本发明涉及一种新的大分子肽类抗肿瘤抗生素的制造方法。 C-1027抗生素是在筛选抗肿瘤抗生素的过程中，从近2000株放线菌的发酵液中，用精原细胞检测出的，不仅具有较强的抗瘤活性，而且还有抗革兰氏阳性细菌及抗革兰氏阴性细菌的作用，但无抗真菌作用。本发明涉及的C-1027抗生素，经检测和查阅现有的技术资料，均未发现有过报导，故可确定为一新的化合物。
本发明的目的是为提供一个具有较好抗肿瘤作用的新抗生素，以解决目前临床使用的抗肿瘤抗生素品种不足或疗效欠佳的问题。
本发明的要点是由具有产生C-1027能力的菌株（下称C-1027产生菌）在适当条件下进行培养，从培养液中分离、提取得到该物质。
用于制造C-1027的产生菌是链霉菌属菌株C-1027，可用Streptomyces globisporus var.qianjiangensis n.var.C-1027来表示。此菌株是从中国湖北省潜江县土壤分离得到的，（原日本专利说明书中误写为“中国云南土壤”），并以CGMCC NO 0135号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该菌株地微rz物学性质如下：
形态特征：
C-1027菌株的孢子丝直至波曲（图1），成熟的孢子链每链10至30个或更多的孢子，孢子柱形，表面光滑（图2）。
培养特征：
C-1027菌株在各种合成的或有机的培养基上形成白色至淡黄的气生菌丝，往往带有微褐或淡肉桂色色彩。
基内菌丝一般无色或乳脂淡黄，浅黄灰或浅灰黄，没有特定的颜色。
在所试验的培养基上不产生可溶性色素。C-1027的培养特征详见表1。
C-1027的生理特征见表2。
C-1027的碳原利用谱见表3。
C-1027菌株的全细胞水解产物含有LL-二氨基庚二酸和葡萄糖、核糖。
表1 C-1027菌株的培养特征
培养基 生长 气生菌丝体 基内菌丝体 可溶性色素
ISP NO2 丰茂 象牙黄至黄灰或淡橄榄软皮黄 浅软皮黄 无或浅黄
ISP NO3 适度 浅黄白至淡橄榄软皮黄 无色或乳脂 无
ISP NO3 适度 浅黄白至淡橄榄软皮黄 无色或乳脂 无
ISP NO5 丰茂 浅黄灰或淡橄榄软皮黄 无色或乳脂 无
ISP NO6 薄 白至浅黄色 浅黄 无
ISP NO7 丰茂 浅黄灰或淡橄榄软皮黄 无色或浅灰黄 无
察氏琼脂（蔗糖） 薄 浅黄白至淡橄榄软皮黄 无色 无
察氏琼脂（葡萄糖）丰茂 浅黄白至淡橄榄软皮黄 无色或乳脂 无
高氏1号琼脂 丰茂 浅黄灰或淡橄榄软皮黄 无色或浅黄灰 无
葡萄糖天门冬素琼脂 适度 浅黄灰或淡橄榄软皮黄 无色 无
Bennetts 琼脂 适度 白至浅黄灰 浅黄 浅黄或无
马铃薯琼脂 丰茂 淡橄榄软皮黄 无色至橄榄软皮黄 无
表2 C-1027菌株的生理特性
观察项目 特征
黑色素产生
ISP NO1 培养基 阴性
ISP NO6 培养基 阴性
ISP NO7 培养基 阴性
H2S的产生 阳性
明胶液化 阳性
牛乳：凝固 阳性
胨化 阳性
硝酸还原 阳性
生长的温度（ISP NO2培养基）
28-32℃ 丰茂，生长迅速，
37℃ 适度，慢
45℃ 不生长
表3 C-1027菌株的碳源利用谱
碳源 生长
L-阿拉伯糖 ++++
D-木糖 +++
D-葡萄糖 +++
D-果糖 ++++
蔗糖 -
肌醇 -
L-鼠李糖 ++++
D-甘露醇 ++++
D-半乳糖 ++++
乳糖 -
纤维素 -
卫茅醇 -
水杨苷 +
棉籽糖 -
基于形态、培养、生理生化、胞壁分析等特征的研究结果表明，C-1027菌株应属于链霉菌属的球孢类群。与球孢链霉菌Streptomyces globispous和西唐氏链霉菌Streptomyces setonii都很相似。经过在同样培养条件下比较结果表明，C-1027菌株与球孢链霉菌更接近但仍存在三点差异，故将C-1027菌株定名为球孢链霉菌潜江变种Stretomyces globisporus var qianjiangensis n.var.（日本专利说明书定为Streptomyces setonii C-1027西唐化链霉菌C-1027）
本发明的C-1027物质可用上述C-1027菌株，在适宜的条件下进行培养、制造，通常宜在需氧环境下进行振荡、通气、搅拌培养。
C-1027产生菌所使用的培养基，以含有该菌可利用的营养物质的培养基为好，各种合成、半合成或天然培养基均可使用。培养基组成的碳源有葡萄糖、果糖、甘油、湖精、淀粉、糖密、玉米浆、有机酸等，可以单度使用或组合使用。氮源有蛋白胨、肉膏、酵母膏、大豆粉、干酪素、氨基酸、尿素等有机氮源以及硝酸钠、硫酸铵等无机氮源，可以单独使用或组合使用。还可在培养基中视其需要适当添加钠盐、钾盐、镁盐、磷酸盐及其它重金属盐类。
培养过程中产生泡沫，可添加大豆油、亚麻仁油及十八醇、十四醇、十七烷醇等高级醇类或各种硅化物等消沫剂。
培养基的PH以中性为好，培养温度在20-37℃范围，最佳温度27-30℃。培养时间一般在2-5天之间。按上述培养条件进行培养，可不断积蓄出C-1027物质。上述各种培养条件，可视所用微生物的种类、特性及各种外部条件适当改变，也可从上述范围内，调整选择最适条件。
由上述培养产生的C-1027物质，其分离提取可采用一般提取发酵产物的方法进行，如盐析、疏水性层析、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤层析等，可单独或任意组合的方式进行。
分离提取方法是：将存在于培养液中的C-1027物质，首先过滤、离心，使滤液与菌丝体分开。取滤液加硫酸铵盐析，然后将含有C-1027的沉淀物离心分离或加助滤粉过滤。为了利于沉淀，可以加硫酸铁、三氯化铁、硫酸铝等沉淀剂。如因添加沉淀剂使溶液PH发生较大变化，可先加入碳酸钠、碳酸钾、磷酸二氢钠等中和剂，使PH保持在5-8之间，上述盐析过程可反复进行。
以上所述的沉淀物，溶于水或适当的缓冲液如Tris-盐酸缓冲液、磷酸缓冲液等，再用cellophane膜，限外滤过膜等脱盐后，进一步精制。精制可用Dowex.1 Amberlite IRA-400等强碱性离子交换树脂，Amberlite IR-45、DEAE-cellulose等弱碱性离子交换树脂、助滤粉、Hydroxy磷灰石等吸附剂，将C-1027水溶液通过进行吸附，然后再洗脱，可除去杂质。洗脱液经过离子交换树脂Sephadex和Cellulose吸附，用Nacl水溶液、Tris-盐酸缓冲液、磷酸缓冲液等洗脱。该洗脱液经限外过滤浓缩后，再经Sephadex G-50，G-75等凝胶过滤精制，最好得到纯品，所含低分子盐类，可经过Sephadex G-25层析，限外过滤、透析等手段除去。用上述各种层析法反复进行，将更有利于除去杂质。
采用上述各种精制法及其组合所得到的C-1027精制液冷冻干燥后，可得到C-1027白色粉末。
本发明所得的C-1027为单一物质，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单一带、Sephadex G-50柱层析显示对称单一峰、TSK-gel G-2000SW高效液相色谱为单一峰、LKB等电点电泳呈单一带，均可得到证实。
C-1027物质的理化性质如下：
性状：白色粉末
溶解性：易溶于水，不溶于甲醇、丙酮、醋酸乙酯等有机溶媒。
紫外吸收光谱：在水、0.01N Hcl、0.01N NaOH中测定的结果分别如图3中的曲线1、2、3所示，从图中可观察到，在中性、酸性水溶液中270-275、350-360nm，在碱性溶液中270-275、340-345nm处有最大吸收值。
红外吸收光谱：以KBr片测定结果，如图4所示，主要吸收在3300、1640、1530cm-1处。
熔点：无明确熔点R分解点，在发泡中漫漫变褐、变黑，260℃完全炭化。
呈色反应：茚三酮、双缩脲、Folin-Lowry反应阳性，蒽酮、苯胺一邻苯二甲酸反应阴性。
等电点：PH 3.5-3.7
酸碱性：酸性
元素分析：C45.22%、H6.65%、N14.03%
分子量：利用TSK gelG-2000SW高效凝胶过滤色谱法及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法计算出分子量约为15，000。
氨基酸组成：6NHCl，110℃水解20小时，测定所含氨基酸结果见表4。检出其所含氨基酸有：天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸、亮氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、而半胱氨酸是以S-磺酸半胱氨酸形成，色氨酸是在NaOH水解后被检出的。
N-末端氨基酸：根据DNP法检出N-末端氨基酸为丙氨酸。
表4 C-1027氨基酸组
氨基酸 重量% 氨基酸 重量% 氨基酸 重量%
天冬氨酸 6.16 苏氨酸 6.27 丝氨酸 8.97
谷氨酸 4.74 脯氨酸 4.96 甘氨酸 6.41
丙氨酸 9.36 胱氨酸 1.90 缬氨酸 6.85
蛋氨酸 0 异亮氨酸 0.76 亮氨酸 3.76
色氨酸 0 酪氨酸 2.76 苯丙氨酸 4.78
组氨酸 1.19 赖氨酸 1.10 精氨酸 1.14
本发明的生物活性表明：C-1027物质对革兰氏阳性细菌生长有较强的抑制作用，其抗菌谱如表5所示。C-1027物质还具有明显的抗瘤活性，体外试验作用很强。用克隆生成测定法检查，对人肝癌BEL-7402细胞的半数杀伤浓度（IC50）为0.000013μm，其活性比阿霉素和丝裂霉素C强。（阿霉素和丝裂霉素C的IC50分别为0.00084μM和0.0059μM）。C-1027物质对小鼠L1210和P388白血病有明显抑制作用。DBA小鼠腹腔内接种白血病细胞，24小时后腹腔内注射C-1027一次，60天观察结果。该物质对小鼠腹水癌包括艾氏腹水癌、H22腹水肝癌均有明显的抑制作用。昆明种小鼠腹腔内接种癌细胞，24小时后腹腔内注射C-1027物质，60天观察结果。以上疗效均见表6。
C-1027物质对小鼠移植性实体瘤包括S180内瘤、U14宫颈癌和Harding-passey黑色素瘤均有明显的抑制作用。皮下接种肿瘤，24小时后静脉内一次注射C-1027物质，对Harding-passy黑色素瘤的抑制率见表7。
表5 C-1027物质的抗菌活性
试验菌 最低抑菌浓度 微克/毫升
金黄色葡萄球菌209P 0.78
枯草杆菌 6633 0.78
八联球菌 0.78
变形杆菌 0×19 ＞100
大肠杆菌 B 3.13
大肠杆菌 0111 50
肺炎克氏杆菌 25
痢疾杆菌302 ＞100
绿脓肝菌 11 ＞100
分枝杆菌 607 （3.13）
草分枝杆菌 1.56
白色念珠菌 ＞100
青霉素 5404 ＞100
精原细胞 0.0039
注：（）表示抑制圈边缘不清晰。
表6 C-1027物质抗瘤活性
肿瘤名称 剂量（mg/kg） 给药次数 生存期（天） 生命延长率（%）
白血病 0.025 1 ＞60 ＞275
L12100.012 1 ＞60 ＞275
0.006 1 ＞60 ＞275
对照 16
白血病 0.025 1 ＞60 ＞275
P388， 0.012 1 ＞60 ＞275
0.006 1 22 37.5
对照 16
腹水肝癌 0.025 1 38.5 156
H220.012 1 48 220
0.006 1 22 47
对照 15
表7 C-1027物质抗瘤活性肿瘤名称剂量动物死亡数瘤重（克）抑制率（％）P值Harding-Passey黑色素瘤0.20.10.05对照10000.200.560.752.98938175<0.01<0.01<0.01
此外，C-1027物质对KB细胞体外杀伤效果ED50（50%有效剂量）很好，半数有效剂量只有0.001-0.0001μg/ml。
C-1027物质制造方法实施例如下：
甘油2%，糊精2%，Soytone1%、酵母膏0.3%（NH4）2SO40.2%，CaCO30.2%、培养基PH6.6，500ml三角瓶中加100ml培养基灭菌，接种入C-1027菌，27℃，旋转震荡培养48小时（180转/分，振幅10cm）。然后再用甘油2%，糊精2.0%、鱼粉1%、（NH4）2SO40.2%、CaCO20.2%、PH6.8培养基500ml三角瓶中装100ml，灭菌。上述种子以5%量种入，27℃培养96小时。
培养完后，取PH8.0的培养液10l离心、过滤，得到7l滤液，用HCl调PH4，加3.5Kg（NH4）2SO4，5℃搅拌3小时，析出的C-1027沉淀离心分离（5℃、3000转、30分钟）得到。此沉淀溶于400ml去离子水、透析、冷冻干燥得粗粉5.3g。
上述粗粉2g溶于400ml去离子水，离心（5℃、3000转、30分钟），除去不溶物。活化物经DEAE-Cellulose柱吸附，400ml去离子水洗后，0.1MNacl洗脱，活性部份112ml，透析，膜内液体冷冻干燥。
这样得到的粗制品245mg，溶于水，经Sephadex G-50柱去离子水层析，活性部份80ml，冷冻干燥得120mg白色粉末，此物再溶于水，经Sephadex G-75柱层析，收集活性部份冷冻干燥，得到62mg C-1027白色粉末精制品，其理化性质及生物学特性如前所述。
附图说明：
图1：C-1027菌株的孢子丝（300×）
图2：C-1027菌株的孢子（15000×）
图3：C-1027的紫外光谱
图4：C-1027的红外光谱