一种核酸与化学药物的复合制剂及其制备方法技术领域
本发明涉及的是一种药物技术领域的药物输送方法，特别是一种核酸与化学药物复
合制剂及其制备方法，尤其为一种可用于炎症的生物大分子核酸药物制剂与现有的小分
子化学药物联合治疗的复合制剂。
背景技术
炎症，特别是关节炎，在中老年人群中普遍存在，给患者的日常工作生活带来很大
不便与痛苦，关节是药物治疗较难达到的靶器官，无论是静脉注射、肌肉注射还是口服
用药，关节内达到的药物浓度总是有限，并且这些治疗方法存在一定的副作用。而关节
穿剌给药的途径虽然一定程度克服了上述存在的问题，但由于局部注射治疗后药物的半
衰期短、反复穿刺关节较容易带来更多的感染机会，使得关节穿刺治疗在广泛使用上存
在一定局限性。而新近开展的基因治疗方法，则能克服以上治疗方法的弊端，其主要优
势表现在将编码某一抗炎物质的基因通过载体转化到关节滑膜中，达到高效、长期、稳
定地表达这一抗炎物质来治疗类风湿关节炎的目的，期望由此而改变目前治疗类风湿关
节炎的现状。例如生物大分子核酸药物白介素1受体拮抗剂(interleukin1receptor
antagonist,IL-1Ra)可以在基因水平上调节白细胞介素-1(IL-1)的表达，从而抑制炎症。
但单独注射带负电荷的核酸药物难以进入细胞，所以需要合适的输送载体来协助核
酸药物进入细胞核，从而达到治病的位点。目前非病毒载体由于没有免疫原性等安全隐
患而成为研究的热点(YinH等人，基于基因治疗的非病毒载体，自然-综述-遗传学.
2014；15:541-55.)，但由于难以克服的化学毒性和低转染活性却很难能够成为药用载体。
因此，目前治疗的主要手段还是采用小分子化学药物通过皮下或肌肉注射完成。而绝大
多数化学药物为激素类药物(肖征宇，类风湿性关节炎的药物治疗方法，中国医师进修
杂志，第九期，1993年)。大剂量长期注射容易对患者造成比如感染、股骨头坏死、消
化道出血、高血压、肥胖等等毒副作用。
为了突破这一技术瓶颈，本发明利用阳离子多肽、经典的无毒脂质体包裹白介素1
受体拮抗剂的纳米颗粒与现有的化学药物注射液混合形成混合制剂然后进行关节腔注
射。
到目前为止，单纯利用生物材料包裹核酸药物进行治疗的方法仍处于实验阶段。为
了能够将该技术运用于实际应用，我们打算结合已经上市的醋酸氢化可的松混悬液注射
技术，将优化的包裹IL-RapcDNA形成的纳米颗粒与醋酸曲安奈德注射液形成混悬注射
液，进行关节腔注射治疗关节炎。由于关节腔注射属于局部给药，相对于系统给药简单
的多，如果利用安全高效的多肽与脂质体一起输送核酸药物来尝试采用化学药与生物药
一起进行联合治疗的方案治疗关节炎，希望该方法会有更好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于克服现有关节炎症技术中的不足，提供一种核酸与化学药物复合
制剂及其制备方法。本发明通过核酸、阳离子多肽(如图1)、阳离子脂质体组装的三元
纳米颗粒，以及在此基础上包裹透明质酸的四元纳米颗粒分别与市售的醋酸曲安奈德注
射液形成混悬注射液：(1)利用已经申请专利的三元纳米颗粒和四元纳米颗粒；(2)利
用市售的醋酸曲安奈德注射液；(3)将(1)和(2)进行混合制备复合制剂。因此，我
们与现有的lipopolyplexes(脂质体)相比，不仅避免了聚阳离子的毒性(多肽是人体内
源性分子)，而且有效突破了通过PEG化实现体内长效循环的弊端。兼顾到达靶细胞之
前的稳定性和进入靶细胞之后的生物响应性。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及用核酸、阳离子多肽、阳离子脂质体组装的三元纳米颗粒，以及在此基
础上包裹透明质酸的四元纳米颗粒分别与市售的醋酸曲安奈德注射液形成的混悬注射
液(见图10)。具体涉及一类由阳离子多肽与阳离子脂质体包裹核酸形成的三元纳米颗
粒、在该三元纳米颗粒表面覆盖透明质酸形成的表面带负电荷的四元纳米颗粒与市售的
醋酸曲安奈德注射液。
第一方面，本发明涉及一种复合制剂，所述复合制剂为生物大分子药物与小分子化
学药物制剂的混合物。
优选地，所述小分子化学药物制剂为用于炎症治疗的化学药物制剂；所述生物大分
子药物为非病毒载体包裹生物大分子药物。
优选地，所述化学药物制剂具体为市售的醋酸曲安奈德注射液。
优选地，所述非病毒载体包裹生物大分子药物包括三元纳米颗粒或四元纳米颗粒；
所述三元纳米颗粒包括阳离子脂质体、多肽、生物大分子药物组分；所述四元纳米颗粒
包括阳离子脂质体、多肽、生物大分子药物组分、透明质酸。
优选地，所述三元纳米颗粒的制备具体为：混合所述阳离子脂质体与多肽，将所得
混合物转移至所述生物大分子药物组分溶液中，常温下孵育15～35分钟得表面带正电
荷的纳米颗粒，即为三元纳米颗粒；
更优选地，所述混合物中阳离子脂质体与多肽的质量比为(0.5～2)：(2～10)；所
述多肽与生物大分子药物组分的质量比为(2～10)：(0.5～2)；
进一步优选地，所述混合物中阳离子脂质体与多肽的质量比为0.75:4或1:4；所述
多肽与生物大分子药物组分的质量比为4:1。
优选地，所述四元纳米颗粒的制备具体为：向所述三元纳米颗粒中加入透明质酸钠，
混合均匀，放置，即得四元纳米颗粒；
更优选地，所述放置的时间为5～20分钟；所述透明质酸钠的加入质量与所述多肽
的质量比为(5～35)：(2～10)；
进一步优选地，所述放置的时间为5分钟；所述透明质酸钠的加入质量与所述多肽
的质量比为14.2：4；
优选地，所述生物大分子药物组分为核酸，具体包括DNA、siRNA、shRNA、
microRNA；
优选地，所述生物大分子药物组分为DNA；
进一步地，所述DNA具体为IL-1RapcDNA。
优选地，所述多肽包括如SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示的序列，聚阳离子多肽，
以及连接靶向基团的阳离子多肽。
更优选地，所述多肽包括如SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示的序列。
优选地，所述阳离子脂质体是通过以下步骤制得的：将质量比为(3～1)：1的(2,3-
二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)与1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)
的氯仿溶液旋转蒸、去除溶剂，然后水合过夜，超声30～60分钟。
更优选地，所述(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵与1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇
胺的质量比1:1。
第二方面，本发明还提供一种所述复合制剂的制备方法，所述制备方法具体为：将
生物大分子药物与小分子化学药物制剂物理共混即可。
优选地，所述共混后生物大分子药物与小分子化学药物制剂中有效成分的浓度比为
40:1。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、利用化学药物与基因药物联合制剂，减弱了单独利用化学药物带来的毒性以及
病情反弹的弊端，并延长了药物作用时间，克服了单纯利用基因药物带来的效率低的缺
陷；
2、由于本申请所用的脂质与多肽均为内源性的生物安全的医用材料，而且该纳米
输送体系通过关节腔注射后通过正负电荷作用迅速被腔内的滑膜细胞内吞，而纳米体系
中的脂质组分通过融膜作用实现内吞逃逸，从而有效地将生物大分子药物组分释放到细
胞浆中，在化学药起作用的同时，从源头上通过基因调控逐渐消除炎症；
3、本申请还进一步将透明质酸(HA)包裹在上述三元纳米颗粒的表面，不仅有效
地避免了聚阳离子的高毒性，而且透明质酸有消炎等治疗作用，有助于缓解关节炎的症
状。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特
征、目的和优点将会变得更明显：
图1：三元纳米颗粒与四元纳米颗粒的构建示意图；
图2：三元纳米颗粒与四元纳米颗粒的凝胶电泳图结果；
图3：三元纳米颗粒与四元纳米颗粒的Zeta电位图；
图4：三元纳米颗粒与四元纳米颗粒的粒径图；
图5：三元纳米颗粒与四元纳米颗粒的滑膜细胞C518萤光素酶转染活性图；
图6：三元纳米颗粒与四元纳米颗粒包裹IL-1RapcDNA转染滑膜细胞C518后细胞
上清IL-1Ra蛋白水平；
图7：滑膜细胞经不同比例的纳米颗粒载体包裹IL-1RapcDNA复合物溶液培养后的
细胞存活率；
图8：大鼠在造模后4天的踝关节周长的变化；
图9：大鼠在给药后48h后血清中IL-1Ra蛋白水平；
图10：为本发明制备方法示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人
员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技
术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于
本发明的保护范围。
本发明对包裹生物大分子核酸药物的三元纳米颗粒与四元纳米颗粒的物化性质表
征方法包括：凝胶电泳、动态光散射和Zeta电位；初步的转染活性与毒性实验的DNA
质粒是荧光素酶质粒细胞是滑膜细胞C518；包裹治疗性基因为白介素受体拮抗剂
(IL-1RapcDNA)；体内实验采用Wistar大鼠(雄性，180-200g，斯莱特)构建的急性
关节炎模型。利用ELISA检测细胞上清液IL-1Ra蛋白的表达水平(RayBioHumanIL-1
RAELISAKit，RayBiotech)。
实施例1
本实施例涉及三元纳米颗粒与四元纳米颗粒的制备方法(如图1所示)：
将一定量的阳离子脂质体与多肽混合后加入到核酸水溶液中继续混合均匀。在室温
下孵育30分钟制得三元纳米颗粒，然后将透明质酸加入该混合物中并充分混合均匀，
静置15分钟制得四元纳米颗粒。
阳离子脂质体与多肽的质量比为(0.5～2)：(2～10)；所述多肽与IL-1RapcDNA
的质量比为(2～10)：(0.5～2)；所述透明质酸钠的加入质量与所述多肽的质量比为(5～
35)：(2～10)。
三元纳米颗粒与四元纳米颗粒的用于测物化性质的体系在水溶液中进行；用于细胞
实验的载体体系用无血清培养基代替超纯水。
实施例2
本实施例涉及实施例1所述方法制备的三元纳米颗粒与四元纳米颗粒的凝胶电泳，
具体包括如下操作：
称取0.3g的琼脂糖粉末，倒入锥形瓶中，将30ml1×TAE缓冲液加入至锥形瓶中，
在加热的条件下将其充分溶解，待温度降到65℃后，加入Gelredinwarter3μL，迅速倒
入制胶槽中，插入样品梳，在室温下放置0.5～1h等待胶变为凝固态。接着将样品梳拔
出，再将TAE缓冲液倒入样品槽中使其浸没凝胶。制备不同比例的三元纳米颗粒与四
元纳米颗粒10μL，将6×上样缓冲液2μL与复合物混匀，上样10μL，同时上样10μLnaked
IL-1RapcDNA作为对照。随后在110mV电压下电泳45min，关掉电泳，取出凝胶置于
紫外凝胶成像系统观察并记录电泳图像。
结果如图2，条带从左向右依次为NakedDNA，样品L:P1:D＝1:4:1(1)、
L:P2:D＝1:4:1(2)、L:P1:D＝0.75:4:1(3)、L:P2:D＝0.75:4:1(4)、L:P1:D:H＝1:4:1:14.2(H-1)、
L:P2:D:H＝1:4:1:14.2(H-2)、L:P1:D:H＝0.75:4:1:14.2(H-3)、L:P2:D:H＝0.75:4:1:14.2(H-4)，
其中，H代表透明质酸；L代表阳离子脂质体；D代表DNA；P1为氨基酸序列为
RRRRRRRRRRRRRRRRKRPTMRFRYTWNPMK(SEQIDNo.1)的多肽；P2为氨基酸
序列为RRRRRRRRRRRRRRRRKMPNWTYRFRMTPRK(SEQIDNo.2)的多肽；各数
据代表各组分的质量比(以下各图表同)。
序号
L(阳离子脂质体)
P1/P2(多肽)
D(DNA)
H(透明质酸)
1
1
P1:4
1
-
2
1
P2:4
1
-
3
0.75
P1:4
1
-
4
0.75
P2:4
1
-
H-1
1
P1:4
1
14.2
H-2
1
P2:4
1
14.2
H-3
0.75
P1:4
1
14.2
H-4
0.75
P2:4
1
14.2
从电泳图中我们可以观察到三元纳米颗粒与四元纳米颗粒的位置都有停在起点，说
明我们的载体完全包裹了IL-1RapcDNA，从而有效保护DNA，避免DNA在细胞吞噬
前被降解。
实施例3
本实施例对实施例2制备的颗粒的Zeta电位进行测试：复合物的电位使用粒度分析
仪测定。
采用zetasizer2000测定颗粒的表面电荷，样品测定时间设置为自动，每个样品测定
3次，取平均值作图。
复合物的ζ电位测定结果如图3所示。从图中可见这8个不同的纳米颗粒的ζ电位
比较稳定：PLD带正电荷，HPLD带负电荷，其电荷的绝对值大于25mV，说明它们形
成的分散体系也相对稳定。
实施例4
本实施例对实施例2制备的颗粒(不同比例的复合物200μL)的粒径进行测试，具
体如下：室温条件下，用MalvernNanoZS激光粒度仪测定Q-complexes的水化半径，
折射介质设置为水，折射率为1.33，粘度为0.8872cP，每个样品测定3次，取平均值作
图。
首先，在室温下预热粒度分析仪30min，在微量样品池中加入颗粒溶液，用超纯水
稀释至450μL，将微量样品池插入粒度分析仪的测试槽中，每个样品记录三次测试结果，
观察并记录样品粒径的平均值，同时也要注意样品的分散性(PDI)。
颗粒的粒径见图4，从图中可见这8个不同的纳米颗粒的粒径都比较稳定，基本上
在100nm左右，其大小有利于细胞内吞。
实施例5
本实施例具体为实施例2制备三元纳米颗粒与四元纳米颗粒的滑膜细胞C518的萤
光素酶转染活性实验，包括如下步骤：
将培养好的细胞接种于96孔板中，每孔细胞数为2×104个，将其置于细胞培养箱
中培养24h。加入不同的复合物：每孔加入的DNA的质量是250ng，每孔加入200μL
的复合物溶液(即每200μL纳米颗粒溶液DNA的质量为250ng)，并平行3个复孔，稀
释介质为Opti-MEM培养基，并以商业化转染试剂PEI25KDa与DNA的复合物作为对
照组。孵育24h后，取出96孔板弃去培养液，每孔用200μL1×PBS缓冲溶液冲洗一遍
后，每孔加入200μL的复合物溶液，置于细胞培养箱中培养4h后，取出96孔板，吸去
培养液，每孔加入200μL的含10％胎牛血清的DMEM/f12培养基，将其置于细胞培养
箱中培养24h。检测瞬时发光强度：过夜后取出96孔板，从每个孔中吸出20μL裂解液
至对应的流式管中，打开照度计，预热20min，测试时每个流式管中加入20μL荧光素
酶底物，快速吹打均匀，检测其瞬时发光强度(RLU)。检测蛋白总量：采用MicroBCA
测定法来确定裂解液中的蛋白总量。通过样品的相对发光强度除以样品的总蛋白浓度后
所得数(RLU/mgprotein)来衡量细胞转染效率(即荧光素酶蛋白的表达量)，每个样品
平行测3次，取平均值作图。
检测结果如图5所示，从中可以看出，采用三元纳米颗粒对C518转染的效果与常
用转染试剂PEI25kDa相当，而相应的四元纳米颗粒转染滑膜细胞C518的效果远高于这
两组。
实施例6
本实施例涉及实施例2制备的三元纳米颗粒与四元纳米颗粒转染滑膜细胞C518后
IL-1Ra蛋白水平实验，具体包括：
将IL-1RapcDNA和不同比例的载体组成的复合物转染滑膜细胞，步骤同荧光素报
告基因质粒的体外转染的过程，每孔加入200μL的完全培养基后放入细胞培养箱中培养
48h，之后将每个实验组和对照组孔的细胞培养上清液吸出，转移至EP管中，即可等待
测定。本测试在96孔板上测定，具体操作按照RayBioHumanIL-1RAELISA试剂盒
检测说明书。
检测结果如图6所示，三元纳米颗粒与四元纳米颗粒对滑膜细胞C518转染IL-1Ra
pcDNA的效率均高于裸IL-1RapcDNA和PEIkDa，特别是样品L:P1:D＝1:4:1与L:P1:D:
H＝1:4:1:14.2其IL-1RapcDNA蛋白表达远高于其它组。
实施例7
本实施例涉及滑膜细胞C518的毒性实验，具体为采用CCK-8CellProliferationand
CytotoxicityAssayKit考察包裹IL-1RapcDNA的纳米颗粒复合物对滑膜细胞的毒性，包
括如下步骤：
毒性实验开始前，先将细胞接种到96孔中，每孔的细胞数为104个，接种24h后，
取出96孔板弃去培养液，每孔用200μL1×PBS缓冲溶液冲洗一遍后，每孔给不同比例
的200μL的复合物溶液，每个样品平行3个复孔，置于细胞培养箱中培养4h后，吸出
100μL的复合物溶液，向96孔板每孔细胞中加入CCK-8试剂10μL，避光在细胞培养箱
中培养1h后，最后，用多功能酶标仪测定样品在450nm处的吸光度OD值。细胞存活
率(百分比)是以待测样品的吸光度相比正常细胞的吸光度值来表示。
检测结果如图7所示，大多三元纳米颗粒与四元纳米颗粒对滑膜细胞C518的毒性
小于PEI25kDa。部分样品组的细胞活性达到90％以上。
实施例8
本实施例涉及大鼠急性关节炎模型的建立以及体内实验，包括如下步骤：
取大鼠30只，每只在其关节处注射100μL的完全弗氏佐剂，造模后第二天观察大
鼠的关节肿胀程度，将其平均分为5组，每组6只，分别为空白对照组、不治疗组、化
药治疗组、化药加基因治疗组、基因治疗组。造模后第二天对大鼠进行治疗，我们选择
的是L:P1:D＝1:4:1比例来复合IL-1RapcDNA形成纳米颗粒复合物来进行关节炎的治疗，
于大鼠的关节腔局部注射不同的药100μL，化药治疗组为100μL醋酸曲安奈德注射液(浓
度为10mg/mL)，化药加基因治疗组中含有10mg/mL醋酸曲安奈德注射液50μL和纳米
颗粒复合物50μL(含有12.5μgIL-1RapcDNA)，基因治疗组的100μL溶液中(含有
25μgIL-1RapcDNA)，阴性基因治疗组是用L:P1:D＝1:4:1比例来复合PGL3DNA形成纳
米颗粒复合物(含有25μgPGL3DNA)，隔一天再给一次药，在第二次给药后48h用ELISA
方法检测体内的IL-1Ra蛋白的表达。
检测结果如图8与9所示，在化药治疗组与化药加基因治疗组中可以看到相同的改
善关节肿胀程度的疗效，在治疗基因组虽然没有看到明显的关节肿胀度的减弱，但从I
L-1RapcDNA蛋白的表达中看到有一定的增加，说明基因组从本质上改善了关节炎的病
情，只是疗效较慢。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上
述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，
这并不影响本发明的实质内容。