一种生物转化改善再造烟叶感官品质的方法技术领域
本发明涉及烟草工业领域，具体是一种生物转化改善再造烟叶感官品质的方法。
背景技术
再造烟叶主要由烟末、碎片、烟梗或低次烟叶加入胶粘剂和其他添加剂等组成。烟
末、碎片、烟梗是烟草工业的副产物，以前多作弃置处理。我国是烟草大国，每年有数十万吨
烟末、碎片、烟梗资源被废弃，既造成环境污染，同时也是对自然资源的浪费。研究表明，烟
末、碎片、烟梗中含有的成分种类与烟叶成分基本一致，但是存在杂气重、刺激性大和口感
不适等吸味缺陷。
再造烟叶的细胞壁物质主要有纤维素、半纤维素、果胶、木质素等，若细胞壁物质
和淀粉含量高，会造成烟叶粗糙，烟气刺激大，不和顺；细胞壁物质中的过量的纤维素，会赋
予烟气尖刺和灼热感并产生呛咳；而木质素的热裂解对烟草品质产生负面影响，其含量越
高，烟叶品质越差，具有强烈的刺激性气味，青杂气重，吸味辛辣、涩口。同时木质素也是造
纸工业排放黑液COD和色度形成的主要原因，是目前公认的微生物难降解芳香化合物之一。
生物转化法是在细胞或酶等生物催化下进行的化学反应，既是指利用微生物(微
生物的生长细胞、微生物的休止细胞)、酶(来自微生物或动植物的纯酶或粗酶)或植物细
胞，通过简单的生物转化或生物合成制备所需物质的方法。与化学催化剂相比，生物催化剂
专一性更强、催化活性更高、条件更易控制。微生物在增殖过程中可产生庞大的高活性酶
系，如多糖水解酶类、蛋白酶类、酯化酶类、氧化还原酶类及裂合酶类等，在酶促作用、化学
作用及微生物体内复杂代谢的协同作用下，可使植物原料发生分解、降解、氧化、还原、聚
合、偶联、转化等作用，形成复杂的低分子化合物，其中包括各种香味化合物，如醇类、醛类、
酮类、酸类、脂类、酚类、吡喃类、吡啶类和萜烯类等，这些香气物质无疑也是烟草或用于烟
草的添加剂的香气组分。
阿魏酸酯酶能切断细胞壁中多糖一多糖、多糖一木质素间的交联，有利于细胞壁
物质中多糖的降解和木质素的释放，利用阿魏酸酯酶处理植物性的原材料，可以将阿魏酸
从植物细胞壁的结构中游离出来，从而破坏了细胞壁的骨架结构，使得木质素、半纤维素以
及纤维素之间的连接被部分打破，结构变得比处理前疏松。阿魏酸存在于烤烟烟叶中。纤维
素、淀粉、蛋白质可被生物酶定向水解生成葡萄糖、低聚糖、短肽、氨基酸等，能有效降低卷
烟的刺激性，减轻杂气和改善吸味。水溶性糖含量高使烟叶吃味醇和，香气优美，但糖类化
合物含量高，焦油释放量大。
以再造烟叶水溶液为底物，采用桔青霉阿魏酸酯酶、木聚糖酶、葡萄糖氧化酶、过
氧化氢酶、酚氧化酶协同作用，并采用食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus(VJ4-
1)转化，分解再造烟叶中木质素、纤维素、蛋白质等大分子刺激性物质，释放阿魏酸，并转化
阿魏酸为香兰素等香味前体物质，使生产的再造烟叶降低刺激性、减少青杂气、香气优美、
略带奶香气，改善再造烟叶感官品质，还未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种生物技术提升再造烟叶香气品质的方法，
采用食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus(VJ4-1)和桔青霉阿魏酸酯酶、木聚糖
酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、酚氧化酶等复合酶协同作用，以再造烟叶水溶液为底物进
行生物转化，再经常规工业工序生产再造烟叶。其中桔青霉阿魏酸酯酶能释放再造烟叶细
胞壁中的阿魏酸，使再造烟叶细胞壁疏松结构，有利于细胞壁物质中多糖的降解和木质素
的释放，再利用复合氧化酶的作用氧化降解木质素，食甲醇芽孢杆菌(VJ4-1)能转化阿魏酸
生成香兰素，其酶体系能分解、转化再造烟叶中的大分子刺激性物质或难挥发的香味前体
物质为小分子香气物质或还原糖等；并且阿魏酸酯酶和木聚糖酶等多糖酶具有协同作用，
这些酶和微生物的复合生物转化，使生产的再造烟叶降低刺激性、减少青杂气、烟气和顺、
香气优美、略带奶香气，改善再造烟叶感官品质。
本发明提供一种生物转化改善再造烟叶感官品质的方法，包括以下步骤：
(1)菌株活化：将食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus(VJ4-1)接种到马
铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在25～38℃、pH5～8条件下，静置培养24～96h后得到斜面
培养物，再接种到种子培养基，在25～38℃，转速100～150rpm/min条件下振荡培养12～
36h，连续转接1～3次后制得种子培养液；
所述的食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus(VJ4-1)保藏号为CCTCC NO：
2012004，于2012年1月16日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心；
所述的斜面培养基：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L。所述的种子培
养基：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。
(2)复合生物转化预处理：在再造烟叶的萃取工序，将步骤1)所述的种子培养液按
质量比2～18％接种到再造烟叶水溶液中，并添加占再造烟叶质量比的0.15～0.4％的桔青
霉阿魏酸酯酶、木聚糖酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、酚氧化酶等复合酶，搅拌混合均匀，
在pH至4.5～6.0，在30～45℃条件下，发酵1～12小时，得到再造烟叶生物转化液；
(3)再造烟叶常规生产工序：所述步骤1)的再造烟叶生物转化液，在55～65℃、pH
自然条件下萃取反应40～60min，碟螺离心分离液渣，将萃取液75～85℃下真空浓缩至固含
量40％，得到浓缩液，在此过程中，温度超过75℃，本发明的酶和菌失活；而残渣则通过用干
燥机实施100～120℃干燥处理，灭活酶和菌，制成质量比5～15％水含量的烟草基片；将浓
缩液喷涂到烟草基片上卷制成提升香气品质的再造烟叶。
进一步的，步骤(2)中所述桔青霉阿魏酸酯酶、木聚糖酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢
酶、酚氧化酶等复合酶，为食品级，酶活500u/g～10000u/g，分别占再造烟叶质量比的0～
0.1％。
本发明的有益效果：
本发明采用功能微生物和复合酶对再造烟叶进行生物转化，通过桔青霉阿魏酸酯
酶水解烟末、烟梗细胞壁的阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键，释放阿
魏酸，有利于细胞壁物质中多糖的降解和木质素的释放，破坏细胞壁的骨架结构，使木质
素、半纤维素以及纤维素之间的连接被部分打破，结构变得比处理前疏松，与木聚糖酶协同
作用，降解细胞壁物质；葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、酚氧化酶协同作用氧化降解木质素；功
能微生物食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus(VJ4-1)能转化阿魏酸生成香兰素，
其复杂的酶体系能分解、转化再造烟叶中的大分子刺激性物质或难挥发的香味前体物质为
小分子香气物质或还原糖等；所有这些酶和微生物的复合生物转化，使生产的再造烟叶降
低刺激性、减少青杂气、烟气和顺、香气优美、略带奶香气，改善再造烟叶感官品质。
本发明工艺条件温和易操作，实现了酶和微生物转化对再造烟叶香气品质的提
升，绿色环保，具有工业化应用的前景。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解，
此部分所描述的具体实施例仅可用于解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种生物转化改善感官品质的再造烟叶的方法，包括以下步骤：
(1)菌株活化：将食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus(VJ4-1)接种到马
铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在28℃、pH5条件下，静置培养28h后得到斜面培养物，再接
种到种子培养基，在28℃，转速115rpm/min条件下振荡培养12h，连续转接2次后制得种子培
养液；
所述的斜面培养基：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L。所述的种子培
养基：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。
(2)复合生物转化预处理：在再造烟叶的萃取工序，将步骤1)所述的种子培养液按
质量比5％接种到再造烟叶水溶液中，并添加占再造烟叶质量比的0.18％的桔青霉阿魏酸
酯酶、木聚糖酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、酚氧化酶等复合酶，搅拌混合均匀，在pH5、30
℃条件下，发酵4小时，得到再造烟叶生物转化液；所述桔青霉阿魏酸酯酶、木聚糖酶、葡萄
糖氧化酶、过氧化氢酶、酚氧化酶等复合酶，为食品级，酶活1000u/g，各占再造烟叶质量比
的0.05％、0.05％、0.03％、0.03％、0.02％；
(3)再造烟叶常规生产工序：所述步骤2)所得的再造烟叶生物转化液，在55℃、pH
自然条件下萃取反应55min，碟螺离心分离液渣，将萃取液78℃下真空浓缩至固含量40％，
得到浓缩液，在此过程中，温度超过78℃，本发明的酶和菌失活；而残渣则通过用干燥机实
施102℃干燥处理，灭活酶和菌，制成质量比12％水含量的烟草基片；将浓缩液喷涂到烟草
基片上卷制成提升香气品质的再造烟叶。
实施例2
一种生物转化改善感官品质的再造烟叶的方法，包括以下步骤：
(1)菌株活化：将食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus(VJ4-1)接种到马
铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在30℃、pH5.5条件下，静置培养36h后得到斜面培养物，再
接种到种子培养基，在30℃，转速120rpm/min条件下振荡培养18h，连续转接3次后制得种子
培养液；
所述的斜面培养基：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L。所述的种子培
养基：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。
(2)复合生物转化预处理：在再造烟叶的萃取工序，将步骤1)所述的种子培养液按
质量比9％接种到再造烟叶水溶液中，并添加占再造烟叶质量比的0.3％的桔青霉阿魏酸酯
酶、木聚糖酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、酚氧化酶等复合酶，搅拌混合均匀，在pH至5.5，
在32℃条件下，发酵6小时，得到再造烟叶生物转化液；所述桔青霉阿魏酸酯酶、木聚糖酶、
葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、酚氧化酶等复合酶，为食品级，800u/g，分别占再造烟叶质量比
的0.1％、0.1％、、0.05％、0.03％、0.02％；
(3)再造烟叶常规生产工序：所述步骤2)所得的再造烟叶生物转化液，在58℃、pH
自然条件下萃取反应55min，碟螺离心分离液渣，将萃取液80℃下真空浓缩至固含量40％，
得到浓缩液，在此过程中，温度达到80℃，本发明的酶和菌失活；而残渣则通过用干燥机实
施105℃干燥处理，灭活酶和菌，制成质量比13％水含量的烟草基片；将浓缩液喷涂到烟草
基片上卷制成提升香气品质的再造烟叶。
实施例3
一种生物转化改善感官品质的再造烟叶的方法，包括以下步骤：
(1)菌株活化：将食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus(VJ4-1)接种到马
铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在32℃、pH6条件下，静置培养72h后得到斜面培养物，再接
种到种子培养基，在32℃，转速125rpm/min条件下振荡培养30h，连续转接2次后制得种子培
养液；
所述的斜面培养基：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L。所述的种子培
养基：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。
(2)复合生物转化预处理：在再造烟叶的萃取工序，将步骤1)所述的种子培养液按
质量比12％接种到再造烟叶水溶液中，并添加占再造烟叶质量比的0.25％的桔青霉阿魏酸
酯酶、木聚糖酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、酚氧化酶等复合酶，搅拌混合均匀，在pH6.0、
32℃条件下，发酵8小时，得到再造烟叶生物转化液；所述桔青霉阿魏酸酯酶、木聚糖酶、葡
萄糖氧化酶、过氧化氢酶、酚氧化酶等复合酶，为食品级，酶活1500u/g，分别占再造烟叶质
量比的0.08％、0.08％、0.04％、0.03％、0.02％；
(3)再造烟叶常规生产工序：所述步骤2)所得的再造烟叶生物转化液，在62℃、pH
自然条件下萃取反应45min，碟螺离心分离液渣，将萃取液82℃下真空浓缩至固含量40％，
得到浓缩液，在此过程中，温度达到82℃，本发明的酶和菌失活；而残渣则通过用干燥机实
施110℃干燥处理，灭活酶和菌，制成质量比11％水含量的烟草基片；将浓缩液喷涂到烟草
基片上卷制成提升香气品质的再造烟叶。
试验例1：感官评吸效果对比试验
将实施例1、2、3制备的生物转化改善感官品质的再造烟叶与未经处理的对照样品
卷制成烟支，放入恒温恒湿箱内(22℃+1、相对湿度为60％+2％)平衡48h，请专家评吸小组
评吸。
经评吸小组反复评吸，表1表明：本发明制备的生物转化改善感官品质的再造烟
叶，复合酶和功能菌株的生物转化作用下，降解、分解、转化再造烟叶萃取液和基片中的蛋
白质、木质素、果胶、淀粉、纤维素等大分子物质为还原糖、香兰素及其香味前体物质，使生
产的再造烟叶降低刺激性、减少青杂气、烟气和顺、香气优美、略带奶香气，改善再造烟叶感
官品质。
表1.生物技术提升香气品质的再造烟叶的感官评吸效果对比
试验例2：再造烟叶木质素含量的检测
采用测定木质素含量的经典方法Klason法来检测再造烟叶中的木质素含量，其原
理是用72％硫酸除去纤维素，难溶的木质素经过滤、洗涤、干燥称重、计算等步骤可得到其
含量，本发明的生物转化改善感官品质的再造烟叶中的木质素含量均有降低，结果如表2。
表2.综合方法全面提升品质的再造烟叶的木质素含量
实验组
木质素含量
木质素降低率
空白对照
3.32％
/
实施例1组
2.82％
15.06％
实施例2组
2.80％
15.66％
实施例3组
2.75％
17.16％
试验例3：再造烟叶生物转化液香兰素HPLC检测
再造烟叶生物转化液，经0.22μm微孔滤膜过滤后用高效液相色谱检测，用Agilent
Eclipse XDB-C8色谱柱(5μm,4.6*150mm)，流动相为甲醇/0.5％冰乙酸＝30/70，流速1mL/
min，检测波长280nm，进样量10μL，检测时间40min。用50％甲醇溶液配制1g/L的标准样品溶
液，稀释成一系列不同浓度,每次进样10μL,以峰面积对标准样品浓度作图，绘制标准曲线。
表3.再造烟叶生物转化液中香兰素的浓度
实验组
香兰素浓度(mg/L)
未处理对照
/
实施例1组
121
实施例2组
262
实施例3组
209
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何
属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应
涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。