用[R-(Z)]-α-(甲氧基亚氨基)-α-(1-氮杂双环[2.2.2] 辛-3-基)乙腈降低阿尔茨海默症中βA4淀粉样蛋白的形成 本发明涉及增强淀粉样前体蛋白沿非淀粉样蛋白生成途径加工的方法并涉及用于所述方法的化合物。
淀粉样前体蛋白(APP)是可以在数种途径中加工的膜组成糖蛋白。用β和γ分泌酶(secretase)裂解最终导致β淀粉样蛋白(βA4)的释放，它们在患阿尔茨海默症(AD)的个体脑中沉积。或者用α分泌酶裂解又会导致非淀粉样蛋白生成途径的APP片段的释放。已经表明毒蕈碱激动剂卡巴胆碱、乌拉胆碱、AF-102B和xanomeline通过激活ml和/或m3受体亚型可以提高非淀粉样蛋白生成途径的APP片段的生成(Nitsch等人，1992，Buxbaum等人，1992，1994，Haring等人，1994，Growdon1994)。
EP-A-0392803(Beecham Group p.l.c)公开了某些氮杂双环化合物，它们通过在中枢神经系统内毒蕈碱受体的作用可以增强乙酰胆碱的功能，这些化合物包括[R-(Z)]-α-(甲氧基亚氨基)-α-(1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)乙腈(化合物(I))和可药用盐，并公开了制备这些化合物的方法。
WO-93/17018公开了其它制备化合物(I)的方法。
现已发现化合物(I)提高淀粉样前体蛋白沿非淀粉样蛋白生成途径的加工，因此通过降低βA4的生成而在阿尔茨海默症的治疗中有潜在的用途。
根据本发明，提供了化合物(I)或其可药用盐在制备药物中的用途，所述药物在患有或有发展成阿尔茨海默症危险的患者中用于提高淀粉样前体蛋白沿非淀粉样蛋白生成途径的加工。本发明还提供了化合物(I)或其可药用盐通过降低βA4的生成而治疗或预防阿尔茨海默症地用途。
本发明的另一方面还提供了在患有或有发展成阿尔茨海默症危险的患者中提高淀粉样前体蛋白沿非淀粉样蛋白生成途径加工的方法，包括给患者施用有效非毒性量的化合物(I)或其可药用盐。本发明还提供了在患有或有发展成阿尔茨海默症危险的患者中通过降低βA4的生成而治疗或预防阿尔茨海默症的方法，包括给患者施用有效非毒性量的化合物(I)或其可药用盐。
化合物(I)可以与强酸形成酸加成盐。术语可药用盐包括溶剂化物和水合物。
优选在药物组合物中提供化合物(I)，所述组合物含有化合物(I)或其可药用盐和可药用载体。
所述组合物可以是片剂，胶囊，粉末，颗粒，锭剂，栓剂，可再配制的粉末或液体制剂如口服或无菌非肠道溶液或悬浮液。
为了使给药均匀，优选该组合物为单位剂型。
用于口服的单位剂量形式可以是片剂和胶囊，而且可含有常规赋形剂如粘结剂如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄蓍胶或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇或甘油；压片润滑剂如硬脂酸镁；崩解剂如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉乙醇酸钠或微晶体纤维素；或可药用湿润剂如月桂基硫酸钠。
用常规的混合，填充，压片等方法可以制备固体口服组合物。可以用反复混合操作将活性剂分散在施用大量填充剂的那些组合物中。当然，所述操作是本领域常规的。采用常规药物实践中熟知的方法，特别是用肠溶包衣可以将片剂包衣。
口服液体制剂可以是例如乳液、糖浆或酏剂形式，或可以作为在使用前与水或其他适宜载体再配制的干燥产品。所述液体制剂可以含有常规添加剂如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧基甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化的可食用脂肪；乳化剂，如卵磷脂，脱水山梨糖醇单油酸酯或阿拉伯胶；非水载体(可包括可食用油)，例如杏仁油，分馏的椰子油，油酯如甘油、丙二醇或乙醇酯；防腐剂，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸；如果需要还可以加入常规的调味剂或着色剂。
对于非肠道给药，用所述化合物和无菌载体，并根据所用的浓度制备液体单位剂量形式，可以将化合物悬浮或溶解在所述载体中。在制备溶液时，可以将所述化合物溶解在注射用水中，在装到适宜的小瓶或安瓿中前过滤灭菌，然后密封。有利的是，可将佐剂如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂溶解在载体中。为了提高稳定性，在装到小瓶中后，可以将所述组合物冷冻，在真空下除去水。用基本上相同的方法制备非肠道悬浮液，不同的是将所述化合物悬浮在载体中而不是将其溶解于载体中，而且不能通过过滤灭菌。在悬浮于无菌载体中前，通过与环氧乙烷接触可以将所述化合物灭菌。有利的是，在所述组合物中可以包含表面活性剂或湿润剂以有利于所述化合物的均匀分散。
根据给药方法，所述组合物可以含有0.1％-99％重量，优选10-60％重量的活性物质。
本发明还提供了如上定义的药物组合物，该组合物用于在患有或有发展成阿尔茨海默症危险的患者中提高淀粉样前体蛋白沿非淀粉样蛋白生成途径加工。本发明还提供了如上定义的药物组合物，该组合物用于通过降低βA4的生成治疗和/或预防阿尔茨海默症。
通常所述化合物的剂量可以随疾病的严重程度、患者的体重以及所述化合物的相对效力而有所不同。然而，一般推荐的适宜单位剂量可以是5-300μg，例如10-200μg，所述单位剂量每天可以给药一次以上，例如一天两次或三次，这样每天的总剂量在约30-600μg的范围内，所述治疗可以延续许多年。
在上述表明的剂量范围内，化合物(I)没有不可接受的毒性作用。
用下列药理学资料来说明本发明。药理学资料淀粉样前体蛋白作用于CHO细胞
用Western印迹技术研究在用人毒蕈碱受体转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，试验化合物对APP加工的影响。用激光密度测量仪扫描免疫反应带对印迹作定量分析。材料
从N.I.M.H.(Md.USA)得到用人毒蕈碱受体(Bonner1988)稳定转染的CHO细胞。组织培养基和试剂来自Gibco BRL(苏格兰)。一般的实验室试剂来自Signa化学公司(Dorset)。在EP-A-0392803中，将[R-(Z)]-α-(甲氧基亚氨基)-α-(1-氮杂双环[2.2.2]辛-3-基)乙腈一盐酸盐描述为草酸盐。
使用下列初级抗体：识别APP氨基末端表位的22C11小鼠单克隆抗体(Boehringer Mannheim，Sussex，UK)，该抗体可识别APP的氨基酸末端表位；抗大鼠βA4 1-25的抗βA4 1-25兔多克隆抗体；抗APP羧基末端表位(APP770的氨基酸751-770)的Ab54兔多克隆抗体。
二级抗体是抗兔或抗小鼠IgG(Sigma化学公司，Dorset，UK)接着兔或小鼠过氧化物酶抗过氧化物酶(PAP)(Sigma化学公司，Dorset，UK)。所用的底物是增强的化学发光试剂盒(ECL)(RPN2106，Amersham，Bucks，UK)，用Hyperfilm-ECL(Amersham，Bucks，UK)监测免疫反应带。方法细胞培养
使用人毒蕈碱受体亚型hm1、hm2、hm3和hm4转染的CHO细胞在组织培养皿(直径10cm)上，于含核糖核苷和脱氧核糖核苷、10％胎牛血清、青霉素100单位/ml和链霉素100单位/ml的α基本培养基(αMEM)中生长至融合。用试验化合物处理细胞
按上述使细胞生长至融合，然后除去含血清的培养基，接着用5ml无血清培养基将细胞洗涤两次。然后用5ml含适宜浓度试验化合物的无血清培养基处理细胞，在37℃保温三小时。
收集条件培养基，放在冰上，加入蛋白酶抑制剂(1mM苯基甲基磺酰氟(PMSF)，5mM EDTA，1ug/ml亮肽素)。然后在3000G和4℃，将培养基离心15分钟，除去细胞碎片。取出上清液，用Centricon10浓缩仪(Amicon，Gloucestershire，UK)通过以3000G于4℃离心90分钟将其浓缩100倍。收集保留物，分等份于-20℃贮存直到准备进行电泳。
用5ml无血清培养基将细胞洗涤两次，刮下，在4℃以3000G离心5分钟以得到细胞沉淀。除去上清液，将细胞沉淀重悬于6x体积的溶解缓冲液(含1％Triton X100、5mM EDTA、1mM PMSF、1μg/ml亮肽素的0.1M Tris，pH7.5)中。间歇涡轮将溶解物在冰上保持30分钟，然后在4℃以10000G离心5分钟以除去细胞碎片。收集上清液，分等份于-20℃贮存直到准备进行电泳。蛋白检测
在凝胶电泳前，检测细胞溶解产物和浓缩的培养基样品的蛋白以确保在凝胶上每份处理的上样蛋白相等。用Bio-Rad(Herts，UK)染料试剂浓缩物，依Bradford染料结合方法(Bradford，1976)测量蛋白。在微滴板上完成检测，用带软件的Titretek Multiskan Plus MkII板阅读器在590nm读出吸收值以分析结果。由于不同试剂，特别是洗涤剂，干扰Bradford检测，因此用适宜的样品载体完成校正。SDS-PAGE
用Novex小凝胶系统(R&D Systems Europe，Ltd，Oxon，UK)分离蛋白。在相同的凝胶上负载等量的蛋白以便在处理之间进行比较。用含0.1M Tris pH6.8，10％十二烷基硫酸钠(SDS)、甘油中的0.1％溴酚蓝和50％β-巯基乙醇的2x还原样品缓冲液稀释样品。在含SDS(Laemmli 1970)的6％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上于100瓦将蛋白分离90分钟。还包括已知分子量的蛋白标准(Sigma)。Western印迹分析
在SDS-PAGE后，用含2.5mM Tris、19.2mM甘油、20％甲醇的转移缓冲液(pH8.3)将凝胶洗涤20分钟。用Bio-Rad半干系统，以0.8mA/cm2经2小时，将蛋白从凝胶转移到Immobilon P聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。转移后，用10％Ponceau S(Sigma)溶液染色2分钟，肉眼观察在膜上的蛋白。用蒸馏水漂洗，使其脱色。
用含0.1％吐温20和5％干奶粉的磷酸盐缓冲盐(PBS)，在室温将膜阻断至少一小时。然后用PBS 0.1％吐温20(PBST)洗涤两个30秒，然后在4℃与初级抗体保温过夜。用含2％牛血清白蛋白(Sigma)的PBST制备所有的抗体。用PBST将膜洗涤1分钟，然后再洗涤两个5分钟。在室温，以1/3000或1/5000稀释度分别加入二级抗体，抗-小鼠或抗-兔IgG(Sigma)。按上述洗涤膜，然后，在室温用1小时以1/3000的稀释度加入小鼠或兔过氧化物酶抗过氧化物酶(Sigma)。最后的洗涤步骤是只用PBS，然后将膜转移到干净的平皿中以加入ECL底物(Amersham)。在使用自动加工仪(柯达)显现的Hyperfilm-ECL(Amersham)上检测反应带。密度测量仪分析
用激光密度测量仪测量APP水平的变化。用与带有Gelscan XL软件的计算机相连的Pharmacia LKB Ultrascan XL扫描免疫反应APP带，进行数据处理。激光束通过样品，用光极测量发射的光量，由此确定吸收了多少。将吸收值数据积分以得到曲线下的面积值。将载体和试验化合物的结果表示为3次试验的平均值±平均值的标准误差(SEM)。体外配体结合试验
切下雄性Hooded Lister大鼠(Olac，U.K.)的大脑皮质放到2.5体积(与净重相比)冰冷的50mM tris pH7.7中。在4℃匀浆，然后以24000g将其离心15分钟。将沉淀重悬在2.5体积中，将匀浆产物以1ml一份在-20℃贮存直到使用。
在含2mM氯化镁的2ml冰冷的50mM Tris中制备用于[3H]-OXO-M结合的保温液。加入[3H]-OXO-M乙酸盐(New England Nuclear，比活性为87Ci/mmol)达到1.88nM的浓度。皮质匀浆物的最后浓度为300体积(以源净重为基础)(等于0.145mg蛋白/ml)。用10uM的oxotremorinesesquifumarate确定非特异性结合。在37℃，用30-45分钟完成保温达到平衡。通过在0.05％聚乙烯亚胺水溶液中预浸30分钟以防止[3H]-OXO-M吸附到玻璃滤器上的Watman GF/B滤器过滤样品。
相似地完成[3H]-QNB(比活性44Ci/mmol，终浓度0.27nM)结合，只是不加氯化镁，并将匀浆物的稀释度增加到1500体积(7.8ug蛋白/ml)。用1uM硫酸阿托品定义非特异性结合。
在表5中列出了所研究化合物的结合数据。结果
用上述方法，研究试验化合物，化合物(I)一盐酸盐对淀粉样前体蛋白加工的影响。
在所有转染的CHO细胞中，检测分子量为108kD的全长APP和分子量为108kD和118kD的分泌APP的两个带。CHOhm1
在处理3小时后，用10-6-10-4M剂量的化合物(I)一盐酸盐减少了细胞膜中的全长APP。在培养基中，试验化合物在该浓度范围内使分泌的APP增加6-10倍(表1)。CHOhm2
用1×10-4M化合物(I)一盐酸盐处理3小时后，细胞膜中的全长APP没有变化，但在培养基中，分泌的APP增加一倍(表2)。CHOhm3
处理3小时后，用10-6-10-4M剂量的化合物(I)一盐酸盐减少了细胞膜中的全长APP。在培养基中，试验化合物在浓度范围内使分泌的APP增加约20倍(表3)。CHOhm4
用1×10-4M化合物(I)一盐酸盐处理3小时后，细胞膜的全长APP或培养基中的分泌的APP没有变化(表4)。配体结合研究
配体结合数据(表5)表明化合物(I)一盐酸盐的QNB/OXO-M比率为22，表明是部分激动剂特性(Brown等人1988)。结论
化合物(I)一盐酸盐通过刺激m1和m3受体亚型而改变了APP的加工。分泌的APP的释放增加，特别是用抗βA4 1-25抗体(其不应识别β分泌酶裂解的APP)检测的释放增加，有力地表明这是沿非淀粉样蛋白生成途径。
因此，化合物(I)一盐酸盐通过增强非淀粉样蛋白生成途径的APP加工，降低脑中βA4的生成，而使其在阿尔茨海默症的治疗中有潜在的应用。参考文献：Bonner T(1988)NIH Patent No PB89-125652；US Appl-7-241 971 filed 08.09.88Bradford，M.(1976)Anal.Biochem.，72，248-254Brown，F.，Clark，M.，Graves，D.，Hatcher，J.，MeArthur，R.，Riley，G.and Semple，J.(1988)Drug Dev Res，14，343-347Buxbaum，J.D.，Oishi，M.，Chen，H.I.，Pinkas-Kramarski，R.，Jaffe，E.A.，Gandy，S.E.and Greengard，P.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.，89，10075-10078Buxbaum，J.D.，Ruefli，A.A.，Parker，C.A.，Cypress，A.M.and Greengard，P.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci. ，91，4489-4493Growdon J.H.(1994)”Muscarinic agonists：Effects on APP processing ”4thInternational Meeting on Alzheimers Disease，Minneapolis，July 1994.Haring，R.，Gurwitz，D.，Barg，J.，Pinkas-Kramarski，R.，Heldman，E.，Pittel，Z.，Wengier，A.，Meshulam，H.，Marciano，D.，Karton，Y.and Fisher，A.(1994)Biochem.Biophys.Res.Comm.203(1)，652-658Laemmli，U.K.(1970)Nature，227，680-685Nitsch，R.M.，Slack，B.E.，Wurtrnan，R.J.and Growdon，J.H(1992)Science，258，304-307Weidemann，A.，Konig，G.，Bunke，D.，Fischer，P.，Salbaum，J.M.，Masters，C.L.andBeyreuther，K.(1989)Cell，57，115-126在表中：表1-CHOhm1剂量反应结果是3个试验的平均值，并表示为与对照APP水平相比较的变化。(分泌的APP增加1倍＝与基线比较无变化)。所用的抗体是在细胞溶解产物中的Ab54以检测全长APP，而用22C11检测分泌的APP。表2-CHOhm2反应所用的抗体与表1中的相同。结果是3个试验的平均值，并表示为与对照APP水平相比较的变化。(分泌的APP增加1倍＝与基线比较无变化)。表3-CHOhm3剂量反应所用的抗体是在细胞溶解产物中的Ab54以检测全长APP，而用βA41-25检测分泌的APP。试验按一式三份完成。结果是3个试验的平均值，并表示为与对照APP水平相比较的变化。(分泌的APP增加1倍＝与基线比较无变化)。表4-CHOhm4反应所用的抗体如表3所示。结果是3个试验的平均值，并表示为与对照APP水平相比较的变化。(分泌的APP增加1倍＝与基线比较无变化)。表5：化合物(I)的配体结合数据
[3H]-OXO-M [3H]-QNB QNB/OXO-M
IC50 IC50化合物(I)* 14 309 22*一盐酸盐OXO-M＝oxotremorine-M，激动剂配体QNB＝二苯乙醇酸奎宁环酯(quinuclidinylbenzilate)，拮抗剂配体QNB/OXO-M比率是所述化合物功能效力的指标。大于100的比率与全激动剂有关，拮抗剂的比率接近1，中间值表明是部分激动剂。
表1 CHOhm1剂量反应
印迹密度 全长APP 印迹密度 分泌APP
(AUC mm2) 减少的平 (AUC mm2) 增加的
(±SEM) 均百分率 (±SEM) 平均倍数对照 23.74±6.84 2.29±1.21化合物(I)*1×10-4M14.03±7.27 40.9 17.54±9.78 7.7
1×10-5M 12.32±5.91 48.1 14.48±7.25 6.3
1×10-6M 16.84±7.20 29.1 24.2±11.61 10.6*一盐酸盐
表2 CHOhm2反应
印迹密度 全长APP 印迹密度 分泌APP
(AUC mm2) 减少的平 (AUC mm2) 增加的
(±SEM) 均百分率 (±SEM) 平均倍数对照 12.61±1.0 2.74±0.55化合物(I)*1×10-4M 12.04±2.56 4.5 5.75±1.60 2.1*一盐酸盐
表3 CHOhm3剂量反应
印迹密度 全长APP 印迹密度 分泌APP
(AUC mm2) 减少的平 (AUC mm2) 增加的
(±SEM) 均百分率 (±SEM) 平均倍数对照 23.06±3.78 0.85±0.18化合物(I)*1×10-4M 4.95±1.14 78.5 15.81±7.87 18.6
1×10-5M 5.51±1.18 76.1 15.60±2.27 18.4
1×10-6M 7.46±3.36 67.7 16.33±5.37 19.2*一盐酸盐
表4 CHOhm4反应
印迹密度 全长APP 印迹密度 分泌APP
(AUC mm2) 减少的平 (AUC mm2) 增加的
(±SEM) 均百分率 (±SEM) 平均倍数对照 25.24±0.68 20.80±4.42化合物(I)*1×10-4M24.62±0.94 2.5 22.59±10.28 1.1*一盐酸盐