具有减毒抗癌功效的中药组合物及其多糖的制备方法技术领域
本发明涉及一种中药组合物，具体的说，涉及一种具有减毒抗癌功效的
中药组合物及其多糖的制备方法。
背景技术
乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，原位乳腺癌并不致命，但
由于乳腺癌细胞丧失了正常细胞的特性，细胞之间连接松散，容易脱落，一
旦脱落，游离的癌细胞可以随血液或淋巴液播散全身，形成转移，危及生命。
目前乳腺癌已成为威胁女性身心健康的常见肿瘤。
随着现代医学的发展，西医治疗乳腺癌的主要方法包括手术治疗，辅助
治疗，放射治疗，内分泌治疗和生物治疗等，但是对于治疗后复发或失败的
患者，进一步提高放、化疗效果，或带瘤生存，是目前肿瘤研究的难点和热
点之一。
中医药治疗乳腺癌具有悠久的历史，积累了丰富的经验，疗效显著，没
有明显的毒副作用，中医药治疗乳腺癌不是通过靶点作用进行的，对乳腺癌
的直接抑制作用不如手术，放化疗明显，但在改善症状，提高肿瘤的稳定率，
改善患者生存质量和生存率等方面具有较强的优势，对手术，放化疗具有协
同和减毒作用。
以往研究表明，放疗和化疗的毒副作用是降低患者生存质量的中药原
因，尽管乳腺癌的治疗方法不断完善，但其远期生存率并未得到明显的改善，
复发和转移是主要的原因，正气内虚，冲任失调，余毒未清是乳腺癌复发转
移的主要因素，五脏六腑功能衰弱，机体免疫功能降低，经过手术，放疗，
化疗后，邪气消减但仍有余毒，由于经过手术，放疗和化疗，身体正气大伤，
正不压邪，使余毒复燃。
中医药能够通过减轻余毒，促进体质恢复，降低复发和转移率，但中医
是辩证施治，不同的患者可能需要不同治疗，如益气养血，养阴生津，温阳
益肾，健脾养胃等，中医药临床研究尚处于探索阶段，没有统一的辩证和疗
效标准，实验研究少，也没有疗效显著、服用方便的制剂。
基于上述缺陷，本发明提供一种具有减毒抗癌功效的中药组合物及其多
糖的制备方法，该中药组合物的多糖能够诱导肿瘤细胞死亡，抑制肿瘤增殖、
迁移，因此可进一步用于制备抗肿瘤的药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有解毒抗癌功效的中药组合物。
本发明的另一目的是提供一种具有解毒抗癌功效的中药组合物的多糖。
本发明的又一目的是提供一种中药组合物的多糖的制备方法。
实验研究发现，本发明所述的中药组合物及其多糖能够诱导肿瘤细胞死
亡，抑制肿瘤增殖、迁移，因此可进一步用于制备抗肿瘤的药物。
本发明所述的中药组合物由以下重量份的中药组成：肿节风：2-3重量
份；龙葵：4-6重量份；浙贝母：2-3重量份；昆布：4-6重量份。
优选的，肿节风与浙贝母用量相同；龙葵与昆布用量相同。本发明所述
的中药组合物由以下重量份的中药组成：肿节风3重量份；龙葵：6重量份；
浙贝母：3重量份；昆布：6重量份。
肿节风，龙葵，浙贝母，昆布都属于中医药中“清热解毒”的药物，但
它们在“清热解毒”的范畴中都有不同的功效。
肿节风苦、辛、平。归心、肝经；功能主治是抗菌消炎，祛风通络，活
血散结；可用于防治肺炎、阑尾炎、蜂窝组织炎、风湿痹痛、跌扑损伤、肿
瘤，白血病和呼吸道疾病。动物实验表明，肿节风能改善肿瘤细胞和荷瘤小
鼠的能量代谢，提高过氧化氢酶活力，对癌细胞和荷瘤机体的耗氧能力有直
接抑制作用，因此，肿节风的主要作用是改善能量代谢而实现抗癌作用。大
剂量肿节风对巨噬细胞系统、T淋巴细胞和B淋巴细胞均具有一定的免疫抑
制作用。小剂量则能增强免疫功能，并对免疫功能具有调节作用。据浙江省
肿节风协作组报道，用不同剂型肿节风治疗恶性肿瘤70例，单独成药使用
肿节风制剂治疗1个月以上，显效6例，占8.75％；有效49例，占70％；无效
15例，占21.43％。
龙葵性寒，味苦、微甘；有小毒；能够清热解毒，利尿；可用于疮痈肿
毒、皮肤湿疹、小便不利、老年性慢性气管炎、白带过多、前列腺炎、痢疾
等。龙葵提取物对动物有抗炎作用，可提高小鼠体内自然杀伤细胞的活性，
对支气管哮喘有良好功效，据初步试验龙葵还可以用于治疗肿瘤。
浙贝母也具有清热解毒功能，属于清化热痰药；性味：味苦；性寒；归
肺经；心经，主治清热化痰，降气止咳，散结解毒；可用于防治风热或痰热
咳嗽；肺痈吐脓；瘰疬瘿瘤；疮痈肿毒。
昆布性味咸；寒；归肝、胃、肾经；功效消痰软坚，消痰，利水退肿。
主瘰疬；瘿瘤；噎膈；(疒颓)疝脚气水肿。用于瘿瘤，瘰疬，睾丸肿痛，
痰饮水肿。其强碱性功效为抗氧化、防癌。昆布还具有抗放射作用：海带多
糖1次注射，能明显地提高900拉德照射小鼠存活率，并随给药剂量增加存
活率提高，能显著地保护照射动物的造血组织。因此，海带多糖对于预防放
疗所致造血组织损伤，刺激造血恢复及增强癌症患者的免疫功能，合并放射
治疗可能有一定实际意义。
上述四种中药合理配方，各种药物组份既有其自身的作用，又相互影响
和协同作用，共同达到解毒抗癌的目的。本发明所述的药物组合物可采用本
领域常用的各种方法制备，可加入本领域常用辅料制成片剂、胶囊、口服液、
颗粒剂等剂型。所述辅料可以包括溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂、
粘合剂、润滑剂、基质等。所采用的方法有液相提取法(常用的水提法和醇
提法)，固态混合法或上述两种方法的组合。
特别的，经过实验研究，本发明还提供上述具有解毒抗癌功效的中药组
合物的多糖，该多糖由下述方法制备：
1)去脂：取中药材，加入3-6倍量的石油醚，回流提取1-3h，滤去药
渣；再加入3-6倍量的石油醚，再回流提取1-3h，滤取药渣，挥干石油醚；
2)浸提：向药渣中加入10-12倍量的水，浸泡，煎煮1-3次，过滤；滤
液浓缩至0.9-1.25g/ml，得浓缩液；
3)醇析：浓缩液中加入无水乙醇，边加入边搅拌，使含醇量为70-85％，
静置，过滤得沉淀，将沉淀干燥，得粗多糖；
4)脱蛋白：将粗多糖脱除蛋白；
5)干燥。
优选的，步骤1)中，所述去脂如下进行：取中药材，加入6倍量的石
油醚，回流提取2h，滤去药渣；再加入6倍量的石油醚，再回流提取2h，
滤取药渣，挥干石油醚；
步骤2)中，所述浸泡时间为30-60分钟，优选30分钟；
所述煎煮为2次，煎煮时间分别为2h和1.5h；
优选的，所述浸提如下进行：药渣加入12倍量的水，浸泡30min，煎
煮2h，过滤；药渣再加入10倍量的水，煎煮1.5h，过滤；合并滤液，过滤，
滤液浓缩至1g/ml，得浓缩液；
步骤3)中，所述含醇量为80％；静置时间为24小时；
所述过滤为减压抽滤；所述干燥为减压干燥(压力小于2.67kPa
(20mmHg))，干燥时温度为60℃，时间为6h；
无水乙醇是常用的试剂，一般含醇量为95％；
步骤4)中，所述脱蛋白可采用本领域常用的方法，如NaOH法，TCA
法，sevage法等，考虑到脱蛋白率和总糖损失率，优选sevage法；
所述sevage法脱蛋白如下进行：粗多糖研匀分散于25倍水中，加入体
积为粗多糖体积1/5的氯仿，随之再加入体积为氯仿体积1/5的正丁醇，振
摇，放出氯仿层；重复7-8次；
步骤5)中，所述干燥用旋转蒸发仪进行，回收溶剂的同时减压干燥，
得本发明所述中药组合物多糖。
具体的说，本发明所述的中药组合物多糖由下述方法制备：
1)去脂：取中药材，加入6倍量的石油醚，回流提取2h，滤去药渣；
再加入6倍量的石油醚，再回流提取2h，滤取药渣，挥干石油醚；
2)浸提：药渣加入12倍量的水，浸泡30min，煎煮2h，过滤；药渣再
加入10倍量的水，煎煮1.5h，过滤；合并滤液，过滤，滤液浓缩至1g/ml；
3)醇析：浓缩液中加入95％乙醇，边加入边搅拌，使含醇量为80％，
静置过夜24h，减压抽滤得沉淀，将沉淀减压干燥，得粗多糖；
4)sevage法脱蛋白：粗多糖研匀分散于25倍水中，加入体积为粗多
糖体积1/5的氯仿，随之再加入体积为氯仿体积1/5的正丁醇，振摇，放出
氯仿层；重复7-8次；
5)干燥：用旋转蒸发仪回收溶剂，减压干燥。
经体外实验的研究结果表明，本中药复方多糖具有抑制乳腺癌细胞增
殖、迁移的作用；MTT和细胞实时检测方法显示，其对小鼠乳腺癌细胞4T1
细胞增殖有抑制作用，还可以抑制4T1细胞的迁移能力。
本发明还提供一种中药组合物的多糖的制备方法。
本发明所述的方法包括以下步骤：
1)去脂：取中药材，加入3-6倍量的石油醚，回流提取1-3h，滤去药
渣；再加入3-6倍量的石油醚，再回流提取1-3h，滤取药渣，挥干石油醚；
2)浸提：向药渣中加入10-12倍量的水，浸泡，煎煮1-3次，过滤；滤
液浓缩至0.9-1.25g/ml，得浓缩液；
3)醇析：浓缩液中加入无水乙醇，边加入边搅拌，使含醇量为70-85％，
静置，过滤得沉淀，将沉淀干燥，得粗多糖；
4)脱蛋白：将粗多糖脱除蛋白；
5)干燥。
优选的，本发明所述的方法包括以下步骤：
1)去脂：取中药材，加入6倍量的石油醚，回流提取2h，滤去药渣；
再加入6倍量的石油醚，再回流提取2h，滤取药渣，挥干石油醚；
2)浸提：药渣加入12倍量的水，浸泡30min，煎煮2h，过滤；药渣再
加入10倍量的水，煎煮1.5h，过滤；合并滤液，过滤，滤液浓缩至1g/ml；
3)醇析：浓缩液中加入95％乙醇，边加入边搅拌，使含醇量为80％，
静置过夜24h，减压抽滤得沉淀，将沉淀减压干燥，得粗多糖；
4)sevage法脱蛋白：粗多糖研匀分散于25倍水中，加入体积为粗多
糖体积1/5的氯仿，随之再加入体积为氯仿体积1/5的正丁醇，振摇，放出
氯仿层；重复7-8次；
5)干燥：用旋转蒸发仪回收溶剂，减压干燥。
本发明所述的中药多糖制备工艺是经过大量的筛选实验得到的，能最大
限度的保存各药物组分的有效成分，从而提高药效。
本发明深入研究了所述中药组合物及其多糖对乳癌细胞的作用，所述中
药组合物及其多糖具有解毒抗癌功效，所述的多糖具有抗小鼠乳腺癌细胞
4T1增殖和迁移的作用。本发明所述的中药组合物，其多糖可以应用于抗肿
瘤药物的研发，其多糖的制备方法还可以应用于其他复方中药制备，制备的
制剂效果显著、施用方便。
附图说明
图1.JD组抑制小鼠4T1乳腺癌细胞增殖的结果；其中(a)为RTCA连
续观察JD组作用4T1细胞48h的增殖情况；(b)为与Control组比较，第
36hJD组不同浓度的Cellindex。
图2.JD组抑制小鼠4T1乳腺癌细胞迁移的结果；其中(a)为RTCA连续
观察JD组作用4T1细胞后的迁移情况；(b)为与Control组比较，JD组不
同时间的Cellindex。
图3.JD组诱导小鼠4T1乳腺癌细胞凋亡的结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明但不限定本发明的技术方案，如无特别说明，所采
用的方法是本领域常用的方法，所采用的设备为本领域常用的设备。
实施例1本发明所述的中药组合物多糖的制备
按照表1所述的分量称取中药材：
表1中药材用量表
按下述步骤提取多糖：
1)去脂：药材加入6倍量的石油醚回流提取2h，滤去药渣，再加入6
倍量的石油醚再提取2h，滤取药渣挥干石油醚。
2)浸提：药渣加入12倍量的水，浸泡30min，煎煮2h，过滤。药渣
再加入10倍量的水，煎煮1.5h，过滤。合并滤液，过滤，滤液浓缩至1g/ml。
3)醇析：浓缩液中加入95％乙醇，边加入边搅拌，使含醇量为80％，
静置过夜24h，减压抽滤得沉淀，将沉淀减压干燥，得粗多糖。
4)sevage法脱蛋白：粗多糖研匀分散于25倍水中，加入1/5体积的
氯仿，随之再加入1/5氯仿体积的正丁醇，振摇，放出氯仿层。重复7-8次。
5)干燥：用旋转蒸发仪回收溶剂，减压干燥。
结果见表2
表2中药材多糖提取结果
表2的结果表明：
1g除蛋白后粗多糖相当于生药15.99g。
实施例2本发明所述的中药组合物多糖的制备
按照表3所述的分量称取中药材：
表3中药材用量表
按下述步骤提取多糖：
1)去脂：药材加入3倍量的石油醚回流提取2h，滤去药渣，再加入5
倍量的石油醚再提取2h，滤取药渣挥干石油醚。
2)浸提：药渣加入10倍量的水，浸泡30min，煎煮2h，过滤。药渣
再加入12倍量的水，煎煮2h，过滤。合并滤液，过滤，滤液浓缩至1g/ml。
3)醇析：浓缩液中加入95％乙醇，边加入边搅拌，使含醇量为78％，
静置过夜24h，减压抽滤得沉淀，将沉淀减压干燥，得粗多糖。
4)sevage法脱蛋白：粗多糖研匀分散于25倍水中，加入1/5体积的
氯仿，随之再加入1/5氯仿体积的正丁醇，振摇，放出氯仿层。重复7-8次。
5)干燥：用旋转蒸发仪回收溶剂，减压干燥。
得到除蛋白后的粗多糖，计算可知1g除蛋白后粗多糖相当于生药16.3g。
实施例3本发明所述的中药组合物多糖的制备
按照表1所述的分量称取中药材：
按下述步骤提取多糖：
1)去脂：药材加入6倍量的石油醚回流提取2h，滤去药渣，再加入3
倍量的石油醚再提取2h，滤取药渣挥干石油醚。
2)浸提：药渣加入10倍量的水，浸泡30min，煎煮2h，过滤。药渣
再加入10倍量的水，煎煮1.5h，过滤。药渣再加入10倍量的水，煎煮1.5h，
过滤。合并滤液，过滤，滤液浓缩至1.1g/ml。
3)醇析：浓缩液中加入95％乙醇，边加入边搅拌，使含醇量为80％，
静置过夜24h，减压抽滤得沉淀，将沉淀减压干燥，得粗多糖。
4)sevage法脱蛋白：粗多糖研匀分散于25倍水中，加入1/5体积的
氯仿，随之再加入1/5氯仿体积的正丁醇，振摇，放出氯仿层。重复7-8次。
5)干燥：用旋转蒸发仪回收溶剂，减压干燥。
得到除蛋白后的粗多糖，计算可知1g除蛋白后粗多糖相当于生药16.1g。
实验例1
1、实验细胞：4T1小鼠乳腺癌细胞购自中国医学科学院基础医学研究
所协和细胞库。
2、药物：肿节风、龙葵、浙贝母、昆布均购于北京中医医院中药房。
3、分组：
空白对照组(Control)
中药组(JD)
4.实验方法：MTT法和实时细胞检测法
4.1MTT:常规培养细胞，消化离心，调整细胞浓度接种于96孔板中,待
次日细胞贴壁后，加药物干预，分别于加药后24h，48h向每孔中加入
15ulMTT，培养箱孵育4h，吸弃培养基，加DMSO溶解蓝紫色结晶，震荡
混匀，酶标仪上570nm处检测OD值。
4.2实时细胞检测法：增殖
细胞悬液准备：
(1)常规消化，重悬后计数
(2)配制成浓度为3x104cells/ml的细胞悬液5ml(共需细胞1.5x105个)
P＝70/4*105＝1.75*106cell/ml
取细胞悬液86ul，加至5ml。
E-plate16准备:Real-timecellanalysis(RTCA)xCELLigenceDP：德国
RocheAppliedScience公司；
(1)在E-Plate16的孔中加入100μl1640培养基；
(2)将E-Plate16放到xCelligence系统上，系统会自动进行扫描，检
查是否接触良好，若接触良好则可进行下一步；
(3)点击“Layout”页面，设置实验孔的细胞名称、数目.需要先设置此
选项，然后才可进行下一步；
(4)测量基线阻抗：进入页面上“schedule”，点击“addastep”按钮，
检测；
(5)取出E-Plate16，在孔中加入100μl混合均匀的4T1细胞悬液；
(6)将E-Plate16置于超净台中室温放置30min；
(7)将E-Plate16放到培养箱中的xCelligence上；
(8)进入页面上“schedule”，点击“addastep”按钮，设置总的测量时
间(h)：大于总的观察时间即可，设置时间间隔(interval)：15min，系统
自动算出测量次数(sweeps)；
Plot界面点击“addall”增加曲线，可以查看曲线变化。
(9)在系统点击“开始”按钮，开始检测细胞增殖曲线。加药时点击“暂
停”按钮，取出E-plate16进行加药，加药结束后将plate放回，点击“开始”
按钮。
(10)观察细胞生长曲线，当cellindex达到1左右时，予以药物干预，
观察药物干预后细胞的增殖情况。
4.3实时细胞检测法：迁移
(1)准备细胞悬液(与实时细胞检测法：增殖相同)；
(2)在CIM-Plate16板下室的孔中用多道或单道移液器加入165ul培养基，
与上室组装在一起；
(3)在上室中加入30ul无血清培养基，轻拍板四周，使培养基分布均匀。
将device置于37℃，CO2浓度为5％的CO2培养箱平衡1h；
(4)基线测量：将平衡1h的device置于xCelligence上，系统自动扫描后，
进行基线检测；
(5)将板取出，加100ul细胞悬液将CIM-Plate16板置于超净台中室温放置
30min；
(6)将CIM-Plate16板放到培养箱中的xCelligence上，检测24hr。
结果见图1和图2，图1显示JD组能够抑制小鼠4T1乳腺癌细胞增殖；
图2显示JD组能够抑制小鼠4T1乳腺癌细胞迁移的结果。
实验例2细胞凋亡检测实验
(1)收集细胞：收集经不同药物处理24h或48h的细胞株，用0.125％
胰酶消化2min，完全培养基终止消化，1500rpm离心5min。
(2)洗涤重悬：用PBS洗涤细胞2次(用手指弹散细胞，用枪轻柔吹
打混匀)，第二次洗涤重悬细胞收集至1.5mLEP管中，离心后弃去上清，
加入500uL的bindingbuffer，悬浮细胞，置于冰上。
(3)染色：加入5uL的AnnexinV-FITC混匀后，加入5uLPI轻轻混
匀，室温避光，反应15min。
(4)检测：用300目滤网过滤一遍细胞到流式的上样管中，流式细胞
仪检测。凋亡早期细胞因磷脂酰丝氨酸的暴露及具有完整细胞膜，故呈现
AnnexinV-FITC染色阳性，PI染色阴性。坏死或者晚期凋亡的细胞呈
AnnexinV-FITC染色阳性，PI染色阳性。流式图上显示：右下为早期凋亡，
右上为晚期凋亡。左上为坏死，右下为活细胞。
结果见图3，显示JD组能够诱导小鼠4T1乳腺癌细胞凋亡。
实验例1和2的实验结果显示：本发明所述的中药组合物多糖可以抑制
小鼠4T1乳腺癌细胞增殖和迁移，并诱导凋亡。