一种拟南芥基因RNB的应用技术领域
本发明属于基因技术领域，具体涉及一种拟南芥基因RNB的应用。
背景技术
低温是限制农作物产量的重要环境因素之一，低温胁迫按照温度情况和植物受害情况可以分为两种类型，第一种称冷害，是指温度高于0℃的低温伤害；第二种称为冻害，为温度低于0℃的低温伤害。低温胁迫通过抑制植物基因的表达而影响植物代谢反应，同时冷害会使植物细胞受到渗透胁迫、氧化胁迫。温带作物如冬小麦、油菜具有一定的耐冷性，通过低温驯育可以增加这些作物的抗冷性。但是热带及亚热带的一些作物如水稻、玉米、大豆、棉花、番茄对低温胁迫敏感，并且不具备低温驯育的能力。值得注意的是这些不耐冷的作物是最主要的粮食和经济作物，低温胁迫会造成这些作物减产减收，并影响它们的地理纬度分布。
研究人员在植物中进行遗传筛选和图位克隆发现一组受到低温诱导的基因，这组基因的启动子区域具有多拷贝的DRE/CRT顺式元件，因这些启动子含有CCGAC核心序列，故被命名为CRT结合蛋白（CRT/DRE2bindingfactor，CBFs）又被称为DRE结合蛋白，CRT/DRE结合蛋白由三个基因CBF1、CBF2、CBF3编码。其中CBF1与CBF3基因在低温条件下能够被瞬时诱导，CBF2基因具与CBF1和CBF3基因不同的功能，能够负调控CBF1和CBF3基因。在拟南芥中过表达CBF3基因会提高脯氨酸及还原性糖含量，因此会提高植物的耐冷性。
对植物耐冷相关的CBF基因的上下游调控网络已有一些报道，ICE1是一个MYC型的碱性螺旋-环-螺旋转录因子，能够结合CBF3基因启动子区域，ICE1基因对CBF3基因在低温下诱导表达非常重要。ice1突变体在低温胁迫时，其CBF3基因表达水平较野生型低，同时该突变体对低温胁迫敏感。MYB15基因编码R2R3类型的MYB转录因子，MYB15蛋白能够和ICE1结合，在低温胁迫条件下负调控CBF基因。myb15突变体在低温胁迫条件下，其CBFs基因表达量较野生型植株高，myb15突变体具有一定的耐冷性。过表达MYB15基因会使植株在低温情况下CBFs的表达水平降低，同时也使植物对低温敏感。HOS1基因编码一个RINGfingerE3泛素连接酶，HOS1基因能够负调控CBF2和CBF3基因。SENSITIVETOFREEZING6是核定位蛋白，位于CBF基因下游参与拟南芥的低温驯育过程，该基因突变后植物耐冷性降低，并且冷诱导基因表达量下降，这些基因组成了植物经典的CBF-COR-ICE路径。另外研究表明乙烯信号路径可以通过使CBFs基因表达下调来负调控植物的抗冷性。
研究表明mRNA加工过程的某些组分也参与植物对冷害的响应。RNA能够发生折叠，从而形成不同的二级结构；低温胁迫能够影响RNA折叠形成二级结构，而不同形式的二级结构能够影响RNA的转录。例如细菌中的nucleic-acid-bindingcoldshockproteins(CSPs)能够被低温诱导，该基因能够通过改变RNA二级结构的稳定性来调控RNA的转录。DEAD-boxRNAhelicase作为RNA分子伴侣能够参与到RNA合成的所有过程中，拟南芥中LOWEXPRESSIONOFOSMOTICALLYRESPONSIVEGENES4(LOS4)编码一个DEAD-boxRNAhelicase，功能分析表明该基因具有把RNA从细胞核运输到细胞质的功能，该基因突变后植物对低温敏感。拟南芥AtNUP160/SUPPRESSOROFAUXINRESISTANCE1(SAR1)同LOS4一样具有将RNA从细胞核运输到细胞质的功能，如果该基因缺失，植物将会对低温敏感。拟南芥中STABILIZED1(STA1)是一个RNA剪切（splicingfactor）基因，该基因能够被低温诱导，STA1基因发生突变会造成其靶mRNA在低温条件下的转录过程发生剪切错误，sta1突变体同样表现出低温敏感的表型，说明pre-mRNA的剪切对植物适应低温胁迫具有极其重要的作用，这种低温胁迫和RNA之间的复杂关系正是需要我们去认识和研究的内容。
发明内容
本发明的目的在于提供一种拟南芥基因RNB的应用。
本发明的目的是这样实现的，所述的拟南芥基因RNB在改变植物RNA的剪切中的应用，使植物对低温胁迫敏感。
本发明公开了一种拟南芥基因RNB在植物抗冷方面的应用。本发明筛选得到了对低温迫敏感的拟南芥突变体rnb，分离得到了RNB基因；实验表明：拟南芥RNB基因定位于植物叶绿体，参与植物RNA的剪切，影响叶绿体的合成，通过改变植物RNA的剪切，使植物对低温胁迫敏感。RNB基因的功能的分析和鉴定为获得抗低温胁迫植物新品种提供了理论和方法的基础。
所述的拟南芥基因RNB在Genebank中的编号为AT1G70200，该基因的CDS长度为1617bp，编码538个氨基酸的蛋白，该蛋白为一个RNA结合蛋白，RNB蛋白主要分布在叶绿体中，RNB蛋白能够影响RNA的剪切。
本发明通过筛选拟南芥突变体获得对低温敏感的突变体SALK_012657C，从tair订购SALK_041100作为第二个allele进行验证，发现具有相同的低温胁迫敏感表型。采用组织定位和GFP融合蛋白的细胞定位方法，分析RNB基因的细胞表达特性。
本发明利用遗传筛选得出了获得了对低温胁迫敏感的拟南芥突变体，通过亚细胞定位，测量叶绿体含量，Northern杂交，发现rnb基因突变后会影响mRNA的剪切，调节植物的抗冷能力。
本发明编号为AT1G70200的RNB(RNAbinding)基因编码一个RNA结合蛋白，主要定位在叶绿体内，该基因参与植物叶绿体合成，在低温胁迫的情况维持叶绿体内RNA的剪切的稳定性。该基因在植物的茎、叶、花、果夹中表达，在根中没有表达。在低温条件下rnb突变体中叶绿体RNA转录受到影响。本发明通过对RNB基因的分离和基因能功能的分析鉴定，确立了RNB基因在植物抗低温胁迫中的作用及其调节机制，为培育抗低温胁迫的转基因作物新品种奠定了理论和生产实践基础。
本发明从拟南芥低温胁迫敏感突变体中得到能够调节植物抗低温胁迫反应的基因RNB，为获得抗低温胁迫作物新品系提供了遗传学材料和基础。
本发明通过筛选拟南芥突变体，筛选得到了对低温胁迫敏感的拟南芥突变体rnb，分离得到了RNB基因；实验表明：拟南芥RNB基因参与拟南芥叶绿体的合成，通过影响叶绿体内RNA的转录及剪切，调节提高植物的抗低温胁迫反应。RNB基因的功能的分析和鉴定为获得抗低温胁迫植物新品种提供了理论和方法的基础。
附图说明
图1突变植株在4℃条件下发育表型；
图2RNB基因注释信息和表达情况，ARNB基因及突变体注释信息，BRNB基因在突变体中表达情况；
图3RNB基因为一个RNA结合蛋白；
图4RNB基因在不同物种中聚类分析；
图5RNB基因在不同物种中聚类分析组织特异性表达，AGUS染色结果，BRT-PCR结果；
图6RNB基因亚细胞定位；
图7RNB基因对植物叶绿体合成的影响；
图8RNB基因对植物叶绿体RNA转录的影响。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的拟南芥基因RNB的应用为所述的拟南芥基因RNB在改变植物RNA的剪切中的应用，使植物对低温胁迫敏感。
本发明公开了一种拟南芥基因RNB在植物抗冷方面的应用。本发明筛选得到了对低温迫敏感的拟南芥突变体rnb，分离得到了RNB基因；实验表明：拟南芥RNB基因定位于植物叶绿体，参与植物RNA的剪切，影响叶绿体的合成，通过改变植物RNA的剪切，使植物对低温胁迫敏感。RNB基因的功能的分析和鉴定为获得抗低温胁迫植物新品种提供了理论和方法的基础。
所述的拟南芥基因RNB在Genebank中的编号为AT1G70200，该基因的CDS长度为1617bp，编码538个氨基酸的蛋白，该蛋白为一个RNA结合蛋白，RNB蛋白主要分布在叶绿体中，RNB蛋白能够影响RNA的剪切。
本发明通过筛选拟南芥突变体获得对低温敏感的突变体SALK_012657C，从tair订购SALK_041100作为第二个allele进行验证，发现具有相同的低温胁迫敏感表型。采用组织定位和GFP融合蛋白的细胞定位方法，分析RNB基因的细胞表达特性。
本发明利用遗传筛选得出了获得了对低温胁迫敏感的拟南芥突变体，通过亚细胞定位，测量叶绿体含量，Northern杂交，发现rnb基因突变后会影响mRNA的剪切，调节植物的抗冷能力。
本发明编号为AT1G70200的RNB(RNAbinding)基因编码一个RNA结合蛋白，主要定位在叶绿体内，该基因参与植物叶绿体合成，在低温胁迫的情况维持叶绿体内RNA的剪切的稳定性。该基因在植物的茎、叶、花、果夹中表达，在根中没有表达。在低温条件下rnb突变体中叶绿体RNA转录受到影响。本发明通过对RNB基因的分离和基因能功能的分析鉴定，确立了RNB基因在植物抗低温胁迫中的作用及其调节机制，为培育抗低温胁迫的转基因作物新品种奠定了理论和生产实践基础。
本发明从拟南芥低温胁迫敏感突变体中得到能够调节植物抗低温胁迫反应的基因RNB，为获得抗低温胁迫作物新品系提供了遗传学材料和基础。
本发明通过筛选拟南芥突变体，筛选得到了对低温胁迫敏感的拟南芥突变体rnb，分离得到了RNB基因；实验表明：拟南芥RNB基因参与拟南芥叶绿体的合成，通过影响叶绿体内RNA的转录及剪切，调节提高植物的抗低温胁迫反应。RNB基因的功能的分析和鉴定为获得抗低温胁迫植物新品种提供了理论和方法的基础。
下面以实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
低温胁迫突变体的筛选
如图1所示，低温胁迫条件下，对拟南芥T-DNA插入突变体进项筛选，得到对低温胁迫敏感的突变体SALK_041100C，我们将突变体分别命名为RNB(RNAbinding)。通过第二个alleleSANL_012657验证已经确定RNB基因参与植物耐冷过程。野生型植株和突变体植株的两个allele及RNA干扰植株在22℃情况下长势相同，说明该基因突变不会影响植物的正常生长发育过程。当野生型植株在经过低温胁迫处理6周后生长正常，而两个突变体植株及RNA干扰植株在经过6周的低温胁迫后新叶变黄，显示突变体及RNA干扰植株对低温胁迫敏感。
实施例2
RNB基因及突变体注释信息基因在突变体中表达情况。
在TAIR网站上寻找到两个突变体allele对应的T-DNA插入位点，两个T-DNA插入均位于基因的外显子区段图2A所示。我们设计相应的引物进行RT-PCR检验，以便确定T-DNA插入对基因表达的影响，两对引物所处位置如图2B所示。RT-PCR结果显示rnb-1及rnb-2均为RNB基因敲除突变体。
RNB基因的体内表达和定位分析
从拟南芥基因组中利用PCR扩增分离得到的RNB基因的启动子区序列和CDS序列，克隆得到GUS报告载体和GFP细胞定位载体，转化拟南芥植株并获得转基因阳性植株。GUS组织化学染色和荧光定位分析表明，RNB主要分布在除根以外的所有组织器官中，同时该基因对应的蛋白主要定位在叶绿体中。这可能与该基因控制叶绿体的合成相关。
实施例3
RNB基因的功能分析
如图7所示，在22℃条件下，RNB两个突变体的叶绿素a、叶绿素b及棕叶绿素的含量都要比野生型低，说明该基因参与到叶绿体的合成过程。
如图8所示Northern结果表明在室温22℃的情况下野生型和两个突变体的叶绿体ndhF及psbBRNA转录没有受到影响，在4℃条件下突变体的ndhF及psbBRNA转录水平较野生型明显降低。说明RNB基因在冷害的条件下能够影响叶绿体RNA的转录。