰亚胺丁二酰亚胺基-([N-顺丁
烯二酰亚胺基丙酰胺基]-乙二醇)酯(SM(PEG)n；n＝2至24)。PEG间隔基可结合于自由氨基。
PEG间隔基包括N-羟基丁二酰亚胺聚乙二醇，其可通过用N-羟基丁二酰亚胺活化聚乙二醇
丁二酸酯来制备。可与自由氨基结合的另一经活化聚乙二醇为2,4-双(O-甲氧基聚乙二
醇)-6-氯-s-三嗪，其可通过使聚乙二醇单甲基醚与氰尿酰氯反应来制备。与自由羧基结合
的经活化聚乙二醇包括聚乙二醇二胺。
一个或多个本发明多肽序列与具有间隔基的PEG缀合可通过各种常规方法来进
行。举例来说，缀合反应可利用4:1至30:1的试剂与蛋白质摩尔比，在5至10的pH值下、4℃至
室温的温度下在溶液中进行30分钟至20小时。可选择反应条件以指引反应朝向主要产生所
要取代度。一般来说，低温、低pH值(例如pH＝5)和短反应时间倾向于减少所连接的PEG数
目，而高温、中性至高pH值(例如pH≥7)和较长反应时间倾向于增加所连接的PEG数目。本领
域中已知的各种手段均可用于终止反应。在一些实施方案中，通过对反应混合物进行酸化
且在例如-20℃下冷冻来终止所述反应。
本发明还涵盖使用PEG模拟物。已开发出保留PEG的属性(例如提高血清半衰期)同
时赋予若干其它有利性质的重组PEG模拟物。举例来说，可重组产生的能够形成类似于PEG
的延伸构形的简单多肽链(包含例如Ala、Glu、Gly、Pro、Ser和Thr)已融合于相关肽或蛋白
质药物(例如Amunix'XTEN技术；Mountain View，CA)。由此回避制备过程中对附加缀合步骤
的需要。此外，已确立的分子生物学技术使得能够控制多肽链的侧链组成，从而允许优化免
疫原性和制备性质。
糖基化：出于本发明的目的，“糖基化”在广义上意指聚糖连接至蛋白质、脂质或其
它有机分子的酶促过程。结合本发明使用术语“糖基化”一般欲意谓添加或缺失一个或多个
碳水化合物部分(通过移除潜在糖基化位点或通过化学和/或酶促手段缺失糖基化)和/或
添加一个或多个天然序列中可能存在或可能不存在的糖基化位点。另外，该词组包括天然
蛋白质糖基化时的质变，包括所存在的各种碳水化合物部分的性质和比例的改变。
糖基化可显著影响蛋白质的物理性质，且还可在蛋白质稳定性、分泌和亚细胞定
位中为重要的。实际上，本文中所描述的GDF15突变蛋白多肽的糖基化赋予其物理性质以有
利改善。举例来说，但不具限制性，可通过糖基化改善GDF15突变蛋白的溶解度，且此种改善
可为实质性的(参见实施例)。本文中所描述的经糖基化的GDF15突变蛋白多肽与未经糖基
化的野生型GDF15相比具有较高溶解度。在某些实施方案中，本文中所公开的经糖基化的
GDF15突变蛋白在缓冲溶液中具有至少0.5mg/ml，例如至少1mg/ml、至少2mg/ml、至少3mg/
ml、至少4mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、至少20mg/ml或至少
25mg/ml的溶解度，例如在0.5mg/ml至25mg/ml、0.5mg/ml至20mg/ml、1mg/ml至25mg/ml、
1mg/ml至20mg/ml、3mg/ml至25mg/ml、3mg/ml至20mg/ml、5mg/ml至25mg/ml、5mg/ml至20mg/
ml或5mg/ml至18mg/ml范围内的溶解度。在某些情况下，本文中所描述的经糖基化的GDF15
突变蛋白在缓冲溶液中可具有至少0.5mg/ml，例如至少1mg/ml、至少2mg/ml、至少3mg/ml、
至少4mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、至少20mg/ml或至少
25mg/ml的溶解度，例如在0.5mg/ml至25mg/ml、0.5mg/ml至20mg/ml、1mg/ml至25mg/ml、
1mg/ml至20mg/ml、3mg/ml至25mg/ml、3mg/ml至20mg/ml、5mg/ml至25mg/ml、5mg/ml至20mg/
ml或5mg/ml至18mg/ml范围内的溶解度。所述缓冲液可为磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES
缓冲液、MOPS缓冲液、PIPES缓冲液或类似缓冲液或其组合。在某些情况下，所述缓冲液可包
括磷酸盐缓冲盐水。在某些情况下，所述缓冲液可包括Tris、磷酸钾和氯化钠。在一些情况
下，所述缓冲液可包括Tris、磷酸钾、氯化钠和甲酸。举例来说，所述缓冲液可包括10mM至
100mM Tris pH 7、1mM至50mM磷酸钾、100mM至200mM氯化钠和10mS/cm至30mS/cm甲酸。
本文中所公开的经糖基化的GDF15突变蛋白多肽优于野生型成熟GDF15多肽。这些
经糖基化的GDF15突变蛋白多肽与野生型成熟GDF15多肽相比具有改善的特征，包括但不限
于以下各项中的一项或多项：更大的细胞培养产率、改善的二聚体形成、更大的溶解度和降
低的免疫原性。此类经修饰的GDF15突变蛋白所展现的溶解度改善可例如使得能够产生比
未经糖基化的GDF15/GDF15突变蛋白更适合于药物施用的制剂。经糖基化的GDF15/GDF15突
变蛋白多肽还可展现提高的稳定性。此外，多肽可改善一种或多种药代动力学性质，诸如半
衰期。
糖基化位点的添加可通过改变如上所描述的氨基酸序列来实现。对多肽的改变可
例如通过一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(对于O连接的糖基化位点)或天冬酰胺残基(对
于N连接的糖基化位点)添加或取代来进行。N连接和O连接的寡糖和各类型中所发现的糖残
基的结构可能不同。两者中通常发现的一种糖类型为N-乙酰神经氨酸(下文中称为唾液
酸)。唾液酸通常为N连接和O连接的寡糖的末端残基，且通过其负电荷，可赋予糖蛋白酸性
性质。本发明的一个特定实施方案包括如上文所描述的N-糖基化变体的产生和使用。
增加多肽上的碳水化合物部分的数目的另一手段为通过使糖苷化学或酶促偶合
于多肽。
二氢叶酸还原酶(DHFR)缺少型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞为用于产生重组糖蛋白的
常用宿主细胞。这些细胞不表达酶β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶，且因此不向这些细胞
中所产生的糖蛋白的N连接的寡糖添加呈α-2,6键联形式的唾液酸。
聚唾液酸化：本发明还涵盖聚唾液酸化、肽与蛋白质的缀合用于天然存在的生物
可降解α-(2→8)连接的聚唾液酸(“PSA”)以便改善其稳定性和体内药代动力学性质。PSA为
高度亲水性生物可降解无毒天然聚合物，从而赋予其在血液中的高表观分子量，由此增加
其血清半衰期。另外，多种肽和蛋白质治疗剂的聚唾液酸化引起蛋白水解作用显著减少，体
内活性得以保留且免疫原性和抗原性降低(参见例如G.Gregoriadis等人,
Int.J.Pharmaceutics 300(1-2):125-30)。如同用其它缀合物(例如PEG)进行修饰，可利用
各种位点特异性聚唾液酸化技术(参见例如T.Lindhout等人,PNAS 108(18)7397-7402
(2011))。
融合蛋白质。本发明涵盖野生型成熟GDF15(例如人GDF15)的融合蛋白质以及本发
明多肽(例如，经修饰的人GDF15分子、人GDF15的突变蛋白、经修饰的GDF15突变蛋白和类似
物)的融合蛋白质。此类融合蛋白质一般由在其N末端或C末端与野生型GDF15多肽或本发明
多肽缀合的非GDF15多肽(例如，白蛋白(例如，HSA)或其片段：白蛋白结合域(ABD)；Fc多肽；
麦芽糖结合域(MBD)，其在本文中可称为“融合配偶体”)构成。任选地，融合配偶体可经由接
头多肽与野生型GDF15或多肽缀合。接头多肽可任选地为可裂解接头，例如酶可裂解接头。
融合配偶体的实例描述如下。
白蛋白融合：适合于缀合的融合配偶体包括白蛋白，诸如人血清白蛋白(HSA)、食
蟹猕猴血清白蛋白和牛血清白蛋白(BSA)。
成熟HSA为具有约20天的血清半衰期的585个氨基酸的多肽(约67kDa)，其主要负
责维持胶体渗透血压、血液pH值以及许多内源性和外源性配体的输送和分配。该蛋白具有
三个结构上同源的结构域(结构域I、结构域II和结构域III)，几乎完全呈α-螺旋构形，且通
过17个二硫桥加以高度稳定。白蛋白的三个主要药物结合区位于亚结构域IB、IIA和IIIA内
的三个结构域中的每一个上。
白蛋白合成在肝脏中发生，由此产生短寿命的主要产物前白蛋白原。因而，全长
HSA具有含18个氨基酸的信号肽，随后为含6个氨基酸的原结构域；此含24个氨基酸残基的
肽可称为前结构域原。可使用其内源性信号肽将HSA表达且分泌为前结构域原。或者，可使
用与成熟HSA融合的IgK信号肽表达并分泌HSA。前白蛋白原在内质网管腔中在其氨基末端
进行快速共转译裂解，以产生含609个氨基酸的稳定前驱多肽白蛋白原。白蛋白原随后传至
高尔基体，其在此由弗林蛋白酶依赖性氨基末端裂解转化成含585个氨基酸的成熟白蛋白。
除非另外阐述，否则“白蛋白”或“成熟白蛋白”是指HSA。
白蛋白的主要氨基酸序列、结构和功能在诸多物种中均为高度保守型，如同在白
蛋白合成和分泌过程中。在例如食蟹猕猴、奶牛、狗、兔和大鼠中发现与HSA相当的白蛋白血
清蛋白质。在非人类物种中，牛血清白蛋白(BSA)在结构上与HSA最相似。[参见例如Kosa等
人,J Pharm Sci.96(11):3117-24(2007年11月)]。本发明涵盖得自非人类物种的白蛋白
(包括但不限于以上所阐述的那些)的用途，其是用于例如与GDF15多肽融合。在某些实施方
案中，所述非人类物种为奶牛。在其它实施方案中，所述非人类物种为食蟹猕猴。
根据本发明，白蛋白可缀合于药物分子(例如，本文中所描述的多肽)的羧基末端、
氨基末端、羧基与氨基末端两者或内部(参见例如USP 5,876,969和USP 7,056,701)。此外，
本发明涵盖包含超过一个同源(例如，多个GDF15突变蛋白分子)或异源(例如，GDF15突变蛋
白分子和不同的抗糖尿病剂)药物分子的白蛋白融合蛋白质。
在本发明所涵盖的HSA-多肽缀合物中，可使用白蛋白的各种形式，诸如HSA变体，
诸如片段。此类形式一般具有一种或多种所要白蛋白活性。在其它实施方案中，本发明包括
包含直接或间接与白蛋白、白蛋白片段和白蛋白变体等融合的多肽药物分子的融合蛋白
质，其中所述融合蛋白质与未融合药物分子相比具有更高血浆稳定性，和/或所述融合蛋白
质保留所述未融合药物分子的治疗活性。在一些实施方案中，所述间接融合是通过诸如肽
接头或其经修饰型式的接头而实现。
HSA可经由接头与本文中所描述的多肽缀合以产生融合蛋白质。适合的接头的实
例描述于本文中。一些实施方案涵盖例如含四至三十个氨基酸的肽接头。
在其中所述融合蛋白质包含接头的实施方案中，所述接头可为不可裂解接头。举
例来说，在一个实施方案中，本发明描述一种融合分子，其中HSA前驱物氨基酸序列或成熟
HSA经由不可裂解(G4S)3接头与成熟人GDF15或GDF15突变蛋白氨基酸序列的N末端融合。
在其中所述融合蛋白质包含接头的其它实施方案中，所述接头可为可裂解接头。
举例来说，本发明涵盖一种融合分子，其中HSA前驱物氨基酸序列或成熟HSA氨基酸序列经
由蛋白酶敏感性(G4S)2因子Xa可裂解接头与如本文中所提供的成熟人GDF15或GDF15突变蛋
白氨基酸序列的N末端融合。
HSA可裂解接头-成熟重组GDF15/GDF15突变蛋白分子的构建以及成熟重组GDF15/
GDF15突变蛋白可裂解接头-HSA融合分子的构建可用于促进对例如GDF15/GDF15突变蛋白
的溶解度的评估和体内效力的测定。在此类实施方案中，可通过细胞内裂解或通过体外酶
促裂解从HSA侣伴蛋白中切除GDF15/GDF15突变蛋白。在一些实施方案中，切除是通过使用
任何活蛋白酶对可裂解接头进行蛋白水解消化来实现。在其它实施方案中，GDF15突变蛋白
也可经由构建与本文中所提供的多肽融合的信号肽而产生为非HSA融合物。
细胞内裂解可通过例如弗林蛋白酶或半胱天冬酶以酶促方式进行。表达所述融合
蛋白质的宿主细胞可表达低水平的这些内源性酶，所述酶能够在细胞内裂解所述融合分子
的一部分；因而，一些多肽在未与HAS缀合的情况下从细胞中分泌，而一些多肽呈包含HSA的
融合分子的形式分泌。本发明的实施方案涵盖各种弗林蛋白酶融合构建体的用途。举例来
说，可设计包含序列RGRR(SEQ ID NO:36)、RKRKKR(SEQ ID NO:37)、RKKR(SEQ ID NO:38)或
RRRKKR(SEQ ID NO:39)的构建体。此类构建体可具有以下一般结构：Igk-HSA-(G4S)2-弗林
蛋白酶序列-hGDF15。
本发明还涵盖细胞外裂解(即，离体裂解)，其中所述融合分子从细胞中分泌，经受
纯化，随后裂解(例如，使用例如因子Xa蛋白水解敏感性接头或肠激酶)。应理解，所述切除
可使整个HSA-接头复合物与多肽(例如，成熟GDF15或GDF15突变蛋白)或小于整个HSA-接头
复合物解离。
如上文所描述，白蛋白与一种或多种本发明多肽的融合可例如通过基因操纵，使
得编码HSA的DNA或其片段与编码一个或多个多肽序列的DNA接合来达成。此后，可用呈例如
适合的质粒形式的经融合核苷酸序列来转化或转染适合的宿主，以便表达融合多肽。所述
表达可在体外由例如原核或真核细胞实现，或在体内由例如转基因生物体实现。在本发明
的一些实施方案中，融合蛋白质的表达是在哺乳动物细胞系，例如CHO细胞系中进行。转化
在本文中广泛用于指由直接摄取、并入和表达来从其周围且经由细胞膜吸收的外源性遗传
物质(外源性DNA)而引起的细胞基因变化。转化在一些细菌种类中天然地发生，但其在其它
细胞中还会受人工手段影响。
此外，白蛋白本身可经修饰以延长其循环半衰期。经修饰的白蛋白与一种或多种
本发明多肽的融合可通过如上文所描述的基因操纵/重组技术或通过化学缀合来获得；所
得融合分子所具有的半衰期超过与未经修饰的白蛋白的融合物的半衰期。(参见例如
WO2011/051489)。
对于多肽(例如，本文中所描述的多肽)与重组白蛋白的基因融合和化学缀合存在
充分确立的技术平台。举例来说，可使用flex平台(Novozymes Biopharma A/
S；Denmark)来实现一种或多种重组白蛋白分子与一种或多种多肽的基因融合，从而产生编
码多肽和白蛋白的连续cDNA以产生单一同源蛋白质。所述平台可用于例如酵母和哺乳动物
宿主表达系统。进一步举例来说，可使用Flex平台(Novozymes Biopharma
A/S；Denmark)在不对白蛋白进行任何进一步衍生化的情况下实现本发明多肽与重组白蛋
白的化学缀合。虽然可在若干氨基酸残基(例如赖氨酸和酪氨酸)上进行缀合，但Cys34上的
自由硫醇基由于位点特异性而成为常用策略，从而产生更均质的最终产物。
替代白蛋白结合策略：已开发若干白蛋白结合策略作为直接融合的替代方案，包
括经由缀合脂肪酸链(酰化)的白蛋白结合。由于血清白蛋白为脂肪酸的转运蛋白，故这些
具有白蛋白结合活性的天然配体已用于小蛋白质治疗剂的半衰期延长。举例来说，已批准
用于糖尿病的产品地特胰岛素(insulin determir)(LEVEMIR)包含与经基因修饰的胰岛素
缀合，从而产生长效胰岛素类似物的肉豆蔻基链。
本发明还涵盖包含白蛋白结合域(ABD)多肽序列和一种或多种本文中所描述的多
肽的序列的融合蛋白质。本文中或文献中所描述的任何ABD多肽序列均可为融合蛋白质的
组分。融合蛋白质的组分可任选地经由接头(诸如本文中所描述的那些接头)共价键结。在
一些本发明实施方案中，融合蛋白质包含作为N端部分的ABD多肽序列和作为C端部分的本
文中所描述的多肽。
本发明还涵盖包含白蛋白结合多肽的片段的融合蛋白质，所述片段基本上保持白
蛋白结合；或白蛋白结合多肽或其片段的多聚体，所述多聚体包含至少两个白蛋白结合多
肽或其片段作为单体单元。
不希望受任何理论束缚，认为本文中所描述的多肽结合ABD多肽序列，从而与受试
者中的多肽螯合，从而引起在受试者中的作用持续时间增加。
关于ABD和相关技术的一般论述，参见WO 2012/050923、WO 2012/050930、WO
2012/004384和WO 2009/016043。
与麦芽糖结合蛋白或其片段的融合蛋白质：本发明还涵盖包含麦芽糖结合蛋白
(MBP)或其片段和一种或多种本文中所描述的多肽的氨基酸序列的融合蛋白质。在一些实
施方案中，所述MBP片段包含麦芽糖结合域(MBD)。本文中所描述或本领域中已知的任何MBP
或其片段或MBD多肽序列均可为本发明的融合蛋白质的组分。融合蛋白质的组分可任选地
经由接头(诸如本文中所描述的那些接头)共价键结。在一些本发明实施方案中，融合蛋白
质包含作为N端部分的MBP或其片段或MBD多肽序列和作为C端部分的本文中所描述的多肽。
本发明还涵盖包含MBP或MBD多肽的片段的融合蛋白质，所述片段基本上保留麦芽
糖结合活性；或麦芽糖结合多肽的多聚体或其片段(例如，MBD的多聚体)，其包含至少两个
麦芽糖结合多肽或其片段作为单体单元(例如两个或更多个MBD多肽)。
关于MBP和MBD和相关技术的一般论述，参见例如Kapust等人,(1999)Protein Sci
8(8):1668-74。
Fc融合蛋白质。本发明还涵盖包含Fc多肽或其片段和一种或多种本文中所描述的
多肽(例如，人GDF15分子、经修饰的人GDF15分子、GDF15突变蛋白和经修饰的GDF15突变蛋
白)的融合蛋白质。本文中所描述或本领域中已知的任何Fc多肽序列均可为本发明的融合
蛋白质的组分。融合蛋白质的组分可任选地经由接头(诸如本文中所描述的那些接头)共价
键结。在一些本发明实施方案中，融合蛋白质包含作为N端部分的Fc多肽序列和作为C端部
分的本文中所描述的多肽。
本发明还涵盖Fc多肽融合配偶体和包含其的融合蛋白质，其中所述Fc多肽融合配
偶体经修饰以成为带电Fc配对的一个配偶体。“带电Fc配对的配偶体”是指(i)(任选地缺少
绞链区)且包含带电配对突变的“带负电”Fc序列或(ii)(任选地缺少绞链区)且包含带电配
对突变的“带正电”Fc序列。为便于参考，“带正电”和“带负电”在本文中用于描述Fc序列中
的电荷配对突变的性质，而非指示整个序列或构建体必需具有正电荷或负电荷。适用于本
发明的多肽构建体(例如，GDF15突变蛋白、经修饰的GDF15突变蛋白)的带电Fc氨基酸序列
描述于例如WO 2013/113008中。
带正电Fc(“Fc(+)”)的实例包括包含缺少绞链区的Fc序列的天冬氨酸至赖氨酸突
变(E356K)和谷氨酸至赖氨酸突变(D399K)的Fc。带负电Fc(“Fc(-)”)的实例包括在Fc序列
中缺少绞链区且包含两个赖氨酸至天冬氨酸突变(K392D、K409D)的Fc。还可任选地缺失C端
赖氨酸(K477)。当Fc(+)多肽融合蛋白质(例如Fc(+)GDF15突变蛋白融合蛋白质)与Fc(-)多
肽融合蛋白质(例如Fc(-)GDF15突变蛋白融合蛋白质)一起培育时，天冬氨酸残基与赖氨酸
残基通过静电力缔合，从而促进在GDF15多肽融合蛋白质的Fc(+)序列与Fc(-)序列之间形
成Fc异源二聚体。
本发明还涵盖命名为“半”或“半Fc”构建体的构建体，其包含由将第一Fc序列的N
末端连接至第二Fc序列的C末端的接头串联接合的两个Fc序列。在一些实施方案中，单体包
含通过将GDF15序列的N末端连接至第一Fc序列的C末端的接头与第一Fc序列连接的多肽
(例如，成熟经修饰GDF15或突变蛋白GDF15)序列，其中所述第一Fc序列通过将第一Fc序列
的N末端连接至第二Fc序列的C末端的第二接头连接至第二Fc序列。所述第一Fc序列和所述
第二序列还通过Fc绞链区缔合。两个此类单体缔合形成二聚物，其中所述单体是经由两个
多肽序列之间的链间二硫键连接。关于适合于与本发明的GDF15突变蛋白一起使用的半Fc
多肽的实例参见WO 2013/113008。
本发明还涵盖具有Fc多肽或其片段的多聚体的融合蛋白质，包括带电Fc配对的配
偶体(例如，Fc多聚体)。
与其它分子的缀合：其它适用于缀合的组分和分子包括例如甲状腺球蛋白；破伤
风类毒素；白喉类毒素；聚氨基酸，诸如聚(D-赖氨酸:D-谷氨酸)；轮状病毒的VP6多肽；流感
病毒血球凝集素、流感病毒核蛋白；钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)；和B型肝炎病毒核心蛋白和表
面抗原；或前述各项的任何组合。
因而，本发明涵盖一种或多种其它组分或分子在多肽序列的N和/或C末端，诸如另
一蛋白质(例如，具有与目标蛋白质异源的氨基酸序列的蛋白质)或载体分子的缀合。因而，
可提供呈与另一组分或分子的缀合物形式的例示性多肽序列。
缀合物修饰可产生保留具有附加或互补功能的活性或第二分子的活性的多肽序
列。举例来说，多肽序列可与分子缀合，例如以促进溶解、储存、体内或储架半衰期或稳定
性、降低免疫原性、延迟或控制体内释放等。其它功能或活性包括相对于未缀合多肽序列降
低毒性的缀合物、比未缀合多肽序列更有效地靶向一种类型细胞或器官的缀合物或进一步
对抗与如本文中所阐述的病症或疾病(例如，糖尿病)相关的原因或效应的药物。
多肽还可与大型缓慢代谢大分子缀合，诸如蛋白质；聚糖，诸如琼脂糖凝胶、琼脂
糖、纤维素、纤维素珠粒；聚合氨基酸，诸如聚谷氨酸、聚赖氨酸；氨基酸共聚物；未活化病毒
颗粒；灭活细菌毒素，诸如得自白喉、破伤风、霍乱、白细胞毒素分子的类毒素；灭活细菌；和
树枝状细胞。此类缀合形式在需要时可用于产生针对本发明多肽的抗体。
用于缀合的其它候选组分和分子包括适用于分离或纯化者。特定非限制性实例包
括结合分子，诸如生物素(生物素-抗生物素特异性结合配对)、抗体、受体、配体、凝集素，或
包含固体载体的分子，包括例如塑料或聚苯乙烯珠粒、板或珠粒、磁性珠粒、测试条和膜。
诸如阳离子交换色谱的纯化方法可用于通过电荷差异来分离缀合物，由此将缀合
物有效地分离成其各种分子量。举例来说，可装载阳离子交换柱且随后用约20mM乙酸钠pH
～4洗涤，且随后用在pH～3至5.5下，例如，在pH～4.5下经缓冲的线性(0M至0.5M)NaCl梯度
洗脱。由阳离子交换色谱获得的级分的内含物可使用常规方法通过分子量鉴别，例如质谱、
SDS-PAGE或用于通过分子量分离分子实体的其它已知方法。
其它修饰：本发明涵盖使用当前已知或未来将要开发的用于改善一种或多种性质
的其它多肽修饰。一种用于延长本发明多肽的循环半衰期、增加稳定性、降低清除率或改变
免疫原性或过敏原性的此种方法包括通过羟乙基淀粉化修饰多肽序列，其利用与其它分子
连接的羟乙基淀粉衍生物以便改变分子的特征。各种羟乙基淀粉化方面描述于例如美国专
利申请第2007/0134197号和第2006/0258607号中。
本发明还涵盖包含SUMO作为融合标签的融合分子(LifeSensors,Inc.；Malvern，
PA)。本文中所描述的多肽与SUMO的融合可向所述多肽传输若干有益效应，包括增强表达、
改善溶解度和/或辅助纯化方法的开发。SUMO蛋白酶识别SUMO的三级结构且在SUMO的C末端
使所述融合蛋白质裂解，从而释放本文中所描述的具有所要N端氨基酸的多肽。
接头：用于修饰本发明的多肽序列的任何前述组分和分子均可任选地经由接头缀
合。适合的接头包括一般具有足够长度以容许经修饰的多肽序列与所连接的组分和分子之
间存在一些移动的“柔性接头”。接头分子可为约6至50个原子长。接头分子也可为例如芳基
乙炔、含2至10个单体单元的乙二醇寡聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。适合的接头可容
易地选择且可以具有任何适合的长度，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50个
氨基酸。
例示性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸
聚合物、甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如(GmSo)n、(GSGGS)n、(GmSoGm)n、(GmSoGmSoGm)n、(GSGGSm)n、
(GSGSmG)n和(GGGSm)n及其组合，其中m、n和o各自独立地选自至少1至20的整数，例如1-18、
2-16、3-14、4-12、5-10、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)和其它柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨
酸聚合物相对未经结构化，且因此可充当组分之间的中性系链。例示性柔性接头包括但不
限于GGSG、GGSGG、GSGSG、GSGGG、GGGSG和GSSSG。
其它柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n或甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如，(GS)n、
(GSGGS)n、(GGGS)n和(GGGGS)n，其中n＝1至50，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、
30-50)。例示性柔性接头包括但不限于GGGS(SEQ ID NO:40)、GGGGS(SEQ ID NO:41)、GGSG
(SEQ ID NO:42)、GGSGG(SEQ ID NO:43)、GSGSG(SEQ ID NO:44)、GSGGG(SEQ ID NO:45)、
GGGSG(SEQ ID NO:46)和GSSSG(SEQ ID NO:47)。这些接头序列的多聚体(例如1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10、10-20、20-30或30-50)可连接在一起以提供可用于使异源氨基酸序列与本文
中所公开的多肽缀合的柔性接头。如本文中所描述，异源氨基酸序列可为信号序列和/或融
合配偶体，诸如白蛋白、Fc序列和类似物。
接头的实例包括例如(GGGGS)n，其中n为1至约10的整数(例如，n＝1、2、3、4、5、6、
7、8、9或10)；GGGSGGGSIEGR(SEQ ID NO:48)；GGGGG(SEQ ID NO:49)；EGGGS(SEQ ID NO:
50)。
在一些情况下，接头可为可裂解接头，例如酶促可裂解接头。在其它情况下，接头
可为不可裂解接头，例如，在正常生理条件下不会发生体内酶促裂解的接头。
举例来说，蛋白水解可裂解接头可包括基质金属蛋白酶(MMP)裂解位点，例如，选
自胶原蛋白酶-1、胶原蛋白酶-2和胶原蛋白酶-3(MMP-1、MMP-8和MMP-13)、明胶酶A和明胶
酶B(MMP-2和MMP-9)、基质溶素1、基质溶素2和基质溶素3(MMP-3、MMP-10和MMP-11)、基质溶
解素(MMP-7)和膜金属蛋白酶(MT1-MMP和MT2-MMP)的MMP裂解位点。MMP-9的裂解序列为
Pro-X-X-Hy(其中X表示任意残基；Hy为疏水性残基)(SEQ ID NO:51)，例如Pro-X-X-Hy-
(Ser/Thr)(SEQ ID NO:52)，例如Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser(SEQ ID NO:53)或Pro-
Leu/Gln-Gly-Met-Thr(SEQ ID NO:54)。蛋白酶裂解位点的另一实例为血纤蛋白溶酶原活
化因子裂解位点，例如尿激酶型血纤蛋白溶酶原活化因子(uPA)或组织血纤蛋白溶酶原活
化因子(tPA)裂解位点。uPA和tPA的裂解序列的特定实例包括包含Val-Gly-Arg的序列。另
一实例为凝血酶裂解位点，例如CGLVPAGSGP(SEQ ID NO:55)。包含蛋白酶裂解位点的其它
适合接头包括包含以下氨基酸序列中的一个或多个的接头：1)SLLKSRMVPNFN(SEQ ID NO:
56)或SLLIARRMPNFN(SEQ ID NO:57)，由组织蛋白酶B裂解；SKLVQASASGVN(SEQ ID NO:58)
或SSYLKASDAPDN(SEQ ID NO:59)，由EB病毒蛋白酶裂解；RPKPQQFFGLMN(SEQ ID NO:60)，由
MMP-3(基质溶素)裂解；SLRPLALWRSFN(SEQ ID NO:61)，由MMP-7(基质溶解素)裂解；
SPQGIAGQRNFN(SEQ ID NO:62)，由MMP-9裂解；DVDERDVRGFASFL(SEQ ID NO:63)，由嗜热菌
蛋白酶样MMP裂解；SLPLGLWAPNFN(SEQ ID NO:64)，由基质金属蛋白酶2(MMP-2)裂解；
SLLIFRSWANFN(SEQ ID NO:65)，由组织蛋白酶L裂解；SGVVIATVIVIT(SEQ ID NO:66)，由组
织蛋白酶D裂解；SLGPQGIWGQFN(SEQ ID NO:67)，由基质金属蛋白酶1(MMP-1)裂解；
KKSPGRVVGGSV(SEQ ID NO:68)，由尿激酶型血纤蛋白溶酶原活化因子裂解；PQGLLGAPGILG
(SEQ ID NO:69)，由膜1型基质金属蛋白酶(MT-MMP)裂解；
HGPEGLRVGFYESDVMGRGHARLVHVEEPHT(SEQ ID NO:70)，由基质溶素3(对于MMP-11)、嗜热菌
蛋白酶、纤维母细胞胶原蛋白酶和基质溶素-1裂解；GPQGLAGQRGIV(SEQ ID NO:71)，由基质
金属蛋白酶13(胶原蛋白酶-3)裂解；GGSGQRGRKALE(SEQ ID NO:72)，由组织型血纤蛋白溶
酶原活化因子(tPA)裂解；SLSALLSSDIFN(SEQ ID NO:73)，由人前列腺特异性抗原裂解；
SLPRFKIIGGFN(SEQ ID NO:74)，由血管舒缓素(hK3)裂解；SLLGIAVPGNFN(SEQ ID NO:75)，
由嗜中性白细胞弹性蛋白酶裂解；和FFKNIVTPRTPP(SEQ ID NO:76)，由钙蛋白酶(钙活化中
性蛋白酶)裂解。
图3描绘本文中所涵盖的两种融合蛋白质M1(SEQ ID NO:77)和M2(SEQ ID NO:78)
的氨基酸序列。融合蛋白质M1从N末端至C末端连续包括与HSA氨基酸序列融合的IgK信号序
列(小写字母)利用(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3接头(加下划线)融合于成熟人GDF15(加粗)的
N末端。融合蛋白质M2从N末端至C末端连续包括与HSA氨基酸序列融合的IgK信号序列(小写
字母)利用(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3接头(加下划线)融合于含3个氨基酸(ΔARN)缺失的成
熟人GDF15(加粗)的N末端。
图5描绘本文中所涵盖的两种融合蛋白质M3(SEQ ID NO:79)和M4(SEQ ID NO:80)
的氨基酸序列。融合蛋白质M3从N末端至C末端连续包括与HSA氨基酸序列融合的IgK信号序
列(小写字母)利用(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)5接头(加下划线)融合于含3个氨基酸缺失(表
示为ΔARN或ΔN3)的成熟人GDF15(加粗)氨基酸序列的N末端。融合蛋白质M4从N末端至C末
端连续包括与HSA氨基酸序列融合的IgK信号序列(小写字母)利用(Gly-Gly-Gly-Gly-
Ser)5接头(加下划线)融合于相对于成熟hGDF15的N末端含6个氨基酸截短(ΔARNGDH)的成
熟人GDF15(加粗)氨基酸序列的N末端。
本发明还涵盖编码本文中所描述的序列、多肽和二聚体的重组核酸序列。在某些
实施方案中，重组核酸所编码的多肽与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的连续氨基酸序列，其中相对于SEQ ID
NO:1中的相应氨基酸，所述连续氨基酸序列具有以下成对取代中的至少一个：
i)D5T和R21N或D5S和R21N；
ii)R16N和H18T或R16N和H18S；
iii)S23N和E25T或S23N和E25S；
iv)S50N和F52T；S50N和F52S；F52N和A54T；或F52N和A54S；
v)Q51N和R53T；Q51N和R53S；R53N和A55T；或R53N和A55S；
vi)S64N和H66T；或S64N和H66S；
vii)K91N和D93T；K91N和D93S；D93N和G95T；或D93N和G95S；
viii)T94N和V96T；T94N和V96S；V96N和L98T；或V96N和L98S；
ix)S97N和Q99T；或S97N和Q99S；以及
x)A106N和D108T或A106N和D108S；
其中所述取代产生一个或多个具有序列NXS/T的N连接的糖基化一致位点，其中N
为Asn；X为除脯氨酸以外的氨基酸；随后为Ser(S)或Thr(T)，且此外其中一个或多个N连接
的糖基化一致位点在得以表达时连接至N聚糖。在另一个实施方案中，所述重组核酸编码在
得以表达时形成二聚体的多肽，所述多肽。在另一个实施方案中，所述重组核酸编码相对于
SEQ ID NO:1具有N端截短和/或C端截短的多肽。相对于参考多肽，例如SEQ ID NO:1，所述
截短可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多个氨基酸。在一个特定实施方案中，
所述重组核酸编码具有GDF15中的前三个N端残基截短(ΔARN或ΔN3)的多肽。在特定实施
方案中，本发明涵盖编码包含选自以下的氨基酸序列的多肽的重组核酸分子：SEQ ID NO:
2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、
SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:30，或相差至多5个氨基酸的氨基酸；其中所述
多肽在得以表达时含有至少一个经N-糖基化的N-糖基化位点。在特定实施方案中，本发明
涵盖编码包含选自以下的氨基酸序列的多肽的重组核酸分子：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、
SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:17、
SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:30，或相差至多2个氨基酸的氨基酸；其中所述多肽在得以表达
时含有至少一个经N-糖基化的N-糖基化位点。在特定实施方案中，所述重组核酸编码包含
选自以下的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:
88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97或SEQ ID
NO:100，或相差至多5个氨基酸的氨基酸；其中所述多肽在得以表达时含有至少一个经N-糖
基化的N-糖基化位点。在特定实施方案中，所述重组核酸编码包含选自以下的氨基酸序列
的多肽：SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ
ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97或SEQ ID NO:100，或相差至多2个
氨基酸的氨基酸；其中所述多肽在得以表达时含有至少一个经N-糖基化的N-糖基化位点。
本发明还涵盖一种制备经修饰的GDF15N-糖基化同源二聚体的方法，所述方法包括在哺乳
动物细胞，例如CHO细胞中表达前述重组核酸的步骤。本发明还涵盖通过前述方法制备的经
修饰的GDF15N-糖基化同源二聚体。
除本文中所提供的特定氨基酸序列和核酸序列以外，本发明还涵盖具有在序列中
与所述氨基酸和核酸存在至少80％、至少85％、至少90％或至少95％一致性的序列的多肽
和核酸。术语“一致”或“一致性”百分比在两个或更多个聚核苷酸序列或两个或更多个氨基
酸序列的内容中是指当在指定区域上比较并比对最大对应性时，两个或更多个序列或子序
列为相同的或所具有的规定百分比的氨基酸残基或核苷酸为相同的(例如，在规定区域上
至少80％、至少85％、至少90％或至少95％一致)。特定地，本发明涵盖具有在序列中与SEQ
ID NO:2-35或77-97的氨基酸序列存在至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少
96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性的氨基酸序列的多肽。
产生多肽的方法
本发明的多肽可通过任何适合的方法来产生，包括重组和非重组方法(例如化学
合成)。
A.化学合成
在化学合成多肽的情况下，所述合成可经由液相或固相来进行。固相肽合成
(SPPS)允许并入非天然氨基酸和/或肽/蛋白质主链修饰。SPPS的各种形式，诸如Fmoc和
Boc，可用于合成本发明的多肽。化学合成的详情在本领域中为已知的(例如，Ganesan
A.2006Mini Rev.Med.Chem.6:3-10；和Camarero J.A.等人,2005Protein Pept Lett.12:
723-8)。
可如下文所描述进行固相肽合成。用酸不稳定或碱不稳定基团保护α官能基(Nα)
和任何反应性侧链。所述保护基在用于连接酰胺键的条件下为稳定的，但可在不削弱已形
成的肽链的情况下容易地裂解。适用于α氨基官能基的保护基包括但不限于以下：叔丁氧基
羰基(Boc)、苯甲氧基羰基(Z)、邻氯苯甲氧基羰基、联苯异丙氧基羰基、叔戊氧基羰基
(Amoc)、α,α-二甲基-3,5-二甲氧-苯甲氧基羰基、邻硝基次磺酰基、2-氰基-叔丁氧基-羰
基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基(Dde)和类似
基团。
适合的侧链保护基包括但不限于：乙酰基、烯丙基(All)、烯丙氧基羰基(Alloc)、
苯甲基(Bzl)、苯甲氧基羰基(Z)、叔丁氧基羰基(Boc)、苯甲氧基甲基(Bom)、邻溴苯甲氧基
羰基、叔丁基(tBu)、叔丁基二甲基甲硅烷基、2-氯苯甲基、2-氯苯甲氧基羰基(2-CIZ)、2,6-
二氯苯甲基、环己基、环戊基、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基(Dde)、异丙
基、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯甲基磺酰基(Mtr)、2,3,5,7,8-五甲基色烷-6-磺酰基(Pmc)、
新戊酰基、四氢吡喃-2-基、甲苯磺酰基(Tos)、2,4,6-三甲氧基苯甲基、三甲基甲硅烷基和
三苯甲基(Trt)。
在固相合成中，C端氨基酸与适合的载体材料偶合。适合的载体材料为对用于合成
过程的逐步缩合和裂解反应的试剂和反应条件呈惰性且不溶解于所使用的反应介质中的
材料。市售载体材料的实例包括已经反应基团和/或聚乙二醇修饰的苯乙烯/二乙烯基苯共
聚物；氯甲基化苯乙烯/二乙烯基苯共聚物；羟甲基化或氨基甲基化苯乙烯/二乙烯基苯共
聚物；和类似物。如果意欲制备肽酸，则可使用聚苯乙烯(1％)-二乙烯基苯或经4-苯甲氧基
苯甲醇(Wang氏锚定子)或2-氯三苯甲氯衍生化的在肽酰胺的情况下，可使用
聚苯乙烯(1％)二乙烯基苯或经5-(4'-氨基甲基)-3',5'-二甲氧基苯氧基)戊酸(PAL-
anchor)或对(2,4-二甲氧基苯基-氨基甲基)苯氧基衍生化的(Rink酰胺锚定
子)。
与聚合载体的键联可通过在室温或高温(例如介于40℃与60℃之间)下且在例如2
至72小时的反应时间下在添加含活化试剂的乙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲
烷、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮或类似溶剂的情况下使C端经Fmoc保护的氨基酸与载体材料
反应来达成。
经Nα保护的氨基酸(例如Fmoc氨基酸)与PAL、Wang或Rink锚定子的偶合可例如在
以下情况下进行：在诸如N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或
其它碳二亚胺、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)或其它脲
鎓盐、邻酰基脲、苯并三唑-1-基-三-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)或其它鏻盐、N-羟基丁
二酰亚胺、其它N-羟基酰亚胺或肟的偶合试剂辅助下，存在或不存在1-羟基苯并三唑或1-
羟基-7-氮杂苯并三唑，例如在TBTU辅助下、在添加羟基苯并三唑(HOBt)的情况下、在添加
或不添加诸如二异丙基乙胺(DIEA)、三乙胺或N-甲基吗啉的碱(例如二异丙基乙胺)的情况
下；反应时间为2至72小时(例如，在氨基酸和偶合试剂呈1.5至3倍过量(例如2倍过量)时为
3小时)；且反应温度介于约10℃与50℃之间，例如25℃；在诸如二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯
烷酮或二氯甲烷的溶剂(例如，二甲基甲酰胺)中。
作为偶合试剂的替代，也有可能在上述条件下使用活性酯(例如五氟苯基、对硝基
苯基或类似基团)、Nα-Fmoc-氨基酸的对称酸酐、其酸氯化物或酸氟化物。
经Nα保护的氨基酸(例如Fmoc氨基酸)可在二氯甲烷中在添加DIEA的情况下在10
至120分钟(例如20分钟)的反应时间下与2-氯三苯甲基树脂偶合，但不限于使用此溶剂和
此碱。
经保护的氨基酸的相继偶合可根据常规方法在肽合成中，典型地在自动化肽合成
器中进行。在通过用例如含哌啶(10％至50％)的二甲基甲酰胺处理5至20分钟(例如，用含
50％哌啶的DMF处理2×2分钟和用含20％哌啶的DMF处理1×15分钟)使固相上的偶合氨基
酸的Nα-Fmoc保护基裂解之后，下一个经保护的氨基酸以3至10倍过量，例如以10倍过量在
诸如二氯甲烷、DMF或这两者的混合物的惰性非水性极性溶剂中且在介于约10℃与50℃之
间的温度下(例如在25℃下)与前述氨基酸偶合。先前提及的用于使第一Nα-Fmoc氨基酸与
PAL、Wang或Rink锚定子偶合的试剂适合作为偶合试剂。经保护的氨基酸或其氯化物或氟化
物或对称酸酐的活性酯也可用作替代物。
在固相合成结束时，所述肽从载体材料中裂解，而同时使侧链保护基裂解。裂解可
利用三氟乙酸或其它强酸性介质在添加5％至20％V/V诸如二甲基硫醚、乙基甲基硫醚、硫
代苯甲醚、硫代甲酚、间甲酚、苯甲醚乙二硫醇、苯酚或水的清除剂(例如，15％v/v二甲基硫
醚/乙二硫醇/间甲酚1:1:1)的情况下在0.5至3小时内(例如2小时)进行。具有经完全保护
的侧链的肽是通过用冰醋酸/三氟乙醇/二氯甲烷2:2:6使2-氯三苯甲基锚定子裂解而获
得。经保护的肽可通过硅胶色谱加以纯化。如果所述肽经由Wang锚定子连接至固相且如果
意欲获得具有C端烷基酰胺化的肽，则裂解可通过利用烷基胺或氟烷基胺的氨解来进行。氨
解是在介于约-10℃与50℃之间的温度(例如，约25℃)和介于约12与24小时之间的反应时
间(例如，约18小时)下进行。另外，肽可通过再酯化，例如用甲醇自载体裂解。
所获得的酸性溶液可与3至20倍量的冷醚或正己烷(例如，10倍过量的乙醚)混合，
以便使肽沉淀且因此分离出保留于醚中的清除剂和已裂解的保护基。可通过使肽从冰醋酸
中再沉淀若干次来进行进一步纯化。所获得的沉淀物可溶解于水或叔丁醇或这两种溶剂的
混合物(例如，叔丁醇/水的1:1混合物)中并冷冻干燥。
所获得的肽可通过各种色谱方法加以纯化，包括在呈乙酸酯形式的弱碱性树脂上
离子交换；在未经衍生化的聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物(例如，XAD)上的疏
水性吸附色谱；硅胶上的吸附色谱；离子交换色谱，例如在羧甲基纤维素上；分配色谱，例
如，在G-25上；逆流分配色谱；或高压液相色谱(HPLC)，例如在辛基或十八烷基
甲硅烷基硅胶(ODS)相上的逆相HPLC。
B.重组产生
在使用重组技术产生多肽的情况下，多肽可使用任何适合的构建体和任何适合的
宿主细胞分别产生为细胞内蛋白质或分泌蛋白质，所述宿主细胞可为原核或真核细胞，诸
如细菌(例如，大肠杆菌)或酵母宿主细胞。可用作宿主细胞的真核细胞的其它实例包括昆
虫细胞、哺乳动物细胞和/或植物细胞。在使用哺乳动物宿主细胞的情况下，其可包括人类
细胞(例如，HeLa、293、H9和Jurkat细胞)；小鼠细胞(例如，NIH3T3、L细胞和C127细胞)；灵长
类动物细胞(例如，Cos 1、Cos 7和CV1)和仓鼠细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。在特
定实施方案中，所述多肽是在CHO细胞中产生。在其它实施方案中，所述多肽是在酵母细胞
中产生，且在特定实施方案中，可为经基因工程改造以产生具有类哺乳动物N聚糖的糖蛋白
的酵母细胞。
可根据本领域中已知的标准程序采用适合于表达多肽的多种宿主-载体系统。参
见例如Sambrook等人,1989Current Protocols in Molecular Biology Cold Spring
Harbor Press,New York；和Ausubel等人,1995Current Protocols in Molecular
Biology,Wiley and Sons出版。用于将遗传物质引入宿主细胞中的方法包括例如转化、电
穿孔、缀合、磷酸钙法和类似方法。可选择用于转移的方法以便提供所引入的多肽编码核酸
的稳定表达。多肽编码核酸可提供为可继承附加体元件(例如质粒)，或可经基因组整合。用
于产生相关多肽的多种适当载体可购自市面。
载体可提供宿主细胞中的染色体外维持或可提供向宿主细胞基因组中整合。表达
载体提供转录和转译调节序列，且可提供诱导型或组成型表达，其中编码区在转录起始区
和转录与转译终止区的转录控制下可操作地连接。一般来说，转录与转译调节序列可包括
但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始与终止序列、转译起始与终止序列和增强
子或活化子序列。启动子可为组成型或诱导型的，且可为强组成型启动子(例如T7)。
表达构建体一般具有位于启动子序列附近以插入编码相关蛋白质的核酸序列的
便利限制位点。表达宿主中可存在可操作的可选标记物以促进对含有该载体的细胞的选
择。此外，表达构建体可包括其它要素。举例来说，表达载体可具有一个或两个复制系统，因
而允许其维持于生物体中，例如在用于表达的哺乳动物或昆虫细胞中和在用于克隆和扩增
的原核宿主中。另外，表达构建体可含有可选标记基因以允许选择经转化的宿主细胞。可选
基因在本领域中为熟知的且将随所使用的宿主细胞而变化。
蛋白质的分离和纯化可根据本领域中已知的方法来实现。举例来说，可通过免疫
亲和力纯化从经基因修饰以组成性表达蛋白质的细胞溶解物中和/或在诱导后，或从合成
反应混合物中分离蛋白质，免疫亲和力纯化一般包括使样品与抗蛋白质抗体接触，洗涤以
移除非特异性结合的物质，和洗脱特异性结合的蛋白质。可通过透渗析和蛋白质纯化方法
中正常采用的其它方法进一步纯化经分离的蛋白质。在一个实施方案中，可使用金属螯合
物色谱法来分离蛋白质。蛋白质可含有修饰以促进分离。
可制备呈基本上纯或经分离形式的多肽(例如，不含其它多肽)。所述多肽可存在
于相对于可能存在的其它组分(例如，其它多肽或其它宿主细胞组分)富含所述多肽的组合
物中。举例来说，可提供经纯化的多肽，使得该多肽存在于基本上不含其它经表达的蛋白质
的组合物中，例如，该组合物的小于90％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于
20％、小于10％、小于5％或小于1％由其它所表达的蛋白质组成。
抗体
本发明提供抗体，包括特异性结合本发明的多肽或融合蛋白质的经分离抗体。术
语“抗体”涵盖完整单株抗体、多株抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如，
双特异性抗体)和抗体结合片段，包括Fab和F(ab)'2，条件为其特异性结合本发明的多肽或
融合蛋白质。基本完整抗体结构单元包含四聚体，且各四聚体由两对相同的多肽链组成，各
对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50至70kDa)。各链的氨基末端部分包括含约
100至110或更多个氨基酸且主要负责抗原识别的可变区。相反，各链的羧基末端部分定义
主要负责效应功能的恒定区。人类轻链分类为κ和λ，而人类重链分类为μ、δ、γ、α或ε，且分
别将抗体的同型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。通过重组DNA技术或通过对完整抗体的酶
促或化学裂解来产生结合片段。结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv和单链抗体。
各重链在一端具有可变域(VH)，随后为许多个恒定域。各轻链在一端具有可变域
(VL)且在其另一端具有恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对准，且轻链可变域与
重链的可变域对准。在轻链和重链内，可变区和恒定区由含约12个或更多个氨基酸的“J”区
接合，其中重链还包括含约10个或更多个氨基酸的“D”区。所述抗体链均展现含由三个高变
区(也称为“互补决定区”或“CDR”)接合的相对保守型架构区(FR)的相同一般结构。通过架
构区使各对的两个链的CDR对准，从而使得能够结合特定表位。从N端至C端，轻链和重链均
包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
完整抗体具有两个结合位点，且除了在双功能或双特异性抗体中，这两个结合位
点相同。双特异性或双功能抗体为具有两个不同的重/轻链对和两个不同的结合位点的人
造混合抗体。双特异性抗体可通过多种方法产生，包括融合杂交瘤或连接Fab'片段。
如以上所阐述，可通过完整抗体的酶促或化学裂解来产生结合片段。用酶木瓜蛋
白酶消化抗体产生两种相同的抗原结合片段，也称为“Fab”片段和不具有抗原结合活性的
“Fc”片段。用酶胃蛋白酶消化抗体产生F(ab')2片段，其中抗体分子的两个臂仍连接且包含
双抗原结合位点。F(ab')2片段具有使抗原交联的能力。
如本文中所使用，术语“Fab”是指包含VH和VL区以及轻链的恒定域和重链的CH1域
的抗体片段。
当用于本文中时，术语“Fv”是指抗体中保留抗原识别位点和抗原结合位点的最小
片段。在双链Fv种类中，此区域包括一个重链可变域与一个轻链可变域呈非共价缔合形式
的二聚体。在单链Fv种类中，一个重链可变域与一个轻链可变域可通过柔性肽接头共价连
接，使得轻链和重链可以类似于双链Fv种类中的结构的“二聚”结构缔合。在此构形中，各可
变域的三个CDR相互作用以定义VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。尽管六个CDR总体
上赋予抗体以抗原结合特异性，但即使单可变域(或仅包含三个CDR的Fv中的抗原特异性部
分)还具有识别和结合抗原的能力。
当用于本文中时，术语“互补决定区”或“CDR”是指免疫受体中与特定配体接触且
决定其特异性的部分。
术语“高变区”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区一般包含来自CDR
的氨基酸残基和/或来自“高变环”的那些残基。
如本文中所使用，术语“表位”是指蛋白质抗原上的抗体结合位点。表位决定簇通
常包含诸如氨基酸或糖侧链的分子的化学活性表面分组以及特定三维结构和电荷特征。据
称当解离常数≤1μM、≤100nM或≤10nM时，抗体结合抗原。增加的平衡常数(“KD”)意谓表位
与抗体之间存在较弱亲和力，而降低的平衡常数意谓表位与抗体之间存在更大亲和力。具
有“不超过”某一量的KD的抗体意谓该抗体将以指定KD或更强地结合表位。KD描述表位和抗
体的结合特征，而“效力”描述抗体本身对抗体功能的效用。平衡常数与效力之间未必存在
相关性；因而，举例来说，相对较低的KD不自动地意谓高效力。
术语“选择性结合”在参考抗体时不意谓该抗体仅结合单一物质，而是该抗体对第
一物质的KD小于抗体对第二物质的KD。排他性结合表位的抗体仅结合该单一表位。
当施用人类时，含有啮齿动物(即，鼠类或大鼠)可变区和/或恒定区的抗体有时与
例如从体内快速清除或身体对该抗体产生免疫反应相关。为了避免利用啮齿动物衍生抗
体，可通过向啮齿动物中引入人类抗体功能，使得啮齿动物产生完全人类抗体来产生完全
人类抗体。除非本文中明确鉴别，否则“人类”抗体与“完全人类”抗体可互换使用。当辨别仅
部分人类抗体与完全人类抗体时，术语“完全人类”可适用。本领域技术人员了解产生完全
人类抗体的各种方法。
为了解决可能的人类抗小鼠抗体反应，可利用嵌合或者人源化抗体。嵌合抗体具
有人类恒定区和鼠类可变区，且因而，可在一些患者中观测到人类抗嵌合抗体反应。因此，
宜提供针对多聚酶的完全人类抗体，以避免可能的人类抗小鼠抗体或人类抗嵌合抗体反
应。
可例如通过以本领域技术人员已知的技术产生杂交瘤细胞系来制备完全人类单
株抗体。其它制备方法包括使用编码特定抗体的序列用于对诸如CHO细胞的适合哺乳动物
宿主细胞进行转化。转化可通过用于将聚核苷酸引入宿主细胞中的任何已知方法，包括例
如将聚核苷酸封装于病毒(或病毒载体)中且用该病毒(或载体)或通过本领域中已知的转
染程序来转导宿主细胞。用于将异源聚核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法在本领域中为熟
知的，且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质粒融合、电穿孔、
聚核苷酸囊封于脂质粒中和直接微量注射DNA于细胞核中。可用作表达宿主的哺乳动物细
胞系在本领域中为熟知的，且包括但不限于CHO细胞、HeLa细胞和人类肝细胞癌细胞。
抗体可用于检测本发明的多肽。举例来说，抗体可通过检测受试者中的一种或多
种本发明多肽的水平和比较检测水平与标准对照水平或先前(例如，在任何疾患之前)测定
的受试者基线水平而用作诊断剂。
本发明的另一个实施方案需要使用一种或多种人类结构域抗体(dAb)。dAb为人类
抗体的最小功能结合单元(IgG)且具有良好稳定性和溶解度特征。该技术需要dAb缀合于
HSA(从而形成“AlbudAb”；参见例如EP1517921B、WO2005/118642和WO2006/051288)和相关
分子(例如，本发明的多肽序列)。与用于延长多肽的血清半衰期的当前技术相比，AlbudAb
通常较小且较容易在诸如细菌或酵母的微生物表达系统中制备。由于HSA具有约三周的半
衰期，故所得缀合分子改善相关分子的半衰期。使用dAb技术还可增强相关分子的效力。
治疗性和预防性用途
本发明提供用于治疗或预防诸如肥胖和其它体重异常、高血糖症、高胰岛素血症、
葡萄糖不耐受和葡萄糖代谢异常的代谢和代谢相关疾病的方法，所述方法是通过施用如本
文中所描述的多肽或其组合物。此类方法也可通过例如降低症状的严重程度或频率而对与
疾病、病症或病状相关的一种或多种症状具有有利效应。在特定实施方案中，本发明提供通
过施用所述多肽、经N-糖基化的二聚体或其组合物来治疗葡萄糖代谢或体重异常的方法。
在特定实施方案中，本发明提供通过施用所述多肽、经N-糖基化的二聚体或其组合物来减
少食物摄取或降低体重的方法。本发明还提供前述序列、多肽、经N-糖基化的二聚体或其组
合物的用途，其用于制备用以治疗选自以下的病状的药剂：代谢和代谢相关病症，诸如肥胖
和其它体重异常、高血糖症、高胰岛素血症、葡萄糖不耐受和葡萄糖代谢异常。本发明还提
供前述序列、多肽、经N-糖基化的二聚体或其组合物的用途，其用于制备用以治疗葡萄糖代
谢或体重异常的药剂。本发明还提供前述序列、多肽、经N-糖基化的二聚体或其组合物的用
途，其用于制备用以减少食物摄取或体重的药剂。
为了确定受试者是否可为通过本文中所提供的方法治疗或预防体重异常(例如肥
胖)的候选者，将评估诸如但不限于病因学和受试者病状程度(例如该受试者与参考健康个
体相比的过重程度)的参数。举例来说，BMI介于约25与约29.9kg/m2之间的成人可被视为过
重(肥胖前期)，而BMI为约30kg/m2或更高的成人可被视为肥胖。如本文中所论述，本发明的
多肽可实现食欲抑制，例如降低食欲，从而引起体重减少。
为了确定受试者是否可为通过本文中所提供的方法治疗或预防高血糖症、高胰岛
素血症、葡萄糖不耐受和/或葡萄糖异常的候选者，可利用本领域中已知的各种诊断方法。
此类方法包括本文中其它部分(例如空腹血浆葡萄糖(FPG)评估和口服葡萄糖耐受性测试
(oGTT))所描述的方法。
本文中所提供的多肽和融合蛋白质当施用受试者以治疗或预防诸如肥胖和其它
体重异常、高血糖症、高胰岛素血症、葡萄糖不耐受、葡萄糖代谢异常的代谢和代谢相关疾
病时可引起血液葡萄糖水平降低、体重减少和/或食物摄取减少。
在某些实施方案中，本文中所涵盖的多肽和融合蛋白质可使血液葡萄糖水平、体
重和/或食物摄取与不存在施用多肽或融合蛋白质时相比降低至少5％。举例来说，本文中
所涵盖的多肽和融合蛋白质可使血液葡萄糖水平、体重和/或食物摄取与开始治疗或预防
之前相比降低至少10％、20％、30％、50％、60％、70％、80％或90％。
药物组合物
本发明的多肽可呈适合于施用受试者的组合物形式。一般来说，此类组合物为包
含一种或多种多肽和一种或多种药学上可接受或生理学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂
的“药物组合物”。在某些实施方案中，所述多肽以治疗有效量存在。药物组合物可用于本发
明的方法中；因而，举例来说，药物组合物可离体或体内施用受试者以实施本文中所描述的
治疗性和预防性方法和用途。
本发明的药物组合物可经配制以便与预定投药方法或途径相容；例示性投药途径
阐述于本文中。此外，药物组合物可与如本文中所描述的其它治疗活性剂或化合物(例如，
葡萄糖降低剂)组合使用，以便治疗或预防如本发明所如涵盖的疾病、病症和病状。
药物组合物典型地包含治疗有效量的至少一种本发明所涵盖的多肽和一种或多
种药学上和生理学上可接受的制剂。适合的药学上可接受或生理学上可接受的稀释剂、载
体或赋形剂包括但不限于抗氧化剂(例如，抗坏血酸和硫酸氢钠)、防腐剂(例如，苯甲醇、对
羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)、乳化剂、悬浮剂、分散剂、溶
剂、填充剂、增积剂、清洁剂、缓冲剂、媒介物、稀释剂和/或佐剂。举例来说，适合的媒介物可
为可能补充有用于肠胃外施用的药物组合物中常用的其它材料的生理盐水溶液或柠檬酸
盐缓冲生理盐水。与血清白蛋白混合的中性缓冲生理盐水或生理盐水为其它例示性媒介
物。本领域技术人员将容易地识别可用于药物组合物和剂型中的多种缓冲液。典型缓冲液
包括但不限于药学上可接受的弱酸、弱碱或其混合物。举例来说，缓冲液组分可为水溶性材
料，诸如磷酸、酒石酸、乳酸、丁二酸、柠檬酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、谷氨酸及其盐。可
接受的缓冲剂包括例如Tris缓冲液、N-(2-羟基乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-
吗啉基)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉基)乙磺酸钠盐(MES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)和N-三
[羟基甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)。
在药物组合物经配制之后，其可作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或脱水或冻干
粉末储存在无菌小瓶中。此类制剂可以即用形式、需要在使用前复原的冻干形式、需要在使
用前稀释的液体形式或其它可接受形式储存。在一些实施方案中，所述药物组合物提供于
单次使用容器(例如单次使用小瓶、安瓿、注射器或自动注射器(类似于例如))中，
而在其它实施方案中提供多次使用容器(例如多次使用小瓶)。任何药物递送装置均可用于
递送多肽，包括植入物(例如，可植入型泵)和导管系统，两者对于本领域技术人员均为熟知
的。一般经皮下或肌内施用的储库式注射剂也可被用来在所限定的时间段内释放本文中所
公开的多肽。储库式注射剂通常基于固体或油，且一般包含至少一种本文中所阐述的配制
组分。本领域技术人员应熟悉可能的制剂和储库式注射剂的用途。
药物组合物可呈无菌可注射水性或油质悬浮液形式。此悬浮液可根据已知技术使
用本文中所提及的那些适合的分散剂或润湿剂和悬浮剂加以配制。无菌可注射制剂还可为
处于无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如处于1,3-丁二
醇中的溶液。可采用的可接受稀释剂、溶剂和分散介质包括水、林格氏溶液、等渗氯化钠溶
液、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)、乙醇、多元醇(例
如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其适合的混合物。另外，无菌不挥发性油惯用作溶剂或
悬浮介质。出于此目的，可采用任何温和不挥发性油，包括合成单甘油酯或二甘油酯。此外，
诸如油酸的脂肪酸得以用于制备可注射剂。延长特定可注射制剂的吸收可通过包括延迟吸
收的试剂(例如单硬脂酸铝或明胶)来达成。
含有活性成分(例如，本发明的多肽)的药物组合物可呈适合于经口使用的形式，
例如，呈片剂、胶囊、喉锭、口含锭、水性或油性悬浮液、可分散粉剂或颗粒剂、乳液、硬胶囊
或软胶囊或糖浆、溶液、微珠或酏剂。意欲经口使用的药物组合物可根据本领域中已知的用
于制备药物组合物的任何方法制备，且此类组合物可含有一种或多种试剂，诸如甜味剂、调
味剂、着色剂和防腐剂，以提供药学上美观且可口的制剂。片剂、胶囊和类似物含有活性成
分与适合于制备片剂的药学上可接受的无毒赋形剂的混合物。这些赋形剂可为例如稀释
剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；粒化和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘
合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
适合于经口施用的片剂、胶囊和类似物可能未经涂覆或通过已知技术加以涂覆以
延迟胃肠道中的崩解和吸收且从而提供持续作用。举例来说，可采用诸如单硬脂酸甘油酯
或双硬脂酸甘油酯的时间延迟材料。其还可通过本领域中已知的技术加以涂覆以形成渗透
性治疗片剂以用于控制释放。其它试剂包括生物可降解或生物相容性颗粒或聚合物质，诸
如聚酯、聚胺酸、水凝胶、聚乙烯基吡咯烷酮、聚酸酐、聚乙醇酸、乙烯-乙酸乙烯酯、甲基纤
维素、羧甲基纤维素、硫酸鱼精蛋白或丙交酯/乙交酯共聚物、聚丙交酯/乙交酯共聚物或乙
烯乙酸乙烯酯共聚物，以控制所施用的组合物的递送。举例来说，口服药剂可分别利用羟甲
基纤维素或明胶微胶囊或聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊通过团聚技术或通过界面聚合而俘
获于微胶囊中，或俘获于胶态药物递送系统中。胶态分散系统包括大分子复合物、纳米胶
囊、微球体、微珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合型胶束和脂质粒。制备脂
质粒的方法描述于例如美国专利第4,235,871号、第4,501,728号和第4,837,028号中。用于
制备以上提及的制剂的方法对于本领域技术人员将显而易见。
用于经口使用的制剂还可作为硬明胶胶囊存在，其中活性成分与惰性固体稀释剂
混合，例如碳酸钙、磷酸钙、高岭土或微晶纤维素；或作为软明胶胶囊存在，其中活性成分与
水或油介质混合，例如花生油、液体石蜡或橄榄油。
水性悬浮液含有活性物质与适合于其制备的赋形剂的混合物。此类赋形剂可为悬
浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯基吡咯烷
酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂，例如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)或氧化乙
烯与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)或氧化乙烯与长链脂族醇的缩合产物(例
如十七氧乙烯鲸蜡醇)或氧化乙烯与来源于脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如聚氧
乙烯山梨醇单油酸酯)或氧化乙烯与来源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚
乙烯脱水山梨醇单油酸酯)。水性悬浮液还可含有一种或多种防腐剂。
油性悬浮液可通过使活性成分悬浮于植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子
油)或矿物油(诸如液体石蜡)中来配制。油性悬浮液可含有增稠剂，例如蜂蜡、固体石蜡或
鲸蜡醇。可添加甜味剂(诸如以上所阐述的那些甜味剂)和调味剂以提供可口的口服制剂。
适合于通过添加水来制备水性悬浮液的可分散粉剂和颗粒剂提供活性成分与分
散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂的混合物。适合的分散剂或润湿剂和悬浮剂例
示于本文中。
本发明的药物组合物还可呈水包油乳液形式。油相可为植物油(例如橄榄油或花
生油)或矿物油(例如液体石蜡)或这些的混合物。适合的乳化剂可为天然存在的树胶，例如
阿拉伯树胶或黄蓍树胶；天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂和来源于脂肪酸的酯或偏酯；
己糖醇酐，例如脱水山梨醇单油酸酯；和偏酯与氧化乙烯的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山
梨醇单油酸酯。
制剂还可包括载体以防止组合物快速降解或从体内消除，诸如控制释放制剂，包
括植入物、脂质粒、水凝胶、前药和微囊封递送系统。举例来说，可采用时间延迟材料，诸如
单独或与蜡组合的单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯。
本发明涵盖施用呈用于经直肠施用药物的栓剂形式的多肽。栓剂可通过将药物与
在常温下为固体但在直肠温度下为液体且因此将在直肠中融化以释放药物的适合无刺激
性赋形剂来制备。此类物质包括但不限于可可脂和聚乙二醇。
本发明所涵盖的多肽可呈目前已知的或未来将要开发的任何其它适合的药物组
合物形式(例如，用于经鼻或吸入使用的喷雾)。
制剂中的多肽或其片段的浓度可广泛变化(例如，以重量计小于约0.1％，通常为
或至少约2％至多达20％至50％或更多)，且通常将主要基于流体体积、粘性和基于受试者
的因素，根据例如所选特定投药模式加以选择。
本文中涵盖对Nano Precision Medical的储库式递送技术(Nano Precision
Medical；Emeryville，CA)的使用。该技术利用产生大分子(诸如蛋白质和肽治疗剂)的零级
释放率的二氧化钛纳米管膜。将生物相容性膜容纳于提供治疗大分子的长期(例如直至一
年)恒定速率递送的小皮下植入物中。当前正评估该技术用于递送GLP-1激动剂以便治疗II
型糖尿病。在某些实施方案中，本文中所公开的多肽可为含膜的制剂。举例来说，多肽可渗
入膜中且由膜围绕。膜可呈圆盘形、管形或球形。在某些实施方案中，管可为纳米管，或球可
为纳米球。
在一些实施方案中，本文中所描述的多肽可通过使用可附接于患者且可向患者递
送预定剂量的多肽的佩戴型递送系统施用受试者。例示性佩戴型递送系统包括贴片或泵。
在某些情况下，诸如用于递送的佩戴型注射器的佩戴型递送系统可用于施用
本文中所公开的多肽。在其它实施方案中，可使用诸如可植入渗透泵(例如泵或
渗透泵)的渗透泵向患者递送本文中所描述的多肽。
施用途径
本发明涵盖以任何适当方式施用所公开的多肽及其组合物。适合的施用途径包括
肠胃外(例如，肌内、静脉内、皮下(例如注射或植入)、腹膜内、脑池内、关节内、腹膜内、脑内
(实质内)和脑室内)、经口、经鼻、经阴道、舌下、经眼内、经直肠、局部(例如，经皮)、舌下和
吸入。
一般经皮下或肌内施用的储库式注射剂还可用于在所限定的时间段内释放本文
中所公开的多肽。储库式注射剂通常基于固体或油，且一般包含至少一种本文中所阐述的
配制组分。本领域技术人员应熟悉可能的制剂和储库式注射剂的用途。
关于抗体，在一例示性实施方案中，本发明的抗体或抗体片段以10mg/ml注射用无
菌等渗生理盐水溶液形式储存在4℃下，且在施用受试者之前稀释于100ml或200ml注射用
0.9％氯化钠中。抗体是以介于0.2与10mg/kg之间的剂量在1小时内通过静脉内输注施用。
在其它实施方案中，抗体是在15分钟与2小时之间的时间段内通过静脉内输注施用。在其它
实施方案中，施用程序为经由皮下推注。
本发明涵盖其中本发明的多肽或抗体或抗体片段每日至少两次、每日至少一次、
每48小时至少一次、每72小时至少一次、每周至少一次、每2周至少一次、每月至少一次、每2
个月至少一次或每3个月至少一次或以更低频率施用受试者的方法。
组合疗法
本发明涵盖多肽与一种或多种活性治疗剂或其它预防或治疗模态组合使用。在此
种组合疗法中，各种活性剂通常具有不同的作用机制。此种组合疗法可因允许减少一种或
多种药剂的剂量，从而减少或消除与一种或多种药剂相关的不良反应而尤其有利；此外，此
种组合疗法可对潜在疾病、病症或病状具有协同治疗或预防效应。
如本文中所使用，“组合”意在包括可单独施用的治疗剂，例如，单独配制以用于单
独施用(例如，如可提供于试剂盒中)，和可于单一制剂中一起施用的治疗剂(即，“共配
制”)。
在某些实施方案中，依序施用或施用多肽，例如，施用一种药剂，随后施用一种或
多种其它药剂。在其它实施方案中，同时施用所述多肽，例如，其中同时或大约同时施用两
种或更多种药剂；所述两种或更多种药剂可存在于两种或更多种单独制剂中或组合于单一
制剂(即，共制剂)中。不考虑所述两种或更多种药剂是依序或是同时施用，其被视为出于本
发明的目的组合施用。
本发明的多肽可与适用于治疗、预防、抑制或改善本文中所阐述的疾病、病症或病
症的其它药剂组合使用，包括正常施用罹患肥胖、进食障碍、高血糖症、高胰岛素血症、葡萄
糖不耐受和其它葡萄糖代谢异常的受试者的药剂。
本发明涵盖与许多药剂(及其类别)的组合疗法，包括1)胰岛素、胰岛素模拟物和
需要刺激胰岛素分泌的药剂，包括磺酰脲(例如氯磺丙脲、甲磺氮脲、醋磺己脲、甲苯磺丁
脲、格列本脲、格列美脲、格列吡嗪)和美格列奈类(例如米格列奈、瑞格列奈(PRANDIN)和那
格列奈(STARLIX))；2)双胍类(例如二甲双胍(GLUCOPHAGE)及其药学上可接受的盐，特定
地，二甲双胍盐酸盐，及其延长释放制剂，诸如GlumetzaTM、FortametTM和GlucophageXRTM)和
通过促进葡萄糖利用、减少肝脏葡萄糖产生和/或减少肠葡萄糖输出而起作用的其它药剂；
3)α-葡糖苷酶抑制剂(例如阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇)和减缓碳水化合物消化且因
此减缓自肠管吸收并且减轻饭后高血糖的其它药剂；4)增强胰岛素作用(例如，通过胰岛素
敏感化)，包括胰岛素和胰岛素模拟物(例如，德谷胰岛素、甘精胰岛素、赖脯胰岛素、地特胰
岛素、赖谷胰岛素和各自的可吸入制剂)，因而促进周围组织中的葡萄糖利用的噻唑烷二酮
类(例如罗格列酮(AVANDIA)、曲格列酮(REZULIN)、吡格列酮(ACTOS)、格列吡嗪、巴格列酮、
来格列酮、奈格列酮、AMG 131、MBX2044、米格列酮(mitoglitazone)、洛贝格列酮
(lobeglitazone)、IDR-105、曲格列酮、恩格列酮、环格列酮、阿格列酮(adaglitazone)、达
格列酮；5)类升糖素肽，包括DPP-IV抑制剂(例如阿格列汀、奥格列汀、利格列汀、维达列汀
(GALVUS)和西他列汀(JANUVIA))和类升糖素肽-1(GLP-1)和GLP-1激动剂和类似物(例如，
艾塞那肽(BYETTA和ITCA 650(插入皮下的渗透泵，其在12个月的时间段内递送艾塞那肽；
Intarcia，Boston，MA))和GLP-1受体激动剂(例如，杜拉鲁肽、索马鲁肽、阿必鲁肽、艾塞那
肽、利拉鲁肽、利西那肽、他司鲁肽、CJC-1131和BIM-51077，包括其鼻内、经皮和每周一次制
剂)；6)以及抗DPP-IV类似物(肠促胰岛素模拟物)、PPARγ激动剂、诸如非诺贝酸衍生物(例
如，吉非罗齐、氯贝丁酯、环丙贝特、非诺贝特、苯扎贝特)的PPARα激动剂、双作用PPAR激动
剂(例如，ZYH2、ZYH1、GFT505、西格列扎、莫格列扎、阿格列扎、索格列扎和那格列扎)、全作
用PPAR激动剂、PTP1B抑制剂(例如，ISIS-113715和TTP814)、SGLT抑制剂(例如，ASP1941、
SGLT-3、恩格列净、达格列净、卡格列净、BI-10773、PF-04971729、瑞格列净、TS-071、托格列
净、伊格列净和LX-4211)、胰岛素促分泌剂、血管收缩素转化酶抑制剂(例如阿拉普利、贝那
普利、卡托普利、西罗普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、咪达普
利、赖诺普利、莫维普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、螺普利、替莫普利或群多普利)、血
管收缩素II受体拮抗剂(例如，洛沙坦，即，缬沙坦、坎地沙坦、奥美沙坦、替米沙
坦和这些药物中的任一种与诸如的氢氯噻嗪组合使用)或其它抗高血压药物(诸
如LCZ 696)、RXR激动剂、糖原合成激酶-3抑制剂、免疫调节剂、交感神经阻断剂、β-肾上腺
素激导性阻断药(例如，普萘洛尔、阿替洛尔、比绍洛尔、卡维洛尔、美托洛尔或酒石酸美托
洛尔)、α肾上腺素激导性阻断药(例如，多沙唑嗪、哌唑嗪或α甲基多巴)、中枢α肾上腺素激
导性激动剂、周围血管舒张剂(例如胼苯哒嗪)、β-3肾上腺素激导性受体激动剂、11β-HSD1
抑制剂、中性内肽酶抑制剂(例如，塞奥芬和磷氨米酮)、醛固酮拮抗剂、醛固酮合成酶抑制
剂、肾素抑制剂(例如，二肽和三肽的脲衍生物(参见美国专利号5,116,835)、氨基酸和衍生
物(美国专利5,095,119和5,104,869)、由非肽键连接的氨基酸链(美国专利5,114,937)、二
肽和三肽衍生物(美国专利5,106,835)、肽基氨基二醇(美国专利5,063,208和4,845,079)
和肽基β-氨基酰基氨基二醇胺基甲酸酯(美国专利5,089,471)；以及如以下美国专利5,
071,837、5,064,965、5,063,207、5,036,054、5,036,053、5,034,512和4,894,437中所公开
的多种其它肽类似物，和小分子肾素抑制剂(包括二醇磺酰胺和亚磺酰(美国专利5,098,
924)、N-吗啉基衍生物(美国专利5,055,466)、N-杂环醇(美国专利4,885,292)和吡咯并咪
唑啉酮(美国专利5,075,451)；以及胃蛋白酶抑制剂衍生物(美国专利4,980,283)和含斯达
酮(statone)的肽的氟代和氯代衍生物(美国专利5,066,643)、依那吉仓(enalkrein)、RO
42-5892、A 65317、CP 80794、ES 1005、ES 8891、SQ 34017、阿利吉仑(2(S),4(S),5(S),7
(S)-N-(2-氨基甲酰基-2-甲基丙基)-5-氨基-4-羟基-2,7-二异丙基-8-[4-甲氧基-3-(3-
甲氧基丙氧基)-苯基]-辛酰胺半富马酸盐)SPP600、SPP630和SPP635)、内皮素受体拮抗剂、
磷酸二酯酶-5抑制剂(例如西地那非、他达拉非和伐地那非)、血管舒张剂、钙通道阻断剂
(例如，氨氯地平、硝苯地平、维拉帕米、地尔硫卓、加洛帕米、尼鲁地平、尼莫地平、尼卡地
平)、钾通道活化剂(例如，尼可地尔、吡那地尔、克罗卡林、米诺地尔、阿吡卡林
(aprilkalim)、氯普唑仑)、降脂剂(例如，HMG-CoA还原酶抑制剂，诸如以内酯前药形式作为
和出售且在施用后充当抑制剂的辛伐他汀和洛伐他汀，和二羟基开环
酸HMG-CoA还原酶抑制剂的药学上可接受的盐，诸如阿托伐他汀(尤其以形式出
售的钙盐)、罗苏伐他汀(尤其以形式出售的钙盐)、普伐他汀(尤其以
形式出售的钠盐)、西立伐他汀和氟伐他汀(尤其以形式出售的钠
盐))；胆固醇吸收抑制剂，诸如依替米贝和依替米贝与任何其它降脂剂，诸如上
述HMG-CoA还原酶抑制剂且尤其与辛伐他汀或与阿托伐他汀钙的组合；HDL升
高药(例如烟酸和烟酸受体激动剂)及其延长释放或控制释放型式，和/或HMG-CoA还原酶抑
制剂；烟酸受体激动剂，诸如阿西莫司和阿昔呋喃，以及烟酸受体部分激动剂；升糖素受体
拮抗剂(例如，MK-3577、MK-0893、LY-2409021和KT6-971)；胆酸螯合剂(例如，考来替兰、考
来替胺、考来维仑盐酸盐、考来替泊、消胆胺和交联葡聚糖的二烷基氨基烷基衍生物)、酰基
CoA:胆固醇酰基转移酶抑制剂(例如阿伐麦布)；意欲用于发炎性病状的药剂，诸如阿司匹
林、非类固醇消炎药或NSAID、糖皮质激素和选择性环加氧酶-2或COX-2抑制剂；葡糖激酶活
化剂(GKA)(例如AZD6370)；11β-羟基固醇脱氢酶1型抑制剂(例如，诸如美国专利号6,730,
690中所公开者和LY-2523199)；CETP抑制剂(例如安塞曲匹、依塞曲匹和托塞曲匹)；果糖1,
6-二磷酸酶抑制剂(例如，诸如美国专利号6,054,587、6,110,903、6,284,748、6,399,782和
6,489,476中所公开者)；乙酰CoA羧化酶-1或乙酰CoA羧化酶-2抑制剂(ACC1或ACC2)；PCSK9
抑制剂；GPR-40部分激动剂；SCD调节剂；脂肪酸合成酶抑制剂；支链淀粉和支链淀粉类似物
(例如普兰林肽)；包括上述活化剂的化学式可能的药学上可接受的盐形式。
此外，本发明涵盖含用于促进体重损失的药剂和方法的组合疗法，诸如刺激代谢
或减少食欲的药剂，和改变的饮食和/或锻炼方案以促进体重损失。
本发明的多肽可与一种或多种其它药剂以在所述情形下适当的任何方式组合使
用。在一个实施方案中，在一段时间内维持用至少一种活性剂和至少一种本发明多肽治疗。
在另一个实施方案中，减少或停止用至少一种活性剂治疗(例如，当受试者稳定时)，同时以
恒定给药方案维持用本发明多肽治疗。在另一个实施方案中，减少或停止用至少一种活性
剂治疗(例如，当受试者稳定时)，同时减少用本发明多肽治疗(例如，较低剂量、较低给药频
率或较短治疗方案)。在另一个实施方案中，减少或停止用至少一种活性剂治疗(例如，和受
试者稳定时)，且增加用本发明多肽治疗(例如，较高剂量、较高给药频率或较久治疗方案)。
在另一个实施方案中，维持用至少一种活性剂治疗，且减少或停止用本发明多肽治疗(例
如，较低剂量、较低给药频率或较短治疗方案)。在另一个实施方案中，减少或停止用至少一
种活性剂治疗和用本发明多肽治疗(例如，较低剂量、较低给药频率或较短治疗方案)。
给药
本发明多肽可施用受试者的量取决于例如以下因素：施用目标(例如，所要解决程
度)；欲治疗受试者的年龄、体重、性别和健康和身体状况；所施用的多肽和/或制剂的性质；
施用途径；和疾病、病症、病状或其症状的性质(例如，葡萄糖/胰岛素失调的严重程度和病
症阶段)。给药方案还可考虑与所施用的药剂相关的任何不利作用的存在、性质和程度。可
根据例如安全性和剂量递增试验、体内研究(例如，动物模型)和本领域技术人员已知的其
它方法容易地确定有效剂量的量和给药方案。
一般来说，给药参数决定剂量的量小于可能对受试者造成不可逆的毒性的量(即，
最大耐受剂量，“MTD”)且不小于对受试者产生可测量的效应所需的量。此类量是由例如与
吸收、分布、代谢和排泄(“ADME”)相关的药代动力学和药效学参数，考虑施用途径和其它因
素而决定。
有效剂量(ED)为药剂在一定分数的服用其的受试者中产生治疗反应或所要效应
的剂量或量。药剂的“中值有效剂量”或ED50为药剂在其所施用的群体的50％中产生治疗反
应或所要效应的剂量或量。尽管ED50通常用作药剂效应的合理预期值的量度，但临床医师
可能认为适当的剂量未必考虑到所有相关因素。因而，在一些情形中，有效量大于计算
ED50，在其它情形中，有效量小于计算ED50，且在其它情形中，有效量与计算ED50相同。
另外，本发明多肽的有效剂量可为当以一个或多个剂量施用受试者时相对于健康
受试者产生所要结果的量。举例来说，有效剂量可为如下量：当施用具有升高的血浆葡萄糖
和/或血浆胰岛素的受试者时相对于健康受试者达成至少约10％、至少约20％、至少约
25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或多于
80％的所要降低。
适当剂量水平一般将为每天约0.001至100mg/kg患者体重，此可以单个或多个剂
量施用。在一些实施方案中，剂量水平将为每天约0.01至约25mg/kg，且在其它实施方案中
为每天约0.05至约10mg/kg。适合的剂量水平可为每天约0.01至约25mg/kg、每天约0.05至
10mg/kg或每天约0.1至5mg/kg。在此范围内，所述剂量可为每天0.005至0.05、0.05至0.5或
0.5至5.0mg/kg。
对于口服药剂的施用，所述组合物可以含1.0至1000毫克活性成分，尤其1.0、3.0、
5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、
600.0、750.0、800.0、900.0和1000.0毫克活性成分的片剂、胶囊和类似形式提供。多肽可按
例如每天1至4次和通常每天一次或两次的方案施用。
本发明多肽的剂量可以适当频率重复，所述频率可在每天一次至每三个月一次的
范围内，取决于多肽的药物动力学性质(例如半衰期)和药效学反应(例如多肽的治疗效应
的持续时间)。在一些实施方案中，通常在每周一次与每3个月一次之间重复给药。在其它实
施方案中，大约每个月一次施用多肽。
在某些实施方案中，所公开的多肽的剂量容纳于“单位剂型”中。词组“单位剂型”
是指物理上离散的单元，各单元含有预定量的单独或与一种或多种其它药剂组合的本发明
多肽，从而足以产生所要效应。应了解，单位剂型的参数将取决于特定药剂和欲达成的效
应。
试剂盒
本发明还涵盖包含所公开的多肽及其药物组合物的试剂盒。所述试剂盒一般呈容
纳各种组分的物理结构形式，如下文所描述，且可用于例如实施以上所描述的方法(例如，
向需要体重减轻的受试者施用多肽)。
试剂盒可包括一种或多种本文中所公开的多肽(提供于例如无菌容器中)，其可呈
适合于施用受试者的药物组合物形式。多肽可以即用形式或以需要在施用前复原或稀释的
形式提供。当多肽呈需要由使用者复原的形式时，所述试剂盒还可包括与多肽一起或分开
包装的缓冲剂、药学上可接受的赋形剂和类似物。当预期组合疗法时，所述试剂盒可含有若
干分开或可能已组合于试剂盒中的药剂。所述试剂盒的各组分可封装于个别容器内，且所
有不同的容器均可处在单一包装内。本发明的试剂盒可设计用于必需适当维持容纳于其中
的组分的状况(例如冷藏或冷冻)。
试剂盒可含有包括关于其中组分的鉴别信息和关于其使用的说明(例如，给药参
数、活性成分的临床药理学(包括作用机制)、药代动力学和药效学、不良反应、禁忌等)的标
签或包装插页。标签或插页可包括制备商信息，诸如批号和过期日期。标签或包装插页可例
如并入容纳组分的物理结构中，分开容纳于所述物理结构内或附着于所述试剂盒的组件
(例如安瓿、管或小瓶)。例示性说明包括关于用所公开的调节剂及其药物组合物减少或降
低血液葡萄糖、治疗高血糖症、治疗糖尿病等的说明。
标签或插页可另外包括或并入计算机可读媒体，诸如磁盘(例如，硬盘、插卡、记忆
磁盘)、光盘(诸如CD-或DVD-ROM/RAM、DVD、MP3、磁带或电存储媒体，诸如RAM和ROM)或这些
媒体的混合形式，诸如磁性/光学储存媒体、FLASH媒体或记忆型插卡。在一些实施方案中，
实际说明不存在于试剂盒中，而是提供用于从远程来源(例如，经由因特网)获得说明的手
段。
实验
发布以下实施例以向本领域技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和
描述，而不欲限制被诸位发明者视作其发明的范围，其也不欲表示以下实验为所有实验或
仅进行的实验。已试图确保关于所使用的数字(例如，量、温度等)的准确度，但应考虑一些
实验误差和偏差。
除非另外指示，否则份数为重量份数，分子量为重量平均分子量，温度为摄氏度
(℃)，且压力为大气压或接近大气压。使用标准缩写，包括以下各项：bp＝碱基对；kb＝千碱
基；pl＝皮升；s或sec＝秒；min＝分钟；h或hr＝小时；aa＝氨基酸；kb＝千碱基；nt＝核苷
酸；ng＝纳克；μg＝微克；mg＝毫克；g＝克；kg＝公斤；dl或dL＝分升；μl或μL＝微升；ml或mL
＝毫升；l或L＝升；μM＝微摩尔；mM＝毫摩尔；M＝摩尔；kDa＝千道尔顿；i.m.＝肌内；i.p.＝
腹膜内；s.c.＝皮下；bid＝每日两次；HPLC＝高效液相色谱；BW＝体重；U＝单位；ns＝统计
上不显著；PG＝空腹血浆葡萄糖；FPI＝空腹血浆胰岛素；ITT＝胰岛素耐受性测试；PTT＝丙
酮酸盐耐受性测试；oGTT＝口服葡萄糖耐受性测试；GSIS＝葡萄糖刺激的胰岛素分泌；PBS
＝磷酸盐缓冲生理盐水；PCR＝聚合酶链反应；NHS＝N-羟基丁二酰亚胺；DMEM＝杜尔贝科氏
改良伊格尔氏培养基(Dulbeco’s Modification of Eagle’s Medium)；GC＝基因组复本；
EDTA＝乙二胺四乙酸。
材料和方法
以下方法和材料用于以下实施例中：
动物。使饮食诱导型肥胖(DIO)雄性C57BL/6J小鼠(The Jackson Laboratory，Bar
Harbor，ME)维持含有60千卡％脂肪、20千卡％蛋白质和20千卡％碳水化合物的高脂肪饮食
(D12492，Research Diets,Inc.，New Brunswick，NJ)持续12至20周。所有动物研究均经NGM
学会动物照护与使用委员会(NGM Institutional Animal Care and Use Committee)批
准。DIO C57BL/6J小鼠提供肥胖的类人模型，其中肥胖是基于过量卡路里摄取。C57BL/6J小
鼠易于肥胖，其中观测到显著体重增加以及高胰岛素血症和有时高血糖症。此品系为最常
用于模仿饮食诱导的肥胖的小鼠品系。(Nilsson C.等人,Acta Pharmacologica Sinica
(2012)33:173-181)。
核酸和氨基酸序列。GenBank登记号BC000529.2阐述编码人GDF15变体的ORF的
cDNA，且GenBank登记号NP_004855.2阐述由所述cDNA编码的氨基酸序列。智人血清白蛋白
cDNA是购自Origene(SC319937)，GeneBank登记号NM_000477.3、NP_000468)。
将Kozak元件和人类IgK信号肽序列(5'
CACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGCCAGATGT3')(SEQ
ID NO:98)插入pTT5载体(National Research Council Canada)中的PmeI与EcoRI位点之
间。尽管两个限制位点均被消除，但产生AgeI位点以便进行进一步同框克隆。为了产生
hIgK-GDF15构建体，使用以下各物通过PCR来扩增GDF15DNA：正向引物：5'-
CTCCGAGGTGCCAGATGTGCGCGCAACGGGGACCACTGTCCGCTCGGG 3'(SEQ ID NO:102)和反向引物：
5'-CCTCGAGCGGCCGCTAGCTCATATGCAGTGGCAGTCTTTGGCTAACAA 3'(SEQ ID NO:99)和
Sapphire PCR混合物(Clontech)。对PCR产物进行凝胶纯化(Qiagen Gel Extraction试剂
盒)，且使用In-Fusion(Clontech)克隆于pTT5-hIgK(用AgeI/HindIII加以线性化)中。为了
产生hIgK-HSA-接头-GDF15构建体，使用适当引物，通过PCR个别地扩增HSA-接头和GDF15。
在凝胶纯化之后，使用Gibson Assembly Master Mix来组装两个PCR片段和线性化pTT5载
体。分别用In-Fusion和Gibson反应转化Stellar或NEB 5α细胞，涂铺于含羧苄青霉素的LB-
琼脂板上且在37℃下培育隔夜。拣选单一群落且通过测序加以分析。纯化得自阳性群落的
DNA(DNA-Maxi-prep，Qiagen)，确定全长序列且用于转染哺乳动物细胞以便进行重组蛋白
质表达。
为了产生特定突变蛋白，用QuikChange Lightning试剂盒(Agilent)和适当引物
进行定点诱变。
瞬时表达。将所有GDF15突变蛋白均瞬时转染于Expi 293F细胞(Invitrogen
Corporation，Carlsbad，CA)中。将细胞以常规方式传代培养于Expi表达培养基
(Invitrogen)中，且维持为尺寸可变的摇瓶中的悬浮液培养物。典型地，细胞是以5e5个活
细胞/ml的细胞密度进行传代培养且在传代培养之前生长3天。将烧瓶维持在湿润CO2培育
器中，将培育器维持在37℃和5％CO2水平下。将细胞维持在120RPM的搅拌速率下的New
Brunswick振荡器平台(New Brunswick Scientific Company，Edison，NJ)上。
当培养物的细胞密度达到2.5e6个活细胞/ml且活力大于95％时进行转染。典型
地，对于50ml转染，将2.5e6个细胞/ml×50ml细胞接种于250ml摇瓶中，培养物体积为
42.5ml。首先将由含相关基因的表达载体组成的50μg质粒DNA稀释于2.5ml OPTI-MEM减血
清培养基(Invitrogen)中。同时，将(为质粒DNA量)2.67倍体积的Expifectamine转染试剂
(Invitrogen)也稀释于2.5ml OPTI-MEM减血清培养基中。在室温下培育5分钟之后，将经稀
释的转染试剂缓慢添加至经稀释的质粒DNA中以形成胜任转染的复合物。在室温下经20分
钟的培育期之后，将5ml转染复合物添加至42.5ml细胞培养物中。随后将经转染的细胞置于
湿润CO2培育器中维持在120RPM下的轨道式振荡器上。转染后二十四小时，对经转染的培养
物馈入250μl增强子1溶液(Invitrogen)和2.5ml增强子2溶液(Invitrogen)。随后将培养物
再置于湿润CO2培育器中的轨道式振荡器上。转染后6至7天，通过在3000RPM下离心30min，
随后经由0.2μm过滤器(Nalgene)过滤来收集细胞。随后在考马斯蓝染色凝胶上分析样品的
表达。
稳定CHO细胞表达。由基于Lonza的确立CHOK1SV细胞表达系统的含CHOK1SV GS-KO
宿主细胞系的GS XceedTM System稳定表达GDF15突变蛋白。GS Xceed System使得能够产生
适合于cGMP制备的高表达细胞系。该系统包括cGMP库存CHOK1SV GS-KO宿主细胞、GS表达载
体、针对细胞培养、转染、选择和细胞系筛选的完整方案和v8产生方法(培养基和馈料)。在
开发针对GDF15突变蛋白的细胞系时，遵循制备商提议的推荐方案以首先建立未克隆的细
胞系。随后使未克隆细胞系经受限制稀释克隆以分离高表达单细胞克隆。
GDF15重组蛋白的纯化。使用蓝色琼脂糖凝胶亲和力俘获或离子变化俘获从培养
基中纯化出HSA-GDF15融合物。在两种情况下，使用有助于实现最佳洗脱和与宿主细胞蛋白
质杂质分离的适当盐梯度/pH值条件来洗脱HSA-GDF15融合物。随后使用GE Healthcare
Superdex 200(26/60)柱，使用1×PBS作为运作缓冲液进一步纯化所有HSA-GDF15融合物。
进一步表征经纯化的融合物且用LC/MS(Agilent 6500系列Q-TOF)证实序列，经由凝胶过滤
HPLC(Agilent 1200-HPLC)和SDS-PAGE凝胶(非还原型和还原型)以考马斯蓝和/或银染色
证实单分散性。对于体内实验，对皮下注射来说，证实内毒素小于5EU/mg。
使用离子交换俘获从培养基中纯化出GDF15糖基化突变蛋白。在所有情况下，使用
有助于实现最佳洗脱和与宿主细胞蛋白质杂质分离的适当盐梯度/pH值条件来洗脱GDF15
突变蛋白。随后在pH 8.0下使用硫酸铵的降低线性梯度，使用GE HiTrap Phenyl HP进一步
纯化所有GDF15突变蛋白。经由非还原型SDS-PAGE凝胶上的凝胶位移，基于纯度和糖基化性
质评估并汇集级分。随后进一步表征各GDF15突变蛋白的最终汇集物且用LC/MS(Agilent
6500系列Q-TOF)证实序列/聚糖(+/-PNGase F，NEB目录号P0704S)，经由凝胶过滤HPLC
(Agilent 1200-HPLC)和SDS-PAGE凝胶(非还原型和还原型)以考马斯蓝和/或银染色证实
单分散性。所有GDF15突变蛋白均在10mM乙酸钠pH 4.0中配制。
对人GDF15突变蛋白的溶解度评估。使突变蛋白透析至0.01％(v/v)甲酸(pH 2.0)
中，且使用由再生硝化纤维10,000NMWL(UFC901096)组成的Amicon Ultra Centrifugal
Filters加以浓缩，在一些情况下大于10mg/mL。使用在280nm波长下的吸光率和比尔定律
(消光系数＝14400，分子量＝12,287Da)来测定各突变蛋白的起始浓度。随后将各突变蛋白
2倍连续稀释回0.01％甲酸中且将90μL各稀释添加至96孔板中。将10μL 10×PBS(含0.5M
Tris pH 7.0)添加至各孔且证实pH值为7。在室温下随振荡培育隔夜之后，在370nm下测量
混浊度。开始发生混浊的拐点被视为各突变蛋白的最大溶解度。将突变蛋白视其溶解度水
平而分类为五组之一：<0.2mg/mL＝+；≥0.2mg/mL＝++；≥0.5mg/mL＝+++；≥1.0mg/mL＝++
++；≥5.0mg/mL＝+++++。
实施例1：经稳定的HSA-GDF15融合分子的工程改造
构建体M1的表达显示在CHOK1SV GSKO稳定细胞系中的产生攻毒(图4)。在细胞培
养基中观测到HSA-GDF15二聚融合分子的显著剪接。使用离子交换和/或疏水性相互作用色
谱和/或凝胶过滤来分离经剪接物质，以产生经富集物质来源以供进一步表征。在Agilent
6500系列Q-TOF上进行LC/MS分析之后，HSA融合物的C末端、接头和GDF15的N末端中显而易
见剪接位点。来自构建体M1的主要物质鉴别如下(接头＝加下划线，GDF15＝加粗)：
物质1(SEQ ID NO:103)：
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FGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRH
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DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEF
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LVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVA
物质2(SEQ ID NO:104)：
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTL
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物质3(SEQ ID NO:105)：
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LVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLG
应注意，物质3包括成熟人血清白蛋白氨基酸序列和接头序列的一(第一)个氨基
酸。物质1和2缺少成熟人血清白蛋白氨基酸序列的最后八个氨基酸和C末端的最后一个氨
基酸。
物质4(SEQ ID NO:106)：
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物质5(SEQ ID NO:107)：
DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTL
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LVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSGGGGSGGGGSARN
为了最小化并修正在融合分子的接头区域附近观测到的剪接问题，设计等效于构
建体M1的构建体M2，然而截除GDF15中的前三个N端残基(ΔARN或ΔN3)(图3)。所得经稳定
的M2构建体在表达于CHOK1SV GSKO稳定细胞系中时显示极小剪接问题，如在针对各经表达
的构建体比较改良培养基时针对M1所观测。图4显示针对M1所观测的显著剪接和构建体M2
的稳定性。
基于针对构建体M2所观测的稳定性增强，达成进一步工程改造以获得最佳接头长
度和剪接潜力。达成[(G4S)]5的优化接头长度且与3个残基(M3-ΔARN或ΔN3)或6个残基
(M4-ΔARNGDH或ΔN6)的GDF15N端缺失偶合(参见图5)。
实施例2：稳定性提高的HSA-GDF15融合分子在DIO小鼠模型中对体重和食物摄取
的效应
在7天时间段内评估经皮下施用的具有与重组人GDF15融合的重组HSA的融合分子
对体重和食物摄取的效应。简单来说，以4nmol/kg、12nmol/kg和40nmol/kg的剂量，以单次
皮下推注(10mL/kg)形式向称重约38g至40g的DIO小鼠施用融合蛋白质M1(图3)、M3和M4(图
5)。在施用媒介物对照或融合蛋白质之后，在给药后24小时和7天监测体重和食物摄取以监
测效力。针对施用40nmol/kg剂量的DIO小鼠所获得的结果呈现于图6和图7中。
如图6中所描绘，以40nmol/kg(4nmol/kg和12nmol/kg未图示)的剂量施用融合蛋
白质显著改善食物摄取减少。在各组小鼠中，n＝8且p值(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<
0.001；ns＝不显著)是通过在各规定时间点比较各种浓度下的食物摄取与媒介物对照组的
司徒顿非配对T检定来确定。
参考图6，施用融合蛋白质相对于媒介物对照后24小时(1天)产生以下食物摄取减
少(媒介物＝2.8g+/-0.13g)：4nmol/kg剂量组(M1＝1.9g+/-0.25g，**；M3＝1.8g+/-
0.18g，***；M4＝1.8g+/-0.10g，***)、12nmol/kg剂量组(M1＝1.5g+/-0.19g，***；M3＝1.9g
+/-0.16g，***；M4＝1.7g+/-0.12g，***)和40nmol/kg剂量组(M1＝1.3g+/-0.11g，***；M3＝
1.8g+/-0.06g，***；M4＝1.5g+/-0.15g，***)。施用融合分子相对于媒介物对照后7天产生
以下食物摄取减少(媒介物＝2.7g+/-0.09g)：4nmol/kg剂量组(M1＝2.0+/-0.18g，**；M3＝
2.5g+/-0.08g，ns；M4＝2.5g+/-0.09g，ns)、12nmol/kg剂量组(M1＝2.0g+/-0.20g，**；M3＝
2.2g+/-0.17g，*；M4＝2.4g+/-0.28g，ns)和40nmol/kg剂量组(M1＝1.7g+/-0.14g，***；M3
＝2.4g+/-0.25g，ns；M4＝2.2g+/-0.24g，ns)。
如图7中所描绘，以40nmol/kg(4nmol/kg和12nmol/kg未图示)的剂量施用融合分
子显著减少体重。在各组小鼠中，n＝8且p值(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；ns＝不显
著)是通过在各规定时间点比较各种浓度下的食物摄取与媒介物对照组的司徒顿非配对T
检定来确定。
参考图7，在施用融合分子相对于媒介物对照之前的给药时间(天数＝0)，记录以
下体重(媒介物＝39.0g+/-0.92g)：4nmol/kg剂量组(M1＝39.2g+/-0.66g；M3＝39.4g+/-
0.91g；M4＝39.3g+/-0.77g)、12nmol/kg剂量组(M1＝39.4g+/-0.78g；M3＝39.3g+/-1.09g；
M4＝39.3g+/-0.81g)和40nmol/kg剂量组(M1＝39.2g+/-0.64g；M3＝39.2g+/-0.68g；M4＝
38.9g+/-0.60g)。施用融合分子相对于媒介物对照后24小时(天数＝1)，记录以下体重(降
低％＝Δ差异相对于施用给药前的群组体重)。媒介物＝+0.3g+/-0.11g，+0.6％)，4nmol/
kg剂量组(M1＝-0.6g+/-0.21g，-1.5％，***；M3＝-0.6g+/-0.17g，-1.6％，***；M4＝-0.9g
+/-0.13g，-2.4％，***)、12nmol/kg剂量组(M1＝-0.9g+/-0.11g，-2.3％，***；M3＝-0.7g
+/-0.18g，-1.6％，***；M4＝-0.6g+/-0.16g，-1.7％，***)和40nmol/kg剂量组(M1＝-1.0g
+/-0.14g，-2.5％，***；M3＝-0.6g+/-0.09g，-1.5％，***；M4＝-0.8g+/-0.22g，-
2.1％，***)。施用融合分子相对于媒介物对照后7天，记录以下体重(降低％＝Δ差异相对
于施用给药前的群组体重)。媒介物＝+1.2g+/-0.25g，+3.1％)、4nmol/kg剂量组(M1＝-
1.3g+/-0.30g，-3.3％，***；M3＝-1.1g+/-0.32g，-2.8％，***；M4＝-2.0g+/-0.29g，-
5.0％，***)、12nmol/kg剂量组(M1＝-1.8g+/-0.34g，-4.7％，***；M3＝-1.4g+/-0.43g，-
3.6％，***；M4＝-1.5g+/-0.32g，-3.7％，***)和40nmol/kg剂量组(M1＝-2.6g+/-0.28g，-
6.7％，***；M3＝-2.1g+/-0.28g，-5.4％，***；M4＝-2.6g+/-0.31g，-6.7％，***)。
图6和图7中的数据显示具有GDF15的接头优化和N端截短的HSA融合物具有活性，
且此类融合分子代表一种用于增强GDF15分子的某些有益性质的可行方法。
实施例3：具有改善的物理性质的人GDF15突变蛋白
实施例3中所阐述的资料解决与成熟人GDF15所固有的表面疏水性和亲水性相关
的溶解度限制。另外，评估沿成熟人GDF15的序列引入N连接的糖基化一致位点对溶解度的
效应。为了有助于评估成熟重组人GDF15突变蛋白的表达特征、糖基化性质和溶解度，均构
建为与IgK信号肽序列融合的成熟突变蛋白且描绘于图8A中。产生17种GDF15突变蛋白(表
示为M5至M21；分别为SEQ ID NO:81-97)。对于M16，N端缺失型式：产生ΔN3-M16突变蛋白且
测定其溶解度。M5突变蛋白含有通过以T取代wt GDF15(SEQ ID NO:1)中位置5上的D和通过
以N取代wt GDF15(SEQ ID NO:1)中位置21上的R而引入的两个N连接的糖基化一致位点。在
突变蛋白M6至M21中，引入一个N连接的糖基化一致位点(参见图8A)。应注意，尽管出于参考
取代位置的目的，突变蛋白在N末端包括IgK信号序列，但所述残基是编号为SEQ ID NO:1中
的相应残基的位置。因而，举例来说，尽管T存在于M5突变蛋白中的位置27上，但其被称为位
置5，因为相应D残基在SEQ ID NO:1中的位置为5。
经由快速倾入10×PBS+0.5M Tris pH 7.0(可评估突变蛋白相对于成熟人GDF15
的溶解度改善的严格缓冲液)中对突变蛋白(于0.01％甲酸中)进行溶解度评估。
溶解度评估是基于使用比尔定律，使用消光系数(成熟人GDF15＝14,400/单体)和
分子量(成熟人GDF15＝12,278Da/单体)计算的在280nm下的吸光率来确定。
在评估溶解度之前，各经工程改造的N-聚糖突变蛋白阐述于图8A中且评估ΔN3-
M16突变蛋白呈折叠型GDF15同源二聚体形式向哺乳动物组织培养基中分泌和N聚糖位点占
用率。如图9中所阐述，十八种糖基化突变蛋白中有十四种分泌为折叠型GDF15同源二聚体，
而M8、M10、M14和M15不形成二聚体且表达为聚集物。随后通过LC/MS和SDS-PAGE凝胶位移评
估分泌为同源二聚体的全部十四种经表达的糖基化突变蛋白，以确定从改良培养基中纯化
出之后N-聚糖基团在一致位点上的占用率。在全部十四种情况下，经表达的突变蛋白含有
高度占用率，且分析亚组对诸如溶解度的物理性质的改善。
监测分泌为同源二聚体且在一致位点内具有高聚糖占用率的经工程改造的N-聚
糖GDF15突变蛋白相对于成熟人GDF15对溶解度的改善。开始发生混浊的拐点被视为各突变
蛋白的最大溶解度。将突变蛋白根据其溶解度水平而分类为五组之一：<0.2mg/mL＝+；≥
0.2mg/mL＝++；≥0.5mg/mL＝+++；≥1.0mg/mL＝++++；≥5.0mg/mL＝+++++。所评估的各N-
聚糖GDF15突变蛋白与成熟人GDF15相比展现改善的溶解度：M5：++++，M7：+++，M11：+++，
M12：+++，M13：++++，M16：+++++，ΔN3-M16：+++++，M17：+++++，M20：++++，M21：+++。
实施例4：M16、ΔN3-M16和M17突变蛋白在DIO小鼠模型中对食物摄取的效应
评估经皮下施用糖基突变蛋白对食物摄取的效应。以上实施例3中描述糖基突变
蛋白M16(SEQ ID NO:92)和M17(SEQ ID NO:93)。还评估了命名为ΔN3-M16的糖基突变蛋
白。ΔN3-M16糖基突变蛋白的序列提供如下：
mdmrvpaqllgllllwlrgarcGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMH
AQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQNTTTGVSLQTYDDLLAKDCHCI(SEQ ID NO:100)
应注意，施用小鼠的多肽不包括IgK信号序列(mdmrvpaqllgllllwlrgarc，SEQ ID
NO:101)，因为IgK信号序列因由细胞(293细胞)表达的信号肽酶而裂解脱离所分泌的多肽。
参见图10，将经皮下施用单次1.0mg/kg(40nmol/Kg)剂量的PBS媒介物、成熟人
GDF15或N-聚糖突变蛋白给与17周龄雄性DIO小鼠(n＝9)。监测经皮下施用后24小时时间段
内的食物摄取(克/动物)。通过非配对司徒顿T检验来确定相对于媒介物(PBS)对照组的P
值。
如图10中所描绘，施用糖基突变蛋白引起食物摄取减少。在各组小鼠中，p值(*，p<
0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)是通过比较食物摄取与媒介物对照组的司徒顿非配对T检
验来确定。野生型GDF15也使食物摄取减少。
实施例5：M16、ΔN3-M16和M17突变蛋白在DIO小鼠模型中对体重的效应
评估经皮下施用的糖基突变蛋白对体重的效应。将经皮下施用单次1.0mg/kg
(40nmol/Kg)剂量的PBS媒介物、成熟人GDF15或N-聚糖突变蛋白(M16、M17和ΔN3-M16)给与
17周龄雄性DIO小鼠(n＝9)。监测经皮下施用后24小时时间段内的体重。通过非配对司徒顿
T检验来确定相对于媒介物(PBS)对照组的P值。
施用糖基突变蛋白引起体重减少(图11)。在各组小鼠中，p值(*，p<0.05；**，p<
0.01；***，p<0.001)是通过比较食物摄取与媒介物对照组的司徒顿非配对T检验来确定。野
生型GDF15也使体重减少。
本发明的特定实施方案描述于本文中，包括发明者已知的用于进行本发明的最佳
模式。在阅读前述描述后，本领域工作人员可显而易见所公开的实施方案的变化形式，且预
期本领域技术人员在适当时可采用此类变化形式。因此，如适用法规所允许，意欲以不同于
如本文中所明确描述的方式来实施本发明，且本发明包括所附权利要求书中所阐述的目标
物的所有修改和等效物。此外，除非本文中另外指示或者上下文明确相抵触，否则本发明涵
盖上述要素的所有可能变化形式的任何组合。
本说明书中所引用的所有公开、专利申请、登录号和其它参考文献均以引用的方
式并入本文中，如同各个别公开案或专利申请明确地且个别地以引用的方式并入。
序列表
<110> NGM生物制药有限公司
D·A·林德浩特
R·霍尔丹卡
田晖
许哲源
<120> 用于治疗代谢异常的组合物和方法
<130> NGMB-139WO
<150> US 62/031,063
<151> 2014-07-30
<160> 127
<170> PatentIn 版本3.5
<210> 1
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg
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<210> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 2
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20 25 30
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Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
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Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val
85 90 95
Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
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<210> 4
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 4
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65 70 75 80
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<212> PRT
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<223> 合成多肽序列
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<212> PRT
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<223> 合成多肽序列
<400> 6
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成多肽序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成多肽序列
<400> 8
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成多肽序列
<400> 9
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽序列
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽序列
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽序列
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽序列
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Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽序列
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Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp
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Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
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<213> 人工序列
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Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp
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Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys
35 40 45
Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser
50 55 60
Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro
65 70 75 80
Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成多肽序列
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Gly Thr His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
1 5 10 15
Val Asn Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 20
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Asn Leu Thr Thr
1 5 10 15
Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
20 25 30
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln
35 40 45
Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg
50 55 60
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln
85 90 95
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105
<210> 21
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 21
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
1 5 10 15
Val Arg Ala Asn Leu Thr Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
20 25 30
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln
35 40 45
Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg
50 55 60
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln
85 90 95
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105
<210> 22
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 22
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
1 5 10 15
Val Arg Ala Ser Asn Glu Thr Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
20 25 30
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln
35 40 45
Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg
50 55 60
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln
85 90 95
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105
<210> 23
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 23
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
1 5 10 15
Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
20 25 30
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Asn Gln
35 40 45
Thr Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg
50 55 60
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln
85 90 95
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105
<210> 24
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 24
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
1 5 10 15
Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
20 25 30
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Asn
35 40 45
Phe Thr Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg
50 55 60
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln
85 90 95
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105
<210> 25
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 25
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
1 5 10 15
Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
20 25 30
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln
35 40 45
Asn Arg Thr Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg
50 55 60
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln
85 90 95
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105
<210> 26
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 26
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
1 5 10 15
Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
20 25 30
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln
35 40 45
Phe Asn Ala Thr Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg
50 55 60
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln
85 90 95
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105
<210> 27
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 27
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
1 5 10 15
Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
20 25 30
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln
35 40 45
Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Asn Leu Thr Arg
50 55 60
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln
85 90 95
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105
<210> 28
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 28
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
1 5 10 15
Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
20 25 30
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln
35 40 45
Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Asn His Thr
50 55 60
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln
85 90 95
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105
<210> 29
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 29
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
1 5 10 15
Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
20 25 30
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln
35 40 45
Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg
50 55 60
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Asn Tyr
65 70 75 80
Thr Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln
85 90 95
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105
<210> 30
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 30
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
1 5 10 15
Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
20 25 30
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln
35 40 45
Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg
50 55 60
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Asn Thr Thr Thr Gly Val Ser Leu Gln
85 90 95
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105
<210> 31
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 31
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
1 5 10 15
Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
20 25 30
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln
35 40 45
Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg
50 55 60
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asn Thr Thr Val Ser Leu Gln
85 90 95
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105
<210> 32
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 32
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
1 5 10 15
Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
20 25 30
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln
35 40 45
Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg
50 55 60
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Asn Gly Thr Ser Leu Gln
85 90 95
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105
<210> 33
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 33
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
1 5 10 15
Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
20 25 30
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln
35 40 45
Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg
50 55 60
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Asn Ser Thr Gln
85 90 95
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105
<210> 34
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 34
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
1 5 10 15
Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
20 25 30
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln
35 40 45
Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg
50 55 60
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Asn Leu Thr
85 90 95
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
100 105
<210> 35
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 35
Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr
1 5 10 15
Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser
20 25 30
Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln
35 40 45
Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg
50 55 60
Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln
85 90 95
Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Asn Lys Thr Cys His Cys Ile
100 105
<210> 36
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 36
Arg Gly Arg Arg
1
<210> 37
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 37
Arg Lys Arg Lys Lys Arg
1 5
<210> 38
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 38
Arg Lys Lys Arg
1
<210> 39
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 39
Arg Arg Arg Lys Lys Arg
1 5
<210> 40
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 40
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 41
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 41
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 42
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 42
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 43
Gly Gly Ser Gly Gly
1 5
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 44
Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 45
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 45
Gly Ser Gly Gly Gly
1 5
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 46
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 47
Gly Ser Ser Ser Gly
1 5
<210> 48
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 48
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ile Glu Gly Arg
1 5 10
<210> 49
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 49
Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 50
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 50
Glu Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 51
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (2)..(3)
<223> 此位置處之胺基酸可為任何胺基酸
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (4)..(4)
<223> 此位置處之胺基酸可為任何疏水性胺基酸
<400> 51
Pro Xaa Xaa Xaa
1
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (2)..(3)
<223> 此位置處之胺基酸可為任何胺基酸
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (4)..(4)
<223> 此位置處之胺基酸可為任何疏水性胺基酸
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (5)..(5)
<223> 此位置處之胺基酸可為Ser或Thr
<400> 52
Pro Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (2)..(2)
<223> 此位置處之胺基酸可為Leu或Gln
<400> 53
Pro Xaa Gly Met Thr Ser
1 5
<210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (2)..(2)
<223> 此位置處之胺基酸可為Leu或Gln
<400> 54
Pro Xaa Gly Met Thr
1 5
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 55
Cys Gly Leu Val Pro Ala Gly Ser Gly Pro
1 5 10
<210> 56
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 56
Ser Leu Leu Lys Ser Arg Met Val Pro Asn Phe Asn
1 5 10
<210> 57
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 57
Ser Leu Leu Ile Ala Arg Arg Met Pro Asn Phe Asn
1 5 10
<210> 58
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 58
Ser Lys Leu Val Gln Ala Ser Ala Ser Gly Val Asn
1 5 10
<210> 59
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 59
Ser Ser Tyr Leu Lys Ala Ser Asp Ala Pro Asp Asn
1 5 10
<210> 60
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 60
Arg Pro Lys Pro Gln Gln Phe Phe Gly Leu Met Asn
1 5 10
<210> 61
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 61
Ser Leu Arg Pro Leu Ala Leu Trp Arg Ser Phe Asn
1 5 10
<210> 62
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 62
Ser Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Asn Phe Asn
1 5 10
<210> 63
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 63
Asp Val Asp Glu Arg Asp Val Arg Gly Phe Ala Ser Phe Leu
1 5 10
<210> 64
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 64
Ser Leu Pro Leu Gly Leu Trp Ala Pro Asn Phe Asn
1 5 10
<210> 65
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 65
Ser Leu Leu Ile Phe Arg Ser Trp Ala Asn Phe Asn
1 5 10
<210> 66
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 66
Ser Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr
1 5 10
<210> 67
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 67
Ser Leu Gly Pro Gln Gly Ile Trp Gly Gln Phe Asn
1 5 10
<210> 68
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 68
Lys Lys Ser Pro Gly Arg Val Val Gly Gly Ser Val
1 5 10
<210> 69
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 69
Pro Gln Gly Leu Leu Gly Ala Pro Gly Ile Leu Gly
1 5 10
<210> 70
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 70
His Gly Pro Glu Gly Leu Arg Val Gly Phe Tyr Glu Ser Asp Val Met
1 5 10 15
Gly Arg Gly His Ala Arg Leu Val His Val Glu Glu Pro His Thr
20 25 30
<210> 71
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 71
Gly Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Arg Gly Ile Val
1 5 10
<210> 72
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 72
Gly Gly Ser Gly Gln Arg Gly Arg Lys Ala Leu Glu
1 5 10
<210> 73
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 73
Ser Leu Ser Ala Leu Leu Ser Ser Asp Ile Phe Asn
1 5 10
<210> 74
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 74
Ser Leu Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly Gly Phe Asn
1 5 10
<210> 75
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 75
Ser Leu Leu Gly Ile Ala Val Pro Gly Asn Phe Asn
1 5 10
<210> 76
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 76
Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro
1 5 10
<210> 77
<211> 734
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 77
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg
20 25 30
Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala
35 40 45
Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu
50 55 60
Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser
65 70 75 80
Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu
85 90 95
Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys
100 105 110
Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys
115 120 125
Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val
130 135 140
Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr
145 150 155 160
Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu
165 170 175
Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln
180 185 190
Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg
195 200 205
Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser
210 215 220
Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg
225 230 235 240
Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu
245 250 255
Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu
260 265 270
Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu
275 280 285
Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro
290 295 300
Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met
305 310 315 320
Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp
325 330 335
Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe
340 345 350
Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu
355 360 365
Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala
370 375 380
Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys
385 390 395 400
Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu
405 410 415
Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg
420 425 430
Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val
435 440 445
Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu
450 455 460
Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln
530 535 540
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545 550 555 560
Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe
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595 600 605
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Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His
625 630 635 640
Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu
645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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690 695 700
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705 710 715 720
Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
725 730
<210> 78
<211> 731
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 78
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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115 120 125
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Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu
165 170 175
Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln
180 185 190
Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg
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Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser
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Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg
225 230 235 240
Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu
245 250 255
Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu
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Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu
275 280 285
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Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met
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Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp
325 330 335
Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe
340 345 350
Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu
355 360 365
Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala
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<210> 79
<211> 741
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 79
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg
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165 170 175
Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln
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Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg
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Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu
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325 330 335
Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe
340 345 350
Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu
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595 600 605
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro
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740
<210> 80
<211> 738
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 80
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Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu
165 170 175
Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln
180 185 190
Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg
195 200 205
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Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg
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Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu
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260 265 270
Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu
275 280 285
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Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met
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Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp
325 330 335
Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe
340 345 350
Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu
355 360 365
Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala
370 375 380
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Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu
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435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
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Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys
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595 600 605
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys
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725 730 735
Cys Ile
<210> 81
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 81
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130
<210> 82
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 82
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
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35 40 45
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<210> 83
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 83
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
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<210> 84
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 84
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115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 85
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 85
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<210> 86
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 86
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115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 87
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 87
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Asn Arg Thr Ala Asn Met His
65 70 75 80
Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro
85 90 95
Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln
100 105 110
Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala
115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 88
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 88
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Asn Ala Thr Asn Met His
65 70 75 80
Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro
85 90 95
Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln
100 105 110
Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala
115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 89
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 89
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His
65 70 75 80
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85 90 95
Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln
100 105 110
Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala
115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 90
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 90
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His
65 70 75 80
Ala Gln Ile Lys Thr Ser Asn His Thr Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro
85 90 95
Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln
100 105 110
Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala
115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 91
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 91
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His
65 70 75 80
Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro
85 90 95
Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Asn Tyr Thr Pro Met Val Leu Ile Gln
100 105 110
Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala
115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 92
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 92
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His
65 70 75 80
Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro
85 90 95
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100 105 110
Asn Thr Thr Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala
115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 93
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 93
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His
65 70 75 80
Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro
85 90 95
Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln
100 105 110
Lys Thr Asn Thr Thr Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala
115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 94
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 94
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His
65 70 75 80
Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro
85 90 95
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100 105 110
Lys Thr Asp Asn Gly Thr Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala
115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 95
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 95
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His
65 70 75 80
Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro
85 90 95
Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln
100 105 110
Lys Thr Asp Thr Gly Asn Ser Thr Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala
115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 96
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 96
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His
65 70 75 80
Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro
85 90 95
Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln
100 105 110
Lys Thr Asp Thr Gly Val Asn Leu Thr Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala
115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 97
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 97
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His
65 70 75 80
Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro
85 90 95
Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln
100 105 110
Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Asn
115 120 125
Lys Thr Cys His Cys Ile
130
<210> 98
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸序列
<400> 98
caccatggac atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctactct ggctccgagg 60
tgccagatgt 70
<210> 99
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸序列
<400> 99
cctcgagcgg ccgctagctc atatgcagtg gcagtctttg gctaacaa 48
<210> 100
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 100
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg
20 25 30
Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp
35 40 45
Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile
50 55 60
Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile
65 70 75 80
Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys
85 90 95
Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Asn Thr Thr
100 105 110
Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys
115 120 125
His Cys Ile
130
<210> 101
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 101
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys
20
<210> 102
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸序列
<400> 102
ctccgaggtg ccagatgtgc gcgcaacggg gaccactgtc cgctcggg 48
<210> 103
<211> 577
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 103
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala
<210> 104
<211> 584
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 104
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
580
<210> 105
<211> 586
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 105
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly
580 585
<210> 106
<211> 602
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 106
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
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Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
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Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
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Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
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Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
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Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
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450 455 460
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515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
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<220>
<223> 合成多肽
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<212> DNA
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<223> 合成寡核苷酸
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<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 109
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60
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<212> DNA
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<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 402
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 117
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60
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gcgcagatca agacgagcct gcaccgcctg aagcccgaca cggtgccagc gccctgctgc 300
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<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 119
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60
agatgtgcgc gcaacgggga ccactgtccg ctcgggcccg ggcgttgctg ccgtctgcac 120
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<210> 120
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 120
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60
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<210> 121
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 121
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<210> 123
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 123
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<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 124
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agatgtgcgc gcaacgggga ccactgtccg ctcgggcccg ggcgttgctg ccgtctgcac 120
acggtccgcg cgtcgctgga agacctgggc tgggccgatt gggtgctgtc gccacgggag 180
gtgcaagtga ccatgtgcat cggcgcgtgc ccgagccagt tccgggcggc aaacatgcac 240
gcgcagatca agacgagcct gcaccgcctg aagcccgaca cggtgccagc gccctgctgc 300
gtgcccgcca gctacaatcc catggtgctc attcaaaaga ccgacaccgg ggtgtcgctc 360
cagacctatg atgacttgtt aaacaaaacc tgccactgca tatga 405
<210> 125
<211> 396
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 125
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60
agatgtgggg accactgtcc gctcgggccc gggcgttgct gccgtctgca cacggtccgc 120
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aagacgagcc tgcaccgcct gaagcccgac acggtgccag cgccctgctg cgtgcccgcc 300
agctacaatc ccatggtgct cattcaaaac accaccaccg gggtgtcgct ccagacctat 360
gatgacttgt tagccaaaga ctgccactgc atatga 396
<210> 126
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 126
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly
20 25 30
Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp
35 40 45
Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr
50 55 60
Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His
65 70 75 80
Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro
85 90 95
Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln
100 105 110
Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala
115 120 125
Lys Asp Cys His Cys Ile
130
<210> 127
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 127
atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60
agatgtgcgc gcaacgggga ccactgtccg ctcgggcccg ggcgttgctg ccgtctgcac 120
acggtccgcg cgtcgctgga agacctgggc tgggccgatt gggtgctgtc gccacgggag 180
gtgcaagtga ccatgtgcat cggcgcgtgc ccgagccagt tccgggcggc aaacatgcac 240
gcgcagatca agacgagcct gcaccgcctg aagcccgaca cggtgccagc gccctgctgc 300
gtgcccgcca gctacaatcc catggtgctc attcaaaaga ccgacaccgg ggtgtcgctc 360
cagacctatg atgacttgtt agccaaagac tgccactgca tatga 405