一种可复性梗阻性黄疸大鼠模型的建立方法技术领域
本发明提供了一种医学动物模型的建立方法，具体为一种可复性梗阻性黄疸大鼠模型的建立方法。
背景技术
梗阻性黄疸(obstructivejaundice，简称OJ)是由于肝内外胆管完全或不完全梗阻引起胆汁引流障碍而出现全身病理生理改变的一类临床常见疾病。常见的原因有肿瘤、结石、炎症、狭窄等。通过手术或内镜方法解除梗阻、畅通引流是梗阻性黄疸最根本的治疗措施。梗阻性黄疸时肠黏膜上皮结构的完整性遭到严重破坏，肠粘膜通透性增高。肠黏膜通透性的改变是发生细菌移位及内毒素血症的形态学基础。肠粘膜屏障功能已经成为判断梗阻性黄疸病人预后的重要参考指标，肠道不但是多脏器功能障碍发生的靶器官，更是MODS（多器官功能障碍综合症）的“启动器”。关于梗阻性黄疸与肠粘膜屏障的研究也已经成为临床医学研究的重要领域。
建立动物模型是实验研究的重要手段，并且模型设计方案的优劣直接关系到最终实验结论的准确性。文献报道有多种建立OJ模型的方法，主要分为传统OJ模型和可复性梗阻性黄疸模型。传统OJ模型与临床上大多OJ疾病的症状表现不甚相符，而关于可复性梗阻性黄疸模型的研究相对较少。且这些方法均不能很好地契合临床梗阻性黄疸疾病的发生及发展过程。
大量研究发现，OJ引起的肠黏膜通透性增加是促使细菌移位和内毒素血症的重要因素。肝内外胆管的阻塞主要影响肠上皮细胞和紧密连接的正常结构和功能，继而由于肠腔内胆汁量的减少导致肠黏膜细胞增殖下降和细胞凋亡增加也是引起肠屏障功能障碍的重要原因，此外还伴有多种炎症介质和细胞因子的产生，若不及时治疗易引起一系列全身病理生理改变，严重者出现MODS。由于胆管阻塞引起的OJ对机体的损害在一定程度上是可逆的，当解除胆管梗阻的因素后，肝脏等器官能够恢复到接近正常的组织学结构或原来的生物学功能，因此在临床上对于绝大多数胆管梗阻引起的OJ的治疗首选手术或内镜解除梗阻畅通引流，后期由于黄疸引起的症状或并发症在一定程度上也会得到相应的缓解或治愈。
传统的OJ大鼠模型的建立都是将胆管直接结扎，以阻断胆汁的排泄导致胆红素迅速入血，这是一种急性梗阻的黄疸模型，并在基础实验中被广泛使用，而在临床上OJ的进展基本都是呈慢性渐进性过程，并且随着社会的进步和医疗水平的提高，很多黄疸患者在发病初期即OJ早期就会及时就诊，采取相应的措施进行治疗。因此经典的胆管结扎黄疸模型已经不能满足目前对OJ研究的需求，也不能很好地反映临床常见黄疸疾病的发生及发展过程。基于这一问题，我们设想建立一种可复性梗阻性黄疸大鼠动物模型以更好的模拟临床OJ疾病的病理生理演变过程。
文献报道中已有多种实现OJ逐渐发生或梗阻再通的方法，主要分为悬吊胆管或胆汁内外引流，但是这些方案都存在着一些不足和问题。电凝烧灼胆管或肝门接种瘤株的方式是一种慢性渐进性或恶性胆管梗阻的良好模型，研究部分阻断胆管的方法是一种胆汁淤积的急性模型，通过给予狗胆管壁内注射稀释的甲醛溶液建立的是难治性黄疸的动物模型，这些与完全性胆管结扎模型没有根本的区别，但是其引起的肝功能的损伤相对较轻。采用慢性OJ模型，通过在胆管内置入经碘仿纱布处理的规格为6-0的VICRYL可吸收线，较好地呈现了某些壶腹部肿瘤压迫胆管引起的波动性黄疸，但不具可恢复性，虽然一段时间后胆红素水平表现为轻度降低，但是仍然与正常大鼠的胆红素水平有较大的差距。通过胆汁外引流的方式建立的黄疸模型，一方面在实施过程中存在胆管过细插管困难的问题，另外这种模型与临床患者相比，并不符合我们胆汁再通的目的，其实质是胆汁外引流达到减黄的作用。通过插管或胆肠吻合实现胆汁内引流的手术方式存在二次手术的风险，严重影响实验正常进行及动物的术后生存率；其次在大鼠胆管结扎一段时间后，胆管扩张明显，胆管壁菲薄，存在插管困难及刺破胆管壁的可能，也大大降低了模型的可操作性。通过纵行剖开长约0.5cm的静脉留置针套管，将其附着于胆总管之上，然后用丝线将其结扎，再次切断线结达到通畅胆管引流目的建立的模型，一定程度上有效保护了胆管，但也同样存在二次开腹的问题。通过悬吊胆总管而建立的黄疸模型虽具有一定的可复性，但是由于受动物体位或活动的影响，其悬吊胶管的紧张度不易控制。通过丝线悬吊大鼠胆总管实现胆管梗阻-再通的实验方法也存在同样的问题。通过可吸收线结扎胆管，3周后大鼠的肝功能及胆红素水平较对照组有明显缓解，不施加任何干预即可解除梗阻，其操作方法简便，但由于受动物个体差异的影响及其梗阻引起的黄疸过程过长，并发症相应增多。用止血钳钳夹胆总管形成的兔可逆型梗阻性黄疸模型在钳夹动物胆管的程度不易量化，并且OJ和再通的程度也因动物个体差异而影响模型的稳定性。在健康版纳猪经胆囊内用foley导尿管将胆道取石球囊由胆囊管送入胆总管，通过控制球囊的空虚间接达到胆道梗阻和再通的目的，这种方法科学且合理，但是因为大鼠无胆囊其胆管且直径仅约0.3cm，无法达到上述目的，操作性差，耗费较高。总之，这些模型的主要问题是:(1)不符合临床上OJ发生发展的过程;(2)术后全身并发症多、死亡率高;(3)手术操作过程相对比较复杂、困难。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种可复性梗阻性黄疸大鼠模型的建立方法，以更贴切地模拟临床梗阻性黄疸疾病的病理和生理演变过程。
本发明是这样实现的，一种可复性梗阻性黄疸大鼠模型的建立方法，所述的建立方法如下：
a，实验动物的选择：
选择无特定病原体(specificpathogenfree,SPF)的♂Wistar大鼠为实验动物，该大鼠由山东鲁抗医疗股份有限公司供应，质量许可证号：SCXK鲁20130001，2.5～3月龄，体质量280～330g；置于温度22～26℃、湿度40%～70%，12小时白-黑周期的安静、通风环境中，分笼喂养，自由进食及饮水，饲养7～14天；
b，可复性梗阻性黄疸模型的建立：
(1)大鼠于手术前禁食12小时，自由饮水，称质量后以质量百分比浓度为10%的水合氯醛行腹腔注射麻醉，水合氯醛的用量为每100g大鼠体质量用0.3mL；
(2)将大鼠固定在超净工作台上，上腹部剑突以下上腹部常规备皮，无菌条件下以稀碘伏及酒精棉球分别消毒术区3遍；
(3)取剑突下、脐上腹部正中纵行手术切口入腹，切口长度为2～2.5cm，自十二指肠与胆管交汇处找到胆管，进一步显露肝门及门静脉，游离胆管至肝门，在胆管远端距肝门1.0cm处，以规格为3-0的不可吸收聚丙烯缝线将胆管与规格为4F的经外周静脉置入的中心静脉导管一并三叠结结扎，力度适中，以聚丙烯缝线结扎后所形成的线圈将胆管正好闭合为度；
(4)用复尔凯空肠造口包内的穿刺套管针，自切口下缘经腹部皮下隧道至左下腹部穿出，拔出针芯，用经外周静脉置入的中心静脉导管近小肠端导入上述套管针，该套管针自切口下部引出潜行至左下腹部，以规格为2-0的慕丝线将经外周静脉置入的中心静脉导管末端固定在皮下，关闭切口完成包埋，经外周静脉置入的中心静脉导管的肝门端游离于腹腔；
(5)实验动物术中腹腔注射5万单位青霉素预防感染，依次双层关腹，术后5小时进水，20小时进食，术后置于温度22～26℃、湿度40%～70%，12小时白-黑周期的安静、通风环境中，分笼喂养；
(6)大鼠术后第5天，首先以碘伏、酒精消毒左下腹部皮肤，自左下腹部切口打开皮下，拆除固定经外周静脉置入的中心静脉导管末端的缝线，以血管钳夹住导管末端轻轻向外拔出经外周静脉置入的中心静脉导管，完成胆管再通，以无菌敷贴覆盖拔管切口，牢固固定，完成可复性梗阻性黄疸大鼠模型的建立。
上述可复性梗阻性黄疸大鼠模型的建立方法，先用一支撑物与大鼠胆管并行并结扎胆管和支撑物，数天后拔出支撑物，解除对胆管的压迫使其恢复正常，重新形成通畅的胆汁引流。其优点是，制作的可复性黄疸模型与传统的OJ模型相比，更加贴近OJ的临床发展过程和治疗过程，更加符合OJ研究的需要。模型制作简便，解除黄疸不需二次开腹手术，创伤小，成功率高、死亡率低，是一种稳定可靠的可复性梗阻性黄疸大鼠模型。该模型的建立为研究OJ对肠黏膜损害相关问题提供了一种新的途径和手段。
附图说明
图1是大鼠术前麻醉、备皮及消毒的示意图。
图2是大鼠皮下隧道建立的示意图。
图3是大鼠胆管及经外周静脉置入的中心静脉导管，用不可吸收聚丙烯缝线三叠结结扎的示意图。
图4是拔出经外周静脉置入的中心静脉导管，完成胆管再通的示意图。
图5是用慕丝线结扎胆管的示意图。
图6是双层关腹的示意图。
图7是可复性梗阻性黄疸大鼠模型建立模式的第一个示意图。
图8是可复性梗阻性黄疸大鼠模型建立模式的第二个示意图。
图9是ROJ组术后第5天的黄疸情况示意图。
图10是ROJ组术后第8天的黄疸情况示意图。
图11是ROJ组术后第5天胆管扩张情况示意图。
图12是ROJ组术后第8天胆管扩张情况示意图。
图13是ROJ组和OJ组大鼠总胆红素水平变化示意图。
图14是ROJ组和OJ组大鼠谷丙转氨酶与碱性磷酸酶水平变化示意图。
图15是ROJ5组肠黏膜形态改变示意图。
图16是ROJ5组肠黏膜形态改变示意图。
图17是ROJ8组肠黏膜形态改变示意图。
图18是OJ8组肠黏膜形态改变示意图。
具体实施方式
下面进一步说明本发明。
经外周静脉置入的中心静脉导管的简称为PICC导管。
可复性梗阻性黄疸大鼠模型建立后，可进行有关指标的观测和评估。
研究对象及分组:SPF♂Wistar大鼠32只在标准条件下适应性喂养2周，采用随机数字表法将实验大鼠分成2组:可复性梗阻性黄疸模型试验组(ROJ组)和传统梗阻性黄疸模型对照组(OJ组)，每组16只。
动物模型的建立:可复性梗阻性黄疸模型试验组(ROJ组)，采用上述建立方法建立。传统梗阻性黄疸模型对照组(OJ组)的建立方法为，游离胆管至肝门，以规格为3-0的单慕丝线结扎。
所有动物术中腹腔注射5万单位青霉素预防感染，依次双层关腹。两组大鼠分别于术后5天和8天各处死8只，分别标记为ROJ5组、ROJ8组、OJ5组和OJ8组。放血法处死，剖腹探查观察胆管梗阻情况，并取标本。术后5小时进水，20小时进食，所有动物置于相同的上述饲养条件下单笼饲养。ROJ组大鼠术后第5天，自左下腹部切口打开皮下轻轻拔出经外周静脉置入的中心静脉导管，完成胆管再通。
观测指标:
一般情况及血液生化分析:术后观察动物的活动状态，进食及黄疸出现的时间及变化，体质量的变化及动物死亡数量。每只大鼠于术前、术后第5天(拔管前)、第6天、第8天分别采血测定血清胆红素水平，除开腹时自下腔静脉采血外，其余均采用断尾取血约2.0mL。所取血样均在室温下3000r/min离心15分钟，取1.0mL血清用EP管保存。应用美国BeckmanCoulter全自动生化分析仪行血清总胆红素(totalbilirubin，TBIL)、谷丙转氨酶(alanineaminotransferase，ALT)、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)生化指标检查。
肠黏膜石蜡切片HE染色及观察:取小肠黏膜标本制作石蜡切片，经苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察大鼠肠黏膜组织形态学变化。应用Motic医学图像分析系统(MMD6.0A)分别测定肠绒毛的垂直高度及隐窝的深度。小肠绒毛高度的计算为肠上皮绒毛尖端至绒毛基底部的垂直距离，隐窝深度为小肠腺基底部至两绒毛之间基底开口处的垂直距离。每个视野取连续取5个100倍视野下排列的小肠绒毛高度和隐窝深度，测量后计算其平均值。
黏膜损伤指数评估:石蜡切片HE染色后光镜下根据肠黏膜损伤分级进行肠黏膜损伤程度的评估。评分标准:0级为正常肠黏膜绒毛;1级为绒毛顶端上皮下间隙增大伴毛细血管充血;2级为绒毛顶端上皮下间隙进一步增加，伴有中等程度上皮层从黏膜固有层分离;3级为大量上皮层从绒毛侧面分离并伴有有少量绒毛脱落;4级为大片绒毛脱落和固有膜裸露，合并暴露的毛细血管，固有层细胞结构增多较为显著;5级为固有层的消化、分解，合并有出血和溃疡改变。
统计学处理：采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示。采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
ROJ组及OJ组分别于术后第4、6天各死亡1只，死因为术后肠梗阻及肠坏死。实验大鼠术后1-2小时大鼠能够自主活动，术后1-3天体质量有明显的下降趋势，ROJ组拔管后体质量增加明显。实验动物术后活动明显受限，神志较差，ROJ组拔管后有明显好转。肉眼观大鼠胆管结扎术后第1天即出现轻度黄疸，以耳朵及皮毛为著，呈进行性加重，术后第3天黄染程度较高，伴有豆油色尿及白色稀便，ROJ组大鼠拔管后黄疸逐步减退，术后1周未见明显黄疸。术后第5天解剖大鼠发现胆管结扎部位以上扩张明显，直径约8.0-10.0mm，呈半透明囊状。ROJ组大鼠术后第8天发现胆管未见明显扩张，OJ组扩张更明显。
肝功能变化情况：ROJ组和OJ组动物术后血清TBIL水平均有升高，术后第5天测得值最高，之后逐渐降低，术后1周略高于正常。ALT及ALP水平变化趋势基本与胆红素变化相同。
光镜观察小肠黏膜形态学变化：ROJ5组和OJ5组实验大鼠小肠绒毛高柱状结构排列轻度紊乱，黏膜腺体较稀疏，少量可见中性粒细胞浸润和间质轻度水肿。ROJ8组大鼠小肠黏膜结构基本完整、连续，小肠绒毛高柱状结构可见，排列不整齐，隐窝间隙轻度增宽，腺细胞结构欠规整。OJ8组小肠黏膜结构重度紊乱，小肠绒毛高柱状结构不可见，大量中性粒细胞及炎细胞浸润，间质及黏膜固有层局部充血、水肿较重，可见血管结构破坏。
表1实验大鼠小肠黏膜损伤程度、绒毛高度与隐窝深度的比较(mean±SD)
bP<0.01vsROJ8。
可复性梗阻性黄疸模型试验组(ROJ组)与传统梗阻性黄疸模型对照组(OJ组)相比，在模型建立后5天血TBIL、ALT和ALP变化规律相似，各时间点两者肝功能指标不存在差异，提示改进的可复性阻塞性黄疽模型肝功能指标与传统模型相似，表明OJ模型建立成功。传统梗阻性黄疸模型对肠黏膜损害较重且呈急性进展，可复性梗阻性黄疸模型取出经外周静脉置入的中心静脉导管3天后，血TBIL、ALT和ALP迅速恢复，肠黏膜损害也较前明显减轻，说明拔出支撑管后胆总管的通畅性得到一定程度的恢复，在对肠黏膜损害的进展与临床更为接近。如表1所示，本实验中ROJ5组与OJ5组在肠黏膜损伤指数的比较上没有明显统计学意义，但是在梗阻因素解除后术后第8天ROJ8与OJ8的肠黏膜损伤程度有明显统计学意义，这一实验结果与临床患者行胆总管切开取石、胆肠吻合手术后的机体变化一致性更高，为临床上胆道再通术后一系列问题的研究提供了良好条件。