一种疫苗佐剂及含该疫苗佐剂的疫苗组合物和疫苗制剂技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种疫苗佐剂及含该疫苗佐剂的疫苗组合物和
疫苗制剂。
背景技术
佐剂是一类先于抗原或与抗原同时应用时能增强抗原免疫效应的物质，它的作
用主要是增强机体免疫系统对抗原的特异性免疫应答反应。自200多年前英国医生
Jenner接种牛痘预防天花并取得了人体试验成功，人类可以通过接种疫苗预防控制某
些传染性疾病。1925年法国免疫学家兼兽医学家GastonRamon发现在白喉、破伤风
疫苗中加入木薯淀粉、琼脂、化脓性细菌等某些与抗原无关的物质可以特异性地增
强机体对白喉和破伤风毒素的抵抗力。在此后的疫苗佐剂的研究中发现许多物质均
具有佐剂效应，如木薯粉、羊毛脂、丹宁酸等。近年来，随着人们对免疫佐剂研究
的不断深入，越来越多的物质被发现有免疫佐剂的功能，如铝盐佐剂、油乳佐剂、
蜂胶佐剂、多糖佐剂、新型免疫佐剂等(BiomolecularEngineering,2001,18(3):69-85.)。
油乳佐剂主要有油包水乳剂的弗氏佐剂(FA)、水包油乳剂的MF-59等。新型免疫佐
剂有脂质体、细胞因子佐剂等。至今被我国批准合法使用的人用疫苗佐剂是铝盐佐
剂，它可以有效地诱导免疫反应，显著增强机体的体液免疫应答(ArchVirol，2008，
153(5):831－837.)。然而，铝盐佐剂只能增强机体的体液免疫功能，对于如HIV等
胞内病毒无法产生有效的细胞免疫促进作用。其次，铝盐佐剂主要以氢氧化铝和磷
酸铝为代表，在注射部位产生红肿、结节等局部反应，铝盐还易在体内蓄积，特别
是脑部，有可能导致脑病的发生。传统兽用疫苗中常用的佐剂有铝盐佐剂和油佐剂。
油佐剂疫苗在抗体效价和免疫持久性方面都优于铝盐佐剂疫苗，但油佐剂不良反应
严重，皮下注射会引起炎症、溃疡和肉芽肿；油类物质长期潴留于组织中不易代谢。
随着免疫学研究的不断深入和基因工程技术的迅速发展，针对不同疾病已开展
了各种新型基因工程疫苗的研制，新型技术疫苗如抗原表位疫苗、基因工程疫苗等
抗原纯度越来越高，但这些疫苗普遍存在分子小、免疫原性弱、难以诱导机体产生
有效免疫应答等不足，从而需要免疫佐剂来协同这种作用，尤其是安全无毒、能够
刺激较强细胞免疫应答的佐剂，以及适合粘膜疫苗、核酸疫苗和肿瘤疫苗的免疫佐
剂。
几丁寡糖分子量小，水溶性良好，易被人体吸收，生物活性高，具有大分子糖
所不具备的更独特的生理生化活性，同时具有纯天然、无辐射、无污染等特点，在
保健品、营养剂、食品添加剂等食品工业方面，植物生长调节剂及饲料添加剂等农
牧业方面，废水处理、纺织、化工、日用化学品、生物工程和医药等方面具有良好
的应用价值(杜昱光，白雪芳，虞星炬.寡聚糖类物质生理活性的研究.中国生化
药物杂志，1997，18(5)：268.)，更为值得关注的是它能够有效激活机体细胞免疫和
体液免疫，将其开发为疫苗佐剂具有良好的应用前景。
几丁寡糖的制备主要有化学法、物理降解法、酶法、糖基转移法(中国生化药物
杂志，1999，20(2)：99)。化学法一般用浓盐酸水解，但其产品多在四糖以下，而
且化学反应条件十分苛刻，不易控制，后处理也繁琐。糖基转移法是利用低聚合度
寡糖，在酶(主要是溶菌酶或几丁质酶)的参与后，延长糖链成为高聚合度的寡糖，
此方法主要得到六糖和七糖。酶降解法所用的酶有几丁质酶、壳聚糖酶、纤维素酶、
糖苷酶和脂肪酶等，对其聚合度无法控制。而不同聚合度的几丁寡糖对其佐剂活性
有影响。目前所能制备得到的非常有限的寡糖价格昂贵，其在应用上受到很大的限
制。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种疫苗佐剂及含该疫苗佐剂的疫苗组合物和疫苗制
剂。
为达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
本发明的第一方面涉及一种具有如下特征的几丁寡糖：
壳聚糖经生物酶法水解或化学法降解或物理方法(微波、射线照射)裂解生成
聚合度为2-10的壳寡糖，将该壳寡糖经氨基的选择性乙酰化反应，制备聚合度为2-10
的几丁寡糖；
或，利用酶法或化学法直接降解几丁质获得2-10聚合度的几丁寡糖。
所制备的几丁寡糖的乙酰度>90％，分子量范围为400～2000Da。
根据本发明所述的几丁寡糖，其具有图1或图2所示特征。
本发明的再一方面涉及一种疫苗佐剂，其包含本发明中上述的几丁寡糖；具体
地，所述疫苗佐剂为减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、核酸疫苗或多肽疫苗的
佐剂。
本发明的再一方面涉及一种疫苗组合物或疫苗制剂，其包含本发明的含几丁寡
糖组分的疫苗佐剂。
根据本发明任一项所述的疫苗组合物或疫苗制剂，其为减毒疫苗、灭活疫苗、
蛋白质疫苗、核酸疫苗或多肽疫苗。
根据本发明任一项所述的疫苗组合物和疫苗制剂，其为猪繁殖与呼吸综合征
(猪蓝耳病)灭活疫苗或乙肝亚单位疫苗。
本发明的再一方面涉及本发明上述几丁寡糖在制备疫苗佐剂中的用途；或者在
制备疫苗组合物和疫苗制剂中的用途。
根据本发明任一项的用途，其中，所述疫苗佐剂为减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白
质疫苗、核酸疫苗或多肽疫苗的佐剂；所述疫苗制剂或疫苗组合物为减毒疫苗、
灭活疫苗、核酸疫苗、蛋白质疫苗或多肽疫苗。
本发明涉及的疫苗组合物，该疫苗组合物含疫苗抗原和几丁寡糖佐剂；
本发明涉及的疫苗制剂，该疫苗制剂含疫苗抗原、几丁寡糖佐剂和制剂所需
的各种辅料；
本发明还涉及一种免疫方法或者接种方法，包括给予哺乳动物有效量的疫苗制
剂或疫苗组合物的步骤。
术语“有效量”是指哺乳动物中实现免疫效果的疫苗制剂或疫苗复合物的剂量。
本发明的有益效果：
本发明的几丁寡糖能够增强免疫应答，具有良好的佐剂作用，可以用作减毒疫
苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、核酸疫苗或多肽疫苗的佐剂。本发明中的几丁寡糖
已经可以大规模生产。本发明为几丁寡糖佐剂作用机理的研究奠定基础，为找到
具有更好佐剂效果的寡糖提供了参考。
本发明通过生物酶法水解、化学法降解或物理方法裂解，并结合膜分离技术，
制备聚合度为2-10的壳寡糖，将该壳寡糖经氨基的选择性乙酰化反应，制备聚合度
为2-10的几丁寡糖。可以高产率大规模地生产，并且质量可控，成本适宜，可以为
制成体内环境下易溶、易吸收、使用方便的几丁寡糖，应用于疫苗佐剂提供物质基
础。
附图说明
图1为本发明的几丁寡糖与壳寡糖红外检测图谱对比；
图2为本发明的几丁寡糖的质谱分析图谱；
图3为猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗抗原配伍几丁寡糖第1次免疫小鼠血清抗
体滴度；
图4为猪蓝耳病灭活疫苗抗原配伍几丁寡糖第2次免疫小鼠血清抗体滴度；
图5为猪蓝耳病灭活疫苗抗原配伍几丁寡糖第3次免疫小鼠血清抗体滴度；
图6为猪蓝耳病灭活疫苗抗原配伍几丁寡糖第3次免疫小鼠血清抗体亚型及亚
类；
图7为乙肝亚单位疫苗配伍几丁寡糖第2次免疫小鼠血清抗体滴度；
图8为乙肝亚单位疫苗配伍几丁寡糖第2次免疫小鼠血清抗体亚型及亚类。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将
会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中
未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注
明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：几丁寡糖的制备及理化性质
1、几丁寡糖制备：
配料罐中加入去离子水，将壳聚糖溶解在1％的醋酸溶液中，搅拌升温至
38±2.0℃。加入5％(对底物)的酶制剂，搅拌，38℃恒温，待酶解溶液粘度降至60％
后，开始超滤(切割分子量在6000)。小于切割分子量的部分透过膜，大于切割分子
量的部分返回反应釜继续降解。超滤透过液再通过纳米膜滤器(切割分子量300)，
透过部分为水、醋酸和小分子糖(该透过部分可循环使用，用于配制壳聚糖溶液)，
未透过部分被浓缩为壳寡糖溶液，喷雾干燥，制得壳寡糖粉末。
选择聚合度在2-10的壳寡糖进行制备高乙酰度的几丁寡糖，将壳寡糖溶于水，
加入过量的乙酸酐，然后加入DMAP催化剂，60℃反应4小时；反应完成后，对反
应液离心，取上清液，然后喷雾干燥，得到几丁寡糖。
2、几丁寡糖红外光谱检测：
通过红外光谱分析，上述所制备的几丁寡糖的谱图如图1所示，由图1可以看
出，所制备的几丁寡糖的谱图与几丁质的谱图基本一致，与高脱乙酰化的壳寡糖的
主要区别在于1640cm-1峰增强。
3、几丁寡糖质谱检测：
仪器：BIFLEXⅢ型MALDI-TOF质谱仪(Bruker公司)；
方法：几丁寡糖样品配成10mg/mL的溶液，基质使用2,5-二羟基苯甲酸(DHB)，
分别吸取1μL基质溶液和样品溶液，充分混匀，吸取0.5μL的混合液滴于干净的不
锈钢样品板上，待溶剂自然挥发样品结晶后，进行质谱分析，结果如图2。
由图2中可以得出：所制备的几丁寡糖的聚合度为2-10。
实施例2：几丁寡糖对猪蓝耳病灭活疫苗的佐剂活性测定(一)
将实施例1中的几丁寡糖作为疫苗佐剂，以猪蓝耳病灭活疫苗(PRRSV，
1.6mg/ml)为抗原，二者联用肌肉注射免疫小鼠，测定抗体滴度。具体方法如下：
实验动物：BALB/c小鼠，6-8周龄，6只/组，雌性，购自北京市维通利华实
验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2012-0001。
药物浓度：由上述实施例1中制备的几丁寡糖(COSNAC)：4mg/ml；猪蓝
耳病灭活疫苗(PRRSV)：1.6mg/ml；ISA206(Seppic公司，油佐剂)
对照溶剂：生理盐水(Saline)。
混合后药物浓度：几丁寡糖：2mg/ml；猪蓝耳病灭活疫苗：800μg/ml。
给药剂量：几丁寡糖：200μg/mouse(小鼠)；猪蓝耳病灭活疫苗：80μg/mouse；
ISA206(阳性对照)与猪蓝耳病灭活疫苗1:1等体积混合，31℃搅拌0.5h。
分组：(1)空白对照组：Saline；(2)P组：Saline+PRRSV；(3)COSNAC
组：COSNAC(200μg/mouse)+PRRSV；(4)阳性对照组：ISA206+PRRSV。
注射前等体积混合，100μl/鼠，右后肢肌肉注射。
免疫方案：动物按照免疫分组首次免疫注射后2周，尾静脉取血，测定血清
中抗体滴度。首次免疫后第4周加强免疫，二次免疫后2周小鼠尾静脉取血，测
定血清中抗体滴度。视滴度情况，测定后2周进行第3次免疫。ELASI法测定血
清中抗体滴度。
ELISA法所用试剂配制：
1.抗原包被液：50mmol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6。称取无水Na2CO31.696g，
NaHCO32.856g，加水溶解到1000mL，PH9.6。
2.洗涤液(10×PBST，PH7.4)：称取NaCl80g，KCl2g，Na2HPO429g，
KH2PO42g，Tween-2010mL，加双蒸水至1000ml，调至PH7.4，使用时稀
释10倍即可。
3.封闭液：1％BSA，用50mmol/LPBSPH7.4溶解。
4.底物液A(TMB-过氧化氢溶液)：取3,3`,5,5`-四甲基联苯胺(TMB)
200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水至1000mL。
5.底物液B(0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/LNa2HPO4缓冲液)：Na2HPO424.8g，
柠檬酸19.33g，加双蒸水至1000ML，调节pH至5.0～5.4。
6.底物液：使用时将底物液A和底物液B按1：1，加入30％H2O2至终浓
度0.5％。
7.终止液：2NH2SO4。
PRRSV的N蛋白抗原用抗原包被液稀释至5μg/ml，加入96孔板(Costar)
中，100μl/孔，4℃包被过夜。用PBST洗3次，1％BSA，200μl/孔，37℃封闭1h。
用PBST洗涤3次，小鼠抗血清从1:400开始，用PBST按等倍倍比稀释6个梯
度，100μl/孔加入酶标板，37℃孵育1h。弃去血清样品，PBST洗涤3次，加入
山羊抗小鼠IgG-HRP抗体(PBST1:1000倍稀释)，加入酶标板中，100μl/孔，37℃
孵育1h。弃去二抗，PBST洗涤6次，加入新配置的新鲜TMB底物显色液，100μl/
孔，室温避光显色15min。加入2N硫酸溶液终止显色，50μl/孔，并用酶标仪测
定450nm吸光度(A450)。
实验结果：
以猪蓝耳病灭活疫苗为免疫抗原，几丁寡糖作为佐剂初次免疫即可产生较
高滴度的特异性抗体，如图3所示。经过第二次免疫，几丁寡糖能够促进抗体的
产生，如图4所示。经过第三次免疫，几丁寡糖具有显著的免疫佐剂活性，能够
促进抗体的产生，如图5所示。
实施例3：几丁寡糖对猪蓝耳病灭活疫苗的佐剂活性测定(二)
将实施例1中的几丁寡糖作为疫苗佐剂，以猪蓝耳病灭活疫苗(PRRSV，
1.6mg/ml)为抗原，二者联用肌肉注射免疫小鼠，测定抗体亚型及亚类。具体实
验同实施例2。
动物肌肉注射，初次免疫4周进行2次免疫，2次疫4周进行3次免疫，3次免
疫2周后再测定小鼠血清抗体亚型及亚类。
ELISA法检测血清特异性抗体亚型及亚类实验方法如下：
PRRSV的N蛋白抗原用抗原包被液稀释至5μg/ml，加入96孔板(Costar)
中，100μl/孔，4℃包被过夜。用PBST洗3次，1％BSA，200μl/孔，37℃封闭1h。
用PBST洗涤3次，小鼠抗血清用PBST进行1:400稀释后100μl/孔加入酶标板，
37℃孵育1h。弃去血清样品，PBST洗涤3次，山羊抗小鼠亚类抗体用PBST1:1000
倍稀释后，加入96孔酶标板中，100μl/孔，37℃孵育1h。PBST洗涤，洗涤3次，
HRP标记的兔抗山羊IgG抗体用PBST1:1000倍稀释，加入酶标板中，100μl/孔，37℃
孵育1h。PBST洗涤5次，加入TMB显色底物，100μl/孔，室温避光显色15min。
加入2N硫酸溶液终止显色，50μl/孔，并用酶标仪测定450nm吸光度(A450)。
实验结果：经过第3次免疫，几丁寡糖与ISA206具有相近的免疫佐剂活性，
能够促进抗体的产生，如图6所示，对抗体IgG亚型的产生均有促进作用，特别
对IgG1、IgG2a、IgG2b亚类抗体的产生促进。
实施例4：几丁寡糖对猪蓝耳病灭活疫苗的佐剂活性测定(三)
将实施例1中的几丁寡糖作为疫苗佐剂，以猪蓝耳病灭活疫苗为抗原，二者
联用肌肉注射免疫小鼠，测定小鼠脾脏淋巴细胞及其亚群变化。
实验材料：流式细胞术抗体PerCP-CD3e、APC-CD19、PE-CD4、FITC-CD8a，
购自BD公司；其他同实施例2。
动物肌肉注射，初次免疫4周进行2次免疫，2次疫4周进行3次免疫，3次免
疫2周后再测定小鼠脾脏淋巴细胞及其亚群变化。具体方法如下：
放血处死各实验组小鼠，用酒精浸泡消毒3分钟，在超净台无菌条件下取出脾
脏，放在100目尼龙网筛上，网筛放在盛有10mlRPMI1640培养基的灭菌玻璃培养
皿中，然后用消毒的玻璃注射器针芯研磨脾脏，使其细胞滤过网筛，制成脾细胞悬
液。脾细胞悬液以1000r/min，离心10min，弃上清，加入2mlTris-NH4Cl缓冲液作
用3～5分钟裂解红细胞，再加3ml培养基同上离心洗涤2次，再次重悬细胞，用台
盼蓝染色计数活细胞需在95％以上。在生物显微镜下用WBC计数法进行细胞计数，
将各组脾细胞悬液细胞浓度调整为1×107/ml备用。取流式检测管5支各加入4℃存
放的1％FBS的PBS(洗液)1.0ml，分别标记为1、2、3、4、5。再加入1×107/ml
备用的正常对照组脾淋巴细胞0.1ml，混匀，1000r/min，4℃离心10min，弃掉上清，
向管1加入洗液0.1ml，向管2-5依次加入2.5mg/L的PerCP仓鼠抗小鼠CD3e、5mg/L
的APC大鼠抗小鼠CD19+、1.25mg/L的PE大鼠抗小鼠CD4+和5μg/ml的FITC大
鼠抗小鼠CD8a的单标抗体溶液0.1ml，轻轻混匀。然后每组取平行3支流式检测管，
加入4℃存放的洗液1.0ml，再加入各自实验组备用的1×107/ml的脾淋巴细胞悬液
0.1ml，混匀，1000r/min，4℃离心10min，并弃去上清，加入混合后的标记抗体(用
洗液配成每毫升溶液中含有PerCP-CD3e2.5μg、APC-CD195μg、PE-CD41.25μg、
FITC-CD8a5μg的混合体)溶液0.1ml，轻轻混匀。于室温下避光孵育25min，加入
洗液1.5ml混匀，1000r/min，4℃离心10min，并弃去上清，各管加洗液500μl，将已
标记的细胞样本充分摇匀，在FACScaliber流式细胞分析仪上，计数CD3+和CD19+
细胞的百分率与CD3+中的CD4+和CD8+细胞的百分率(表1)。
表1为流式细胞术检测猪蓝耳病灭活疫苗抗原配伍COSNAC第3次免疫小鼠脾
脏淋巴细胞及其亚群
*与正常对照组(Saline)比较p<0.05，**与正常对照组(Saline)比较p<0.01，***与
正常对照组(Saline)比较p<0.001；#与抗原对照组(Salin+PRRSV)比较p<0.05，##与抗
原对照组(Salin+PRRSV)比较p<0.01，###与抗原对照组(Salin+PRRSV)比较p<0.001；
$与阳性对照组(ISA206)比较p<0.05，$$与阳性对照组(ISA206)比较p<0.01，$$$与
阳性对照组(ISA206)比较p<0.001。
由表1可以看出，COSNAC可显著提高免疫小鼠脾脏淋巴细胞CD4+T细胞和
CD8+T细胞的比例，显著提高CD3+细胞的含量及CD3+/CD19+细胞的比值。
实施例5：几丁寡糖对乙肝疫苗的佐剂活性
将实施例1中的几丁寡糖作为疫苗佐剂，以重组乙型肝炎亚单位疫苗(汉逊
酵母表达HBsAg，大连汉信生物医药有限公司生产)为抗原，二者联用肌肉注射
免疫小鼠，测定抗体滴度。具体实验同实施例2。
给药剂量：几丁寡糖：200μg/mouse(小鼠)；HBsAg：2μg/mouse；铝佐剂(Al)：
200μg/mouse。
实验分组：(1)生理盐水组(Saline)；(2)乙肝亚单位组(Saline+HBsAg)；(3)
COSNAC组：COSNAC(200μg/mouse)+HBsAg；(4)铝佐剂组：Al(200μg/mouse)
+HBsAg。
注射前等体积混合，100μl/鼠，右后肢肌肉注射。
免疫方案：动物肌肉注射，初次免疫2周后ELASI方法测定小鼠血清抗体滴度，
然后进行2次免疫。2次免疫2周后再次测定抗体滴度和亚型及亚类。
ELISA法检测血清特异性抗体亚型及亚类实验方法如下：
HBsAg抗原用抗原包被液稀释至4μg/ml，加入96孔板(Costar)中，100μl/
孔，4℃包被过夜。用PBST洗3次，1％BSA，200μl/孔，37℃封闭1h。用PBST
洗涤3次，小鼠抗血清用PBST进行1:400稀释后100μl/孔加入酶标板，37℃孵
育1h。弃去血清样品，PBST洗涤3次，山羊抗小鼠亚类抗体用PBST1:1000倍稀释
后，加入96孔酶标板中，100μl/孔，37℃孵育1h。PBST洗涤，洗涤3次，HRP标
记的兔抗山羊IgG抗体用PBST1:1000倍稀释，加入酶标板中，100μl/孔，37℃孵育
1h。PBST洗涤5次，加入TMB显色底物，100μl/孔，室温避光显色15min。加入
2N硫酸溶液终止显色，50μl/孔，并用酶标仪测定450nm吸光度(A450)。
实验结果：以重组乙型肝炎亚单位疫苗为免疫抗原，几丁寡糖作为佐剂经过
第二次免疫，几丁寡糖比同等剂量的铝佐剂具有更高的免疫佐剂活性，能够促进
抗体的产生(图7)，对抗体IgG亚型以及IgM的产生均有促进作用，特别对IgG1、
IgG2a、IgG2b亚类抗体的产生促进(图8)。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根
据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发
明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。