用于诱导细胞自噬的方法及组成物技术领域
本发明关于在患有细胞自噬(autophagy)缺陷的个体诱导细胞自噬的方法，特别
是一种通过对个体投予灵芝萃取物而用于在患有细胞自噬缺陷的个体中诱导细胞
自噬的方法。
背景技术
细胞自噬(autophagy)或称“自体消化过程(selfdigestionprocess)”，为一种重要的
生理过程，其靶向细胞质中的成分，诸如要于溶酶体中降解的蛋白质、蛋白质聚集
体(aggregates)和胞器。细胞自噬过程对于维持神经恒定性也是必要的，且其功能失
调(dysfunction)与多种疾病有直接关联。
当细胞处在饥饿状态时，细胞自噬的目的在于回收细胞内营养物质來維持细胞
代谢，而当细胞处于压力时，细胞自噬也能将累积的损坏胞器和蛋白质清除。
细胞自噬的缺陷是多种疾病的主要成因，这些疾病可以是，但不限于：神经退
行性疾病、肝脏疾病和癌症。许多人类神经退行性疾病与异常突变和/或泛素蛋白
(polyubiquitinatedprotein)的累积以及过度的神经细胞死亡有关。
神经生长因子(Nervegrowthfactor，NGF)于1951年被分离出来，且其为是第一
个被分离出来的神经滋养因子。在发育过程及成熟动物个体中，NGF是由星状细胞
(astrocytes)分泌，且对于神经突触可塑性以及建立有功能的神经回路亦扮演重要的
角色。内生性的NGF对于前脑负责学习记忆的胆碱神经元的存活及功能的重要性亦
被证实，此种神经滋养因子的部分去除与可量测的学习和记忆缺陷相关。
在许多动物模式中，NGF已显示具有潜在的神经保护效果。此外，在大鼠中，
NGF能保护对抗諸如3-NP和MPTP的线粒体毒素所引起的神经元死亡。因此，在神
经退行性疾病的治疗的药理应用中，NGF被认为扮演关键的角色。然而，NGF的获
取受到血脑障壁(blood-brainbarrier)的限制，且当经由周边投药时又易被代谢掉；因
此，使用时它只能被直接注入至脑部。当NGF经由脑室注射时，其与许多的副作用
相关联，因而使该传递途径不实用。因此，对于神经退行性疾病，调控内生性NGF
表达可能是一种崭新的治療策略。
神经退行泛指神经元的功能或结构渐进式的丧失。许多神经退行性疾病，包括
帕金森氏症(Parkinson’sdisease,PD)、阿兹海默症(Alzheimer’sdisease,AD)、亨丁顿
氏舞蹈症(Huntington’sdisease,HD)和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophiclateral
sclerosis,ALS)都是因神经退行的过程所造成。最近，许多神经退行性疾病的类似疾
病被发现，这些疾病彼此之间都有些关联。举例来说，有些神经退行性疾病与错误
折叠的蛋白质的不正常堆积有关，其亦被称为非典型的蛋白质集结(atypicalprotein
assemblies)。
亨丁顿氏舞蹈症(HD)是一种常染色体显性的神经退行性疾病，其由亨丁顿
(huntingtin，Htt)基因的外显子1(exon1)上CAG三核苷酸重复序列的异常扩张所导
致。HD的主要特征是HD实验动物及病患脑中受影响的纹状体神经元的突变亨丁顿
蛋白Htt(mHtt)聚集体的形成。Htt基因的多谷氨酰胺(polyglutamine,polyQ)延伸大于
37个谷氨酰胺的扩张或编码该polyQ延伸的短N-端片段就足以造成小鼠或该疾病的
细胞模型中的聚集体形成。
灵芝(Ganodermalucidum)是亚洲地区使用广泛且歷史悠久的药用植物(真菌)之
一。已有许多研究探讨灵芝在疾病治療上的应用。灵芝的最重要药理活性小分子成
分是三萜类(triterpenoids)，其被报导具有肝脏保护、抗高血压、降胆固醇
(hypocholesterolemic)、抗组织胺(anti-histaminic)、抗癌以及抗血管新生活性。然而，
其增进智能的特性尚未被充分研究。
发明内容
在一方面，本发明提供一种在患有细胞自噬缺陷的个体中诱导细胞自噬的方
法。根据本发明，该方法包含对该个体投予治疗有效量的灵芝萃取物，其中，该细
胞自噬增进该个体中的蛋白质聚集体的清除。
在本发明的一具体实施例中，该细胞自噬缺陷是在该个体的细胞，其表达蛋白
质聚集体，且其中该細胞是神经细胞或神经胶质细胞。在本发明的一具体实施例中，
该蛋白质聚集体是选自下列所组成的群组的聚集体：亨丁顿蛋白、淀粉样蛋白β、α-
突触核蛋白、τ蛋白、超氧化物歧化酶1、其变异体和突变形式以及其组合。
在本发明的一具体实施例中，该细胞自噬缺陷为选自于由神经退行性疾病、克
隆氏症(Crohn’sdisease)、老化、心脏疾病和肝脏疾病所组成的群组的疾病。在本
发明的一具体实施例中，该神经退行性疾病选自于由亨丁顿氏舞蹈症、阿兹海默症、
帕金森氏症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症和致死性家族性失眠症所组成的群组。
根据本发明，该灵芝萃取物是经由口服投予至该个体。
另一方面，本发明提供一种用于在患有细胞自噬缺陷的个体中活化神经生长因
子(NGF)的方法，其中，该神经生长因子可活化个体的细胞自噬，且其中该细胞
自噬可增进个体的蛋白质聚集体的清除。根据本发明，该方法包含对该个体投予治
疗有效量的灵芝萃取物。
在本发明的一具体实施例中，该细胞自噬缺陷是在该个体的细胞，其表达蛋白
质聚集体。
在本发明的一具体实施例中，该蛋白质聚集体是亨丁顿蛋白、淀粉样蛋白β、α-
突触核蛋白、τ蛋白、超氧化物歧化酶1、其变异体和突变形式以及其组合中的一种
或多种。
另一方面，本发明提供一种用于预防个体记忆丧失的方法。根据本发明，该方
法包含对该个体投予治疗有效量的灵芝萃取物，其中，该灵芝萃取物可活化该个体
的细胞自噬。
在本发明的一具体实施例中，该灵芝萃取物诱导神经生长因子(NGF)以活化
该个体的细胞自噬。在本发明的一具体实施例中，该细胞自噬可增进个体的蛋白质
聚集体的清除。
根据本发明，该个体患有细胞自噬缺陷。在本发明的一具体实施例中，该细胞
自噬缺陷为选自于由亨丁顿氏舞蹈症、阿兹海默症、帕金森氏症、肌萎缩性脊髓侧
索硬化症和致死性家族性失眠症所组成的群组神经退行性疾病
另一方面，本发明提供一种在患有细胞自噬缺陷的个体中诱导细胞自噬的组合
物，其中，该方法包含灵芝酸和医药上可接受的载剂。在本发明的一具体实施例中，
该灵芝酸是一种或多种选自于由灵芝酸C2、灵芝酸A、灵芝酸H、灵芝烯酸D、灵芝
酸D和12-乙酰氧基灵芝酸F所组成的群组的灵芝酸。
附图说明
灵芝(Ganodermalucidum)在说明书及附图中缩写为GaLu。图1A至1E显示神经
生长因子(NGF)对表达mHtt-74Q的PC12细胞模型的影响。(A)经NGF处里后的细胞的
荧光平均强度(FMI)比。直方图表示在两次独立实验中测得的FMI的量化(n＝6)。(B)
在表达mHtt-74Q并经50ng/ml的NGF处理的细胞中，荧光分布向左移，代表聚集体
减少。X轴代表测得的绿色荧光幅度，而呈荧光程度绘制的Y轴代表细胞数。数值以
平均标准偏差(mean±SD)方式表示(**P<0.01为与未经Dox处理(NoDox)相比；而
#P<0.05、##P<0.01为与经Dox处理(Dox)相比)。(C)NGF促进自噬小体
(autophagosome)的形成，并可促进mHtt的降解。利用MDC染色以检视细胞内表达自
体吞噬泡。在经NGF处理的细胞中可见MDC染色后的荧光强度增加。白色箭头代表
在经NGF处理的细胞中的MDC与EGFP的影像重迭(co-localization)，而黄色箭头代表
在经Dox处理的细胞中的EGFP聚集体和经MDC染色的点状荧光影像。在Dox细胞中
有稀少的EGFP与MDC的影像重迭。(比例尺为10微米(μm))。(D)MDC染色的量化
结果。与控制组(noDox)相比，结果为每细胞中所含的点状荧光影像。(E)以西方
墨点法检视在不同条件下LC3-I与LC3-II的蛋白质浓度(以200nM的雷帕霉素
(Rapamycin)诱导细胞自噬作为正控制组)(n＝3).*P<0.05,**P<0.01为与NoDox相
比，而#P<0.05,##P<0.01为与Dox相比。
图2A至2G显示灵芝(GaLu)(为星状细胞NGF诱导物)在PC12细胞中调节粒腺
体的生体合成(biogenesis)与在HD细胞模型中减缓mHtt所诱导的损害。分析初级星状
细胞经GaLu处理六小时的mRNA表达量(A)或二十四小时的蛋白质表达量(B)。(C)
显示NGF于星状细胞经GaLu(GaLu-ACM)处理二十四小时所收集的二十倍浓缩细胞
培养液的西方墨点图示。(D)利用流式细胞仪分析以GaLu-ACM抑制mHtt-74Q聚集
体。直方图表示在两次独立实验中测得的FMI的量化(n＝6)。(E)在表达mHtt-74Q
并经100μg/ml的GaLu处理的细胞中，荧光分布向左移，代表聚集体数目减少。(F)
GaLu增加MDC强度。白色箭头所指为经GaLu处理的细胞有MDC和EGFP的影像重
迭。(比例尺为10微米)。与未经处理的控制组(noDox)相比，将每细胞的点状荧光影
像区进行MDC的量化。(G)显示利用西方墨点法观察LC3-I和LC3-II在每个条件下
的蛋白质表达浓度。(使用200nM的雷帕霉素处理作为诱导细胞自噬的正控制组)
(n＝3)。*P<0.05,**P<0.01为与NoDox相比，而#P<0.05,##P<0.01为与Dox相比。
图3显示灵芝萃取物在初级星状细胞中专一性的增加NGFmRNA的表达量。星
状细胞经灵芝萃取物处理6小时后进行RT-PCR，分析神经滋养因子(NGF,IGF-1,
bFGF和BDNF)的表达。
图4A至4C显示星状细胞NGF诱导物(灵芝萃取物)在PC12细胞中诱导神经突触
的生长。所使用的培养液为经灵芝(GaLu-ACM)处理或未经灵芝处理24小时后的初
级星状细胞培养液。将PC12细胞以GaLu-ACM或NGF处理后收集。
图5A至5J显示区分来自灵芝粗萃物的不同成分以及灵芝酸C2对PC12细胞和HD
细胞模型的影响。(A)GaLu乙醇萃取物的HPLC分析。逆相HPLC的条件为：管柱：
NucleosilC18(4.6mmx250mm；5μm)。移动相组成为：0.1％乙酸水溶液及乙腈，
使用线性梯度程序为0至40分钟为30至32％的乙腈、40至60分钟为32至40％的乙腈、
60至65分钟为40％的乙腈、65至70分钟为40至82％的乙腈；流速为：0.8ml/min；侦
测波长：254nm。总共六种三萜类被分离出来。(B)从GaLu萃取物分离出的六种
三萜类的化学结构(A至F)。(C)将星状细胞以各个成分处理6小时后，利用实时聚
合酶链锁反应(RealtimePCR)分析该星状细胞中NGFmRNA的表达量。β-肌动蛋白
(β-actin)的表达量作为校正值。(D)侦测各个化合物提升50％活性时所需的浓度，
列出最大的活化潜力。(E)将PC12细胞以GaLu-ACM或NGF(正控制组)处理24小时
后，观察神经突触生长的情形，其生长活性以百分比表示。(F)侦测提升50％活性
时所需的各个化合物浓度，列出最大的活化潜力。结果与控制组相比后取相对值，
以标准偏差表示，其结果包含至少三次的独立实验。(*P<0.05,**P<0.01,单因子变
异数分析(one-wayANOVA)后接着进行Tukey的多重比较检定(Tukey’smultiple
comparisontest))。(G)利用流式细胞仪分析灵芝酸C2-ACM抑制mHtt-74Q聚集体的
情形。经灵芝酸C2-ACM处理的细胞系以荧光平均强度(FMI)值表示。直方图表示在
两次独立实验中测得的FMI的量化(n＝6)。(H)在表达mHtt-74Q并经20μg/ml的灵芝
酸C2-ACM处理的细胞中，荧光分布向左移，代表聚集体减少。(I)灵芝酸C2-ACM
增强MDC强度。白色箭头所指为经灵芝酸C2-ACM处理的细胞有MDC和EGFP存在
同一位置的现象。(比例尺为10微米)。与未经处理的控制组(noDox)相比，将每细胞
的点状荧光影像区进行MDC的量化。(J)显示利用西方墨点法观察LC3-I和LC3-II
在各个条件下的蛋白质表达浓度。(使用200nM的雷帕霉素处理作为诱导细胞自噬的
正控制组)(n＝3)。*P<0.05,**P<0.01为与NoDox相比，而#P<0.05,##P<0.01为与
Dox相比。
图6A至6G显示灵芝萃取物处理改善在3-NP模型中的行为表现。
图7A和7B显示C57BL/6J小鼠经过短暂的睡眠剥夺后，其长期增益现象(LTP)有
受损情形。(A)首先，小鼠先喂以GaLu(20,50,125mg/kg/day)三天。第四天时，对
小鼠施以五小时的人工睡眠剥夺。睡眠剥夺之后，将半数小鼠牺牲，进行电生理实
验，另外半数小鼠则被放回鼠笼内。24小时回复睡眠之后，将该批小鼠进行牺牲与
电生理实验。(B)维持TBS以诱导LTP的情形显著的因睡眠剥夺而被破坏(0＝0.002)。
图8A和8B显示以灵芝萃取物喂食小鼠后，进行脑切片，使用MED64系统侦测
海马回CA1的场兴奋性突触后膜电位(fieldexcitatorypost-synapticpotentials,
fEPSP)。四到六周大的C57BL/6J小鼠喂食前述的灵芝萃取物。(A)经过五小时的睡
眠剥夺后，各组别的LTP都有被诱导的情形(控制组、睡眠剥夺组(SD)、喂食GaLu20
mg/kg/day组)。(B)24小时回复睡眠之后，将小鼠牺牲进行fEPSP记录。各组别的LTP
都有被诱导的情形。(控制组，n＝6；睡眠剥夺组，n＝7：喂食GaLu20mg/kg/day组，
n＝5)。
图9A和9B显示以灵芝萃取物喂食小鼠后，以MED64系统侦测对于海马回CA1
的fEPSP影响。四到六周大的C57BL/6J小鼠喂食前述的灵芝萃取物。(A)经过五小
时的睡眠剥夺后，各组别的LTP都有被诱导的情形(控制组、睡眠剥夺组(SD)、喂食
GaLu50mg/kg/day组)。(B)24小时回复睡眠之后，将小鼠牺牲进行fEPSP记录。各
组别的LTP都有被诱导的情形。(控制组，n＝6；睡眠剥夺组，n＝7：喂食GaLu50
mg/kg/day组，n＝5)。
图10A和10B显示以灵芝萃取物喂食小鼠后，以MED64系统侦测对于海马回
CA1的fEPSP影响。四到六周大的C57BL/6J小鼠喂食如前文所述的灵芝萃取物。(A)
经过五小时的睡眠剥夺后，各组别的LTP都有被诱导的情形(控制组、睡眠剥夺组
(SD)、喂食GaLu125mg/kg/day组)。(B)24小时回复睡眠之后，将小鼠牺牲进行
fEPSP记录。各组别的LTP都有被诱导的情形。(控制组，n＝6；睡眠剥夺组(SD)，n＝7：
喂食GaLu125mg/kg/day组，n＝5至7)。
图11显示将C57BL/6J小鼠进行睡眠剥夺后，进行回避测试。首先，C57BL/6J
小鼠先进行回避测试的训练。经过行为给分后，将控制组的小鼠放回原本的鼠笼，
而其他小鼠则进行五小时的睡眠剥夺。完成睡眠剥夺后，立即开始第一轮的回避测
试。完成一轮测试后，所有动物须放回原本的鼠笼直至第二轮测试。
图12A至12D显示睡眠剥夺小鼠喂食GaLu三种剂量后的体重变化与进食量。八
周大的C57BL/6J小鼠第一次开始喂食三种剂量(20,50and125mg/kg/day)的GaLu，
控制组的小鼠喂食一般饲料。(A)小鼠在喂食GaLu(第1天)前先测一次体重，之后开
始喂食GaLu的期间(第1到5天)和睡眠剥夺时皆称重。(B)喂食GaLu的期间测量进食
量。结果显示为五组之间每只小鼠体重与进食量的平均值。(C)喂食GaLu三天后，
各组进行回避测试训练的结果。(D)不同组别遭受电击的平均时间。睡眠剥夺组，
n＝11；控制组与喂食GaLu组，n＝9。
图13显示C57BL/6J小鼠在五小时睡眠剥夺后进行回避测试的结果。小鼠先给予
训练后接着进行五小时睡眠剥夺或是维持小鼠在原鼠笼中(控制组)，以小鼠在回避
测试中，滞留不进入暗箱(latency)的时间(秒)以平均标准偏差方式表示。在24小时睡
眠恢复的的数值亦表示于图中。#p<0.001为与控制组相比较，*p<0.05,**p<0.01,
***p<0.001为与睡眠剥夺组相比较。控制组，n＝12；睡眠剥夺组，n＝15；灵芝喂食
组，n＝12。
图14A至14C显示在五小时睡眠剥夺后，可见GaLu喂食的小鼠的细胞自噬增加。
于八周大的C57BL/6J小鼠分别喂食不同剂量(20、50、125mg/kg)的GaLu四天。接着
进行五小时睡眠剥夺后，立即将小鼠牺牲。收集海马回与皮质进行细胞溶解。分析
细胞自噬标志LC3的表达与切除。(A)海马回细胞溶解物。(B)皮质细胞溶解物。
(C)图示为西方墨点法利用软件(ImageQuantsoftware)做蛋白质表达强度相对定量。
蛋白质表达强度为LC3除以GAPDH的结果。数值以平均标准偏差方式表示(n＝6至8)。
**P<0.01为与控制组相比后具显著差异；而#P<0.05、##P<0.01为与睡眠剥夺
组相比具显著差异。
图15A至15C显示在二十四小时睡眠恢复后，可见GaLu喂食的小鼠的细胞自噬
增加。将八周大的C57BL/6J小鼠分别喂食不同剂量(20、50、125mg/kg)的GaLu五天。
接着在24小时睡眠恢复后立即将小鼠牺牲。收集海马回与皮质进行细胞溶解。分析
细胞自噬标志LC3的表达与切除。(A)海马回细胞溶解物。(B)皮质细胞溶解物。(C)
图示为西方墨点法利用ImageQuantsoftware软件做蛋白质表达强度相对定量。蛋白
质表达强度为LC3除以GAPDH的结果。数值以平均标准偏差方式表示(n＝6至8)。**
P<0.01为与控制组相比后具显著差异；而#P<0.05、##P<0.01为与睡眠剥夺组
相比具显著差异。
具体实施方式
此处提供各种具体的细节说明，以供更透彻了解本发明。
在说明书及图式中，灵芝缩写为GaLu。
灵芝萃取物样本的制备
将干燥灵芝(Ganodermalucidum)(Leyss.exFr.)Karst.浸泡于85％(v/v)酒精中以
萃取小分子(分子量小于1000道耳吞(dalton))部分(fraction)。将萃取物在旋转真空蒸
发器中浓缩并冷冻干燥储存于-20℃备用。通过HPLC得到分离的灵芝小分子萃取
物。利用管柱(NeulcosilC18column)(250mm×4.6mmi.d.5μm)在室温进行逆相层析
(Reverse-phaseHPLC)的分析。移动相包含溶液(A)0.1％的乙酸水溶液(v/v)以及溶液
(B)乙腈，使用的线性梯度变化程序为：0至40分钟为30至32％的B溶液、40至60分钟
为32至40％的B溶液、60至65分钟为40％的B溶液、65至70分钟为40至82％的B溶液、
70至85分钟为82至100％的B溶液。利用波长254nm以及流速0.8ml/min进行侦测。将
质谱仪(BrukerDaltonicsiontrapmassspectrometer)(Bruker,Billerica,USA)透过ESI
接口(ESIinterface)連接至HPLC仪器(Agilent1100HPLCinstrument)。LC流出液导入
ESI源在管柱后的分光比为2：1。使用超高纯度氦(He)作为碰撞气体及使用高纯度氮
(N2)作为雾化气体。在负离子模式下的优化的参数设定如下：喷雾器,30psi；干气,8
L/min；干燥温度,350℃。在全扫瞄质谱仪(MS)分析时，将光谱记录范围设定于m/z
50到1500。设定由数据决定的撷取，以使全扫瞄MS中的两个最丰富离子能触发串联
式质谱(tandemmassspectrometry)(MSn,n＝2)。
细胞培养
富含星状细胞的培养物是制备自初生一天C57BL/6J小鼠，其获取自阳明大学动
物中心(AnimalCenterattheNationalYangMingUniversity,Taiwan)。简言之，以胰蛋
白酶(trypsin)酶切皮质组织。将得到的分离细胞悬浮于含有10％FBS的DMEM中并培
养于100-mm培养皿。培养三天后，更换新鲜的10％FBS/DMEM并维持于37℃额外三
天。利用胰蛋白酶将细胞收下，悬浮于10％FBS/DMEM并培养于10-cm培养皿7至8
天后进行实验。依此方法培养，星状细胞的组成约为90至95％，其通过星状细胞特
定标记(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)的免疫组织染色判断。神经干细胞培养物
是制备自初生一天的C57BL/6J小鼠。将通过皮质组织的胰蛋白酶化(trypsinization)
获取的細胞悬浮于DMEM/F12培养液(2×105cells/ml)中培养於1L滚瓶中7天，培养
液中含有1％N2、20ng/mlEGF、20ng/mlbFGF和100g/mlBSA，以形成神经球
(neurospheres)。通过Nestin(神经干细胞特定标记)来检验神经球。将神经干细胞培养
于含有1％N2和10％FCS的DMEM/F12中分化7天直到成熟，得到神经细胞与胶质细
胞混合培养物。PC12细胞株是维持于DMEM培养液，其添加10％热失活的马血清
(heat-inactivatedhorseserum)和5％FBS。所有的细胞维持于37℃5％CO2/95％空气
的加湿大气中。
表达mHtt74Q的PC12细胞株
含有EGFP(pEGFP-C1,Clontech)的哺乳动物表达载体(其中，其于C端是与一
段HD基因表达子1片段(其具有23(Htt-23Q)或74多麸酰胺重复(mHtt-74Q))融合，，
是由Dr.DavidC.Rubinsztein的实验室所赠送。稳定的PC12细胞是于37℃与5％CO2
下维持于含有100μg/ml湿霉素(hygromycin)的标准培养液，其组成为含有100U/ml
的盘尼西林(penicillin)/链霉素(streptomycin)、2mM的L-麸酰胺酸(L-glutamine)、10％
的热失活马血清(heat-inactivatedhorseserum)、5％的FBS及200μg/ml的G418的
DMEM。于12孔盘中接种每孔有2x105细胞，并以200ng/ml的多西环素(doxycycline)
诱导mHtt-74Q的表达24小时。通过移除培养液中的多西环素中止转基因的表达。针
对基因表达的分析，细胞不处理或以NGF(10,50,100ng/ml)、GaLu-ACM(20,100,
500μg/ml)以及灵芝酸C2-ACM(4,20,100μgml-1)于上述浓度处理24小时，或针
对粒线体活性及mHtt-74Q聚集体的分析，细胞处理48小时。接着，细胞以1倍的PBS
清洗两次并离心，利用1％的三聚甲醛(paraformaldehyde)固定20分钟以进行mHtt-74Q
的EGFP荧光表达的流式细胞仪(FACS)(BDBiosciences)分析，接着以Cellquest软件
(BDBiosciences)分析10,000个事件的平均荧光值，或经处理后进行实时PCR分析。
使用荧光物质单磺酰戊二胺(Monodansylcadaverine,MDC)(Sigma)作為自噬泡
(autophagicvacuoles)示踪剂。于37℃将细胞以0.05mM的MDC染色30分钟，之后用
PBS清洗细胞四次。样本固定后于激发波为335nm及发射波为525nm以荧光显微镜
(OlympusIX-70andPOT2,USA)分析。染色强度反映细胞自噬活性的水平，其通过
Image-ProPlus分析系统(MediaCybernetics,Bethesda,USA)来测量。为了量化MDC
泪点，拍摄至少选4个随机视野并计算每个细胞的泪点区域的平均数目。
RNA单离与实时PCR
使用RNA-BeeTMRNA单离试剂(Tel-test,Friendswood,TX)制备得RNA。5μg等
分的总RNA与AMV-RT(Promega)反应产生cDNA，用於β-肌动蛋白、NGF以及
PGC-1α基因表达量的RT-PCR分析，其使用ABIPrism7700序列侦侧系统和SYBR
GreenMasterMix套组(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)。以小鼠的β-肌动蛋白表
达量作为内部参考。用2–ΔΔCT方法计算相对的基因表达量。使用每一基因的特定
引子放大100-250-bp的片段(表1)。
表1
西方墨点法
使用放射免疫沉淀法的溶解缓冲液(lysisbuffer)来制备细胞裂解液，然后装载约
20μg的蛋白质并进行西方墨点法分析。收集以灵芝萃取物处理24小时后的星状细胞
调整培养液(Astrocyte-conditionedmedium,ACM)，于200×g离心20分钟以去除细胞碎
片。在装载前以冷冻干燥机将上清液浓缩20倍。初级抗体包括1:1,000稀释的多株抗
小鼠NGF胜肽(胺基酸40-63)的兔抗体(Catno.ab6198,Abcam,Cambridge,UK)、
1:1,000稀释的多株抗小鼠LC3的兔抗体(Catno.PM-036,MBL,JAPAN)及1:10,000稀
释的抗GAPDH抗体(Catno.ab9385,Abcam,Cambridge,UK)，其作为装载控制
(loadingcontrol)。使用辣根过氧化物酶联结抗IgG二级抗体系统染色结合抗体的蛋白
质，用于增强型化学荧光侦测(Amersham,Buckinghamshire,UK)。
使用PC12生物分析侦测星状细胞调整培养液(ACM)中的NGF-样蛋白质
为了评估神经突触的生长，将PC12细胞株以低密度(2×104细胞/平方公分(cm2)
种于聚-D-赖氨酸涂覆的24孔盘中。24小时后，以PBS清洗附着的PC12细胞，与
得自未经处理或以灵芝萃取液处理的星状细胞的条件培养基共同培养，并观察神经
轴突生长(使用低血清条件，在含有1％FBS的DMEM中)。每个组別在光学显微镜
下拍8至10张照片，轴突生长超過细胞体直径的细胞的百分比是通过检查每个图
像100-200个细胞进行分析。图像分析由不知实验条件的操作者进行。针对ACM
的制备，以PBS清洗灵芝萃取物处理24小时后的星状细胞，并加入血清含量低的
培养液(不含灵芝萃取物)。24小时后，将培养液离心(200×g)20分钟以去除细胞碎
片，收集的上清液即为ACM并立即使用。鼠NGF100ng/ml(PromegaBiotechCo.,
Ltd,USA)作为正控制组。
琥珀酸脱氢酶(Succinatedehydrogenase,SDH)分析、线粒体追踪染剂
(Mitotracker)分析以及线粒体/核DNA比
将PC12或mHtt-74Q细胞(2×104细胞/孔)种于96孔盘。24小时后，将细胞培
养于含GaLu-ACM或NGF的培养液(100μl/孔)48小时。琥珀酸脱氢酶活性标准化
至细胞蛋白(以BioRedproteinkit测量)，然后使用微量盘侦测系统(microplatereader)
(PerkinElmerLifeSciencesWallacVictor2)侦测吸光值变化。活性的表示是相对于对
照条件。通过MitotrackerGreenFM染色(Invitrogen)來侦测线粒体的含量，并通过
MitotrackerRed(四甲基若丹明甲酯(tetramethylrhodaminemethylester,TMRM)染色
(Invitrogen)来侦测线粒体膜通透性。细胞与含GaLu-ACM或NGF的培养液共同培
养24或48小时。以不含血清的DMEM清洗细胞，并以100nMMitotrackerGreenFM
或MitotrackerRed(TMRM)染色30分钟，未染色的控制组样品与无血清的DMEM
共同培养，该DMEM不含染剂，但使用等量的二甲基亚砜(DMSO)作为染色样品。
染色后，细胞以PBS清洗三次。受染色的细胞通过荧光显微镜来侦测。针对微量盘
分析，在荧光微量盘读值机(激发波长485nm,发射波长520nm)上侦测染色。经染
色(以及未染色的控制组)的细胞通过流式细胞仪(BDBiosciences)来分析，接著通过
软件(Cellquestsoftware)(BDBiosciences)来分析10,000个讯号的平均荧光强度。通过
实时PCR来分析线粒体/核DNA比。细胞(2×105细胞/孔)种在12孔盘中。24小时
后，细胞培养于含GaLu-ACM或NGF的培养液48小时。从细胞萃取出基因组DNA
(含有线粒体和核DNA两者)。以定量实时PCR放大DNA(10ng)。使用的引子如表
1所示。
动物及3-NP致中毒
从国家动物中心(台北，台湾)购置的60只12周大的C57Bl/6J成年公鼠饲养在
恆温下并给与实验室饲料(PMI,Brentwood,MO,USA)及任意饮用水。实验程序经台
湾阳明大学动物研究委员会核可。线粒体毒素3-硝基丙酸(3-NP)(Sigma,法国)(储
存液10mg/ml)溶于0.1M的磷酸盐缓冲液(PBS),pH＝7.4，并经过濾(Millipore,0.22
um)，使用前保存于4℃。小鼠每天两次以腹腔注射方式给予3-NP溶液，间隔12
小时(10:00a.m.and10:00p.m.)，根据下列计划并稍加修改：使用3-NP的浓度到达
600mg/kg以延长神经退化的时间：以20mg/kg进行四次注射、以40mg/kg进行四
次注射、以60mg/kg进行六次注射(七天内总累积剂量为600mg/kg)。共60只小
鼠分为5组；亦即，四个3-NP处理组及只给予盐水小鼠的控制组。经过3-NP诱导
的伤害后(第8天)，小鼠接着喂食正常的饲料或正常饲料含不同浓度的灵芝(24,60
或150mg/kg/天)14天。
行为给分
行为根据以下标准分成0至5等：等级0：正常的行为；等级1：因轻微后肢受损
所造成的一般性移动缓慢；等级2：显著的步态异常且不协调；等级3：接近完全后肢
瘫痪；等级4：因前肢受损而无法移动；等级5：斜卧或死亡。小鼠行为由对实验条
件不知情的两位独立评分者给分。
滚轮测试
使用滚轮测试来检测各组小鼠的感觉运动能力。测试之前，每只动物在滚轮装
置上训练最多180秒连续三次共三天。进一步的实验排除无法学会此任务的动物。
此装置由一个直径6公分的杆子组成，并以直径50公分的盘分隔成四个隔间。杆子
以加快的速度为14和22rpm旋转。针对每次试验，记录动物能够留在装置上到掉落
之前的时间，最长试验时间180秒。以三次分別的测试进行纪录并平均。
组织的处理与GFAP免疫组织化学分析
完成行为测试及药物处理两周后，所有的动物以致死剂量的戊巴比妥钠(sodium
pentobarbital)(腹腔注射)麻醉，小鼠灌流以10ml的0.9％NaCl，接着是30ml的4％三
聚甲醛(在0.1MPBS中,pH7.4)。将大脑取出并置于相同的固定液中24小时。它
们接着移至30％蔗糖溶液(在0.1MPBS中)至下沉。大脑冷冻保存于-70℃，切成30μm
的低温恒温器冠状切片，其自由浮动的收集用於免疫组织化学分析。针对GFAP免
疫染色，如上述般制备冷冻切片并以PBS冲洗三次，再以4％胎牛血清白蛋白阻断。
阻断之后，切片在4℃与Tris的缓冲液中反应隔夜，其中含有辨认GFAP的初级单克
隆抗体(1:1000稀释,NOVOUS,Littleton,USA)，GFAP是反应性胶质细胞增生
(reactivegliosis)的一种型态学标记。切片以PBS冲洗三次，再于3％H2O2中反应
30分钟以阻断过氧化酶。加入二级抗体(兔抗小鼠，联结有辣根过氧化物酶)(1:200
稀释DAKOKit；Dakocytomation,Glostrup,Denmark)和二胺基联苯胺，然后由对实验
条件不知情的评估者以光学显微镜分析切片的胶质细胞增生。
尼氏(Nissl)染色细胞的计数
Nissl染色用來分析实验后的纹状体区域周围的细胞密度。使用先前的方法，如
所描述的。简言之，将所有切贯穿斜纹状体的切片进行甲苯酚紫染色并在光学显微
镜下观察。利用甲苯酚紫染色，视野下最大的细胞辨识为神经细胞(神经元)，其
具有典型的形态特征，包括丰富的细胞质、多边型形状和至少一个放射出的突触。
而胶质细胞的轮廓与神经细胞的区别则通过其圆、小且深染的细胞核。计数在每一
第6个冠状切面图像上的尼氏(+)-神经元，每个脑平均十片，由对实验条件不知情
的评估者进行分析。以视野中一個200×200μm的图像进行计数分析。每片分析的
切片中，通过使用测定的细胞数目和划定图像的平方面积，来计算尼氏(+)-神经
元的堆积密度(packingdensity,PD)由的方型区域下所含的决定。使用下列公式：
PD = Σ i = 1 n N i Σ i = 1 n S A i ]]>
其中，PD表示堆积密度(mm-2)，Ni为第i个切片中数得的神经元数目(以Abercrombie’s
公式校正)，而SAi为第i个分析的图像的平方面积(mm2)。数据为每组三只动物的平
均值和标准偏差。
测定SDH活性
控制组载剂(只处理3-NP或3-NP加灵芝处理的组别)的脑组织的SDH活性测定方
法如先前所描述。每只动物约取20片切片在37℃下与0.1MPBS培养15分钟，以活
化SDH。切片以大量0.1M的PBS冲洗，并在37℃与0.3mM的硝基蓝四氮唑(nitroblue
tetrazolium)、0.05M的琥珀酸钠(sodiumsuccinate)和0.05M的磷酸盐缓冲液(pH7.6)
共同培养30分钟。针对与SDH活性无关的非专一性染色的测定，相邻的切片在省略
琥珀酸盐的相同的培养基中培养。用冰的PBS冲洗切片5分钟，以4％三聚甲醛固定，
以水冲洗，最后于室温下干燥。蓝色染色的强度反映SDH活性，其通过Image-ProPlus
分析系统(MediaCybernetics,Bethesda,USA)来测量。将圆形探头置于感兴趣的区域
以测定該组织部分的染色相对光密度(在0至255灰度级的范围内)。由对实验条件不
知情的评估者分析每只动物十個切片(每组有三到四个大脑)。
电生理实验
4至6周大的C57BL/6J小鼠以乙醚麻醉，随后获得这些小鼠的脑并立即浸泡于冰
的人工脊髓液(aCSF)，其含以下：122mMNaCl、3.1mMKCl、1.1mMMgSO4·8H2O、
1.3mMCaCl2·2H2O、10mMglucose、0.4mMKH2PO4和25mMNaHCO3。去除小脑
及嗅葉后，保留三分之一的脑，以震动组织切片机(vibratingtissueslicer)(D.S.K
Microslicer,ModelDTK-1000)将脑切成350微米的切片。将脑切片保存在aCSF中兩
小时，其维持95％O2、5％CO2中，使脑受损部分修復。进一步，将脑切片置于MED64
探针(Panasonic；MED-P515AP)上，数位式显微镜(Olympus,MIC-D)，在适当调整位
置后，用来拍摄脑切片上的相应位置，并使用多频道记录系统(Panasonic,MED64)
记录脑切片的电生理反应。
MED64系统(Panasonic)包含探针、连接件、整合放大器及Lerformer软件1.5，探
针的中央具有64个微电极的布置。每个微电极大小为50×50μm2，每个电极间距为
150微米。第一次使用前，探针先以0.1％聚乙烯亚胺(PEI)于硼酸盐缓冲液(0.15M,pH
8.4)浸泡八小时以上，允许涂布(coating)发生。接着，探针以去离子水冲洗后可使用，
且探针内注入蒸馏水，以石蠟膜封起，保存于4℃冰箱中。
记忆力测试
被动回避测试用来了解与小鼠海马回有关的记忆行为。将小鼠置于暗房与亮房
中间，一般它们会倾向往暗房移动。然而，当小鼠进入暗房，给予0.5mA持续2秒
的电击，使它们受训练而联结暗房与电击，以小鼠待在亮房的延迟时间作为评估小
鼠对暗房中电击的记忆的基础。小鼠待在亮房延迟时间超过300秒则不再记录。观
察比较灵芝对睡眠剥夺的小鼠的记忆的影响。
小鼠的睡眠剥夺
在完成被动回避测试后，约10周大的C57BL/6J小鼠分成睡眠剥夺组与停留于原
鼠籠的控制组，所有小鼠被安置在同一区室。睡眠剥夺组进行五小时的完全睡眠剥
夺。以主观的观察小鼠的昏昏欲睡的状态，当小鼠呈现想睡觉的状态，轻微敲击鼠
籠，以防止他们入睡。在鼠籠内提供充足的食物与饮水，且小鼠在醒着的时候可自
由在籠内移动。
统计分析
所有的结果以平均值(mean)与±标准偏差(SD)表示。当比较兩组以上的差异时运
用单因子变异数分析(ANOVA)后接着进行Tukey的事后检定(Tukey’spost-hoctest)，
比较成对样品时用Student’st-test进行分析。P值小于0.05时视为有显著差异。
在HD细胞模型中NGF处理降低mHtt-74Q的累积
遗传细胞模型，其在四环霉素(Dox)控制下表达亨丁顿蛋白(mHtt-74Q)，用來证
明NGF处理的影响。以FACS分析来鉴定HD细胞模型中的mHtt-74Q含量。NGF处理
后，观察到mHtt-74Q累积降低(图1A及1B)。接着，探讨NGF降低mHtt聚集体可能的
机制。为达此目的，以MDC染色来了解细胞自噬的角色(图1C及1D)和用西方墨点法
分析LC3-II的表达(图1E)，其中LC3-II为自噬溶酶体的特异性标记。在经NGF处理的
细胞中观察到细胞自噬的活性上调，而仅以Dox处理的细胞中细胞自噬的活性被略
微的诱导。此外，NGF处理的细胞中显示增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的聚集体的降
低(图1A及1C)。进一步确定EGFP与细胞自噬的空泡在NGF处理的细胞中位于同样
的位置，这暗示至少有一部分的mHtt-74Q的清除是涉及细胞自噬的。然而，仅以Dox
处理的细胞，MDC及EGFP则未有效的位于相同的位置。因此，累积更多的聚集体，
可能是由于运送物(cargo)辨识的缺陷。整体看来，此结果支持通过NGF触发的更有
效的细胞自噬程序，可透过较多的降解和较少的聚集体形成使mHtt在细胞中的累积
较少。
灵芝刺激初级星状细胞中NGF的表达
由于外生性NGF无法通过血脑障壁的事实，因而影响了它在臨床上的应用，测
试灵芝作为星状细胞分泌内生性NGF的诱导物的效果。以灵芝处理后，以RT-PCR
及实时PCR分析，星状细胞展現NGFmRNA表达的剂量依赖性上升(图2A)。灵芝处
理亦可上调细胞内的NGF蛋白质表达(图2B)。为了研究NGF诱导是否伴随着NGF
分泌的上升，分析以不同浓度的灵芝处理24小时后的星状胶质细胞条件培养液中的
NGF含量。结果显示灵芝处理以剂量依赖性的方式增进了NGF分泌到培养液中的量
(图2C)。因此，灵芝增加了星状细胞的NFG的合成与释放两者。灵芝对于初级星状
细胞培养物中NGF表达的影响的专一性如图3所示。当PC12细胞与灵芝处理后的星
状细胞条件培养液(ACM)共同培养，可刺激神经突触的增生(图4A及4B)。NGF对
神经突触增生的特定活性在将PC12细胞与500μg/ml灵芝-ACM和NGF专一性抗体
共同培养后被阻断(图4A及4C)。
在表达mHtt74Q的HD细胞模型中，灵芝的影响
以FACS鉴定亨丁顿氏舞蹈症细胞模型(表达mHtt-74Q的细胞)中的mHtt-74Q含
量。灵芝-ACM处理降低了细胞中mHtt-74Q的累积(图2D及2E)。灵芝-CM处理也提
高了MDC的强度(图2F)和LC3-II的表达(图2G)。
灵芝的HPLC与LC-MS分析：识别不同灵芝酸和其对于刺激NGF以及诱发神经突
触生长活性的影响
进行HPLC和LC-MS分析来鉴别灵芝乙醇萃取物中的有效成分。灵芝的指纹图
谱通过使用逆相(reversed-phase)HPLC分析而得。图5A显示灵芝乙醇萃取物的
HPLC-UV图谱。为了获得最佳的提取效率和良好的分离，优化了提取和色层分离条
件。针对粗提物中三萜类的分析，使用正(positive)/负(negative)离子ESI-MS来获得分
子量资料。从灵芝乙醇萃取物中推测出六个馏分，并确定其结构(图5B)。通过对星
状胶质细胞NGFmRNA的诱导以及神经突触增生分析来测试这些萃取物的活性(图
5C及5E)。被通过測定提高活性50％(EC1.5)所需的馏分的浓度來追踪其效能(图5D
及5F)。富含灵芝酸C2的馏分对于NGF刺激和神经突触增生活性的效果特别显着。
在表达mHtt74Q的HD细胞模型中，灵芝酸C2的影响
观察到灵芝酸C2-ACM处理降低了亨丁顿疾病细胞模型中mHtt-74Q的累积(图
5G及5H)。藉由MDC染色的(图5I)与LC3-II表达的西方墨点法分析(图5J)，证实了灵
芝酸C2-ACM处理的细胞中的细胞自噬活性上调。
灵芝对于3-NP诱导的小鼠斜纹状体降解的影响
由于已观察到NGF对于3-NP模型有神经保护效果，利用此模型进一步评估灵芝
在活体中的治疗效果。将先前的方法作些许修改，使用高达600mg/kg的3-NP的浓度
來增加神经退化的过程。在3-NP诱导损伤后(第八天)，给予小鼠不同浓度的灵芝饲
料(24、60、150mg/kg)14天。如图6A所示，在致中毒后第八天，3-NP誘發了严重的
姿势异常，而喂食灵芝的小鼠则能较快回復它们的行为分数(GaLu60mg/kg及150
mg/kg在第14天；GaLu24mg/kg在第21天)。当在第14天及21天进行滚轮测试以评估
小鼠感觉运动能力的回復时，通过灵芝治疗其表现有所改善，在浓度60及150mg/kg
在第14天以及24mg/kg在第21天，相对的3-NP处理的控制组小鼠仍然受损(图6B及
6C)。因此，相较于3-NP处理的控制组动物，灵芝的处理能够改善行为缺陷。使用
灵芝治疗结束的小鼠冠状脑切片的Nissl、GFAP以及SDH染色来检验灵芝对于逆转
3-NP诱导神经毒性的效果(图6D)。图6D显示仅以3-NP处理以及3-NP处理接着投予三
种不同浓度灵芝的小鼠的代表性的影像。仅以3-NP处理的动物显示斜纹状体神经元
的明显的失去，但在喂食灵芝的组别显示较少的斜纹状体神经元的失去。此外，喂
食24到150mg/kg的灵芝显示对3-NP诱导的斜纹状体神经失去的剂量依赖性的对抗
功效。图6E表示得自Nissl染色的神经元量化分析，且观察到灵芝喂食的显著的神经
保护效果。灵芝喂食亦减弱了3-NP诱导的GFAP过度活化。相较于3-NP-灵芝的组别，
仅接受3-NP处理的组别在损伤的斜纹状体周围有更多GFAP-正的星状胶质细胞。
3-NP是一种廣為人知的活體內不可逆的SDH抑制剂。如图6D及6F所示，相较于控制
组，在仅处理3-NP的小鼠的脑部中，3-NP处理诱导了显著的SDH活性的抑制。然而，
灵芝的投予缓解了3-NP诱导的SDH活性抑制。总结，由上述神经元计数结合GFAP
及SDH活性实验的结果可知，灵芝在动物中提供了对抗3-NP诱导的斜纹状体损伤的
神经保护效果。从处理或不处理灵芝的3-NP模型的斜纹状体中分离的mRNA被处理
用於分析NGF表达。喂食灵芝的小鼠其斜纹状体中的NGF表达显著较高(图6G)。此
提高是剂量依赖的，且在灵芝为60mg/kg呈现最明显的NGF表达刺激，相较于控制
组有4.5倍的增加，而相较于3-NP组别有7倍的增加。
灵芝预防睡眠剥夺及降低长时程增强(longtermpotentiation)
小鼠实验上已证实长期或短期睡眠剥夺皆会影响小鼠记忆的巩固。广为人知的
是，五小时睡眠剥夺方法能夠影响小鼠的海马回中的长时程增强期增益现象(long
termpotentiation,LTP)。长时程增强无法在三十分钟的睡眠剥夺后维持良好表现，且
随时间拉长，其长时程增强减少，且影响到长期记忆。
小鼠喂食灵芝三天，在第四天早晨對小鼠执行(导入)睡眠剥夺。在睡眠剥夺
后，允许小鼠自由睡眠24小时，接着进行实验。
观察到，相较无喂食灵芝的小鼠，的睡眠剥夺未严重影响喂食灵芝的小鼠的
LTP。喂食灵芝的小鼠的LTP为133.6±7.0％，但是无喂食灵芝的小鼠的LTP为
113.5±5.9％。随着时间增加，其LTP被诱发的程度接近于没有受到睡眠剥夺的控制
组(148.5±16.7％)(图8A、9A及10A)。有關可代表长期记忆的后期LTP(late-phaselong
termpotential,L-LTP)，喂食125mg/kg/day灵芝再受到睡眠剥夺的小鼠组别显示的结
果(p＝0.001至0.4)接近于控制组(表2)。此外，如表2所示，喂食灵芝20mg/kg/day及
50mg/kg/day的小鼠的L-LTP分别为126.9±22.3％和127.6±18.6％，再者，此两组的
LTP都较睡眠剥夺组高。另外，在允许自由睡眠24小时后，不同的处理的组别的LTP
没有明显的差异(图8B、B和10B)，这些结果显示，在正常生理情况下，灵芝可能不
会异常促进LTP；然而，在其他外在因素存在时，诸如睡眠剥夺而影响记忆巩固，
灵芝能夠预防或逆转记忆干扰(记忆障碍)。
表2喂食不同剂量GaluM的小鼠在5小时睡眠剥夺后的后期LTP
a，p＜0.05，与控制组相比
b，p＜0.05，与SD(睡眠剥夺)组相比
灵芝增加小鼠海马回中细胞自噬的活化，且预防或逆转由睡眠剥夺所造成的记
忆力缺失
于睡眠剥夺模型下，在第四天早晨进行被动回避试验的训练(图11)。小鼠在被
动回避试验训练前已事先喂食灵芝三天，而事先的喂食并不会影响到小鼠在学习所
需的时间或训练的次数上的差异(图12C)。此外，小鼠在体重的增加(图12A)及进食
情形(图12B)亦未受到灵芝混入饲料的影响。
在训练完毕后，对五小时睡眠剥夺的小鼠进行被动回避试验测试。观察到控制组的
小鼠并不清楚记得其进入暗室会被电击的经验(滞留(latency):96.3±72.7)(图14)。
然而，食用灵芝小鼠的组别，其滞留期(latencyperiod)为160.8±20.6至242.9±89.8，
较控制组差，但较睡眠剥夺组佳。这些结果显示灵芝可预防或是逆转睡眠剥夺对记
忆力造成的损失。
小鼠于实验后牺牲，取其海马回及大脑皮质，验证是否有细胞自噬的活化。以
西方墨点法分析侦测睡眠剥夺后(图14)的小鼠及共喂食五天灵芝(图15)的小鼠其海
马回及皮质，显示海马回中细胞自噬的表现随灵芝喂食浓度增加有增加的情形
(0.90±0.38至1.63±0.49倍)，而皮质的采样中，各组表达LC3-II的差异不大。这些结
果显示灵芝的喂食可在小鼠海马回中活化细胞自噬。被动回避试验显示海马回与在
动物的行为中的记忆形成有关。因此，在实验中观察到海马回中细胞自噬的活化且
参与了记忆巩固的过程。
上述说明书仅用以说明本发明的特征及功效，而非用于限制本发明的范围。本
领域的技术人员可在不悖离本说明书所揭示的精神及原理下赋予不同的修饰与变
更，且本发明的权利保护范围应如权利要求书所列。