说明书吡咯并苯并二氮杂卓和其结合物
技术领域
本发明涉及吡咯并苯并二氮杂(吡咯并苯并二氮杂卓，pyrrolobenzodiazepines)(PBD)，特别是具有连接至细胞结合剂的接头基团的吡咯并苯并二氮杂
背景技术
吡咯并苯并二氮杂
一些吡咯并苯并二氮杂(PBD)能够识别和结合于DNA的特定序列；优选的序列是PuGPu。于1965年发现第一PBD抗肿瘤抗生素，安曲霉素(anthramycin)(Leimgruber,etal.,J.Am.Chem.Soc.,87,5793-5795(1965)；Leimgruber,etal.,J.Am.Chem.Soc.,87,5791-5793(1965))。其后，已报道许多自然存在的PBD，并且针对各种类似物已开发超过10种合成途径(Thurston,etal.,Chem.Rev.1994,433-465(1994)；Antonow,D.andThurston,D.E.,Chem.Rev.2011111(4),2815-2864)。家族成员包括abbeymycin(Hochlowski,etal.,J.Antibiotics,40,145-148(1987))、奇卡霉素(chicamycin)(Konishi,etal.,J.Antibiotics,37,200-206(1984))、DC-81(日本专利58-180487；Thurston,etal.,Chem.Brit.,26,767-772(1990)；Bose,etal.,Tetrahedron,48,751-758(1992))、甲基氨茴霉素(mazethramycin)(Kuminoto,etal.,J.Antibiotics,33,665-667(1980))、新丝拉霉素(neothramycin)A和B(Takeuchi,etal.,J.Antibiotics,29,93-96(1976))、porothramycin(Tsunakawa,etal.,J.Antibiotics,41,1366-1373(1988))、prothracarcin(Shimizu,etal,J.Antibiotics,29,2492-2503(1982)；LangleyandThurston,J.Org.Chem.,52,91-97(1987))、西班米星(sibanomicin)(DC-102)(Hara,etal.,J.Antibiotics,41,702-704(1988)；Itoh,etal.,J.Antibiotics,41,1281-1284(1988))、西伯里亚霉素(sibiromycin)(Leber,etal.,J.Am.Chem.Soc.,110,2992-2993(1988))和托马霉素(tomamycin)(Arima,etal.,J.Antibiotics,25,437-444(1972))。PBD为以下一般结构：
它们的区别在于取代基的数量、类型和位置，在于它们的芳族A环和吡咯并C环两者，以及在于C环的饱和度。在B环中，在N10-C11位置(其是负责使DNA烷基化的亲电中心)处存在亚胺(N＝C)、甲醇胺(carbinolamine)(NH-CH(OH))或甲醇胺甲醚(NH-CH(OMe))。所有已知的天然产物在手性C11a位置处具有(S)-构型，当从C环到A环观察时，该构型向它们提供右手扭转(right-handedtwist)。这给予它们用于与B型DNA的小沟的等螺旋性(isohelicity)的适当的三维形状，获得在结合位点处的滑动配合(Kohn,InAntibioticsIII.Springer-Verlag,NewYork,pp.3-11(1975)；HurleyandNeedham-VanDevanter,Acc.Chem.Res.,19,230-237(1986))。它们在小沟中形成加合物的能力使得它们可以干扰DNA加工，因此它们可用作抗肿瘤剂。
由Gregsonetal.作为化合物1(Chem.Commun.1999,797-798)以及由Gregsonetal.作为化合物4a(J.Med.Chem.2001,44,1161-1174)描述了特别有利的吡咯并苯并二氮杂化合物。该化合物，也称为SJG-136，在以下示出：
其他二聚体PBD化合物，如WO2005/085251中的包含C2芳基取代基的那些，也已经公开，实例有：
已经证明这些化合物是高度有用的细胞毒性剂。
抗体-药物结合物
已经建立用于患有癌症、免疫疾病和血管疾病患者的靶向治疗的抗体疗法(Carter,P.(2006)NatureReviewsImmunology6:343-357)。癌症治疗中用于局部递送细胞毒性剂或细胞抑制剂(即，药物)以杀死或抑制肿瘤细胞的抗体-药物结合物(ADC)(即，免疫结合物)的使用靶向将药物部分递送至肿瘤，并且在其中细胞内积聚，而这些非结合药物试剂的全身给予可以导致对正常细胞以及设法去消除的肿瘤细胞不可接受的毒性水平(Xieetal(2006)Expert.Opin.Biol.Ther.6(3):281-291；Kovtunetal(2006)CancerRes.66(6):3214-3121；Lawetal(2006)CancerRes.66(4):2328-2337；Wuetal(2005)NatureBiotech.23(9):1137-1145；LambertJ.(2005)CurrentOpin.inPharmacol.5:543-549；HamannP.(2005)ExpertOpin.Ther.Patents15(9):1087-1103；Payne,G.(2003)CancerCell3:207-212；Trailetal(2003)CancerImmunol.Immunother.52:328-337；SyrigosandEpenetos(1999)AnticancerResearch19:605-614)。
由此观察到具有最小毒性的最大疗效。设计和改善ADC的努力集中在单克隆抗体(mAb)的选择性以及药物作用机制、药物连接、药物/抗体比值(负载)和药物释放性质上(Junutula,etal.,2008bNatureBiotech.,26(8):925-932；Dornanetal(2009)Blood114(13):2721-2729；US7521541；US7723485；WO2009/052249；McDonagh(2006)ProteinEng.Design&Sel.19(7):299-307；Doroninaetal(2006)Bioconj.Chem.17:114-124；Ericksonetal(2006)CancerRes.66(8):1-8；Sandersonetal(2005)Clin.CancerRes.11:843-852；Jeffreyetal(2005)J.Med.Chem.48:1344-1358；Hamblettetal(2004)Clin.CancerRes.10:7063-7070)。药物部分可以通过包括微管结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制的机制赋予它们细胞毒性和细胞抑制作用。在结合至大抗体或蛋白质受体配体时，一些细胞毒性剂趋向于不活泼或较不活泼。
ADC中的PBD
已经公开二聚的PBD作为药物结合物中的药物。例如，在WO2011/130598中，公开了具有连接到细胞结合剂如抗体的接头基团的二聚体PBD化合物，其中接头基团连接至可用的N10位置中的一个，并且一般由在接头基团上的酶作用而被切割。
与此相反，在WO2011/130613和WO2011/130616中，公开了具有用于连接到细胞结合剂如抗体的接头基团的二聚体PBD化合物，其中接头基团在C2位置之一处经由芳族基团连接，并且一般由在接头基团上的酶作用而被切割。这种抗体药物结合物也描述于文献Flygare,J.,etal,Chem.Biol.DrugDes.81:113-121(2013)中，其还描述了其他类型的抗体药物结合物。
另一种方法描述于WO2007/085930中，其中托马霉素样的二聚体具有用于连接至细胞结合剂如抗体的接头基团，其中接头基团被连接至托马霉素单元之间的系链(tether)，并且一般由接头基团上的酶作用而被切割。
本发明人已经开发出了一种形成具有细胞结合剂的PBD结合物、并且特别是PBD抗体结合物的新方法。
发明内容
在一个一般方面中，本发明提供了包含具有用于连接至细胞结合剂的接头的PBD二聚化合物的结合物，其中接头具有连接至在连接两个PBD单体的桥中的亚苯基或亚吡啶基的三唑、哌嗪、亚丙炔基或肟基团。细胞结合剂优选是抗体。
在第一方面中，本发明提供了式(A)的新的结合物化合物：
其中：
D代表基团D1或D2：
虚线指示C2和C3之间的双键的可选存在；
当C2和C3之间存在双键时，R2选自由以下组成的组：
(ia)C5-10芳基基团，可选地被选自包含以下的组中的一个或多个取代基取代：卤素、硝基、氰基、醚、羧基、酯、C1-7烷基、C3-7杂环基和双-氧基-C1-3亚烷基；
(ib)C1-5饱和脂肪族烷基；
(ic)C3-6饱和环烷基；
其中R31、R32和R33中每个独立地选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基和环丙基，其中R2基团中的碳原子总数不超过5；
其中R35a和R35b中的一个是H而另一个选自：苯基，该苯基被选自卤素、甲基、甲氧基的基团可选取代；吡啶基；和苯硫基；和
其中R34选自：H；C1-3饱和烷基；C2-3烯基；C2-3炔基；环丙基；苯基，该苯基被选自卤素、甲基、甲氧基的基团可选取代；吡啶基；和苯硫基；
(ig)卤素；
当C2和C3之间存在单键时，
R2是其中R36a和R36b独立地选自H、F、C1-4饱和烷基、C2-3烯基，该烷基和烯基基团被选自C1-4烷基酰胺基和C1-4烷基酯的基团可选取代；或者，当R16a和R16b中的一个是H时，另一个选自腈和C1-4烷基酯；
D’代表基团D’1或D’2：
其中虚线指示C2’和C3’之间的双键的可选存在；
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素；
Y选自式A1、A2、A3、A4、A5和A6：
L是连接至细胞结合剂的接头；
CBA是细胞结合剂；
n是在0至48范围内选择的整数；
RA4是C1-6亚烷基基团；
要么
(a)R10是H，并且R11是OH、ORA，其中RA是C1-4烷基；或
(b)R10和R11形成它们键连的氮和碳原子之间的氮-碳双键；或
(c)R10是H并且R11是OSOzM，其中z是2或3并且M是单价药用阳离子；
R和R’各自独立地选自可选取代的C1-12烷基、C3-20杂环基和C5-20芳基基团，并可选地关联基团NRR’，R和R’连同它们连接的氮原子一起形成可选取代的4-、5-、6-或7-元杂环环；
其中R16、R17、R19、R20、R21和R22如分别对R6、R7、R9、R10、R11和R2所限定的；
其中Z是CH或N；
其中T和T”独立地选自单键或C1-9亚烷基，其链可以被一个或多个杂原子例如O、S、N(H)、NMe中断，条件是X和X’之间的原子的最短链中的原子数是3至12个原子；和
X和X’独立地选自O、S和N(H)。
除了C2和C3与C2’和C3’二者之间不能都是双键之外。
因此，取决于Y，式A选自下式A-I、A-II、A-III、A-IV、A-V和A-VI：
本发明的第二方面提供了式(B)的新的药物-接头化合物：
其中所有基团是如在本发明的第一方面中所限定的；和
YL选自式B1、B2、B3、B4、B5和B6的组中：
其中G是用于连接至细胞结合剂的反应性基团。
本发明的第三方面提供了可以用于制备本发明的化合物和结合物化合物的式(c)的化合物：
其中YC选自式C1、C2、C3、C4、C5和C6的组中：
要么
(a)R30是H，并且R31是OH、ORA，其中RA是C1-4烷基；或
(b)R30和R31形成它们键连的氮和碳原子之间的氮-碳双键；或
(c)R30是H和R31是OSOzM，其中z为2或3并且M是单价药用阳离子；或
(d)R30是氮保护基团并且R31是OProtO，其中ProtO是羟基保护基团；和
R40和R41如分别对R30和R31所限定的；和
所有其余的基团如在本发明的第一方面中所限定的。
本发明第四方面提供了可以用于制备本发明的第二方面和第三方面的化合物的式(D)的化合物：
YD选自式D2、D3、D4和D6的组中：
而所有其余的基团是如在本发明的第三方面中所限定的。
本发明的第五方面提供了可以用于制备本发明第二方面、第三方面和第四方面的化合物的式(E)的化合物：
YE选自式E1、E2和E5的组中：
其中
RE1选自H和TMS；
RE2选自Br、Cl和I；和
所有其余的基团是如在本发明的第三方面中所限定的。
本发明的第六方面提供了本发明的第一方面的化合物在医学治疗中的用途。第四方面还提供了包含第一方面的化合物和药用赋形剂的药物组合物。
本发明的第七方面提供了适用于治疗增生性疾病的方法的本发明的第一方面的化合物或本发明第四方面的药物组合物。第四方面还提供了第一方面的化合物在生产治疗增生性疾病的药物的方法中的用途，以及治疗患有增生性疾病的哺乳动物的方法，包括给予有效量的第一方面的化合物或第四方面的药物组合物。
本发明的第八方面提供了一种合成本发明的第一方面的化合物的方法，包括将第二方面的药物-接头与细胞结合剂结合的步骤。
本发明还提供了由本发明第三方面、第四方面或第五方面的化合物通过将其与合适试剂反应而合成本发明第二方面的化合物。
具体实施方式
本发明的详细描述
本发明提供了包含通过二聚体桥接部分经由具体的接头连接至细胞结合剂的PBD二聚体的结合物。
本发明适用于向受试者内的优选位点提供PBD结合物。
氮保护基团
氮保护基团在本领域内是已知的。适用于本发明的优选氮保护基团是具有以下通式的氨基甲酸酯保护基团：
其中R’30是可选取代的烷基(例如C1-20烷基)、芳基(例如C5-20芳基)或杂芳基(例如C3-20杂环基)基团。
大量可能的氨基甲酸酯氮保护基团列于JohnWiley&Sons，Inc.2007年的《有机合成中的格林氏保护基团》(Greene’sProtectiveGroupsinOrganicSynthesis)第4版(ISBN978-0-471-69754-1)的第706至772页中，该书通过引用结合于此。
特别优选的保护基团包括Alloc、Troc、Teoc、BOC、TcBOC、Fmoc、1-Adoc和2-Adoc。
羟基保护基团
羟基保护基团在本领域内是众所周知的。大量的合适基团描述于JohnWiley&Sons，Inc.2007年的《有机合成中格林氏保护基团》第4版(ISBN978-0-471-69754-1)的第24至298页，该书通过引用结合于此。
特别感兴趣的类别包括甲硅烷基醚、甲基醚、烷基醚、苄基醚、酯、苯甲酸酯、碳酸酯和磺酸酯。特别优选的羟基保护基团包括THP。
优选内容
以下优选内容可以适用于如以上的本发明所有方面或可以涉及单个方面。这些优选内容可以按照任何组合进行合并。
R2
当R2是C5-10芳基基团时，在一些实施方式中它可以是C5-7芳基基团。C5-7芳基基团可以是苯基基团或C5-7杂芳基基团，例如呋喃基、苯硫基和吡啶基。在一些实施方式中，R2可以是苯基。在其他实施方式中，R2可以是苯硫基，例如，噻吩-2-基和噻吩-3-基。
当R2是C5-10芳基基团时，在一些实施方式中，它可以是C8-10芳基，例如喹啉基或异喹啉基基团。喹啉基或异喹啉基基团可以通过任何可利用的环位置结合至PBD核。例如，喹啉基可以是喹啉-2-基、喹啉-3-基、喹啉-4-基、喹啉-5-基、喹啉-6-基、喹啉-7-基和喹啉-8-基。这些之中喹啉-3-基和喹啉-6-基可以是优选的。异喹啉基可以是异喹啉-1-基、异喹啉-3-基、异喹啉-4-基、异喹啉-5-基、异喹啉-6-基、异喹啉-7-基和异喹啉-8-基。这些之中异喹啉-3-基和异喹啉-6-基可以是优选的。
当R2是C5-10芳基基团时，它可以带有任何数目的取代基基团。在一些实施方式中，它可以带有1至3个取代基基团。在一些实施方式中，它可以带有1或2个取代基基团。在一些实施方式中，它可以带有单个取代基基团。取代基可以是任何位置。
在R2是C5-7芳基基团的情况下，在一些实施方式中，单个取代基可以在环原子上，其不与化合物其余部分的键邻接，即，它可以是化合物其余部分的键的β或γ位。因此，在C5-7芳基基团是苯基的实施方式中，取代基可以是在间-或对-位置，或可以是在对-位置。
在R2是C8-10芳基基团、例如喹啉基或异喹啉基的情况下，在一些实施方式中，在喹啉或异喹啉环的任何位置上可以有任何数目的取代基。在一些实施方式中，它带有一个、两个或三个取代基，而这些可以处于远端环和近端环或这二者(如果不只一个取代基)。
当R2是C5-10芳基基团时的R2取代基
在R2是C5-10芳基基团时R2上取代基是卤素的实施方式中，它可以是F或Cl，而在一些这些实施方式中是Cl。
在R2是C5-10芳基基团时R2上取代基是醚的实施方式中，在一些实施方式中，它可以是烷氧基基团，例如，C1-7烷氧基基团(例如，甲氧基、乙氧基)或在一些实施方式中，它可以是C5-7芳氧基基团(例如，苯氧基、吡啶氧基、呋喃氧基)。烷氧基基团本身可以进一步取代，例如由氨基基团(例如二甲基氨基)取代。
在R2是C5-10芳基基团时R2上取代基是C1-7烷基的实施方式中，它可以是C1-4烷基基团(例如，甲基、乙基、丙基、丁基)。
在R2是C5-10芳基基团时R2上取代基是C3-7杂环基的实施方式中，它可以是C6含氮杂环基基团，例如，吗啉基、硫代吗啉基、哌啶基、哌嗪基。这些基团可以经由氮原子结合至PBD部分的其余部分。这些基团可以进一步、例如被C1-4烷基基团取代。如果C6含氮杂环基基团是哌嗪基，则其他取代基可以在第二个氮环原子上。
在R2是C5-10芳基基团时R2上取代基是二-氧基-C1-3亚烷基的实施方式中，这可以是二-氧基-亚甲基或二-氧基-亚乙基。
在R2是C5-10芳基基团时R2上取代基是酯的实施方式中，这优选是甲酯或乙酯。
在一些实施方式中，当R2是C5-10芳基基团时取代基可以包括甲氧基、乙氧基、氟、氯、氰基、二-氧基-亚甲基、甲基-哌嗪基、吗啉基、甲基-苯硫基、二甲基氨基丙氧基和羧基。
在一些实施方式中，R2可以选自4-甲氧基-苯基、3-甲氧基苯基、4-乙氧基-苯基、3-乙氧基-苯基、4-氟-苯基、4-氯-苯基、3,4-二氧基亚甲基-苯基、4-甲基苯硫基、4-氰基苯基、4-苯氧基苯基、喹啉-3-基和喹啉-6-基、异喹啉-3-基和异喹啉-6-基、2-噻吩基、2-呋喃基、甲氧基萘基、萘基、4-硝基苯基、4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基和3,4-二氧基亚甲基-苯基。
当R2是C1-5饱和脂肪族烷基时，它可以是甲基、乙基、丙基、丁基或戊基。在一些实施方式中，它可以是甲基、乙基或丙基(正戊基或异丙基)。在一些这些实施方式中，它可以是甲基。在其他实施方式中，它可以是丁基或戊基，其可以是直链或支链的。
当R2是C3-6饱和环烷基时，它可以是环丙基、环丁基、环戊基或环己基。在一些实施方式中，它可以是环丙基。
当R2是时，在一些实施方式中，在R2基团中的碳原子总数不超过4或不超过3。
在一些实施方式中，R31、R32和R33中的一个是H，而其他两个基团选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基和环丙基。
在其他实施方式中，R31、R32和R33中的两个是H，而另一个基团选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基和环丙基。
在一些实施方式中，不是H的基团选自甲基和乙基。在一些这些实施方式中，不是H的基团是甲基。
在一些实施方式中，R31是H。
在一些实施方式中，R32是H。
在一些实施方式中，R33是H。
在一些实施方式中，R31和R32是H。
在一些实施方式中，R31和R33是H。
在一些实施方式中，R32和R33是H。
特别感兴趣的R2基团是：
当R2是时，在一些实施方式中，不是H的基团(R35a或R35b)是可选取代的苯基。如果苯基的可选取代基是卤素，则它可以是氟。在一些实施方式中，苯基基团是未取代的。
当R2是时，在R34是苯基的一些实施方式中，它是未取代的。在其他实施方式中，苯基基团带有单个氟取代基。在其他实施方式中，R14选自H、甲基、乙基、乙烯基和乙炔基。在一些这些实施方式中，R14选自H和甲基。
在R2是卤素的情况下，在一些实施方式中，它是氟。
当C2和C3之间存在单键时，R2是
在一些实施方式中，R36a和R36b都是H。
在其他实施方式中，R36a和R36b都是甲基。
在进一步的实施方式中，R36a和R36b中的一个是H，而另一个选自C1-4饱和烷基、C2-3烯基，该烷基和烯基基团被可选取代。在一些这些进一步的实施方式中，不是H的基团可以选自甲基和乙基。
R22
当C2’和C3’之间存在双键时，对于R2当C2和C3之间存在双键时的以上优选内容等同适用于R22。
当C2’和C3’之间存在单键时，对于R2当C2和C3之间存在单键时的以上优选内容等同适用于R22。
如以上所描述的，C2和C3与C2’和C3’之间不能都是双键。
R6
在一个实施方式中，R6独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn-和卤素。
在一个实施方式中，R6独立地选自H、OH、OR、SH、NH2、NO2和卤素。
在一个实施方式中，R6独立地选自H和卤素。
在一个实施方式中，R6独立地是H。
在一个实施方式中，R6和R7一起形成基团-O-(CH2)p-O-，其中p为1或2。
这些实施方式也适用于R16。
R7
R7独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn和卤素。
在一个实施方式中，R7独立地是OR。
在一个实施方式中，R7独立地是OR7A，其中R7A独立地是可选取代的C1-6烷基。
在一个实施方式中，R7A独立地是可选取代的饱和C1-6烷基。
在一个实施方式中，R7A独立地是可选取代的C2-4烯基。
在一个实施方式中，R7A独立地是Me。
在一个实施方式中，R7A独立地是CH2Ph。
在一个实施方式中，R7A独立地是烯丙基。
这些实施方式也适用于R17。
R9
在一个实施方式中，R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn-和卤素。
在一个实施方式中，R9独立地是H。
在一个实施方式中，R9独立地是R或OR。
这些实施方式也适用于R19。
N10-C11
在一些实施方式中，R10是H，并且R11是OH、ORA，其中RA是C1-4烷基。在一些这些实施方式中，R11是OH。在其他的这些实施方式中，R11是ORA，其中RA是C1-4烷基。在一些这些实施方式中，RA是甲基。
在一些实施方式中，R10和R11形成它们键连的氮和碳原子之间的氮-碳双键。
在一些实施方式中，R10是H并且R11是OSOzM，其中z为2或3并且M是单价药用阳离子。在一些这些实施方式中，M是单价药用阳离子，并可以是Na+。另外，在一些实施方式中z为3。
以上优选内容同等适用于R20和R21。
在一些实施方式中，R30是H，并且R31是OH、ORA，其中RA是C1-4烷基。在一些这些实施方式中，R31是OH。在其他的这些实施方式中，R31是ORA，其中RA是C1-4烷基。在一些这些实施方式中，RA是甲基。
在一些实施方式中，R30和R31形成它们键连的氮和碳原子之间的氮-碳双键。
在一些实施方式中，R30是H并且R31是OSOzM，其中z为2或3并且M是单价药用阳离子。在一些这些实施方式中，M是单价药用阳离子，并可以是Na+。另外，在一些实施方式中z为3。
在一些实施方式中，R30是氮保护基团并且R31是OProtO，其中ProtO是羟基保护基团。
在一些这些实施方式中，氮保护基团可以选自Alloc、Troc、Teoc、BOC、TcBOC、Fmoc、1-Adoc和2-Adoc，并且更优选是Boc。
在一些这些实施方式中，氮保护基团可以是THP。
对于式D的化合物，优选的是R30和R31形成它们键连的氮和碳原子之间的氮-碳双键。
对于式E的化合物，优选的是R30是氮保护基团并且R31是OProtO，其中ProtO是羟基保护基团。
对于式C的化合物，其中YC是式C2、C3或C4，优选的是R30和R31形成它们键连的氮和碳原子之间的氮-碳双键。
对于式的化合物C，其中YC是式C1或C5，优选的是R30是氮保护基团并且R31是OProtO，其中ProtO是羟基保护基团。
以上优选内容同等适用于R40和R41。
T和T’
T和T’各自独立地选自单键或C1-9亚烷基基团，其链可以被一个或多个杂原子例如O、S、N(H)和/或NMe中断，条件是X和X’之间的原子的最短链中的原子数是3至12个原子。
在一个实施方式中，T和T’的每一个亚烷基基团可选地被一个或多个选自O，S的杂原子和NMe中断。
在一个实施方式中，T和T”中的每一个独立地选自单键和C1-9亚烷基基团。
在一个实施方式中，T选自单键、C1、C2、C3和C4亚烷基基团并且T’选自单键、C1、C2、C3和C4亚烷基基团。
在一个实施方式中，T选自单键、C1、和C2亚烷基基团并且T’选自单键、C1、和C2亚烷基基团。
在一个实施方式中，T选自单键和C1亚烷基基团并且T’选自单键和C1亚烷基基团。
在一个实施方式中，T是单键并且T’是单键。
在一个实施方式中，T是C1亚烷基基团并且T’是C1亚烷基基团。
在一些实施方式中，T和T’是相同的。
以上所列出的亚烷基基团可以可选地被一个或多个杂原子中断。
以上所列出的亚烷基基团可以是未取代的直链脂肪族亚烷基基团。
X
在一个实施方式中，X选自O、S或N(H)。
优选X是O。
二聚体
在一些实施方式中，基团R22、R16、R17、R19、R20和R21分别与基团R2、R6、R9、R7、R10和R11相同。在这些实施方式中，PBD单体单元具有相同的取代基。
本发明的第一方面的特别优选的化合物可以是式Ia的化合物：
其中
R10、R11、R20、R21和Y是如以上所限定的；
t1和t2独立选自0、1和2；
R7a和R17a独立地选自甲基和苯基；
R2a和R22a独立地选自：
和
这些化合物可以优选是对称的。
本发明第二方面的特别优选的化合物可以是式IIa的化合物：
其中
R10、R11、R20、R21和YL是如以上所限定的；
t1和t2独立选自0、1和2；
R7a和R17a独立地选自甲基和苯基；
R2a和R22a独立地选自：
和
这些化合物可以优选是对称的。
本发明的第三方面特别优选的化合物可以是式IIIa的化合物：
其中
R10、R11、R20、R21和YC是如以上所限定的；
t1和t2独立选自0、1和2；
R7a和R17a独立地选自甲基和苯基；
R2a和R22a独立地选自：
和
这些化合物可以优选是对称的。
n(Y，YL)
在一些实施方式中，n(在Y或YL中)是0和24之间的整数。
在一些实施方式中，n(在Y或YL中)是0和12之间的整数。
在一些实施方式中，n(在Y或YL中)是0和8之间的整数。
在一些实施方式中，n(在Y或YL中)是0和6之间的整数。
在一些实施方式中，n(在Y或YL中)是0。
在一些实施方式中，n(在Y或YL中)是1。
在一些实施方式中，n(在Y或YL中)是2。
在一些实施方式中，n(在Y或YL中)是3。
在一些实施方式中，n(在Y或YL中)是4。
在一些实施方式中，n(在Y或YL中)是5。
在一些实施方式中，n(在Y或YL中)是6。
在一些实施方式中，n(在Y或YL中)是7。
在一些实施方式中，n(在Y或YL中)是8。
在一些实施方式中，n(在Y或YL中)是9。
在一些实施方式中，n(在Y或YL中)是10。
在一些实施方式中，n(在Y或YL中)是11。
在一些实施方式中，n(在Y或YL中)是12。
在一些实施方式中，n(在Y或YL中)是13。
在一些实施方式中，n(在Y或YL中)是14。
在一些实施方式中，n(在Y或YL中)是15。
在一些实施方式中当Y为A1或YL是B1，n可以选自3和6。
在一些实施方式中当Y为A2或YL是B2，n可以选自4和6。
在一些实施方式中当Y为A3或YL是B3，n可以是4。
在一些实施方式中当Y为A4或YL是B4，n可以是4。
在一些实施方式中当Y为A5或YL是B5，n可以是11。
在一些实施方式中当Y为A6或YL是B6，n可以是2。
L和G
L是结合物化合物中连接至细胞结合剂的接头。G是用于将PBD二聚体连接至细胞结合剂以形成结合物化合物的反应性基团。
优选地，接头/反应性基团包含用于与细胞结合剂上的亲核官能团反应的亲电官能团。抗体上的亲核基团包括，但不限于：(i)N-端氨基基团，(ii)侧链胺基基团，例如赖氨酸，(iii)侧链硫醇基团，例如半胱氨酸，和(iv)在抗体是糖基化的情况下的糖羟基或氨基。胺、硫醇和羟基基团是亲核的，并能够与接头部分和接头试剂上的亲电基团反应以形成共价键，接头部分和接头试剂包括：(i)马来酰亚胺基团(ii)活化的二硫化物，(iii)活性酯如NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)酯、HOBt(N-羟基苯并三唑)酯、卤代甲酸酯和酰卤；(iv)烷基卤化物和苯甲酰卤如卤代乙酰胺；和(v)醛、酮、羧基，并且其中某些情况如下举例说明：
某些抗体具有可还原的链间二硫化物，即半胱氨酸桥。抗体可以通过用还原剂如DTT(二硫苏糖醇)处理而制备成具有与接头试剂发生结合的反应活性。因此，每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应活性的硫醇亲核体。能够通过赖氨酸与2-亚氨基硫烷(特劳特(Traut)试剂)导致胺成为硫醇的转化而将另外的亲核基团引入抗体。通过引入一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基(例如，制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变抗体)而可以将反应性硫醇基团引入到抗体(或其片段)中。US7521541教导了通过引入反应性半胱氨酸氨基酸而对抗体的改造设计。
在一些实施方式中，接头具有与抗体上存在的亲电基团具有反应活性的反应性亲核基团。抗体上有用的亲电基团包括，但不限于，醛和酮羰基基团。接头的亲核基团的杂原子能够与抗体上的亲电基团反应并且形成与抗体单元的共价键。接头上有用的亲核基团包括，但不限于，酰肼、肟、氨基、羟基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳酰肼。抗体上的亲电基团提供了连接至接头的有利位点。
在一个实施方式中，基团L是：
其中星号表示与基团Y的其余部分的连接点，波浪线表示与细胞结合剂的连接点，而m是选自范围为0至6的整数。在一个实施方式中，m选自2，3，4和5。
在一个实施方式中，细胞结合剂和L之间的连接是通过细胞结合剂的硫醇残基和L的马来酰亚胺基团完成的。
在一个实施方式中，细胞结合剂和L之间的连接是：
其中星号表示与L基团的其余部分或Y基团的其余部分的连接点而波浪线表示与细胞结合剂其余部分的连接点，在该实施方式中，S原子通常衍生自细胞结合剂。
在以上的每一实施方式中，可替代的官能度可以用于代替如下所示的马来酰亚胺衍生的基团：
其中波浪线如前表示与细胞结合剂的连接点，并且星号表示与L基团的其余部分或Y基团的其余部分的连接点。
在一个实施方式中，用以下基团代替马来酰亚胺衍生的基团：
其中波浪线如前表示与细胞结合剂的连接点，并且星号表示与L基团的其余部分或Y基团的其余部分的连接点。
在一个实施方式中，用可选地连同细胞结合剂一起的选自以下基团的基团代替马来酰亚胺衍生的基团：
-C(＝O)NH-、
-C(＝O)O-、
-NHC(＝O)-、
-OC(＝O)-、
-OC(＝O)O-、
-NHC(＝O)O-、
-OC(＝O)NH-、
-NHC(＝O)NH-、
-NHC(＝O)NH、
-C(＝O)NHC(＝O)-、
-S-、
-S-S-、
-CH2C(＝O)-、
-C(＝O)CH2-、
＝N-NH-、和
-NH-N＝。
在一个实施方式中，用可选地连同细胞结合剂一起的选自以下基团的基团代替马来酰亚胺衍生的基团：
其中波浪线表示与细胞结合剂的连接点或键连至L基团的其余部分或Y基团的其余部分的键，并且星号表示与细胞结合剂的连接点之外的其他连接点或键连至L基团的其余部分或Y基团的其余部分的键。
其他能够用作L用于将Y基团的其余部分连接至细胞结合剂的基团描述于WO2005/082023中。
因此，在本发明的实施方式中，L是下式：
-LA-(CH2)m-
其中m为0至6；和
LA选自：
其中Ar代表C5-6亚芳基，例如亚苯基。
在L是L1的一些实施方式中，m可以是2、3或5。
在L是L1的一些实施方式中，LA可以是LA1-1。
在本发明的实施方式中，L是下式：
-LA-(CH2)m-O-(L2)
其中m为0至6；和
LA选自以上基团。
不期望受限于理论，这种基团可以从抗体上切割使得氨基甲酸酯基团产生末端胺。
在L是L2的一些实施方式中，LA可以是LA3-2。
在L是L2的一些实施方式中，m可以是1。
在本发明的实施方式中，L是下式：
-LA-(CH2)q-O-C(＝O)-NH-(CH2)p-(L3)
其中q为1至3，并且p为1至3；和
LA选自以上基团。
不期望受限于理论，这种基团可以是可以从抗体上切割使得氨基甲酸酯基团产生基团：H2N-(CH2)p-(L3’)。
在L是L3的一些实施方式中，q可以是1，并且p可以是2。
在L是L3的一些实施方式中，LA可以选自LA7、LA8-1和LA8-2。
在本发明的实施方式中，L是下式：
其中m为0至6；
X1和X2是选自天然氨基酸的氨基酸基团，其可以是修饰的；
LA选自以上基团。
可以选择天然氨基酸使得二肽基团是组织蛋白酶易分解的。
在一个实施方式中，基团-X1-X2-选自：
-Phe-Lys-、
-Val-Ala-、
-Val-Lys-、
-Ala-Lys-、
-Val-Cit-、
-Phe-Cit-、
-Leu-Cit-、
-Ile-Cit-、
-Phe-Arg-、
-Trp-Cit-、
其中Cit是瓜氨酸。
优选地，基团-X1-X2-选自：
-Phe-Lys-、
-Val-Ala-、
-Val-Lys-、
-Ala-Lys-、
-Val-Cit-。
最优选地，基团-X1-X2-是-Phe-Lys-或-Val-Ala-。
在一些实施方式中，在L是L4的情况下，m可以是1。
可以使用其他二肽组合，包括文献Dubowchiketal.,BioconjugateChemistry,2002,13,855-869中描述的那些，该文献通过引用结合于此。
在一个实施方式中，在合适的情况下氨基酸侧链被衍生化。例如，氨基酸侧链的氨基基团或羧基基团可以被衍生化。
在一个实施方式中，侧链氨基酸如赖氨酸的氨基基团NH2是选自由NHR和NRR’组成的组的衍生化形式。
在一个实施方式中，侧链氨基酸如天门冬氨酸的羧基基团COOH是选自由COOR、CONH2、CONHR和CONRR’组成的组的衍生化形式。
在一个实施方式中，氨基酸侧链在合适的情况下是化学保护的。侧链保护基团可以是如下对于基团RL进行讨论的基团。本发明人已确立受保护的氨基酸序列是酶可切割的。例如，已经确立的是，包含Boc侧链-保护的Lys残基的二肽序列是由组织蛋白酶可切解的。
用于氨基酸侧链的保护基团在本领域内是众所周知的，并描述于NovabiochemCatalog中。另外的保护基团策略记载于格林和伍兹的《有机合成中的保护基团》(ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis，GreeneandWuts)中。
对于具有反应性侧链官能度的那些氨基酸可能的侧链保护基团如下所示：
Arg：Z、Mtr、Tos；
Asn：Trt、Xan；
Asp：Bzl、t-Bu；
Cys：Acm、Bzl、Bzl-OMe、Bzl-Me、Trt；
Glu：Bzl、t-Bu；
Gln：Trt、Xan；
His：Boc、Dnp、Tos、Trt；
Lys：Boc、Z-Cl、Fmoc、Z、Alloc；
Ser：Bzl、TBDMS、TBDPS；
Thr：Bz；
Trp：Boc；
Tyr：Bzl、Z、Z-Br。
因此，在本发明的实施方式中，G是下式：
GA-(CH2)m-
其中m为0至6；和
GA选自：
其中Ar代表C5-6亚芳基基团，例如，亚苯基。
在G是G1的一些实施方式中，m可以是2、3或5。
在G是G1的一些实施方式中，GA可以是GA1-1。
在本发明的实施方式中，G是下式：
GA-(CH2)m-O-(G2)
其中m为0至6；和
GA选自以上基团。
在G是G2的一些实施方式中，GA可以是GA3-2。
在G是G2的一些实施方式中，m可以是1。
在本发明的实施方式中，G是下式：
GA-(CH2)q-O-C(＝O)-NH-(CH2)p-(L3)
其中q为1至3，并且p为1至3；和
GA选自以上基团。
在G是G3的一些实施方式中，q可以是1，并且p可以是2。
在G是G3的一些实施方式中，GA可以选自GA7和GA8。
在本发明的实施方式中，G是下式：
其中m为0至6；
X1和X2如以上对于L4所限定的；
GA选自以上基团。
R和R’
在一个实施方式中，R独立地选自可选取代的C1-12烷基、C3-20杂环基和C5-20芳基基团。这些基团每一个都限定于以下取代基部分中。
在一个实施方式中，R独立地是可选取代的C1-12烷基。
在一个实施方式中，R独立地是可选取代的C3-20杂环基。
在一个实施方式中，R独立地是可选取代的C5-20芳基。
在一个实施方式中，R独立地是可选取代的C1-12烷基。
对于R的优选内容也适用于R’。
在本发明的一些实施方式中，提供了具有取代基-NRR’的化合物。在一个实施方式中，R和R’连同它们连接的氮原子一起形成可选取代的4-、5-、6-或7-元杂环环。环可以包含其他杂原子，例如N、O或S。
在一个实施方式中，杂环环自身取代有基团R。在存在另外的N杂原子的情况下，取代基可以处于N杂原子上。
RA4
在一个实施方式中，RA4是C2-4亚烷基基团。
在一个实施方式中，RA4是C2亚烷基基团。
在一个实施方式中，RA4是C3亚烷基基团。
在一个实施方式中，RA4是未取代的C1-6亚烷基基团。
在一个实施方式中，RA4是直链C1-6亚烷基基团。
在一个实施方式中，RA4选自由-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-组成的组。
细胞结合剂
细胞结合剂可以是任何类型，并且包括肽类和非肽类。这些能够包括包含至少一个结合位点的抗体或抗体片段、淋巴因子、激素、生长因子、营养素转运分子或任何其他细胞结合分子或物质。
本文的术语“抗体”是在最广义上使用并且具体地覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物活性(Milleretal(2003)Jour.ofImmunology170:4854-4861)。抗体可以是鼠科动物抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体或来自其他物种的抗体。抗体是能够识别和结合至特异性抗原的由免疫系统产生的蛋白质。(Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)ImmunoBiology,5thEd.,GarlandPublishing,NewYork)。靶抗原通常具有许多结合位点，也称为表位，其由在多种抗体上的CDR所识别。特异性结合至不同表位的每种抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可以具有一种以上的对应抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含免疫特异性结合感兴趣的靶的抗原或其部分的抗原结合位点的分子，这种靶包括但不限于癌细胞或产生与自身免疫病相关的自身免疫性抗体的细胞。免疫球蛋白可以是任何形式(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类别的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白可以源自任何物种，包括人源、鼠源或兔源。
“抗体片段”包括全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体；线性抗体；由Fab表达文库产生的片段，抗独特型(抗Id)抗体，CDR(互补决定区)，和任 何以上免疫特异性结合至癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的表位结合片段，单链抗体分子，和由抗体片段形成的多特异性抗体。
如在本文中所使用的，术语“单克隆抗体”是指获自基本上同质抗体的群体的抗体，即，除可以以少量存在的可能的天然存在的突变之外，包括该群体的单个抗体是相同的。单克隆抗体针对单个抗原位点是高度特异性的。此外，相对于多克隆抗体制剂，其包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除它们的特异性以外，单克隆抗体是有利的，因为它们可以被合成而不被其他抗体污染。修饰语“单克隆”是指获自抗体的基本上同质群体的抗体的特性，并且不应当解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。例如，通过Kohleretal(1975)Nature256:495首次描述的杂交瘤方法可以制备，或可以通过DNA重组方法(参见US4816567)制备根据本发明使用的单克隆抗体。也可以使用Clacksonetal(1991)Nature,352:624-628；Marksetal(1991)J.Mol.Biol.,222:581-597中描述的技术从噬菌体抗体库分离单克隆抗体。
本文的单克隆抗体确切地包括“嵌合”抗体，其中，重链和/或轻链的部分与源自特定物种的抗体中的对应序列相同或同源或者属于特定特定抗体类别或子类别，而链的剩余部分与源自另一物种的抗体中的对应序列相同或同源或者属于另一抗体类别或子类别，以及这种抗体的片段，只要它们表现出期望的生物活性(US4816567；和Morrisonetal(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855)。嵌合抗体包括包含源自非人类灵长类动物(例如，旧大陆猴或猿猴)的可变结构域抗原结合序列和人类恒定区域序列的“灵长类化的”抗体。
本文的“完整抗体”是包含VL结构域和VH结构域以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是天然的序列恒定结构域(例如，人类天然序列恒定结构域)或它的氨基酸序列变体。完整抗体可以具有一种或多种“效应子功能”，其是指由抗体的Fc区域(天然序列Fc区域或氨基酸序列变体Fc区域)引起的生物活性。抗体效应子功能的实例包括C1q结合；补体依赖的细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；和细胞表面受体(如B细胞受体和BCR)的下调。
取决于它们的重链的恒定结构域的氨基酸序列，可以将完整抗体分为不同“类别”。存在完整抗体的5种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM， 并且这些中的一些可以进一步分为“子类别”(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA和IgA2。对应于抗体的不同类别的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。免疫球蛋白的不同类别的亚单位结构和三种尺寸构型是熟知的。
细胞结合剂的实例包括适用于WO2007/085930中描述的那些结合剂，该专利结合于本文中。
细胞结合剂可以是或包括，多肽。多肽可以是环状多肽。细胞结合剂可以是抗体。因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体-药物结合物(ADC)。
载药量
载药量是每抗体PBD药物的平均数目。载药量可以在每抗体(Ab)1至8个药物(D)的范围内，即在这种情况下1、2、3、4、5、6、7和8个药物部分共价连接至抗体。ADC的组合物包括结合由从1至8的一定范围的药物的抗体的集合。在由结合反应制备ADC中，每抗体药物的平均数可以通过常规方法如质谱、ELISA分析测定法、电泳和HPLC进行表征。ADC依据p的定量分布也可以进行测定。通过ELISA，可以确定在特定的ADC的制备品中p的平均值(Hamblettetal(2004)Clin.CancerRes.10:7063-7070；Sandersonetal(2005)Clin.CancerRes.11:843-852)。然而，通过抗体-抗原结合和ELISA的检测限，p(药物)值的分布是不可识别的。另外，用于检测抗体-药物结合物的ELISA测定不能确定药物部分在什么位置连接至抗体，如重链或轻链片段或特定的氨基酸残基。在某些情况下，可以通过如反相HPLC或电泳的方式来实现均相ADC(其中p是特定的值)与具有其他载药量的ADC的分离、纯化和表征。
对于某些抗体-药物结合物，p可以由抗体上连接位点的数目限制。例如，抗体可以具有仅一个或具有多个半胱氨酸硫醇基团，或可以具有仅一个或具有多个充分反应性的硫醇基团，通过该硫醇基团可以连接接头。较高的载药量，例如p>5，可以引起某些抗体-药物结合物的聚集、不溶、毒性或细胞通透性丧失。
通常，将少于理论最大量的药物部分通过结合反应结合至抗体。例如，抗体可以包含许多不与药物-接头中间产物(D-L)或接头试剂反应的赖氨酸残基。仅最具反应性的赖氨酸基团可以与胺反应性接头试剂反应。另外， 仅最具反应性的半胱氨酸基团可以与硫醇反应性接头试剂反应。通常，抗体不包含许多(如果有的话)游离的和反应性的半胱氨酸硫醇基团，其可以连接至药物部分。化合物的抗体中的大多数半胱氨酸硫醇残基作为二硫桥存在，并且必须在部分或全部还原条件下用还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或TCEP将其还原。可以以多种方式控制ADC的载药量(药物/抗体比)，包括：(i)限制药物-接头中间产物(D-L)或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制结合反应时间或温度，以及(iii)用于半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制性还原条件。
可以在抗体中的反应位点处工程化半胱氨酸残基并且其不形成链内或分子内二硫键(Junutula,etal.,2008bNatureBiotech.,26(8):925-932；Dornanetal(2009)Blood114(13):2721-2729；US7521541；US7723485；WO2009/052249，Shenetal(2012)NatureBiotech.,30(2):184-191；Junutulaetal(2008)JourofImmun.Methods332:41-52)。工程化的半胱氨酸硫醇可以与具有硫醇反应活性的亲电基团如马来酰亚胺或α-卤代酰胺的接头试剂或本发明的药物-接头试剂反应以形成具有半胱氨酸工程化的抗体(ThioMabs)和PBD药物部分的ADC。因此，可以工程化、控制以及已知药物部分的位置。由于工程化的半胱氨酸硫醇基团通常以高产率与硫醇反应性接头试剂或药物-接头试剂反应，所有可以控制载药量。通过在重链或轻链的单一位点置换来设计IgG抗体以引入半胱氨酸氨基酸在对称抗体上产生两个新的半胱氨酸。能够实现载药量接近2和接近同质性的结合产物ADC。
当抗体的多于一个亲核或亲电基团与药物-接头中间产物或药物部分试剂之前的接头试剂反应时，那么得到的产物是具有连接至抗体的药物部分(例如，1、2、3个等)的分布的ADC化合物的混合物。液相色谱法，如聚合物反相(PLRP)和疏水相互作用可以通过载药量值分离混合物中的化合物。可以分离具有单一载药量值(p)的ADC的制备品，然而，这些单一载药量值ADC仍然可以是多种的混合物，因为药物部分可以经由接头连接在抗体的不同位点上。
因此，本发明的抗体-药物结合组合物包括抗体-药物结合化合物的混合物，其中，抗体具有一个或多个PBD药物部分，并且其中，药物部分可以在不同氨基酸残基处连接至抗体。
在一个实施方式中，每细胞结合剂的二聚体吡咯并苯并二氮杂基团的平均数目在1至20的范围内。在一些实施方式中，范围选自1至8、2至8、2至6、2至4和4至8。
在一些实施方式中，存在每细胞结合剂一个二聚体吡咯并苯并二氮杂基团。
肽
在一个实施方式中，细胞结合剂是包含4-20、优选6-20个邻接氨基酸残基的直链或环状肽。在该实施方式中，优选一个细胞结合剂连接至一个单体或二聚体吡咯并苯并二氮杂化合物。
在一个实施方式中，细胞结合剂包括结合整联蛋白ανβ6的肽。肽在XYS上针对ανβ6可以是选择性的。
在一个实施方式中，细胞结合剂包含A20FMDV-Cys多肽。A20FMDV-Cys具有序列：NAVPNLRGDLQVLAQKVARTC。可替代地，可以使用A20FMDV-Cys序列的变体，其中用另一氨基酸残基取代一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个氨基酸残基。
在一个实施方式中，抗体是单克隆抗体；嵌合抗体；人源化抗体；完全人类抗体；或单链抗体。在一个实施方式中，抗体是具有生物活性的这些抗体之一的片段。这些片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段。
在这些实施方式中，每一抗体可以连接至一个或几个二聚体吡咯并苯并二氮杂基团。吡咯并苯并二氮杂与细胞结合剂的优选比率如上所给出。
抗体可以是域抗体(DAB)。
在一个实施方式中，抗体是单克隆抗体。
本发明中使用的抗体包括在WO2005/082023中描述的那些抗体，该专利结合于本文中。特别优选的是对于那些肿瘤相关抗原的抗体。本领域已知这些抗原的实例包括，但不限于，那些描述于WO2005/082023的肿瘤相关的抗原，参见，例如，第41-55页。
本发明的结合物经过设计而经由其细胞表面抗原靶向肿瘤细胞。抗原通常是过度表达或异常倍数表达的正常细胞表面抗原。理想地，靶抗原仅 仅表达于增生性细胞(优选肿瘤细胞)上，然而，这种情况很少在实践中观察到。因此，通常基于增生性和健康组织之间的差异表达选择靶抗原。
肿瘤相关的抗原(TAA)在本领域内是已知的，并能够制备用于使用本领域内众所周知的方法和信息产生抗体。在试图发现对癌诊断和治疗有效的细胞靶的努力中，研究人员正如相比于一种或多种正常的非癌细胞已设法识别特异性表达于一种或多种类型的癌细胞表面上的跨膜多肽或要不然是肿瘤相关的多肽。通常，这种肿瘤相关的多肽相比于非癌细胞的表面上更丰富地表达于癌细胞的表面上。识别这种肿瘤相关的细胞表面抗原多肽，已经产生了特异性靶向癌细胞而经由抗体-基疗法进行破坏的能力。
TAA的实例包括，但不限于，以下列出的TAA(1)-(36)。为方便起见，有关这些抗原的信息(其所有这些都是本领域中已知的)列于下面，并包括名称、替代名称、GenBank登录号和主参考文献、接着是“生物技术信息国家中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)(NCBI)”的核酸和蛋白序列标识约定。能够在公共数据库如GenBank中获得对应于TAA(1)-(36)的核酸和蛋白序列。由抗体靶向的肿瘤相关抗原包括所有的氨基酸序列变体和同种型，其具有相对于所引用的参考文献中确定的序列至少约70％、80％、85％、90％或95％的序列同一性，或其表现出基本上与具有所引用的参考文献中找到的序列的TAA相同的生物学性质或特性。例如，具有变体序列的TAA一般能够特异性结合至特异性结合至具有所列出的相应序列的TAA的抗体。在本文中专门引用的参考文献中的序列和公开内容都明确通过引用结合于此。
肿瘤相关的抗原(1)-(36)：
(1)BMPR1B(骨形态生成蛋白受体-IB型，GenBank登录号NM_001203)tenDijke，P.,etalScience264(5155):101-104(1994)，Oncogene14(11):1377-1382(1997))；WO2004/063362(权利要求2)；WO2003/042661(权利要求12)；US2003/134790-A1(第38-39页)；WO2002/102235(权利要求13；第296页)；WO2003/055443(第91-92页)；WO2002/99122(实施例2；第528-530页)；WO2003/029421(权利要求6)；WO2003/024392(权利要求2；图112)；WO2002/98358(权利要求1；第183页)；WO2002/54940(第100-101页)；WO2002/59377(第349-350页)；WO2002/30268(权利要求27；第376页)；WO2001/48204(实施例；图4)；NP_001194骨形态生成蛋白 受体，IB型/pid＝NP_001194.1.交叉引用：MIM:603248；NP_001194.1；AY065994。
(2)E16(LAT1、SLC7A5，GenBank登录号NM_003486)Biochem.Biophys.Res.Commun.255(2)，283-288(1999)，Nature395(6699):288-291(1998)，Gaugitsch，H.W.,etal(1992)J.Biol.Chem.267(16):11267-11273)；WO2004/048938(实施例2)；WO2004/032842(实施例IV)；WO2003/042661(权利要求12)；WO2003/016475(权利要求1)；WO2002/78524(实施例2)；WO2002/99074(权利要求19；第127-129页)；WO2002/86443(权利要求27；第222，393页)；WO2003/003906(权利要求10；第293页)；WO2002/64798(权利要求33；第93-95页)；WO2000/14228(权利要求5；第133-136页)；US2003/224454(图3)；WO2003/025138(权利要求12；第150页)；NP_003477溶质载体家族7(阳离子氨基酸转运子，y+系统)，成员5/pid＝NP_003477.3-智人；交叉引用：MIM:600182；NP_003477.3；NM_015923；NM_003486_1。
(3)STEAP1(前列腺的六个跨膜上皮抗原，GenBank登录号NM_012449)；CancerRes.61(15)，5857-5860(2001)，Hubert，R.S.,etal(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(25):14523-14528)；WO2004/065577(权利要求6)；WO2004/027049(图1L)；EP1394274(实施例11)；WO2004/016225(权利要求2)；WO2003/042661(权利要求12)；US2003/157089(实施例5)；US2003/185830(实施例5)；US2003/064397(图2)；WO2002/89747(实施例5；第618-619页)；WO2003/022995(实施例9；图13A，实施例53；第173页，实施例2；图2A)；NP_036581前列腺的六个跨膜上皮抗原；交叉引用：MIM:604415；NP_036581.1；NM_012449_1。
(4)0772P(CA125、MUC16，GenBank登录号AF361486)；J.Biol.Chem.276(29):27371-27375(2001)；WO2004/045553(权利要求14)；WO2002/92836(权利要求6；图12)；WO2002/83866(权利要求15；第116-121页)；US2003/124140(实施例16)；交叉引用：GI:34501467；AAK74120.3；AF361486_1。
(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核细胞增效因子、间皮素，GenBank登录号NM_005823)Yamaguchi，N.,etalBiol.Chem.269(2)，805-808(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(20):11531-11536(1999)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(1):136-140(1996)，J.Biol.Chem. 270(37):21984-21990(1995))；WO2003/101283(权利要求14)；(WO2002/102235(权利要求13；第287-288页)；WO2002/101075(权利要求4；第308-309页)；WO2002/71928(第320-321页)；WO94/10312(第52-57页)；交叉引用：MIM:601051；NP_005814.2；NM_005823_1。
(6)Napi3b(NAPI-3B、NaPi2B、NPTIIb、SLC34A2、溶质载体家族34(磷酸钠)，成员2、II型钠依赖型磷酸盐转运蛋白3b，GenBank登录号NM_006424)J.Biol.Chem.277(22):19665-19672(2002)，Genomics62(2):281-284(1999)，Feild，J.A.,etal(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.258(3):578-582)；WO2004/022778(权利要求2)；EP1394274(实施例11)；WO2002/102235(权利要求13；第326页)；EP0875569(权利要求1；第17-19页)；WO2001/57188(权利要求20；第329页)；WO2004/032842(实施例IV)；WO2001/75177(权利要求24；第139-140页)；交叉引用：MIM:604217；NP_006415.1；NM_006424_1。
(7)Sema5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、臂板蛋白5bHlog、sema域、七个钙结合糖蛋白重复体(1型和1型样)、跨膜域(TM)和短胞质域、(臂板蛋白)5B，GenBank登录号AB040878)；NagaseT.,etal(2000)DNARes.7(2):143-150)；WO2004/000997(权利要求1)；WO2003/003984(权利要求1)；WO2002/06339(权利要求1；第50页)；WO2001/88133(权利要求1；第41-43，48-58页)；WO2003/054152(权利要求20)；WO2003/101400(权利要求11)；登录号：Q9P283；EMBL；AB040878；BAA95969.1.Genew；HGNC:10737。
(8)PSCAhlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKENcDNA2700050C12、RIKENcDNA2700050C12基因，GenBank登录号AY358628)；Rossetal(2002)CancerRes.62:2546-2553；US2003/129192(权利要求2)；US2004/044180(权利要求12)；US2004/044179(权利要求11)；US2003/096961(权利要求11)；US2003/232056(实施例5)；WO2003/105758(权利要求12)；US2003/206918(实施例5)；EP1347046(权利要求1)；WO2003/025148(权利要求20)；交叉引用：GI:37182378；AAQ88991.1；AY358628_1。
(9)ETBR(内皮缩血管肽B型受体，GenBank登录号AY275463)；NakamutaM.,etalBiochem.Biophys.Res.Commun.177，34-39，1991；OgawaY.,etalBiochem.Biophys.Res.Commun.178，248-255，1991；AraiH., etalJpn.Circ.J.56，1303-1307，1992；AraiH.,etalJ.Biol.Chem.268，3463-3470，1993；SakamotoA.,YanagisawaM.,etalBiochem.Biophys.Res.Commun.178，656-663，1991；ElshourbagyN.A.,etalJ.Biol.Chem.268，3873-3879，1993；HaendlerB.,etalJ.Cardiovasc.Pharmacol.20，s1-S4，1992；TsutsumiM.,etalGene228，43-49，1999；StrausbergR.L.,etalProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99，16899-16903，2002；BourgeoisC.,etalJ.Clin.Endocrinol.Metab.82，3116-3123，1997；OkamotoY.,etalBiol.Chem.272，21589-21596，1997；VerheijJ.B.,etalAm.J.Med.Genet.108，223-225，2002；HofstraR.M.W.,etalEur.J.Hum.Genet.5，180-185，1997；Puffenberger例如，etalCell79，1257-1266，1994；AttieT.,etal，Hum.Mol.Genet.4，2407-2409，1995；AuricchioA.,etalHum.Mol.Genet.5:351-354，1996；AmielJ.,etalHum.Mol.Genet.5，355-357，1996；HofstraR.M.W.,etalNat.Genet.12，445-447，1996；SvenssonP.J.,etalHum.Genet.103，145-148，1998；FuchsS.,etalMol.Med.7，115-124，2001；PingaultV.,etal(2002)Hum.Genet.111，198-206；WO2004/045516(权利要求1)；WO2004/048938(实施例2)；WO2004/040000(权利要求151)；WO2003/087768(权利要求1)；WO2003/016475(权利要求1)；WO2003/016475(权利要求1)；WO2002/61087(图1)；WO2003/016494(图6)；WO2003/025138(权利要求12；第144页)；WO2001/98351(权利要求1；第124-125页)；EP0522868(权利要求8；图2)；WO2001/77172(权利要求1；第297-299页)；US2003/109676；US6518404(图3)；US5773223(权利要求1a；第31-34列)；WO2004/001004。
(10)MSG783(RNF124、假定蛋白FLJ20315，GenBank登录号NM_017763)；WO2003/104275(权利要求1)；WO2004/046342(实施例2)；WO2003/042661(权利要求12)；WO2003/083074(权利要求14；第61页)；WO2003/018621(权利要求1)；WO2003/024392(权利要求2；图93)；WO2001/66689(实施例6)；交叉引用：基因座ID:54894；NP_060233.2；NM_017763_1。
(11)STEAP2(HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相关的基因1、前列腺癌相关的蛋白1、前列腺的六个跨膜上皮抗原2、六个跨膜前列腺蛋白，GenBank登录号AF455138)；Lab.Invest.82(11):1573-1582(2002))；WO2003/087306；US2003/064397(权利要 求1；图1)；WO2002/72596(权利要求13；第54-55页)；WO2001/72962(权利要求1；图4B)；WO2003/104270(权利要求11)；WO2003/104270(权利要求16)；US2004/005598(权利要求22)；WO2003/042661(权利要求12)；US2003/060612(权利要求12；图10)；WO2002/26822(权利要求23；图2)；WO2002/16429(权利要求12；图10)；交叉引用：GI:22655488；AAN04080.1；AF455138_1。
(12)TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬时受体电位阳离子通道，子家族M，成员4，GenBank登录号NM_017636)；Xu，X.Z.,etalProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(19):10692-10697(2001)，Cell109(3):397-407(2002)，J.Biol.Chem.278(33):30813-30820(2003))；US2003/143557(权利要求4)；WO2000/40614(权利要求14；第100-103页)；WO2002/10382(权利要求1；图9A)；WO2003/042661(权利要求12)；WO2002/30268(权利要求27；第391页)；US2003/219806(权利要求4)；WO2001/62794(权利要求14；图1A-D)；交叉引用：MIM:606936；NP_060106.2；NM_017636_1。
(13)CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎癌衍生的生长因子，GenBank登录号NP_003203或NM_003212)；Ciccodicola，A.,etalEMBOJ.8(7):1987-1991(1989)，Am.J.Hum.Genet.49(3):555-565(1991))；US2003/224411(权利要求1)；WO2003/083041(实施例1)；WO2003/034984(权利要求12)；WO2002/88170(权利要求2；第52-53页)；WO2003/024392(权利要求2；图58)；WO2002/16413(权利要求1；第94-95，105页)；WO2002/22808(权利要求2；图1)；US5854399(实施例2；第17-18列)；US5792616(图2)；交叉引用：MIM:187395；NP_003203.1；NM_003212_1。
(14)CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/爱泼斯坦巴尔病毒受体)或Hs.73792GenBank登录号M26004)；Fujisakuetal(1989)J.Biol.Chem.264(4):2118-2125)；WeisJ.J.,etalJ.Exp.Med.167，1047-1066，1988；MooreM.,etalProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84，9194-9198，1987；BarelM.,etalMol.Immunol.35，1025-1031，1998；WeisJ.J.,etalProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83，5639-5643，1986；SinhaS.K.,etal(1993)J.Immunol.150，5311-5320；WO2004/045520(实施例4)；US2004/005538(实施例1)；WO2003/062401(权利要求9)；WO2004/045520(实施例4)；WO91/02536(图 9.1-9.9)；WO2004/020595(权利要求1)；登录号：P20023；Q13866；Q14212；EMBL；M26004；AAA35786.1。
(15)CD79b(CD79B、CD79β、IGb(免疫球蛋白-相关的β)、B29、GenBank登录号NM_000626或11038674)；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(7):4126-4131，Blood(2002)100(9):3068-3076，Mulleretal(1992)Eur.J.Immunol.22(6):1621-1625)；WO2004/016225(权利要求2，图140)；WO2003/087768，US2004/101874(权利要求1，第102页)；WO2003/062401(权利要求9)；WO2002/78524(实施例2)；US2002/150573(权利要求5，第15页)；US5644033；WO2003/048202(权利要求1，第306和309页)；WO99/58658，US6534482(权利要求13，图17A/B)；WO2000/55351(权利要求11，第1145-1146页)；交叉引用：MIM:147245；NP_000617.1；NM_000626_1。
(16)FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含SH2域磷酸酶锚链蛋白1a)、SPAP1B、SPAP1C，GenBank登录号NM_030764，AY358130)；GenomeRes.13(10):2265-2270(2003)，Immunogenetics54(2):87-95(2002)，Blood99(8):2662-2669(2002)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(17):9772-9777(2001)，Xu，M.J.,etal(2001)Biochem.Biophys.Res.Commun.280(3):768-775；WO2004/016225(权利要求2)；WO2003/077836；WO2001/38490(权利要求5；图18D-1-18D-2)；WO2003/097803(权利要求12)；WO2003/089624(权利要求25)；交叉引用：MIM:606509；NP_110391.2；NM_030764_1。
(17)HER2(ErbB2，GenBank登录号M11730)；CoussensL.,etalScience(1985)230(4730):1132-1139)；YamamotoT.,etalNature319，230-234，1986；SembaK.,etalProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82，6497-6501，1985；SwierczJ.M.,etalJ.CellBiol.165，869-880，2004；KuhnsJ.J.,etalJ.Biol.Chem.274，36422-36427，1999；ChoH.-S.,etalNature421，756-760，2003；EhsaniA.,etal(1993)Genomics15，426-429；WO2004/048938(实施例2)；WO2004/027049(图1I)；WO2004/009622；WO2003/081210；WO2003/089904(权利要求9)；WO2003/016475(权利要求1)；US2003/118592；WO2003/008537(权利要求1)；WO2003/055439(权利要求29；图1A-B)；WO2003/025228(权利要求37；图5C)；WO2002/22636(实施例13；第95-107页)；WO2002/12341(权利要求68；图7)； WO2002/13847(第71-74页)；WO2002/14503(第114-117页)；WO2001/53463(权利要求2；第41-46页)；WO2001/41787(第15页)；WO2000/44899(权利要求52；图7)；WO2000/20579(权利要求3；图2)；US5869445(权利要求3；第31-38列)；WO9630514(权利要求2；第56-61页)；EP1439393(权利要求7)；WO2004/043361(权利要求7)；WO2004/022709；WO2001/00244(实施例3；图4)；登录号：P04626；EMBL；M11767；AAA35808.1.EMBL；M11761；AAA35808.1。在某些实施方式中，本发明的结合物化合物包含抗HER2抗体。在本发明的一个实施方式中，本发明的ADC的抗HER2抗体包含人源化的抗HER2抗体，例如，huMAb4D5-1，huMAb4D5-2，huMAb4D5-3，huMAb4D5-4，huMAb4D5-5，huMAb4D5-6，huMAb4D5-7和huMAb4D5-8，正如US5821337的表3中。这些抗体包含具有结合至HER2的鼠抗体(4D5)的互补性决定区的人类框架区。人源化抗体huMAb4D5-8也称为曲妥珠单抗，市售的商品名为HERCEPTIN(赫塞汀)。在本发明的另一个实施方式中，本发明ADC的抗HER2抗体包括人源化抗HER2抗体，例如，人源化2C4，正如US7862817中的描述。示例性人源化2C4抗体是帕妥珠单抗，以商品名PERJETA可商购获得。
(18)NCA(CEACAM6，GenBank登录号M18728)；BarnettT.,etalGenomics3，59-66，1988；TawaragiY.,etalBiochem.Biophys.Res.Commun.150，89-96，1988；StrausbergR.L.,etalProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:16899-16903，2002；WO2004/063709；EP1439393(权利要求7)；WO2004/044178(实施例4)；WO2004/031238；WO2003/042661(权利要求12)；WO2002/78524(实施例2)；WO2002/86443(权利要求27；第427页)；WO2002/60317(权利要求2)；登录号：P40199；Q14920；EMBL；M29541；AAA59915.1.EMBL；M18728。
(19)MDP(DPEP1，GenBank登录号BC017023)；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26):16899-16903(2002))；WO2003/016475(权利要求1)；WO2002/64798(权利要求33；第85-87页)；JP05003790(图6-8)；WO99/46284(图9)；交叉引用：MIM:179780；AAH17023.1；BC017023_1。
(20)IL20Rα(IL20Ra、ZCYTOR7，GenBank登录号AF184971)；ClarkH.F.,etalGenomeRes.13，2265-2270，2003；MungallA.J.,etalNature425，805-811，2003；BlumbergH.,etalCell104，9-19，2001；DumoutierL.,et alJ.Immunol.167，3545-3549，2001；Parrish-NovakJ.,etalJ.Biol.Chem.277，47517-47523，2002；PletnevS.,etal(2003)Biochemistry42:12617-12624；SheikhF.,etal(2004)J.Immunol.172，2006-2010；EP1394274(实施例11)；US2004/005320(实施例5)；WO2003/029262(第74-75页)；WO2003/002717(权利要求2；第63页)；WO2002/22153(第45-47页)；US2002/042366(第20-21页)；WO2001/46261(第57-59页)；WO2001/46232(第63-65页)；WO98/37193(权利要求1；第55-59页)；登录号：Q9UHF4；Q6UWA9；Q96SH8；EMBL；AF184971；AAF01320.1。
(21)短缩素(BCAN、BEHAB，GenBank登录号AF229053)；GaryS.C.,etalGene256，139-147，2000；ClarkH.F.,etalGenomeRes.13，2265-2270，2003；StrausbergR.L.,etalProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99，16899-16903，2002；US2003/186372(权利要求11)；US2003/186373(权利要求11)；US2003/119131(权利要求1；图52)；US2003/119122(权利要求1；图52)；US2003/119126(权利要求1)；US2003/119121(权利要求1；图52)；US2003/119129(权利要求1)；US2003/119130(权利要求1)；US2003/119128(权利要求1；图52)；US2003/119125(权利要求1)；WO2003/016475(权利要求1)；WO2002/02634(权利要求1)。
(22)EphB2R(DRT、ERK、Hek5、EPHT3，Tyro5，GenBank登录号NM_004442)；Chan,J.andWatt，V.M.,Oncogene6(6)，1057-1061(1991)Oncogene10(5):897-905(1995)，Annu.Rev.Neurosci.21:309-345(1998)，Int.Rev.Cytol.196:177-244(2000))；WO2003042661(权利要求12)；WO200053216(权利要求1；第41页)；WO2004065576(权利要求1)；WO2004020583(权利要求9)；WO2003004529(第128-132页)；WO200053216(权利要求1；第42页)；交叉引用：MIM:600997；NP_004433.2；NM_004442_1。
(23)ASLG659(B7h，GenBank登录号AX092328)；US2004/0101899(权利要求2)；WO2003104399(权利要求11)；WO2004000221(图3)；US2003/165504(权利要求1)；US2003/124140(实施例2)；US2003/065143(图60)；WO2002/102235(权利要求13；第299页)；US2003/091580(实施例2)；WO2002/10187(权利要求6；图10)；WO2001/94641(权利要求12；图7b)；WO2002/02624(权利要求13；图1A-1B)；US2002/034749(权利要求54；第45-46页)；WO2002/06317(实施例2；第320-321页，权利要求34； 第321-322页)；WO2002/71928(第468-469页)；WO2002/02587(实施例1；图1)；WO2001/40269(实施例3；第190-192页)；WO2000/36107(实施例2；第205-207页)；WO2004/053079(权利要求12)；WO2003/004989(权利要求1)；WO2002/71928(第233-234，452-453页)；WO01/16318。
(24)PSCA(前列腺干细胞抗原前体，GenBank登录号AJ297436)；ReiterR.E.,etalProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95，1735-1740，1998；GuZ.,etalOncogene19，1288-1296，2000；Biochem.Biophys.Res.Commun.(2000)275(3):783-788；WO2004/022709；EP1394274(实施例11)；US2004/018553(权利要求17)；WO2003/008537(权利要求1)；WO2002/81646(权利要求1；第164页)；WO2003/003906(权利要求10；第288页)；WO2001/40309(实施例1；图17)；US2001/055751(实施例1；图1b)；WO2000/32752(权利要求18；图1)；WO98/51805(权利要求17；第97页)；WO98/51824(权利要求10；第94页)；WO98/40403(权利要求2；图1B)；登录号：O43653；EMBL；AF043498；AAC39607.1。
(25)GEDA(GenBank登录号AY260763)；AAP14954脂肪瘤HMGIC类融合配对体的蛋白/pid＝AAP14954.1-智人(人类)；WO2003/054152(权利要求20)；WO2003/000842(权利要求1)；WO2003/023013(实施例3，权利要求20)；US2003/194704(权利要求45)；交叉引用：GI:30102449；AAP14954.1；AY260763_1。
(26)BAFF-R(B细胞-活化因子受体、BLyS受体3、BR3，GenBank登录号AF116456)；BAFF受体/pid＝NP_443177.1-智人：Thompson，J.S.,etalScience293(5537)，2108-2111(2001)；WO2004/058309；WO2004/011611；WO2003/045422(实施例；第32-33页)；WO2003/014294(权利要求35；图6B)；WO2003/035846(权利要求70；第615-616页)；WO2002/94852(第136-137列)；WO2002/38766(权利要求3；第133页)；WO2002/24909(实施例3；图3)；交叉引用：MIM:606269；NP_443177.1；NM_052945_1；AF132600。
(27)CD22(B-细胞受体CD22-B同种型、BL-CAM、Lyb-8、Lyb8、SIGLEC-2、FLJ22814，GenBank登录号AK026467)；Wilsonetal(1991)J.Exp.Med.173:137-146；WO2003/072036(权利要求1；图1)；交叉引用：MIM:107266；NP_001762.1；NM_001771_1。
(28)CD79a(CD79A、CD79α、免疫球蛋白相关的α，与Igβ(CD79B)共价相互作用并在与IgM分子在表面上形成配合物的B细胞特异性的蛋白，转导涉及于B-细胞分化的信号)，pI：4.84，MW：25028TM：2[P]基因染色体：19q13.2，GenBank登录号NP_001774.10)；WO2003/088808，US2003/0228319；WO2003/062401(权利要求9)；US2002/150573(权利要求4，第13-14页)；WO99/58658(权利要求13，图16)；WO92/07574(图1)；US5644033；Haetal(1992)J.Immunol.148(5):1526-1531；Mülleretal(1992)Eur.J.Immunol..22:1621-1625；Hashimotoetal(1994)Immunogenetics40(4):287-295；Preud’hommeetal(1992)Clin.Exp.Immunol.90(1):141-146；Yuetal(1992)J.Immunol.148(2)633-637；Sakaguchietal(1988)EMBOJ.7(11):3457-3464。
(29)CXCR5(伯基特(Burkitt)淋巴瘤受体1，通过CXCL13趋化因子活化，在淋巴细胞迁移和体液防御中发挥功能，在HIV-2感染中扮演一定角色而或许发展AIDS，淋巴瘤，骨髓瘤和白血病的G蛋白-偶联受体)；372aa，pI：8.54MW：41959TM：7[P]基因染色体：11q23.3，GenBank登录号NP_001707.1)；WO2004/040000；WO2004/015426；US2003/105292(实施例2)；US6555339(实施例2)；WO2002/61087(图1)；WO2001/57188(权利要求20，第269页)；WO2001/72830(第12-13页)；WO2000/22129(实施例1，第152-153页，实施例2，第254-256页)；WO99/28468(权利要求1，第38页)；US5440021(实施例2，第49-52列)；WO94/28931(第56-58页)；WO92/17497(权利要求7，图5)；Dobneretal(1992)Eur.J.Immunol.22:2795-2799；Barellaetal(1995)Biochem.J.309:773-779。
(30)HLA-DOB(结合肽并将其呈递于CD4+T淋巴细胞的MHCII类分子的β亚单位(Ia抗原))；273aa，pI：6.56，MW：30820.TM：1[P]基因染色体：6p21.3，GenBank登录号NP_002111.1)；Tonnelleetal(1985)EMBOJ.4(11):2839-2847；Jonssonetal(1989)Immunogenetics29(6):411-413；Becketal(1992)J.Mol.Biol.228:433-441；Strausbergetal(2002)Proc.Natl.Acad.SciUSA99:16899-16903；Serveniusetal(1987)J.Biol.Chem.262:8759-8766；Becketal(1996)J.Mol.Biol.255:1-13；Naruseetal(2002)TissueAntigen59:512-519；WO99/58658(权利要求13，图15)；US6153408(第35-38列)；US5976551(第168-170列)；US6011146(第145-146列)；Kasaharaet al(1989)Immunogenetics30(1):66-68；Larhammaretal(1985)J.Biol.Chem.260(26):14111-14119。
(31)P2X5(嘌啉能受体P2X配体门控离子通道5，由胞外ATP门控的离子通道，可以参与突触传递和神经发生，缺乏可能有助于特发性逼尿肌不稳定的病理生理学)；422aa)，pI：7.63，MW：47206TM：1[P]基因染色体：17p13.3，GenBank登录号NP_002552.2)；Leetal(1997)FEBSLett.418(1-2):195-199；WO2004/047749；WO2003/072035(权利要求10)；Touchmanetal(2000)GenomeRes.10:165-173；WO2002/22660(权利要求20)；WO2003/093444(权利要求1)；WO2003/087768(权利要求1)；WO2003/029277(第82页)。
(32)CD72(B-细胞分化抗原CD72，Lyb-2)；359aa，pI：8.66，MW：40225，TM：1[P]基因染色体：9p13.3，GenBank登录号NP_001773.1)；WO2004042346(权利要求65)；WO2003/026493(第51-52，57-58页)；WO2000/75655(第105-106页)；VonHoegenetal(1990)J.Immunol.144(12):4870-4877；Strausbergetal(2002)Proc.Natl.Acad.SciUSA99:16899-16903。
(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)，富亮氨酸重复(LRR)家族的I型膜蛋白，调节B-细胞活化和细胞凋亡，功能缺失与患有系统性红斑狼疮的患者中疾病活性增长有关)；661aa，pI：6.20，MW：74147TM：1[P]基因染色体：5q12，GenBank登录号NP_005573.1)；US2002/193567；WO97/07198(权利要求11，第39-42页)；Miuraetal(1996)Genomics38(3):299-304；Miuraetal(1998)Blood92:2815-2822；WO2003/083047；WO97/44452(权利要求8，第57-61页)；WO2000/12130(第24-26页)。
(34)FcRH1(Fc受体样蛋白1，包含C2型类Ig和ITAM域的免疫球蛋白Fc域的推定受体，在B-淋巴细胞分化中可能具有一定作用)；429aa，pI：5.28，MW：46925TM：1[P]基因染色体：1q21-1q22，GenBank登录号NP_443170.1)；WO2003/077836；WO2001/38490(权利要求6，图18E-1-18-E-2)；Davisetal(2001)Proc.Natl.Acad.SciUSA98(17):9772-9777；WO2003/089624(权利要求8)；EP1347046(权利要求1)；WO2003/089624(权利要求7)。
(35)IRTA2(免疫球蛋白超家族受体易位相关的2，在B-细胞发展和淋巴瘤形成中具有可能作用的推定免疫受体；通过易位的基因异常出现在某些B细胞恶性肿瘤中)；977aa，pI：6.88，MW：106468，TM：1[P]基因染色体：1q21，GenBank登录号人类：AF343662、AF343663、AF343664、AF343665、AF369794、AF397453、AK090423、AK090475、AL834187、AY358085；鼠：AK089756、AY158090、AY506558；NP_112571.1；WO2003/024392(权利要求2，图97)；Nakayamaetal(2000)Biochem.Biophys.Res.Commun.277(1):124-127；WO2003/077836；WO2001/38490(权利要求3，图18B-1-18B-2)。
(36)TENB2(TMEFF2，肿瘤抑癌蛋白，TPEF，HPP1，TR，推定跨膜蛋白聚糖，相关于生长因子的EGF/人神经调节蛋白家族和卵泡抑素)；374aa，NCBI登录号：AAD55776，AAF91397，AAG49451，NCBIRefSeq：NP_057276；NCBI基因：23671；OMIM：605734；SwissProtQ9UIK5；GenBank登录号AF179274；AY358907，CAF85723，CQ782436；WO2004/074320；JP2004113151；WO2003/042661；WO2003/009814；EP1295944(第69-70页)；WO2002/30268(第329页)；WO2001/90304；US2004/249130；US2004/022727；WO2004/063355；US2004/197325；US2003/232350；US2004/005563；US2003/124579；Horieetal(2000)Genomics67:146-152；Uchidaetal(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.266:593-602；Liangetal(2000)CancerRes.60:4907-12；Glynne-Jonesetal(2001)IntJCancer.Oct15；94(2):178-84。
(37)CD33(CD33分子，SIGLEC-3，SIGLEC3，p67；CD33抗原(gp67)；gp67；髓细胞表面抗原CD33；结合唾液酸的Ig样凝集素3；结合唾液酸的Ig样凝集素)；核苷酸：GenBank登录号M_23197；GenBank版本号NM_23197.1GI:180097；GenBank记录更新日期：1月23日，201008:47AM；多肽：GenBank登录号AAA51948；GenBank版本号AAA51948.1GI:188098；GenBank记录更新日期：1月23日，201008:47AM；SimmonsD.,etalJ.Immunol.141(8)，2797-2800(1988)；Antibodies：H195(Lintuzumab)-RazaA.,etalLeukLymphoma.2009Aug；50(8):1336-44；US6,759,045(Seattlegenetics/Immunomedics)；mAbOKT9：Sutherland，D.R.etal.ProcNatlAcadSciUSA78(7)：4515-45191981，Schneider,C.,etalJBiolChem257，8516-8522(1982)；mAbE6：Hoogenboom,H.R.,etalJ Immunol144，3211-3217(1990)；US6,590,088(HumanGenomeSciences)-例如，SEQIDNO:1和2和ATCC登录号97521；US7,557,189(Immunogen)-f例如，抗体或及其片段包含含有三个具有SEQIDNO:1-3的氨基酸序列的CDR的重链可变区和包含三个具有SEQIDNO:4-6的氨基酸序列的CDR的轻链可变区。
(38)LGR5/GPR49；核苷酸：GenBank登录号NM_003667；GenBank版本号NM_003667.2GI:24475886；GenBank记录更新日期：2012年7月22日，03:38PM；多肽：GenBank登录号NP_003658；GenBank版本号NP_003658.1GI:4504379；GenBank记录更新日期：2012年7月22日，03:38PM。
亲本抗体也可以是包含白蛋白结合肽(ABP)序列的融合蛋白(Dennisetal.(2002)“AlbuminBindingAsAGeneralStrategyForImprovingThePharmacokineticsOfProteins”JBiolChem.277:35035-35043；WO01/45746)。本发明的抗体包括具有由以下文献教导的ABP序列的融合蛋白：(i)Dennisetal(2002)JBiolChem.277:35035-35043表III和IV，p35038；(ii)US2004/0001827在[0076]行；和(iii)WO01/45746第12-13页，而所有这些都通过引用结合于此。
在一个实施方式中，抗体已经提出特异性靶向肿瘤相关的抗原ανβ6。
可以在作为结合物或作为结合物的部分引入之前进行标记细胞结合剂，例如，以辅助试剂的检测和纯化。标记可以是生物素标记。在另一实施方式中，可以用放射同位素标记细胞结合剂。
取代基
如在本文中所使用的，短语“可选取代”涉及其可以是未取代的或其可以是取代的母基团。
除非另有规定，如在本文中所使用的，术语“取代”涉及其带有一个或多个取代基的母基团。术语“取代基”在本文中是在常规意义上使用并且是指这样的化学部分，其共价连接于，或者如果合适的话，稠合于母基团。各种的取代基是众所周知的，并且用于它们的形成和引入至各种的母基团的方法也是众所周知的。
在优选的实施方式中，本文描述的取代基(其包括可选的取代基)仅限于那些对细胞结合剂没有反应活性的基团。对本发明情况下与细胞结合剂的连接由两个PBD部分之间的桥接通过与细胞结合剂的接头基团形成。位于PBD结构的其他部位上的反应活性官能团可能能够形成与细胞结合剂的另外的键(这可以称之为交联)。这些另外的键可能改变结合物的运输和生物活性。因此，在一些实施方式中，其他取代基仅限于缺少反应活性官能度的那些。
在一个实施方式中，取代基选自由R、OR、SR、NRR’、NO2、卤素、CO2R、COR、CONH2、CONHR和CONRR’组成的组。
在一个实施方式中，取代基选自由R、OR、SR、NRR’、NO2、CO2R、COR、CONH2、CONHR和CONRR’组成的组。
在一个实施方式中，取代基选自由R、OR、SR、NRR’、NO2和卤素组成的组。
在一个实施方式中，取代基选自由R、OR、SR、NRR’和NO2组成的组。
以上提及的实施方式中任何一个可以适用于本文中的取代基中任何一个。可替代地，取代基可以选自以下所列的一种或多种基团。
在下文更详细描述取代基的实例。
C1-12烷基：如在本文中所使用的，术语“C1-12烷基”涉及通过从具有1至12个碳原子的烃化合物的碳原子去除氢原子所获得的单价部分，其可以是脂族或脂环族，并且其可以是饱和或不饱和的(例如部分不饱和的、完全不饱和的)。因此，术语“烷基”包括下文讨论的亚类：烯基、炔基、环烷基等。
饱和烷基的实例包括但不限于甲基(C1)、乙基(C2)、丙基(C3)、丁基(C4)、戊基(C5)、己基(C6)和庚基(C7)。
饱和线性烷基的实例包括但不限于甲基(C1)、乙基(C2)、正丙基(C3)、正丁基(C4)、正戊基(戊基)(C5)、正己基(C6)和正庚基(C7)。
饱和支链烷基的实例包括异丙基(C3)、异丁基(C4)、仲丁基(C4)、叔丁基(C4)、异戊基(C5)和新戊基(C5)。
饱和烷基的实例包括但不限于甲基(C1)、乙基(C2)、丙基(C3)、丁基(C4)、戊基(C5)、己基(C6)和庚基(C7)。
饱和线性烷基的实例包括但不限于甲基(C1)、乙基(C2)、正丙基(C3)、正丁基(C4)、正戊基(戊基)(C5)、正己基(C6)和正庚基(C7)。
饱和支链烷基的实例包括异丙基(C3)、异丁基(C4)、仲丁基(C4)、叔丁基(C4)、异戊基(C5)和新戊基(C5)。
烷基基团可以可选地被一个或多个选自O、N(H)和S的杂原子中断。这种基团可以称为“杂烷基”。
C2-12杂烷基：如本文中所使用的，术语“C2-12杂烷基”，涉及通过从具有2至12个碳原子和一个或多个选自O、N(H)和S，优选O和S的杂原子的烃化合物的碳原子除去一个氢原子的单价部分。
杂烷基基团的实例包括，但不限于包含一个或多个类型-(OCH2CH2)-的乙二醇单元的那些。杂烷基基团的末端可以是杂原子的原形(primaryform)，例如-OH、-SH或-NH2。在优选的实施方式中，末端是-CH3。
C2-12烯基：如在本文中所使用的，术语“C2-12烯基”涉及具有一个或多个碳-碳双键的烷基。
不饱和烯基的实例包括但不限于乙烯基(ethenyl)(乙烯基，vinyl，-CH＝CH2)、1-丙烯基(-CH＝CH-CH3)、2-丙烯基(烯丙基，-CH-CH＝CH2)、异丙烯基(1-甲基乙烯基，-C(CH3)＝CH2)、丁烯基(C4)、戊烯基(C5)和己烯基(C6)。
C2-12炔基：如在本文中所使用的，术语“C2-12炔基”涉及具有一个或多个碳-碳三键的烷基。
不饱和炔基的实例包括但不限于乙炔基(-C≡CH)和2-丙炔基(2-propynyl)(炔丙基(propargyl)，-CH2-C≡CH)。
C3-12环烷基：如在本文中所使用的，术语“C3-12环烷基”涉及也是环基的烷基；即，通过从环烃(碳环)化合物的脂环原子去除氢原子所获得的单价部分，该单价部分具有3至7个碳原子，包括3至7个环原子。
环烷基的实例包括但不限于那些环烷基，其源自：
饱和单环烃化合物；
环丙烷(C3)、环丁烷(C4)、环戊烷(C5)、环己烷(C6)、环庚烷(C7)、甲基环丙烷(C4)、二甲基环丙烷(C5)、甲基环丁烷(C5)、二甲基环丁烷(C6)、甲基环戊烷(C6)、二甲基环戊烷(C7)和甲基环己烷(C7)；
不饱和单环烃化合物；
环丙烯(C3)、环丁烯(C4)、环戊烯(C5)、环己烯(C6)、甲基环丙烯(C4)、二甲基环丙烯(C5)、甲基环丁烯(C5)、二甲基环丁烯(C6)、甲基环戊烯(C6)、二甲基环戊烯(C7)和甲基环己烯(C7)；以及
饱和多环烃化合物：
降蒈烷(norcarane)(C7)、降蒎烷(norpinane)(C7)、降莰烷(降冰片烷，norbornane)(C7)。
C3-20杂环基：如在本文中所使用的，术语“C3-20杂环基”涉及通过从杂环化合物的环原子去除氢原子所获得的单价部分，该部分具有3至20个环原子，其中1至10个是环杂原子。优选地，每个环具有3至7个环原子，其中1至4个是环杂原子。
在此上下文中，前缀(例如C3-20、C3-7、C5-6,等)表示环原子的数目或环原子的数目的范围，而不管是碳原子或杂原子。例如，如在本文中所使用的，术语“C5-6杂环基”涉及具有5或6个环原子的杂环基。
单环杂环基的实例包括但不限于源自以下的那些单环杂环基：
N1：氮丙啶(C3)、氮杂环丁烷(C4)、吡咯烷(四氢吡咯)(C5)、吡咯啉(例如，3-吡咯啉、2,5-二氢吡咯)(C5)、2H-吡咯或3H-吡咯(异吡咯，异噁唑)(C5)、哌啶(C6)、二氢吡啶(C6)、四氢吡啶(C6)、氮杂(C7)；
O1：氧杂环丙烷(oxirane)(C3)、氧杂环丁烷(oxetane)(C4)、氧杂环戊烷(四氢呋喃)(C5)、氧杂环戊二烯(氧杂茂，oxole)(二氢呋喃)(C5)、氧杂环己烷(exane)(四氢吡喃)(C6)、二氢吡喃(C6)、吡喃(C6)、氧杂(噁庚，oxepin)(C7)；
S1：硫杂环丙烷(C3)、硫杂环丁烷(C4)、硫杂环戊烷(四氢噻吩)(C5)、硫杂环己烷(四氢噻喃)(C6)、硫杂环庚烷(thiepane)(C7)；
O2：二氧杂环戊烷(C5)、二氧杂环已烷(C6)和二氧杂环庚烷(dioxepane)(C7)；
O3：三氧杂环己烷(C6)；
N2：咪唑烷(C5)、吡唑烷(二偶氮烷)(C5)、咪唑啉(C5)、吡唑啉(二氢吡唑)(C5)、哌嗪(C6)；
N1O1：四氢噁唑(C5)、二氢噁唑(C5)、四氢异噁唑(C5)、二氢异噁唑(C5)、吗啉(C6)、四氢噁嗪(C6)、二氢噁嗪(C6)、噁嗪(C6)；
N1S1：噻唑啉(C5)、噻唑烷(C5)、硫代吗啉(C6)；
N2O1：噁二嗪(C6)；
O1S1：氧硫杂环戊二烯(噁噻吩，oxathiole)(C5)和氧硫杂环己烷(噻噁烷)(C6)；以及
N1O1S1：噁噻嗪(C6)。
取代的单环杂环基的实例包括那些取代的单环杂环基，其源自环形式的糖类，例如，呋喃糖(C5)，如阿拉伯呋喃糖、来苏呋喃糖(lyxofuranose)、呋喃核糖和呋喃木糖(xylofuranse)，以及吡喃糖(C6)，如别吡喃糖(allopyranose)、吡喃阿卓糖、吡喃葡萄糖、吡喃甘露糖、吡喃古洛糖(gulopyranose)、吡喃艾杜糖(idopyranose)、吡喃半乳糖和吡喃塔罗糖(talopyranose)。
C5-20芳基：如在本文中所使用的，术语“C5-20芳基”涉及通过从芳族化合物的芳环原子去除氢原子所获得的单价部分，其具有3至20个环原子。优选地，每个环具有5至7个环原子。
在此上下文中，前缀(例如C3-20、C5-7、C5-6等)表示环原子(碳原子或杂原子)的数目或环原子的数目的范围。例如，如在本文中所使用的，术语“C5-6芳基”涉及具有5或6个环原子的芳基。
环原子可以都是碳原子，如在“碳芳基”中。
碳芳基的实例包括但不限于源自以下的那些碳芳基：苯(即苯基)(C6)、萘(C10)、薁(甘菊环)(C10)、蒽(C14)、菲(C14)、萘并萘(C18)和芘(C16)。
包含稠环(其至少之一是芳环)的芳基的实例包括但不限于源自以下的基团：茚满(例如2,3-二氢-1H-茚)(C9)、茚(C9)、异茚(C9)、四氢化萘(1,2,3,4-四氢萘(C10)、苊(C12)、芴(C13)、非那烯(C13)、醋菲(C15)和醋蒽(C16)。
可替换地，环原子可以包括一个或多个杂原子，如在“杂芳基”中。单环杂芳基的实例包括但不限于源自以下的那些：
N1：吡咯(Pyrrole)(唑，azole)(C5)、吡啶(吖嗪)(C6)；
O1：呋喃(氧杂茂，oxole)(C5)；
S1：噻吩(thiophene)(噻吩，thiole)(C5)；
N1O1：噁唑(C5)、异噁唑(C5)、异噁嗪(C6)；
N2O1：噁二唑(呋咱)(C5)；
N3O1：噁三唑(C5)；
N1S1：噻唑(C5)、异噻唑(C5)；
N2：咪唑(1,3-二唑)(C5)、吡唑(1,2-二唑)(C5)、哒嗪(1,2-二嗪)(C6)、嘧啶(1,3-二嗪)(C6)(例如，胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)、吡嗪(1,4-二嗪)(C6)；
N3：三唑(C5)、三嗪(C6)；以及
N4：四唑(C5)。
包含稠环的杂芳基的实例包括但不限于：
源自以下的C9(具有2个稠环)：苯并呋喃(O1)、异苯并呋喃(O1)、吲哚(N1)、异吲哚(N1)、氮茚(N1)、吲哚啉(N1)、异吲哚啉(N1)、嘌呤(N4)(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤)、苯并咪唑(N2)、吲唑(N2)、苯并噁唑(N1O1)、苯并异噁唑(N1O1)、苯并二氧杂环戊二烯(苯并二噁茂)(O2)、苯并呋咱(N2O1)、苯并三唑(N3)、苯并噻吩(S1)、苯并噻唑(N1S1)、苯并噻二唑(N2S)；
源自以下的C10(具有2个稠环)：色烯(O1)、异色烯(O1)、色满(chroman)(O1)、异色满(O1)、苯并二噁烷(O2)、喹啉(N1)、异喹啉(N1)、喹嗪(N1)、苯并噁嗪(N1O1)、苯并二嗪(N2)、吡啶并吡啶(N2)、喹喔啉(N2)、喹唑啉(N2)、噌啉(N2)、酞嗪(phthalazine)(N2)、萘啶(二氮杂萘，naphthyridine)(N2)、蝶啶(N4)；
源自以下的C11(具有2个稠环)：苯并二氮杂(N2)；
源自以下的C13(具有3个稠环)：咔唑(N1)、二苯并呋喃(O1)、二苯并噻吩(S1)、咔啉(N2)、呸啶(萘嵌间二氮杂苯，perimidine)(N2)、吡啶并吲哚(N2)；以及
源自以下的C14(具有3个稠环)：吖啶(N1)、呫吨(xanthene)(O1)、噻吨(S1)、噁蒽(oxanthrene)(O2)、吩噁噻(phenoxathiin)(O1S1)、吩嗪(N2)、吩噁嗪(N1O1)、吩噻嗪(N1S1)、噻蒽(S2)、菲啶(N1)、菲咯啉(N2)、吩嗪(N2)。
上述基团，无论单独地或是另一取代基的一部分，可以本身可选地被选自它们本身和以下列出的另外的取代基的一个或多个基团取代。
卤素：-F、-Cl、-Br和-I。
羟基：-OH。
醚：-OR，其中R是醚取代基，例如，C1-7烷基(还被称为C1-7烷氧基，下文讨论的)、C3-20杂环基(还被称为C3-20杂环氧基)或C5-20芳基(还被称为C5-20芳氧基)，优选C1-7烷基。
烷氧基：-OR，其中R是烷基，例如，C1-7烷基。C1-7烷氧基的实例包括但不限于-OMe(甲氧基)、-OEt(乙氧基)、-O(nPr)(正丙氧基)、-O(iPr)(异丙氧基)、-O(nBu)(正丁氧基)、-O(sBu)(仲丁氧基)、-O(iBu)(异丁氧基)和-O(tBu)(叔丁氧基)。
缩醛：-CH(OR1)(OR2)，其中R1和R2独立地是缩醛取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基，或者，在“环状”缩醛基团的情况下，R1和R2连同它们所连接的两个氧原子和它们所连接的碳原子一起形成具有4至8个环原子的杂环。缩醛基团的实例包括但不限于-CH(OMe)2、-CH(OEt)2和-CH(OMe)(OEt)。
半缩醛：-CH(OH)(OR1)，其中R1是半缩醛取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。半缩醛基团的实例包括但不限于-CH(OH)(OMe)和-CH(OH)(OEt)。
缩酮：-CR(OR1)(OR2)，其中R1和R2是如针对缩醛所限定的，以及R是除氢以外的缩酮取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。缩酮基团的实例包括但不限于-C(Me)(OMe)2、-C(Me)(OEt)2、-C(Me)(OMe)(OEt)、-C(Et)(OMe)2、-C(Et)(OEt)2和-C(Et)(OMe)(OEt)。
半缩酮：-CR(OH)(OR1)，其中R1是如针对半缩醛所限定，并且R是除氢以外的半缩酮取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优 选C1-7烷基。半缩醛基团的实例包括但不限于-C(Me)(OH)(OMe)、-C(Et)(OH)(OMe)、-C(Me)(OH)(OEt)和-C(Et)(OH)(OEt)。
氧代(酮基、-酮)：＝O。
硫酮(Thione)(硫代酮，thioketone)：＝S。
亚氨基(亚胺)：＝NR，其中R是亚氨基取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基。酯基的实例包括但不限于＝NH、＝NMe、＝Net和＝NPh。
甲酰基(甲醛，carbaldehyde,carboxaldehyde)：-C(＝O)H。
酰基(酮基)：-C(＝O)R，其中R是酰基取代基，例如，C1-7烷基(还被称为C1-7烷酰基)、C3-20杂环基(还被称为C3-20杂环酰基)或C5-20芳基(还被称为C5-20芳酰基)，优选C1-7烷基。酰基的实例包括但不限于-C(＝O)CH3(乙酰基)、-C(＝O)CH2CH3(丙酰基)、-C(＝O)C(CH3)3(叔丁酰基)和-C(＝O)Ph(苯甲酰基，苯酮)。
羧基(羧酸)：-C(＝O)OH。
硫代羧基(硫代羧酸)：-C(＝S)SH。
巯基代羧基(硫醇羧基，Thiolocarboxy)(巯基代羧酸(硫醇羧酸)，thiolocarboxylicacid)：-C(＝O)SH。
硫羰羧基(硫羰羧酸)：-C(＝S)OH。
亚胺酸(Imidicacid)：-C(＝NH)OH。
异羟肟酸：-C(＝NOH)OH。
酯(羧酸酯(carboxylate,carboxylicacidester)，氧基羰基(oxycarbonyl))：-C(＝O)OR，其中R是酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。酯基的实例包括但不限于-C(＝O)OCH3、-C(＝O)OCH2CH3、-C(＝O)OC(CH3)3和-C(＝O)Oph。
酰氧基(反向酯)：-OC(＝O)R，其中R是酰氧基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。酰氧基的实例包括但不限于-OC(＝O)CH3(乙酰氧基)、-OC(＝O)CH2CH3、-OC(＝O)C(CH3)3、-OC(＝O)Ph、和-OC(＝O)CH2Ph。
氧基羰氧基(Oxycarboyloxy)：-OC(＝O)OR，其中R是酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。酯基的实例包括但不限于-OC(＝O)OCH3、-OC(＝O)OCH2CH3、-OC(＝O)OC(CH3)3和-OC(＝O)Oph。
氨基：-NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，例如，氢、C1-7烷基(还被称为C1-7烷基氨基或二C1-7烷基氨基)、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选H或C1-7烷基，或者，在“环状”氨基的情况下，R1和R2连同它们所连接的氮原子一起形成具有4至8个环原子的杂环。氨基可以是伯氨基(-NH2)、仲氨基(-NHR1)或叔氨基(-NHR1R2)，以及在阳离子形式中，可以是季氨基(-+NR1R2R3)。氨基的实例包括但不限于-NH2、-NHCH3、-NHC(CH3)2、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2和-NHPh。环状氨基的实例包括但不限于氮丙啶基、氮杂环丁烷基、吡咯烷并、哌啶子基(piperidino)、哌嗪子基(piperazino)、吗啉代和硫代吗啉代。
酰氨基(氨基甲酰基，氨基甲酰，氨基羰基，甲酰胺)：-C(＝O)NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，如针对氨基所限定的。酰氨基的实例包括但不限于-C(＝O)NH2、-C(＝O)NHCH3、-C(＝O)N(CH3)2、-C(＝O)NHCH2CH3和-C(＝O)N(CH2CH3)2，以及酰氨基，其中R1和R2连同它们所连接的氮原子一起形成杂环结构，如在，例如，哌啶子基羰基、吗啉代羰基、硫代吗啉代羰基和哌嗪子基羰基中。
硫代酰氨基(硫代氨基甲酰基)：-C(＝S)NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，如针对氨基所限定的。酰氨基的实例包括但不限于-C(＝S)NH2、-C(＝S)NHCH3、-C(＝S)N(CH3)2和-C(＝S)NHCH2CH3。
酰基酰氨基(酰氨基)：-NR1C(＝O)R2，其中R1是酰胺取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基，以及R2是酰基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基。酰胺基团的实例包括但不限于-NHC(＝O)CH3、-NHC(＝O)CH2CH3和-NHC(＝O)Ph。R1和R2可以一起形成环状结构，如在，例如，琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基和苯邻二甲酰亚胺基中：
氨基羰氧基：-OC(＝O)NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，如针对氨基所限定的。氨基羰氧基的实例包括但不限于-OC(＝O)NH2、-OC(＝O)NHMe、-OC(＝O)NMe2和-OC(＝O)NEt2。
脲基：-N(R1)CONR2R3，其中R2和R3独立地是氨基取代基，如针对氨基所限定的，以及R1是脲基取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基。脲基的实例包括但不限于-NHCONH2、-NHCONHMe、-NHCONHEt、-NHCONMe2、-NHCONEt2、-NMeCONH2、-NMeCONHMe、-NMeCONHEt、-NMeCONMe2和-NMeCONEt2。
胍基：-NH-C(＝NH)NH2。
四唑基：具有4个氮原子和一个碳原子的五元芳环，
亚氨基：＝NR，其中R是亚氨基取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选H或C1-7烷基。亚氨基的实例包括但不限于＝NH、＝NMe和＝NEt。
脒(脒基)：-C(＝NR)NR2，其中每个R是脒取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选H或C1-7烷基。脒基团的实例包括但不限于-C(＝NH)NH2、-C(＝NH)NMe2和-C(＝NMe)NMe2。
硝基：-NO2。
亚硝基：-NO。
叠氮基：-N3。
氰基(腈，nitrile，carbonitrile)：-CN。
异氰基：-NC。
氰酰基(Cyanato)：-OCN。
异氰酰基：-NCO。
硫氰基(Thiocyano)(硫氰基)：-SCN。
异硫氰基(isothiocyano)(异硫氰基，isothiocyanato)：-NCS。
巯基(Sulfhydryl)(硫醇，thiol；巯基，mercapto)：-SH。
硫醚(硫化物)：-SR，其中R是硫醚取代基，例如，C1-7烷基(还被称为C1-7烷硫基)、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。C1-7烷硫基的实例包括但不限于-SCH3和-SCH2CH3。
二硫化物：-SS-R，其中R是二硫化物取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基(在本文中还称为C1-7烷基二硫化物)。C1-7烷基二硫化物基团的实例包括但不限于-SSCH3和-SSCH2CH3。
硫肟基(锍化物，sulfine)(亚硫酰基，亚砜)：-S(＝O)R，其中R是硫肟基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。硫肟基基团的实例包括但不限于-S(＝O)CH3和-S(＝O)CH2CH3。
砜(磺酰基)：-S(＝O)2R，其中R是砜取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基，包括，例如，氟化或全氟化C1-7烷基。砜基团的实例包括但不限于-S(＝O)2CH3(甲磺酰基)、-S(＝O)2CF3(三氟甲磺酰基，triflyl)、-S(＝O)2CH2CH3(乙磺酰基，esyl)、-S(＝O)2C4F9(九氟丁磺酰基，nonaflyl)、-S(＝O)2CH2CF3(三氟乙磺酰基，tresyl)、-S(＝O)2CH2CH2NH2(牛磺酰基，tauryl)、-S(＝O)2Ph(苯磺酰，苯磺酰基(besyl))、4-甲基苯磺酰(甲苯磺酰基(tosyl))、4-氯苯磺酰(氯苯磺酰基(closyl))、4-溴苯磺酰(溴苯磺酰基(brosyl))、4-硝基苯基(硝基苯磺酰基(nosyl))、2-萘磺酸酯(萘磺酰基，napsyl)和5-二甲基氨基-萘-1-基磺酸酯(丹磺酰基(dansyl))。
亚磺酸(亚磺基)：-S(＝O)OH、-SO2H。
磺酸(磺基)：-S(＝O)2OH、-SO3H。
亚磺酸酯(sulfinate)(亚磺酸酯，sulfinicacidester)：-S(＝O)OR；其中R是亚磺酸酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。亚磺酸酯基团的实例包括但不限于-S(＝O)OCH3(甲氧基亚硫酰基；亚磺酸甲酯)和-S(＝O)OCH2CH3(乙氧基亚硫酰基；亚磺酸乙酯)。
磺酸酯(sulfonate)(磺酸酯，sulfonicacidester)：-S(＝O)2OR，其中R是磺酸酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。 磺酸酯基团的实例包括但不限于-S(＝O)2OCH3(甲氧基磺酰基；磺酸甲酯)和-S(＝O)2OCH2CH3(乙氧基磺酰基；磺酸乙酯)。
亚磺酰氧基：-OS(＝O)R，其中R是亚硫酰氧基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。亚硫酰氧基的实例包括但不限于-OS(＝O)CH3和-OS(＝O)CH2CH3。
磺酰氧基：-OS(＝O)2R，其中R是磺酰氧基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。磺酰氧基的实例包括但不限于-OS(＝O)2CH3(甲磺酸酯)和-OS(＝O)2CH2CH3(乙磺酸酯)。
硫酸酯：-OS(＝O)2OR；其中R是硫酸酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。硫酸酯基团的实例包括但不限于-OS(＝O)2OCH3和-SO(＝O)2OCH2CH3。
氨磺酰(sulfamyl)(氨磺酰(sulfamoyl)；亚磺酸酰胺；亚磺酰胺)：-S(＝O)NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，如针对氨基所限定的。氨磺酰的实例包括但不限于-S(＝O)NH2、-S(＝O)NH(CH3)、-S(＝O)N(CH3)2、-S(＝O)NH(CH2CH3)、-S(＝O)N(CH2CH3)2和-S(＝O)NHPh。
亚磺酰氨基(亚氨磺酰基；磺酸酰胺；氨磺酰)：-S(＝O)2NR1R2，其中R1和R2独立地是氨基取代基，如针对氨基所限定的。亚磺酰氨基的实例包括但不限于-S(＝O)2NH2、-S(＝O)2NH(CH3)、-S(＝O)2N(CH3)2、-S(＝O)2NH(CH2CH3)、-S(＝O)2N(CH2CH3)2和-S(＝O)2NHPh。
磺氨基：-NR1S(＝O)2OH，其中R1是氨基取代基，如针对氨基所限定的。磺氨基的实例包括但不限于-NHS(＝O)2OH和-N(CH3)S(＝O)2OH。
磺酰氨基(Sulfonamino)：-NR1S(＝O)2R，其中R1是氨基取代基，如针对氨基所限定的，以及R是磺酰氨基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。磺酰氨基的实例包括但不限于-NHS(＝O)2CH3和-N(CH3)S(＝O)2C6H5。
亚磺酰氨基(Sulfinamino)：-NR1S(＝O)R，其中R1是氨基取代基，如针对氨基所限定的，并且R是亚磺酰氨基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂 环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。亚磺酰氨基的实例包括但不限于-NHS(＝O)CH3和-N(CH3)S(＝O)C6H5。
膦基(膦)：-PR2，其中R是膦基取代基，例如，-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。膦基的实例包括但不限于-PH2、-P(CH3)2、-P(CH2CH3)2、-P(t-Bu)2和-P(Ph)2。
二氧磷基：-P(＝O)2。
磷酰基(氧化膦)：-P(＝O)R2，其中R是氧膦基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基或C5-20芳基。磷酰基的实例包括但不限于-P(＝O)(CH3)2、-P(＝O)(CH2CH3)2、-P(＝O)(t-Bu)2和-P(＝O)(Ph)2。
膦酸(膦酰基)：-P(＝O)(OH)2。
膦酸酯(膦酰基酯)：-P(＝O)(OR)2，其中R是膦酸酯取代基，例如，-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。膦酸酯基团的实例包括但不限于-P(＝O)(OCH3)2、-P(＝O)(OCH2CH3)2、-P(＝O)(O-t-Bu)2和-P(＝O)(OPh)2。
磷酸(膦酰氧基)：-OP(＝O)(OH)2。
磷酸酯(膦酰氧基酯)：-OP(＝O)(OR)2，其中R是磷酸酯取代基，例如，-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。磷酸酯基团的实例包括但不限于-OP(＝O)(OCH3)2、-OP(＝O)(OCH2CH3)2、-OP(＝O)(O-t-Bu)2和-OP(＝O)(OPh)2。
亚磷酸：-OP(OH)2。
亚磷酸酯：-OP(OR)2，其中R是亚磷酸酯取代基，例如，-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。亚磷酸酯基团的实例包括但不限于-OP(OCH3)2、-OP(OCH2CH3)2、-OP(O-t-Bu)2和-OP(OPh)2。
亚磷酰胺：-OP(OR1)-NR22，其中R1和R2是亚磷酰胺取代基，例如，-H、(可选取代的)C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。亚磷酰胺基团的实例包括但不限 于-OP(OCH2CH3)-N(CH3)2、-OP(OCH2CH3)-N(i-Pr)2和-OP(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2。
氨基磷酸酯：-OP(＝O)(OR1)-NR22，其中R1和R2是氨基磷酸酯取代基，例如，-H、(可选取代的)C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。氨基磷酸酯基团的实例包括但不限于-OP(＝O)(OCH2CH3)-N(CH3)2、-OP(＝O)(OCH2CH3)-N(i-Pr)2和-OP(＝O)(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2。
亚烷基
C3-12亚烷基：如在本文中所使用的，术语“C3-12亚烷基”涉及通过从具有3至12个碳原子(除非另有规定)的烃化合物的相同碳原子去除两个氢原子或从两个不同的碳原子各去除一个氢原子所获得的二齿部分，其可以是脂族或脂环族，并且其可以是饱和的、部分不饱和的或完全不饱和的。因此，术语“亚烷基”包括下文讨论的以下亚类：亚烯基、亚炔基、环亚烷基等。
直链饱和C3-12亚烷基的实例包括但不限于-(CH2)n-，其中n是3至12的整数，例如，-CH2CH2CH2-(亚丙基)、-CH2CH2CH2CH2-(亚丁基)、-CH2CH2CH2CH2CH2-(亚戊基)和-CH2CH2CH2CH-2CH2CH2CH2-(亚庚基)。
支链饱和C3-12亚烷基的实例包括但不限于-CH(CH3)CH2-、-CH(CH3)CH2CH2-、-CH(CH3)CH2CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-、-CH2CH(CH3)CH2CH2-、-CH(CH2CH3)-、-CH(CH2CH3)CH2-和-CH2CH(CH2CH3)CH2-。
直链部分不饱和的C3-12亚烷基(C3-12亚烯基和亚炔基)的实例包括但不限于-CH＝CH-CH2-、-CH2-CH＝CH2-、-CH＝CH-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH＝CH-、-CH＝CH-CH＝CH-CH2-、-CH＝CH-CH＝CH-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH2-CH＝CH-、-CH＝CH-CH2-CH2-CH＝CH-和-CH2-C≡C-CH2-。
支链部分不饱和的C3-12亚烷基(C3-12亚烯基和亚炔基)的实例包括但不限于-C(CH3)＝CH-。-C(CH3)＝CH-CH2-、-CH＝CH-CH(CH3)-和-C≡C-CH(CH3)-。
脂环族饱和C3-12亚烷基(C3-12环亚烷基)的实例包括但不限于亚环戊基(例如环戊-1,3-亚基)和亚环己基(例如环己-1,4-亚基)。
脂环族部分不饱和的C3-12亚烷基(C3-12环亚烷基)的实例包括但不限于亚环戊烯基(例如4-环戊烯-1,3-亚基)、亚环己烯基(例如2-环己烯-1,4-亚基；3-环己烯-1,2-亚基；2,5-环己二烯-1,4-亚基)。
包括其他形式
除非另有规定，在上文中包括这些取代基的众所周知的离子、盐、溶剂化物和保护形式。例如，提及羧酸(-COOH)还包括其阴离子(羧酸根)形式(-COO-)、盐或溶剂化物，以及常规保护形式。类似地，提及氨基包括氨基的质子化形式(-N+HR1R2)、盐或溶剂化物，例如，盐酸盐，以及氨基的常规保护形式。类似地，提及羟基还包括其阴离子形式(-O-)、盐或溶剂化物，以及常规保护形式。
盐
可以方便的或所期望的是，制备、纯化和/或处理活性化合物的相应盐，例如，药学上可接受的盐。药学上可接受的盐的实例讨论于Berge,etal.,J.Pharm.Sci.,66,1-19(1977)。
例如，如果化合物是阴离子化合物，或具有其可以是阴离子的官能团(例如，-COOH可以是-COO-)，那么可以与合适的阳离子形成盐。适合的无机阳离子的实例包括但不限于碱金属离子如Na+和K+，碱土金属阳离子如Ca2+和Mg2+，以及其他阳离子如Al+3。适合的有机阳离子的实例包括但不限于铵离子(即NH4+)和取代的铵离子(例如NH3R+、NH2R2+、NHR3+、NR4+)。一些适合的取代的铵离子的实例是那些取代的铵离子，其源自：乙胺、二乙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和氨丁三醇(tromethamine)，以及氨基酸，如赖氨酸和精氨酸。常见的季铵离子的实例是N(CH3)4+。
如果化合物是阳离子化合物，或具有其可以是阳离子的官能团(例如-NH2可以是-NH3+)，那么可以与合适的阴离子形成盐。适合的无机阴离子的实例包括但不限于源自以下无机酸的那些：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸和亚磷酸。
适合的有机阴离子的实例包括但不限于源自以下有机酸的那些：2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、樟脑磺酸、肉桂酸、柠檬酸、乙二胺四乙酸、乙烷二磺酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、羟基马来酸、羟基萘甲酸、羟乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、粘酸、油酸、草酸、棕榈酸、扑酸、泛酸、苯乙酸、苯磺酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、对氨基苯磺酸、酒石酸、甲苯磺酸、三氟乙酸和戊酸。适合的高分子有机阴离子的实例包括但不限于那些高分子有机阴离子，其源自以下聚合酸：丹宁酸、羧甲基纤维素。
溶剂化物
可以方便的或所期望地制备、纯化和/或处理活性化合物的相应溶剂化物。术语“溶剂化物”在本文中以常规含义来使用，用来指溶质(例如活性化合物、活性化合物的盐)和溶剂的复合物。如果溶剂是水，溶剂化物可以方便地称作水合物，例如，一水合物、二水合物、三水合物等。
本发明包括其中横过(across)PBD部分的亚胺键添加溶剂的化合物，其示出下文，其中溶剂是水或醇(RAOH，其中RA是C1-4烷基)：
这些形式可以被称为PBD的甲醇胺和甲醇胺醚形式(如在以上关于R10的部分中所描述的)。这些等式的平衡取决于发现化合物的条件以及部分本身的特性。
例如，可以通过冷冻干燥以固体形式来分离这些特定化合物。
异构体
本发明的某些化合物可以以一种或多种特定的几何形式、光学形式、对映体形式、非对映体形式、差向异构体形式、异位异构体(atropic)形式、立体异构体形式、互变异构体形式、构象形式或异头异构体(anomeric)形式，包括但不限于顺式和反式；E型和Z型；c式、t式和r式；内形式和外形式；R型、S型和内消旋型；D型和L型；d型和l型；(+)和(-)形式； 酮式、烯醇式和烯醇化物形式；顺式和反式；向斜形式和背斜形式；α形式和β形式；轴向形式和平伏形式；船式、椅式、扭式、信封式和半椅式；并且它们的组合，在下文中统称为“异构体”(或“异构体形式”)。
术语“手性”是指具有镜像伴侣的非重叠(不可重叠，non-superimposability)性质的分子，而术语“非手性”是指在它们的镜像伴侣上是重叠的分子。
术语“立体异构体”是指具有相同化学构成、但是在空间上原子或基团排布不同的化合物。
“非对映异构体”是指具有两个或多个手性中心、并且其分子相互不是另一个的镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理性质，例如，熔点、沸点、光谱性质和反应性。可以在高的再溶解分析步骤下如电泳和色谱分离非对映异构体的混合物。
“对映异构体”是指化合物的两种立体异构体，其是彼此的非重叠镜像。
本文使用的立体化学限定和规定通常遵循S.P.Parker,Ed.,McGraw-HillDictionaryofChemicalTerms(1984)McGraw-HillBookCompany,NewYork；andEliel,E.andWilen,S.，“StereochemistryofOrganicCompounds”,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,1994。本发明的化合物可以包含不对称或手性中心，因此以不同的立体异构体形式存在。旨在本发明的化合物的所有立体异构体形式包括但不限于非对映异构体、对映异构体和阻转异构体(atropisomer)以及它们的混合物(如外消旋混合物)，形成本发明的一部分。许多有机化合物以光学活性形式存在，即，它们具有使平面偏振光的平面旋转的能力。在描述光学活性化合物中，前缀D和L或R和S用于表示分子关于它的手性中心的绝对构型。使用前缀d和l或(+)和(-)来指定化学物的平面偏振光旋转的符号，其中(-)或l是指化合物是左旋的。前缀为(+)或d的化合物是右旋的。对于给定的化学结构，这些立体异构体除了它们是彼此的镜像外是相同的。特定的立体异构体可以由称为对映异构体，并且经常将这种异构体的混合物称为对映异构体混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋体，这在不具有立体选择性或立体特异性的化学反应或过程中可以发生。术语“外消旋混合物”和“外消旋体”是指两种没有光学活性的对映异构体物质的等摩尔混合物。
要注意的是，除非如下文针对互变异构体形式所讨论的，从术语“异构体”(如在本文中所使用的)明确排除结构(或构造)异构体(即，其差异在于在原子之间的连接而不仅在于原子在空间中的位置的异构体)。例如，提及甲氧基(-OCH3)并不被解释为提及它的结构异构体(羟甲基，-CH2OH)。类似地，提及邻氯苯基并不被解释为提及它的结构异构体(间氯苯基)。然而，提及一类结构可以包括落在上述类型的范围之内的结构异构体形式(例如C1-7烷基包括正丙基和异丙基；丁基包括正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基；甲氧基苯基包括邻甲氧基苯基、间甲氧基苯基和对甲氧基苯基)。
上述排除并不涉及互变异构体形式，如在，例如，以下互变异构体对中：酮/烯醇(如下图所示)、亚胺/烯胺、酰胺/亚氨基醇、脒/脒、亚硝基/肟、硫酮/烯硫醇、N-亚硝基/羟基偶氮和硝基/异硝基中的例如，酮式、烯醇式和烯醇化物形式。
术语“互变异构体”或“互变异构体形式”是指不同能量的结构异构体，其通过低能量势垒是可互变的。例如，质子互变异构体(也称为质子性互变异构体)包括通过质子的迁移的互变现象，如酮-烯醇和亚胺-烯胺异构化。化合价互变异构体包括通过一些成键电子的重组(reorganization)的互变现象。
要注意的是，术语“异构体”特别包括具有一个或多个同位素取代的化合物。例如，H可以是任何同位素形式，包括1H、2H(D)和3H(T)；C可以是任何同位素形式，包括12C、13C和14C；O可以是任何同位素形式，包括16O和18O；等等。
可以结合至本发明的化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，如但不限于2H(氘，D)、3H(氚)、11C、13C、14C、15N、18F、31P、32P、35S、36Cl和125I。本发明的各种同位素标记的化合物，例如放射性同位素如3H、13C、14C并入到这些化合物中。这样的同位素标记的化合物可以用于代谢研究、反应动力学研究、检测或成像技术，如正电子断层扫描成像(PET)或单光子发射计算机断层成像术(SPECT)，包括药物 或底物组织分布分析，或在患者的放射性治疗中。本发明的氘标记的或取代的治疗性化合物可以具有改善的DMPK(药物代谢及药物动力学)性质，涉及分布、代谢以及排泄(ADME)。用较重的同位素(如氘)取代可以提供因更高的代谢稳定性以产生的某种治疗优点，例如，体内半衰期增加或所需的剂量减少。18F标记的化合物对PET或SPECT研究是有用的。本发明的同位素标记的化合物通常能够通过以下制备：实施在如下所述的反应方案或实施例以及制备例中披露的步骤(程序)，用容易获得的同位素标记的试剂代替非同位素标记的试剂。另外，用较重的同位素，尤其是氘(即，2H或D)替代，可以提供因更高的代谢稳定性以产生的某种治疗优点，例如，体内半衰期增加或所需的剂量减少或治疗指数增加。应当理解的是将上下文中的氘视作取代基。这种较重同位素(尤其是氘)的浓度可以通过同位素富集因子来限定。在本发明的化合物中，任何没有明确指明为具体同位素的原子是指该原子的任何稳定的同位素。
除非另外说明，否则提到的具体化合物包括全部这些异构体形式，包括其(全部或部分地)外消旋和其他混合物。用于这种异构体形式的制备(例如，不对称合成)和分离(例如，分步结晶和色谱法)的方法是本领域已知的，或者通过已知的方式调整本文所教导的方法或已知的方法是容易得到的。
生物活性
体外细胞增殖测定
通常，通过以下测量抗体-药物结合物(ADC)的细胞毒性或细胞抑制活性：将具有受体蛋白质，例如HER2的哺乳细胞暴露于细胞培养基中ADC的抗体；培养细胞一段约6小时至约5天的时间段；以及测量细胞生存能力。基于细胞的体外测定用于测量本发明的ADC的生存能力(增殖)、细胞毒性和细胞死亡的诱导(半胱天冬酶激活)。
可以通过细胞增殖测定测量抗体-药物结合物的体外效力。Luminescent细胞生存能力测定仪是商业可获得的(PromegaCorp.,Madison,WI)，基于Coleopteraluciferase的重组表达的同质测定方法(US专利号5583024；5674713和5700670)。该细胞增殖测定基于存在ATP的定量确定培养基中生存细胞的数目，该ATP是代谢活性细胞的指示(Crouchetal(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88；US6602677)。在96孔板中进行测定，使它可经受高通过量筛选(HTS)的检验(Cree etal(1995)AntiCancerDrugs6:398-404)。同种测定步骤涉及直接添加单一试剂(试剂)至培养在补充血清的培养基的细胞。细胞洗涤、除去培养基和多次移液步骤是不需要的。添加试剂和混合之后，在10分钟内体系检测到384孔板中低至15细胞/孔。可以用ADC连续处理细胞，或可以处理细胞并将其与ADC分离。通常，简单处理(即，3小时)的细胞示出与连续处理的细胞的相同效力。
同质的“添加-混合-测量”模式导致胞溶作用和与存在ATP的量成比例的发光(luminescent)信号的产生。ATP的量与存在于培养基中的细胞的数目直接成比例。测定产生由荧光素酶反应产生的“生长型”发光信号，取决于使用的细胞类型和培养基，其具有通常大于5小时的半衰期。生存细胞反应在相对发光单元(RLU)上。通过重组萤火虫荧光素酶与ATP至AMP的伴随转化和光子的产生，底物BeetleLuciferin(甲虫荧光素)被氧化脱羧基。
也可以通过细胞毒性测定测量抗体-药物结合物的体外效力。用PBS洗涤、用胰蛋白酶分离培养的粘附细胞，将其稀释在包含10％FCS的完全培养基中，离心、再悬浮于新鲜培养基中，并用血细胞计数器(haemocytometer)计数。直接计数悬浮培养物。适用于计数的单分散细胞悬浮物可能需要通过重复送气以打散细胞团来搅动悬浮物。
将细胞悬浮物稀释至期望的接种密度并将其分散至黑色的96孔板中(100μl/孔)。孵育粘附细胞系的板过夜以允许粘附。可以在接种当天使用培养的悬浮细胞。
在适当的细胞培养基中制备ADC(20μg/ml)的储备液(1ml)。通过顺序地将100μl转移至900μl的细胞培养基，在15ml离心管中制备储备ADC的一系列10倍稀释液。
在用细胞悬浮液(100μl)铺板之前，将每个ADC稀释液(100μl)的四个重复孔分散在96孔黑板中，得到最终体积200μl。对照孔接收细胞培养基(100μl)。
如果细胞系的倍增时间大于30小时，那么ADC孵育5天，否则在四天内完成孵育。
在孵育时间段最后，用阿尔玛(Alamar)蓝测定评估细胞生存能力。将阿尔玛蓝(Invitrogen)分散在整个板上(20μl/孔)并且孵育4小时。在 Varioskan快速读板器上以570nm激发、585nm发射测量阿尔玛蓝荧光。与对照孔中的平均荧光相比，由ADC处理的孔中的平均荧光计算百分比细胞存活率。
体内效力
可以通过小鼠中肿瘤异种移植(xenograft)研究测定本发明的抗体-药物结合物(ADC)的体内效力。例如，可以过高表达HER2转基因外植体小鼠模型测定本发明的抗HER2ADC的体内效力。同种异体移植(allograft)从对疗法并不响应或响应差的Fo5mmtv转基因小鼠增殖(propagate)。用ADC按照一定的剂量水平(mg/kg)和PBD药物暴露(μg/m2)；以及安慰剂缓冲剂对照物(媒介物，vehicle)处理受试者一次并在两周或更长的时间内监测以测定肿瘤翻倍的时间、细胞杀伤log和肿瘤收缩。
用途
本发明的结合物可被用于在靶向位置提供PBD结合物。
靶向位置优选地是增殖的细胞群体。抗体是用于存在于增殖细胞群体中的抗原的抗体。
在一个实施方式中，与存在于增殖细胞群体(例如，肿瘤细胞群体)中的抗原的量相比，抗原不存在或以降低水平存在于非增殖细胞群体中。
靶向位置可以是体外、体内或离体。
本发明的抗体-药物结合物(ADC)化合物包括具有用于抗癌活性效用的那些。具体地，化合物包括结合的，即，通过接头共价连接至PBD部分的抗体。
在靶位置接头可能并未被切割。本发明的抗体-药物结合物(ADC)化合物可以具有细胞毒性作用而并未发生接头的切割以释放出PBD药物部分。本发明的抗体-药物结合物(ADC)选择性地向肿瘤组织递送细胞毒性剂，从而可以实现较高的选择性，即，较少的有效剂量。
因此，一方面，本发明提供本文所描述的用于在治疗中使用的结合物化合物。
在进一步的方面，还提供本文所描述的用于在增生性疾病的治疗中使用的结合物化合物。本发明的第二方面提供结合物化合物在制备用于治疗增生性疾病的药物中的用途。
本领域普通技术人员能够容易地确定候选结合物是否治疗任何特定细胞类型的增生性病症。例如，在以下的实例中描述了这样的测定法，它们可以方便地用于评估由特定化合物所提供的活性。
术语“增生性疾病”涉及不希望的过度或异常细胞的不需要的或不受控制的细胞增生，如，新生性或增生性生长(不管是体外或体内)。
增生性病症的实例包括但不限于良性、恶化前和恶性细胞增生，包括但不限于新生物和肿瘤(例如，组织细胞瘤、胶质瘤、星形细胞瘤、骨瘤)、癌症(例如肺癌、小细胞肺癌、胃肠癌、肠癌、结肠癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、脑癌、肉瘤、骨肉瘤、卡波西肉瘤、黑素瘤)、白血病、牛皮癣、骨病、纤维增生性疾病(例如结缔组织的纤维增生性疾病)和动脉粥样硬化。特别感兴趣的癌症包括但不限于白血病和卵巢癌。
可以治疗任何类型的细胞，包括但不限于肺、胃肠道(包括，例如，肠、结肠)、乳(乳房)、卵巢、前列腺、肝脏(肝)、肾脏(肾)、膀胱、胰腺、脑和皮肤。
在一个实施方式中，治疗是胰腺癌的治疗。
在一个实施方式中，治疗是在细胞表面上具有ανβ6整联蛋白的肿瘤的治疗。
预期本发明的抗体-药物结合物(ADC)可被用于治疗多种疾病或紊乱，例如，由肿瘤抗原的过表达表征。示例性病症或过度增生性紊乱包括良性或恶性肿瘤；白血病、血液和淋巴系统恶性肿瘤。其他包括以下的紊乱：神经元的、神经胶质细胞的、星形细胞的、下丘脑的、腺体的、巨噬细胞的、上皮的、基质的、囊胚腔的、炎症性的、血管产生的和免疫学的，包括自身免疫性紊乱。
通常，待治疗的疾病或紊乱是过度增生性疾病，如癌症。本文中待治疗的癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这种癌症的更具体地实例包括鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、肺的鳞状细胞癌和肺的腺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃部癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、直 肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾脏癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝肿瘤、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。
在治疗中可以使用ADC的自身免疫疾病包括风湿性疾病(如例如，类风湿关节炎、干燥综合征、硬皮病、狼疮如SLE和狼疮性肾炎、多肌炎/皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗体综合征和银屑病关节炎)，骨关节炎、自身免疫性胃肠和肝紊乱(如例如，炎症性肠疾病(例如，溃疡性结肠炎和克罗恩病)、自身免疫性胃炎和恶性贫血、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎和乳糜泻、血管炎(如例如，ANCA相关的血管炎，包括丘-施血管炎、韦格纳肉芽肿病和多动脉炎)、自身免疫性神经紊乱(如，例如，多发性硬化、斜视眼肌阵挛综合征、重症肌无力、视神经脊髓炎、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病和自身免疫性多发性神经病变)、肾脏疾病(如例如，肾小球肾炎、古德帕斯彻氏综合征和贝格尔氏病)、自身免疫性皮肤病紊乱(如例如，牛皮癣、荨麻疹、麻疹、寻常天疱疮、大疱性类天疱疮和皮肤红斑狼疮)、血液学紊乱(如例如，血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、输血后紫癜和自身免疫性溶血性贫血)、动脉粥样硬化、葡萄膜炎、自身免疫性听觉紊乱(如例如，内耳病和听力损失)、贝切特氏病、雷诺氏综合征、器官移植和自身免疫性内分泌紊乱(如例如，糖尿病相关自身免疫病诸如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、阿狄森氏病和自身免疫性甲状腺病(例如，格雷夫斯病和甲状腺炎))。更优选的这种疾病包括，例如，风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、ANCA相关的血管炎、狼疮、多发性硬化症、干燥综合征、格雷夫斯病、IDDM、恶性贫血、甲状腺炎和肾小球肾炎。
治疗方法
本发明的结合物可以在治疗方法中使用。还提供的是一种治疗的方法，包括向需要的受试者给予治疗有效量的本发明的结合物化合物。术语“治疗有效量”是足以显示对患者有益处的量。上述益处可以是至少改善一种症状。给予的实际量以及给予的速率和时间进程将取决于待治疗的性质和严重性。治疗处方，例如剂量决定，是在全科医师和其他医生的责任范围内。
可以单独给予或与其他治疗组合给予本发明的化合物，同时给予还是顺序给予取决于待治疗的病症。治疗和疗法的实例包括但不限于化学疗法(给予活性剂，包括例如药物，如化疗)；手术；和放射疗法。
不考虑作用机制，“化疗剂”是在癌症治疗中有用的化学化合物。化疗剂的类别包括但不限于烷化试剂、抗代谢物、纺锤体毒植物生物碱、细胞毒性/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、抗体、光敏剂和激酶抑制剂。化疗剂包括在“靶向疗法”和常规化疗中使用的化合物。
化疗剂的实例包括：厄洛替尼(Genentech/OSIPharm.)、多西他赛(Sanofi-Aventis)、5-FU(氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，CASNo.51-21-8)、吉西他滨(Lilly)、PD-0325901(CASNo.391210-10-9，Pfizer)、顺铂(顺-二胺，二氯铂(II)，CASNo.15663-27-1)、卡铂(CASNo.41575-94-4)、紫杉醇(Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N.J.)、曲妥珠单抗(Genentech)、替莫唑胺(4-甲基-5-氧代-2,3,4,6,8-五氮杂双环[4.3.0]壬-2,7,9-三烯-9-甲酰胺，CASNo.85622-93-1，ScheringPlough)、他莫昔芬((Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N,N-二甲基乙胺、)和多柔比星Akti-1/2、HPPD和雷帕霉素。
化疗剂的更多实例包括：奥沙利铂(Sanofi)、硼替佐米(MillenniumPharm.)、索坦(SU11248,Pfizer)、来曲唑(Novartis)、甲磺酸伊马替尼(Novartis)、XL-518(Mek抑制剂，Exelixis，WO2007/044515)、ARRY-886(Mek抑制剂，AZD6244，ArrayBioPharma，AstraZeneca)、SF-1126(PI3K抑制剂，SemaforePharmaceuticals)、BEZ-235(PI3K抑制剂，Novartis)、XL-147(PI3K抑制剂，Exelixis)、PTK787/ZK222584(Novartis)、氟维司群(AstraZeneca)、亚叶酸钙(亚叶酸)、雷帕霉素(西罗莫司，Wyeth)、拉帕替尼(GSK572016，GlaxoSmithKline)、洛那法尼(SARASARTM，SCH66336，ScheringPlough)、索拉非尼(BAY43-9006，BayerLabs)、吉非替尼(AstraZeneca)、伊立替康(CPT-11,Pfizer)、替吡法尼(ZARNESTRATM，Johnson&Johnson)、ABRAXANETM(不含聚氧乙烯蓖麻油)、紫杉醇的白蛋白纳米设计制剂(AmericanPharmaceuticalPartners，Schaumberg,Il)、凡德他尼(rINN，ZD6474，AstraZeneca)、苯丁酸氮芥、AG1478、AG1571(SU5271；Sugen)、西罗莫司(Wyeth)、帕唑帕尼(GlaxoSmithKline)、莰佛(Telik)、塞替派和环磷酰胺 烷基磺酸酯如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺和甲基蜜胺(甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；内酯(尤其是布拉它辛和布拉它辛酮)；喜树碱(包括合成的类拓扑替康)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括它的]阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；隐藻素(特别是隐藻素1和的隐藻素8)；多拉司他汀；倍癌霉素(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin(软珊瑚醇)；水鬼蕉碱；sarcodictyin(匍枝珊瑚醇)；spongistatin；氮芥如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、二氯甲基二乙胺氧化物盐酸化物、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、氯乙环磷酰胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和ranimnustine；抗生素如烯二炔抗生素(例如卡里奇霉素、卡里奇霉素γ1I、卡里奇霉素ΩI1(AngewChem.Intl.Ed.Engl.(1994)33:183-186)；达内霉素(dynemicin)、达内霉素A；二膦酸盐，如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素；以及新制癌菌素生色团和相关色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素，放线菌素、authramycin、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素、carabicin、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素(chromomycinis)、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯啉基-阿霉素和脱氧阿霉素、表柔比星、依索比星、伊达比星、奈莫柔比星、麻西罗霉素、丝裂霉素如丝裂霉素C、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素类、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、结核菌素(tubercidin)、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(Demecolcine)；地吖醌；elfornithine；依利醋铵；埃博霉素；依托格 鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登醇(maytansinoid)如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙；米托蒽醌；mopidanmol；硝嗪(根瘤菌剂(nitraerine))；喷司他丁；苯来美特；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基肼；甲基苄肼；多糖复合物(JHSNaturalProducts，Eugene，OR)；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2’,2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurinA)、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春花碱；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；卡培他滨(Roche)；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DFMO)；类视黄醇类(类维生素A)如视黄酸；以上任一种的药学上可接受的盐、酸和衍生物。
还包括在“化疗剂”的限定中的是：(i)作用为调节或抑制肿瘤上的激素作用的抗激素试剂如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，例如包括它莫西芬(包括柠檬酸它莫西芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基它莫西芬、曲沃昔芬、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和(柠檬酸托瑞米芬)；(ii)抑制酶芳香酶的芳香酶抑制剂，其调节产生于肾上腺的雌激素如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、(醋酸甲地孕酮)、(依西美坦；Pfizer)、福美司坦(formestanie)、法倔唑、(伏氯唑)、(来曲唑；Novartis)和(阿那曲唑；AstraZeneca)；(iii)抗雄激素如氟他米特、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他滨(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白质激酶抑制剂如MEK抑制剂(WO2007/044515)；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，特别是抑制异常细胞增殖中受影响的信号通路的基因例如PKC-α、Raf和H-Ras表达的那些，如奥利默森(oblimersen)(GentaInc.)；(vii)核糖酶如VEGF表达抑制剂(例如，)和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗如基因疗法疫苗，例如和rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂如rmRH；(ix) 抗血管产生剂如贝伐珠单抗(Genentech)和以上任一种的药学上可接受的盐、酸和衍生物。
还包括在“化疗剂”限定中的是治疗性抗体如阿仑单抗(Campath)、贝伐珠单抗(Genentech)；西妥昔单抗(Imclone)；帕尼单抗(Amgen)、利妥昔单抗(Genentech/BiogenIdec)、帕妥珠单抗(OMNITARGTM，2C4，Genentech)、曲妥珠单抗(Genentech)、托西莫单抗(Bexxar，Corixia)和抗体药物结合物、吉妥珠单抗(gemtuzumabozogamicin)(Wyeth)。
具有与本发明的结合物组合作为化疗剂的治疗潜力的人源化单克隆抗体包括：阿仑单抗、阿泊珠单抗、阿塞珠单抗、atlizumab、巴品珠单抗(bapineuzumab)、贝伐珠单抗、莫比伐珠单抗(bivatuzumabmertansine)、莫坎妥珠单抗(cantuzumabmertansine)、西利珠单抗、赛妥珠单抗(certolizumabpegol)、cidfusituzumab、cidtuzumab、达利珠单抗、依库丽单抗、依法利珠单抗、依帕珠单抗、厄利珠单抗、非维珠单抗、芳妥珠单抗(Fontolizumab)、吉妥珠单抗、英妥珠单抗(InotuzumabOzogamicin)、伊匹单抗、拉贝珠单抗、林妥珠单抗、马妥珠单抗、美泊利单抗、莫维珠单抗、motovizumab、那他珠单抗、尼妥珠单抗、nolovizumab、numavizumab、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕考珠单抗、pecfusituzumab、pectuzumab、帕妥珠单抗、培克珠单抗、ralivizumab、雷珠单抗、reslivizumab、瑞利珠单抗、resyvizumab、rovelizumab、鲁利单抗、西罗珠单抗、西利珠单抗(Siplizumab)、索土珠单抗、他珠单抗(tacatuzumabtetraxetan)、他度珠单抗、他利珠单抗、特非珠单抗、塔西单抗、托利珠单抗(toralizumab)、曲妥单抗、tucotuzumabcelmoleukin、tucusituzumab、umavizumab、乌珠单抗和维西珠单抗(visilizumab)。
按照本发明的和按照本发明使用的药物组合物，除活性成分(即，结合物化合物)以外，还可以包含药用赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他物质。这样的物质应是无毒的，并且不应干扰活性成分的效力。载体或其他物质的确切性质将取决于给予途径，该给予途径可以是口服或通过注射(例如皮肤、皮下或静脉内)。
用于口服给予的药物组合物可以是片剂、胶囊剂、散剂或液体形式。片剂可以包含固体载体或佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体如水、石油(petroleum)、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶 液、右旋糖或其他糖溶液或二醇类如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。胶囊剂可以包含固体载体如明胶。
对于静脉内、皮肤或皮下注射，或在痛苦部位处的注射，活性组分将具有胃肠道外可接受的水溶液的形式，其是无热原的并具有适合的pH、等渗性和稳定性。本领域技术人员能够使用例如，等渗载体如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液来很好地制备适合的溶液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
制剂
尽管可以单独使用(例如，给予)结合物化合物时，往往优选的是使其作为组合物或制剂存在。
在一个实施方式中，组合物是包含本文所描述的结合物化合物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物(例如，制剂、配制品、药品)。
在一个实施方式中，组合物是包含至少一种本文所描述的结合物化合物与一种或多种本领域技术人员熟知的药学上可接受的成分的药物组合物，该成分包括但不限于药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂、填料、缓冲液、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、稳定剂、增溶剂、表面活性剂(例如，润湿剂)、掩蔽剂、着色剂、调味剂和甜味剂。
在一个实施方式中，组合物进一步包含其他活性剂，例如，其他治疗剂或预防剂。
可以在标准药品文本中找到合适的载体、稀释剂、赋形剂等。参见，例如，HandbookofPharmaceuticalAdditives,2ndEdition(eds.M.AshandI.Ash),2001(SynapseInformationResources,Inc.,Endicott,NewYork,USA),Remington'sPharmaceuticalSciences,20thedition,pub.Lippincott,Williams&Wilkins,2000；和HandbookofPharmaceuticalExcipients,2ndedition,1994。
本发明的另一方面涉及制备药物组合物的方法，包括将本文限定的至少一种[11C]-放射性同位素标记的结合物或结合类化合物与一种或多种本领域技术人员熟知的其他药学上可接受的成分混合在一起，例如，载体、稀释剂、赋形剂等。如果配制为离散单元(例如，片剂等)，那么每个单元包含预定量(剂量)的活性化合物。
本文所用的术语“药学上可接受的”涉及化合物、成分、材料、组合物、剂型等，其在合理的医学判断范围内、适用于与所讨论的受试者(例如，人类)的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，并与合理的利益/风险比相称。每种载体、稀释剂、赋形剂等在与制剂的其他成分相容的意义上也必须是“可接受的”。
可通过药学领域熟知的任何方法来制备制剂。这样的方法包括使活性化合物与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。一般而言，制剂通过使活性化合物与载体(例如，液体载体、精细固体载体等)均匀和紧密地结合，然后如必要的话使产品成形来制备。
可以将制剂制备为快速或慢速释放；立即、延迟、即时或缓慢释放；或它们的组合。
适于胃肠外给予(例如，通过注射)的制剂包括水性或非水性的、等渗的、无热原的、无菌液体(例如溶液，悬浮液)，其中活性成分被溶解、悬浮或以其他方式提供(例如，在脂质体或其他微粒中)。这种液体可以另外包含其他药学上可接受的成分如抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂、助悬剂、增稠剂以及使制剂与预期受体的血液(或其他相关体液)等渗的溶质。赋形剂的实例包括，例如，水、醇、多元醇、甘油、植物油等。用于此类制剂的合适等渗载体的实例包括氯化钠注射液、林格氏液(Ringer'sSolution)或乳酸林格氏注射液。通常，液体中活性成分的浓度是约1ng/ml至约10μg/mL，例如约10ng/mL至约1μg/mL。该制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器，例如安瓿和小药烧瓶中，并且可在冷冻干燥(冻干)条件下储藏，仅需在临用前加入无菌液体载体例如注射用水。可以由无菌粉末、颗粒和片剂当场制备注射溶液和悬浮液。
剂量
本领域技术人员应当理解的是，结合物化合物和包含该结合物化合物的组合物的适当剂量可因患者而异。确定最佳剂量一般将牵涉使治疗益处的水平与任何风险或有害副作用平衡。选择的剂量水平将取决于多个因素，包括但不限于特定化合物的活性、给予途径、给予时间、化合物的排泄时间、治疗的持续时间、其他药物、化合物和/或组合使用的物质、病况的严重性和物种、性别、年龄、体重、病况、总体健康状况和患者的病史。化合物的量和给予途径最终将由医师、兽医或临床医师慎重决定，但是一 般而言，将选择剂量以在作用部位达到实现所期望的作用而不会造成实质性损害或有害副作用的局部浓度。
在整个治疗过程中，可以单剂量、连续或间歇地(例如，以适当时间间隔分剂量)实现给予。确定最有效的给予手段和剂量的方法是本领域技术人员熟知的，并且将随用于疗法的制剂、疗法目的、所治疗的(多种)靶细胞和所治疗的受试者的不同而改变。可以用治疗医师、兽医或临床医师选择的剂量水平和模式进行单次或多次给予。
一般而言，活性化合物的合适剂量是在约100μg至约25mg(更通常地约1μg至约10mg)/千克受试者体重/天的范围内。在该化合物是盐、酯、酰胺、前药等的情况下，基于母体化合物计算给予量，所以所用的实际重量成比例增加。
在一个实施方式中，根据以下剂量方案将活性化合物给予至人类患者：约100mg，每天3次。
在一个实施方式中，根据以下剂量方案将活性化合物给予至人类患者：约150mg，每天2次。
在一个实施方式中，根据以下剂量方案将活性化合物给予至人类患者：约200mg，每天2次。
然而，在一个实施方式中，根据以下剂量方案将结合物化合物给予至人类患者：约50或约75mg，每天3或4次。
在一个实施方式中，根据以下剂量方案将结合物化合物给予至人类患者：约100或约125mg，每天2次。
以上描述的剂量可以适用于结合物(包含PBD部分和至抗体的接头)或适用于提供的PBD化合物的有效量，例如，接头切割后释放的化合物的量。
对于预防或治疗疾病，本发明的ADC的适当剂量将取决于待治疗的以上限定的疾病类型、疾病的严重度和情况(无论给予分子是用于预防还是治疗目的)、先前治疗、患者的临床病史和对抗体的反应，以及主治医生的判断。一次或通过一系列治疗将分子合适地给予至患者。取决于疾病的类型和严重程度，无论，例如通过一次或多次单独给予或通过连续输注，约1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1-20mg/kg)的分子是用于给予至患者的初 始候选剂量。通常的每日剂量可以在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围内，这取决于上述的因素。给予至患者的ADC的示例性剂量在约0.1至约10mg/kg患者重量的范围内。对于几天或更长的重复给予，取决于病症，治疗持续到实现疾病症状的期望抑制。示例性剂量方案包括给予约4mg/kg初始载药量的情况，随后每周、每两周或每三周添加另外剂量的ADC。其他剂量方案可以是有用的。该疗法的进展易于通过常规技术和测定法监测。
治疗
在治疗病症的情况下本文所使用的术语“治疗”通常涉及无论人类或动物(例如，兽医应用)的治疗和疗法，其中，其中实现了一些期望的疗效，例如，对病症发展的抑制，并且包括发展速度降低、发展速度减半、病症恢复、病症改善和病症康复。还包括作为预防性措施(即，预防、防止)的治疗。
本文所使用的术语“治疗有效量”涉及活性化合物或包含活性化合物的物质、组合物或剂型的量，当根据期望的治疗方案给予时，其对于产生一些期望的疗效是有效的、与合理的利益/风险比相当。
类似地，本文所使用的术语“预防有效量”涉及活性化合物或包含活性化合物的物质、组合物或剂型的量，当根据期望的治疗方案给予时，其对于产生一些期望的预防效果是有效的、与合理的利益/风险比相当。
抗体药物结合物的制备
可以通过本领域技术人员已知的多种途径，使用有机化学反应、条件和试剂制备抗体药物结合物，包括：(1)抗体的亲核基团与二价接头试剂反应，以经由共价键形成抗体-接头中间产物Ab-L，然后与活化的药物部分试剂反应；和(2)药物部分试剂与接头试剂反应，以经由共价键形成药物-接头试剂D-L，然后与抗体的亲核基团反应。结合方法(1)和(2)可以适用于各种抗体和接头以制备本发明的抗体-药物结合物。
抗体上的亲核基团包括但不限于侧链硫醇基团，例如，半胱氨酸。硫醇基团是亲核的并且能够与接头部分上的亲电基团(如本发明的那些)反应形成共价键。某些抗体具有可还原的链内二硫化物，即，半胱氨酸桥。通过用还原剂如DTT(克莱兰氏试剂(Cleland's)，二硫代苏糖醇)或TCEP(三(2-羧乙基)磷化氢盐酸化物；Getzetal(1999)Anal.Biochem.Vol273:73-80； SoltecVentures,Beverly,MA)处理可以使抗体与接头试剂的结合变得易反应。因此，每理论上个半胱氨酸二硫桥将形成两个反应性硫醇亲核体。通过产生胺至硫醇的转化的赖氨酸与2-亚氨基噻吩(特劳特氏(Traut’s)试剂)的反应，可以将其他亲核基团引入至抗体中。
受试者/患者
受试者/患者可以是动物、哺乳动物、胎盘哺乳动物、有袋动物(例如，袋鼠、袋熊)、单孔目动物(例如，鸭嘴兽)、啮齿动物(例如，豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠科动物(例如，小鼠)、兔类动物(例如，家兔)、鸟类(例如，鸟)、犬科动物(例如，家犬)、猫科动物(例如，家猫)、马科动物(例如，马)、猪科动物(例如，家猪)、绵羊类(例如，绵羊)、牛科动物(例如，奶牛)、灵长类动物、猿类(例如，猴子或类人猿)、猴(例如，狨猴、狒狒)、类人猿(例如，大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或人类。
此外，受试者/患者可是其发育的任何形式，例如胎儿。在一个优选实施方式中，受试者/患者是人类。
在一个实施方式中，患者是每个患者具有在细胞表面上包含ανβ6整联蛋白的肿瘤的群体。
合成
式IVE的二聚体中间产物的一个可能合成路径如下所示：
中间产物IV可以用于制备中间产物VII
中间产物IV可以用于制备中间产物IX：
可替代地，中间产物IV可以与中间产物X偶联以制备中间产物IX：
中间产物IV可以用于制备中间产物XVI
中间产物IV可以用于制备中间产物XIX
式XIV的二聚体中间产物的一个可能合成路径如下所示：
中间产物XXI可以用于制备中间产物XXVII：
在上述图解方案中，RN、RN’和RN”各自独立地表示氮保护基团。RC和RC’分别表示OH或OProtO，其中ProtO是羟基保护基团。在本领域内，保护基团是众所周知的。RN、RN’和RN”可以是例如BOC。ProtO可以是THP。可能的是，取决于所采用的化学过程，在以上所示的合成方法的不同阶段除去N10-C11亚胺键的保护。
一般而言，可以首先将两个PBD单体与亚苯基或亚吡啶基二聚体桥连接以产生中间产物IV或XXI来制备化合物和结合物。随后可以使用中间产物IV的二聚体桥中的芳环上的卤素基团形成系链(包括接头基团G或L)以将PBD二聚体连接至细胞结合剂。
更详细地，在每个PBD单体的C8位置上具有-XH和–X'H基团的两个PBD单体(分别是中间产物I和II)可以与中间产物III或中间产物XX上的-T-Hal和-T’-Hal基团反应。这种合成方法允许PBD单体不同，而因此所获得的PBD二聚体是不对称的。同样，PBD单体可以是相同的。
PBD二聚体中间产物IV可以用于通过在许多方式中使桥中的芳基卤素基团反应以提供本发明的化合物和结合物。
首先，中间产物IV可以用于Sonogishira交叉偶联反应以提供二聚体桥的芳基基团上的乙炔基基团。Sonogishira交叉偶联反应在本领域内是众所周知的，用于在钯催化剂如PD(Ph3)4，铜催化剂如CuI，和碱如二乙胺的存在下将端炔与芳基卤化物偶联。
当乙炔用作末端乙炔时，乙炔分子的一侧通常用例如TMS保护以防止PBD二聚体的交联。一旦Sonogishira反应完成，TMS基团就可以被切割以提供炔中间产物V。
中间产物V可以与叠氮化合物反应以在叠氮-炔惠斯更(Huisgen)环加成中形成三唑衍生物。这种反应可以由铜催化剂催化。为了形成本发明的化合物和结合物，叠氮化物键连至亚乙基基团和可不同数目的PEG基团。叠氮可以用胺基团封端以进一步反应。中间产物V与氨基-叠氮化合物的反应将会提供中间产物VI。
然后中间产物VI的游离胺基基团可以与用于连接至细胞结合单元的接头基团的羧酸基团反应以形成将PBD二聚体连接至接头基团G或L的酰胺基团，以提供化合物VII。
中间产物VII的接头/反应性基团，G，可以结合至细胞结合剂以提供本发明的结合物。
作为可替代的Sonogishira反应，中间产物IV可以在钯和铜催化剂和碱的存在下偶联至乙酰胺，如炔丙胺。这种反应提供了连接至其中乙炔基团被保护并且游离端胺可用于进一步反应的PBD二聚体桥的系链的部分。例如，中间产物IV与炔丙胺的反应提供了中间产物VIII。
中间产物VIII的端胺可以与例如连接至接头基团/反应性基团G(用于连接至细胞结合剂)的羧酸基团反应以提供中间产物IX。
作为中间产物IX的可替代的合成，中间产物XI的羧酸基团可以与炔丙胺反应以形成中间产物XII。中间产物IV与中间产物XII在Sonogoshira反应中的反应产生中间产物XIII。
封端可变PEG链的受保护的胺基基团可以被脱保护并与中间产物XIV的羧酸基团反应以将接头/反应性基团G偶联至PBD二聚体上并生成中间产物XIV。
中间产物IV也可以用于交叉偶联胺化反应，如布赫瓦尔德-哈特维希(Buchwald-Hartwig)胺化反应中。碳-氮键经由钯催化的胺与芳基卤化物的交叉偶联(cross-coupling)形成。适用于这种交叉偶联反应的许多钯催化剂是已知的，如Pd(Ph3)4或RuPhos/RuPhosPd。
具有哌嗪官能化的中间产物IV与保护的丙-1-胺的反应提供了中间产物XV(ReactionofintermediateIVwithapiperizinefunctionlisedwithaprotectedpropan-1-amineprovidesintermediateXV)。中间产物XV的受保护的胺可以进一步与例如连接至用于连接至细胞结合剂的接头/反应性基团，G，反应以提供中间产物XVI。
中间产物IV与部分受保护的哌嗪的交叉偶联胺化反应，如布赫瓦尔德-哈特维希胺化反应，随后是(例如，用三氟乙酸)脱保护以提供中间产物XVII。
中间产物XVII的脱保护的哌嗪胺基团可以与中间产物XVIII中的羧酸基团反应以提供中间产物XIX。
可以使用中间产物XXI以形成肟中间产物XXIV。例如，部分受保护的聚PEG-二胺，中间产物XXII，可以与中间产物XIV的羧酸基团反应。脱保护作用产生中间产物XIII。
中间产物XXI和XXIII的反应会产生肟中间产物XXIV。可以使用制备HPLC拆分顺式和反式肟。
也可以使用中间产物XXI以形成丙烯酰胺中间产物XXVII。例如，醛中间产物XXI可以与丙二酸在克莱温格(Knoevenagel)缩合中反应生成丙烯酸中间产物XXV。这可以与部分保护的PEG-二胺反应以产生中间产物XXVI。脱保护作用和与中间产物XIV的偶联产生丙烯酰胺中间产物XXVII。
在以下的参考文献中进行了广泛讨论包含两个亚胺部分的PBD化合物的合成，其讨论通过引用结合于此：
a)WO00/12508(第14至30页)；
b)WO2005/023814(第3至10页)；
c)WO2005/085259(第31至39页)；
d)WO2011/128650(第2至12和42至51页)；
e)PCT/EP2012/070232，2012年10月12日提交(第2至15和49至58页)。
实施例
通用实验方法
在ADP220旋光仪(BellinghamStanleyLtd.)上测量旋光性并以g/100mL为单位来给出浓度(c)。使用数字熔点仪(Electrothermal)来测量熔点。用Perkin-ElmerSpectrum1000FTIR分光计来记录IR谱。在300K下，利用BrukerAvanceNMR分光计，分别在400和100MHz处获得1H和13CNMR谱。相对于TMS(δ＝0.0ppm)报告化学位移，并将信号指示为s(单峰)、d(双峰)、t(三重峰)、dt(双三重峰)、dd(双峰的双峰)、ddd(双峰的双双峰)或m(多重峰)，其中以赫兹(Hz)为单位来给出偶合常数。利用连接于具有Waters2996PDA的Waters2695HPLC上的WatersMicromassZQ仪器来收集质谱(MS)数据。使用的WatersMicromassZQ参数是：毛细管(kV)，3.38；锥电压(V)，35；提取器(V)，3.0；源温度(℃)，100；去溶剂化温度(℃)，200；锥流速(L/h)，50；去溶剂化流速(L/h)，250。使用金属涂覆的硼硅玻璃尖端来将样品引入仪器，以正W模式在WatersMicromassQTOFGlobal上记录高分辨率质谱(HRMS)数据。在硅胶铝板(Merck60,F254)上进行薄层色谱(TLC)，并利用硅胶(Merck60，230-400目ASTM)来进行快速色谱。所有化学品和溶剂购自Sigma-Aldrich并如供应的使用而没有进一步的纯化。
LC/MS条件-方法A：使用水(A)(甲酸0.1％)和乙腈(B)(甲酸0.1％)的流动相运行HPLC(WatersAlliance2695)。梯度：初始组成5％B，1.0分钟，然后，在3分钟内，从5％B到95％B。将上述组成保持在95％B下0.5分钟，然后在0.3分钟内回到5％B。总梯度运行时间等于5分钟。流速 3.0mL/min，经由零死容积T形管(其通入质谱仪)来分开400μL。波长检测范围：220至400nm。功能类型：二极管阵列(535次扫描)。柱子：OnyxMonolithicC1850×4.60mm。
LC/MS条件-方法B：使用水(A)(甲酸0.1％)和乙腈(B)(甲酸0.1％)的流动相进行HPLC(WatersAlliance2695)。梯度：初始组成5％B，持续1.0分钟，然后，在2.5分钟内，从5％B升高到95％B。将上述组成保持在95％B下0.5分钟，然后在0.1分钟内回到5％B并保持0.9min。总梯度运行时间等于5分钟。流速3.0mL/min，经由零死容积T形管(其通入质谱仪)来分开400μL。波长检测范围：220至400nm。功能类型：二极管阵列(535次扫描)。柱子：OnyxMonolithicC1850×4.60mm。
LC/MS条件-方法C：使用ShimadzuLCMS-2020进行阳离子模式电喷雾质谱。所用流动相是溶剂A(含0.1％甲酸的H2O)和溶剂B(含0.1％甲酸的CH3CN)。梯度：初始组成5％B保持0.25min，然后2min内从5％B升高至100％B。组成在100％B下保持持续0.5min，而随后在0.05min内恢复至5％B并就此保持0.05min。梯度运行的总持续时间等于3.0min。流速为0.8mL/min。在214nm和254nm下检测。柱：50℃下，WatersAcquityBEHShieldRP181.7μm2.1×50mm。
用于实施例2和3的制备HPLC条件如下：在Shimadzu机器上使用以下尺寸的GeminiNX5μC18柱(50℃)执行反相超快速高效液相色谱法(UFLC)：150×4.6mm用于分析，而150×21.2mm用于制备工作。所使用的洗脱液是溶剂A(含0.1％甲酸的H2O)和溶剂B(含0.1％甲酸的CH3CN)。用以下梯度条件实施所有UFLC实验：从0至30min组成B从0％增加至100％并保持于100％B持续另外2min。从32.0min至32.1min，B的组成从100％降低到0％，并保持于0％B直至35.0min。梯度运行的总持续时间为35min。所使用的流速为1mL/min用于分析，而20mL/min用于制备HPLC。在254nm和280nm处进行检测。
LC/MS条件-方法D：ShimazuLCMS-2020，使用的流动相是水(A)(0.1％甲酸)和乙腈(B)(0.1％甲酸)。梯度：初始组成5％B保持0.25min，然后在2min内从5％B增加至100％B。组成在100％B下保持持续0.50min，而随后在0.05min内恢复至5％B并就此保持0.05min。总梯度 运行时间等于3min。流速0.8mL/min。检测波长范围：190至800nm。柱箱温度：50℃。柱：Kinetex2.6uXB-C18100A50×2.10mm。
LC/MS条件-方法E：ShimazuLCMS-2020，使用的流动相是水(A)(0.1％甲酸)和乙腈(B)(0.1％甲酸)。梯度：初始组成5％B保持1min，然后9min内从5％B增加至100％B。组成在100％B下保持持续2min，而随后在0.10min内恢复至5％B并就此保持3min。总梯度运行时间等于15min。流速0.6mL/min。检测波长范围：190至800nm。柱箱温度：50℃。柱子：Gemini-NX3uC18110A100×2.00mm。
中间产物的合成
(15-氧代-3,6,9,12-四氧杂-16-氮杂十九烷-18-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯(I3)
将EDCI(263mg，1.37mmol，1当量)加入至炔丙胺(88μL，1.37mmol，1当量)和t-boc-N-酰胺基--酸(365.42mmol，1.37mmol，1当量)在二氯甲烷(10mL)中的溶液。在室温搅拌反应持续3h，在此之后通过TLC观察到完全转化。反应混合物稀释于二氯甲烷中并用水和盐水洗涤。有机层用硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量二氯甲烷。获得的残余物进行快速柱色谱(硅胶；梯度，0％至10％甲醇在二氯甲烷中)。收集纯馏分并合并并且通过在减压下旋转蒸发除去过量洗脱液以获得产物I3(490mg，89％)。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ6.90(s，1H)，5.06(d，J＝23.2Hz，1H)，4.03(dd，J＝5.3，2.5Hz，2H)，3.72(t，J＝5.7Hz，2H)，3.69–3.57(m，12H)，3.53(t，J＝5.1Hz，2H)，3.30(d，J＝5.0Hz，2H)，2.49(t，J＝5.7Hz，2H)，2.20(t，J＝2.5Hz，1H)，1.43(s，9H)。
实施例1
(a)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-卤素-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(7-甲氧基-5-氧代-11-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,3,11,11a-四氢-1H吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-10(5H)-羧酸酯)(2a，2b，2c)
(i)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-碘代-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(7-甲氧基-5-氧代-11-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,3,11,11a-四氢-1H吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂10(5H)-羧酸酯)(2a)
将1,3-二(溴甲基)-5-碘苯(960mg，2.34mmol)加入Boc/THP-保护的PBD帽单元1(2.1g，4.68mmol)、TBAI(86mg，0234mmol)和K2CO3(647mg，4.68mmol)在无水DMF(30mL)中的搅拌溶液中。将反应混合物加热至60℃并在氩气氛下搅拌持续3h，此时通过LC/MS的分析表明在4.00min保留时间处绝大部分产物形成(ES+)m/z1125([M+H]+.,～50％相对强度)。容许反应混合物冷却至室温并且通过在真空下蒸发除去DMF。获得的残余物在水(50mL)和EtOAc(50mL)之间分配并且用EtOAc(3×15mL)萃取水相。合并的有机层用水(2×20mL)、盐水(40mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空蒸发以提供粗产物。通过快速色谱法的纯化(梯度洗脱：50:50v/vEtOAc/己烷至100％EtOAc)提供为白色泡沫的二醚2a(2.05g，78％收率)：1HNMR(400MHz，CDCl3)(3种非对映异构体的混合物)δ7.78–7.74(m，2H)，7.50(d，1H，J＝4.76Hz)，7.26(s，1H)，7.22(s，1H)，6.87(s，1H)，6.51(s，1H)，5.80(d，1H，J＝8.52Hz)，5.70(d，1H，J＝9.44Hz)，5.16–4.95(m，6H)，3.93–3.87(m，8H)，3.74–3.40(m，8H)，2.22–1.99(m，8H)，1.79–1.22(m，30H)；13CNMR(100MHz，CDCl3)(3种非对映异构体的混合物)δ167.4，167.2，154.9，149.6，149.4，149.2，148.8，139.6，139.4，135.6(x2)，129.8，129.6，127.9，127.4，125.0，116.0，115.8，111.0，110.4，100.8，95.8，94.8，91.2，88.2，81.4，80.9，70.4，70.0，64.9，63.4，60.2，60.0，56.2，56.1(x2)，46.3，31.4，30.9，29.2，28.9，28.2，28.1，25.3，23.3，23.2，20.9，19.9。
(ii)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-溴-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(7-甲氧基-5-氧代-11-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,3,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂10(5H)-羧酸酯)(2b)
将1-溴-3,5-二(溴甲基)苯(331mg，0.97mmol)加入Boc/THP-保护的PBD帽单元1(876mg，1.95mmol)、TBAI(36mg，97.4μmol)和K2CO3(270mg，1.95mmol)在无水DMF(16mL)中的搅拌溶液中。将反应混合物加热至60℃并在氩气氛下搅拌持续2.5h，此时通过LC/MS的分析表明在4.00min保留时间处绝大部分产物形成(ES+)m/z1079([M+H]+.,～95％相对强度)。容许反应混合物冷却至室温并且通过在真空下蒸发除去DMF。获得的残余物在水(25mL)和DCM(25mL)之间分配并且用DMC(3×10mL)萃取水相。合并的有机层用水(20mL)、盐水(30mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空蒸发以提供粗产物。通过快速色谱法的纯化(梯度洗脱：50:50v/vEtOAc/己烷至100％EtOAc)提供为白色泡沫的二醚2b(725mg，69％收率)。1HNMR(400MHz，CDCl3)(3种非对映异构体的混合物)δ7.57–7.53(m，2H)，7.50(d，1H，J＝4.92Hz)，7.27(s，1H)，7.22(s，1H)，6.87(s，1H)，6.51(s，1H)，5.80(d，1H，J＝7.88Hz)，5.70(d，1H，J＝9.36Hz)，5.18–4.94(m，6H)，3.93–3.85(m，8H)，3.75–3.40(m，8H)，2.14–1.99(m，8H)，1.79–1.22(m，30H)；13CNMR(100MHz，CDCl3)(3种非对映异构体的混合物)δ167.4，167.2，154.9，149.6，149.4，149.2，148.8，139.6，139.4，129.8，127.9，128.0，127.4，124.2，123.2，116.0，115.8，111.0，110.4，100.9，95.8，91.3，88.2，81.3，80.9，70.5，70.1，64.9，63.4，60.2，60.0，56.2，56.1，46.4，31.4，30.9，29.2，28.9，28.2，28.1，25.3，23.3，23.1，20.9，19.9。
(iii)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-氯-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(7-甲氧基-5-氧代-11-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸酯)(2c)
将1,3-二(溴甲基)-5-氯苯(470mg，1.57mmol)加入Boc/THP-保护的PBD帽单元1(1.41g，3.15mmol)、TBAI(58mg，0.16mmol)和K2CO3(435mg，3.15mmol)在无水DMF中(20mL)的搅拌溶液中。将反应混合物加热至60℃并在氩气氛下搅拌持续2h，此时通过LC/MS(方法A)的分析表明在1.94min保留时间处绝大部分产物形成(ES+)m/z1033([M+H]+.,～50％相对强度)。容许反应混合物冷却至室温并且通过在真空下蒸发除去DMF。获得的残余物在水(50mL)和EtOAc(50mL)之间分配并且用EtOAc(3×15mL)萃取水相。合并的有机层用水(2×20mL)、盐水(40mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空蒸发以提供粗产物。通过快速色谱法的纯化(梯度洗 脱：50:50v/vEtOAc/己烷至100％EtOAc)提供为白色泡沫的二醚2c(825mg，51％收率)。
(b)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-乙炔基-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(7-甲氧基-5-氧代-11-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,3,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-10(5H)-羧酸酯)(4)
(i)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(7-甲氧基-5-氧代-11-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,3,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-10(5H)-羧酸酯)(3)。
在烘箱干燥的可密封容器中将催化量的Pd(PPh3)4(14.9mg，12.9μmol)加入二醚2a(721mg，0.64mmol)、TMS-乙炔(273μL，190mg，1.93mmol)、CuI(4.9mg，25.8μmol)、二乙胺(1.33mL，942mg，12.9mmol)和烘箱干燥的分子筛丸粒在无水DMF中(4.8mL)的混合物中。混合物经过脱气并用氩气吹扫3次，随后在100℃微波中加热1.5h此时通过LC/MS(方法A)的分析表明在4.27min保留时间处原料完全消耗且绝大部分产物形成(ES+)m/z1096([M+H]+.,～35％相对强度)。在3.82min保留时间处观察到峰(ES+)m/z1023([M+H]+.,～35％相对强度)，这对应于这对应于在LC/MS条件(方法A)下的TMS-断裂。容许反应混合物冷却至室温并随后通过烧结物过滤以除去分子筛(用DMF洗涤)。在真空下蒸发滤液并且获得的残余物经过快速色谱法(梯度洗脱：50:50v/vEtOAc/己烷至100％EtOAc)以提供为黄色泡沫的TMS-乙炔3(656mg，93％收率)：1HNMR(400MHz，CDCl3)(3种非对映异构体的混合物)δ7.52–7.46(m，3H)，7.26(s，1H)，7.21(s，1H)，6.87(s，1H)，6.51(s，1H)，5.80(d，1H，J＝8.68Hz)，5.69(d，1H，J＝9.36Hz)，5.18–4.94(m，6H)，3.93–3.86(m，8H)，3.73–3.40(m，8H)，2.13–1.97(m，8H)，1.78–1.22(m，30H)，0.22，0.23和0.24(sx3，9H)；13CNMR(100MHz， CDCl3)δ167.6，167.4，155.2，155.0，149.9，149.6，149.2，148.8，137.8，137.6，130.2，129.9，129.7，127.8，127.2，125.8，124.4，116.0，115.8，111.0，110.4，104.4，101.0，95.8，91.4，88.3，81.4，81.0，71.0，70.6，65.0，63.5，60.3，60.1，56.2，46.4，31.0，29.2，29.0，28.2，25.4，23.4，23.3，21.1，20.0，0.28，0.09，0.00，-0.28。
(ii)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-乙炔基-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(7-甲氧基-5-氧代-11-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,3,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-10(5H)-羧酸酯)(4)。
将固体K2CO3(296mg，2.14mmol)加入TMS-保护的化合物3(1.17g，1.07mmol)在MeOH(20mL)中的搅拌溶液中。在3h之后，室温搅拌下通过LC/MS判断认为反应进行完全[所需的产品峰在3.82min保留时间处(ES+)m/z1023([M+H]+.,～30％相对强度)]。通过在真空下蒸发除去MeOH并且将获得的残余物在水(25mL)和EtOAc(25mL)之间分配。将这些层分离并且用EtOAc(3×15mL)萃取水相。合并的有机层用水(3×30mL)、盐水(40mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空蒸发以提供粗产物。通过快速色谱法的纯化(梯度洗脱：50:50v/vEtOAc/己烷至100％EtOAc)提供为橙色泡沫的炔4(1.02g，94％收率)：1HNMR(400MHz，CDCl3)(3种非对映异构体的混合物)δ7.55–7.52(m，3H)，7.26(s，1H)，7.22(s，1H)，6.88(s，1H)，6.51(s，1H)，5.80(d，1H，J＝8.68Hz)，5.69(d，1H，J＝9.48Hz)，5.18–4.94(m，6H)，3.93–3.86(m，8H)，3.73–3.40(m，8H)，3.09和3.08(sx3，1H)，2.13–1.97(m，8H)，1.78–1.22(m，30H)；13CNMR(100MHz，CDCl3)(3种非对映异构体的混合物)δ167.5，167.3，155.2，149.7，149.5，149.1，148.8，137.8，137.7，130.3，129.8，129.6，127.8，127.2，126.1，123.2，115.9，115.7，110.9，110.4，100.9，100.0，95.7，91.3，88.2，82.9，81.3，80.9，78.0，70.7，70.4，64.9，63.4，60.2，60.0，56.1，46.3，31.4，30.9，29.2，28.9，28.1(x2)，25.3，23.3，23.2，20.9，19.9。
(c)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-(1-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(7-甲氧基-5-氧代-11-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,3,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂10(5H)-羧酸酯)(5)。
室温下将固体CuSO4.5H2O(10.3mg，41.4μmol)和(+)-L-抗坏血酸钠(33.0mg，0.17mmol)加入至11-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷-1-胺(181mg，164μL，0.83mmol)和炔4(846mg，0.83mmol)在t-BuOH(5mL)和H2O(5mL)中的搅拌溶液中。随着反应进行观察到由黄变绿的颜色变化。在搅拌1.5h之后，通过LC/MS(方法A)的分析表明生成了绝大部分的所需产物的量，对应于在3.02min保留时间处的峰(ES+)m/z1242([M+H]+.,～35％相对强度)。[注意：然而，在反应进程失速的某些情况下，一旦加入另外的CuSO4.5H2O(0.05当量)和(+)-L-抗坏血酸钠(0.2当量)就能驱使反应完全]。反应混合物在水(50mL)和EtOAc(50mL)之间分配(无需振荡分液漏斗)。用EtOAc(3×20mL)萃取水相并且合并的有机层用水(20mL)、盐水(30mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空蒸发以提供为绿色泡沫的粗产物5(817mg，80％粗收率)。粗产物无需进一步纯化直接用于下一步骤：1HNMR(400MHz，CDCl3)(3种非对映异构体的混合物)δ7.98–7.83(m，3H)，7.55–7.48(brs，1H)，7.31–7.22(m，2H)，6.96(brs，1H)，6.57(s，1H)，5.85–5.78(m，1H)，5.72–5.68(m，1H)，5.18–4.94(m，6H)，4.60–4.50(m，2H)，3.93–3.80(m，12H)，3.73–3.40(m，12H)，2.13–1.80(m，8H)，1.71–1.10(m，30H)。
(d)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-(1-(18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-13-氧代-3,6,9-三氧杂-12-氮杂十八烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(7-甲氧基-5-氧代-11-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,3,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-10(5H)-羧酸酯)(6)。
室温下将固体6-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(136mg，0.44mmol)加入伯胺5(523mg，0.42mmol)在无水DCM(10mL)中的搅拌溶液中。通过LC/MS(方法A)监测进程并在3天搅拌后反应不再进行，观察到3.48min保留时间处的绝大部分的所需产品的量(ES+)m/z1434([M+H]+.,～30％相对强度)伴随有3.40min保留时间处的肩峰和3.02min保留时间处的未反应原料。用硅胶处理反应混合物并真空蒸发除去溶剂。获得的残余物经过快速色谱法(梯度洗脱：100％DCM至97:3v/vDCM/MeOH)而获得为泡沫的马来酰亚胺6(253mg，42％收率)：1HNMR(400MHz，CDCl3)(3种非对映异构体的混合物)δ8.05–7.99(m，1H)，7.92–7.87(m，2H)，7.56，7.55和7.53(sx3，1H)，7.26和7.22(sx2，2H)，6.94(s，1H)，6.66(s，2H)，6.58(s，1H)，6.04(brs，1H)，5.80(d，1H，J＝6.88Hz)，5.70(d，1H，J＝9.16Hz)，5.24–4.94(m，6H)，4.60(t，2H，J＝4.68Hz)，3.95–3.86(m，10H)，3.69–3.37(m，22H)，2.15–1.97(m，10H)，1.75–1.22(m，36H)；13CNMR(100MHz，CDCl3)(3种非对映异构体的混合物)δ172.8，170.8，167.6，167.4，149.1，137.9，134.1，129.8，124.2，115.8，115.6，110.3，95.8，71.1，70.8，70.6，70.5(x2)，70.2，69.9，69.5，63.4，60.2，56.1，53.4，50.5，46.4，39.1，37.7，36.3，31.4，30.9，29.2，28.9，28.3，28.1，26.4，25.3(x2)，25.1，23.3，23.2，19.9。
(e)N-(2-(2-(2-(2-(4-(3,5-二((((S)-7-甲氧基-5-氧代-2,3,5,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂8-基)氧基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(7)。
在0℃(冰/丙酮)下将95:5v/vTFA/H2O(3mL)的溶液加入Boc/THP-保护的化合物6(253mg，0.18mmol)的样品中。在0℃下搅拌1h之后通过LC/MS判断认为反应进行完全，所需的产品峰在2.63min保留时间处(ES+)m/z1030([M+H]+.,～30％相对强度)。反应混合物保持冰冷并逐滴加入至NaHCO3的冷冻饱和水溶液(50mL)中。混合物用DCM(3×15mL)萃取并且合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空蒸发以提供粗产物。通过快速色谱法的纯化(梯度洗脱：100％CHCl3至97:3v/vCHCl3/MeOH)提供为橙色泡沫的标题化合物(127mg，70％收率)。
实施例2
(a)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-(3-氨基丙-1-炔-1-基)-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(7-甲氧基-5-氧代-11-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸酯)(8)
在烘箱干燥的可密封容器中将催化量的Pd(PPh3)4(2.05mg，1.75μmol)加入二醚2a(100mg，0.089mmol)、炔丙胺(17μL，15mg，0.26mmol)、CuI(0.65mg，3.5μmol)、二乙胺(18μL，13mg，1.75mmol)和烘箱干燥的分子筛丸粒在无水DMF中(1.5mL)的混合物中。混合物经过脱气并用 氩气吹扫3次，随后在密封容器中100℃加热2h。此时通过LC/MS(方法C)的分析表明原料完全消耗并且绝大部分产物在1.36min保留时间处形成(ES+)m/z1052.95([M+H]+.,～100％相对强度)。容许反应混合物冷却至室温并随后通过烧结物过滤除去分子筛(用DMF洗涤)。在真空下蒸发滤液以提供不稳定的粗产物8，无需纯化或分析直接用于下一步骤中。
(b)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-(1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,19-二氧代-7,10,13,16-四氧杂-4,20-二氮杂二十三烷-22-炔-23-基)-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(7-甲氧基-5-氧代-11-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸酯)(9)
室温下将MAL--酸(37mg，0.089mmol)加入EDCI(17mg，0.089mmol)和粗伯胺8在无水DCM(4mL)的搅拌溶液中。反应混合物在氩气氛下搅拌3h，此时通过LC/MS(方法C)的分析表明在1.69min保留时间处的所需产品的绝大部分量(ES+)m/z1450.55([M+H]+.,～10％相对强度)，1498([M+Na]+.,～80％相对强度)。用DCM(30mL)稀释反应混合物并用H2O(3×10mL)、盐水(20mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空蒸发以提供粗产物。通过快速色谱法的纯化(梯度洗脱：100％DCM至96:4v/vDCM/MeOH)提供为泡沫的马来酰亚胺9(80mg，在2个步骤内收率62％)。
(c)N-(3-(3,5-二((((S)-7-甲氧基-5-氧代-2,3,5,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)甲基)苯基)丙-2-炔-1-基)-1-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(10)
在0℃(冰/丙酮)下将95:5v/vTFA/H2O(1mL)的溶液加入Boc/THP-保护的化合物9(80mg，55μmol)的样品中。在0℃下搅拌1h之后，通过LC/MS(方法C)判断认为反应进行完全，所需的产品峰在1.24min保留时间处(ES+)m/z1046.35([M+H]+.,100％相对强度)。反应混合物保持冰冷并逐滴加入至NaHCO3冷冻饱和水溶液(50mL)中。用DCM(3×15mL)萃取混合物并且合并的有机层用盐水(40mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空蒸发以提供粗产物。通过快速色谱法的纯化(梯度洗脱：100％CHCl3至96:4v/vCHCl3/MeOH)提供为橙色固体的10(9mg，16％收率)。
实施例3
(a)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-(4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基)-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(7-甲氧基-5-氧代-11-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)-2,3,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-羧酸酯)(11)
将催化量的RuPhosPd(15.8mg，0.019mmol)加入至烘箱干燥的可密封容器内的二醚2c(200mg，0.19mmol)、1-Boc-哌嗪(39.6mg，0.21mmol)、CsCO3(157mg，0.48mmol)和RuPhos(9mg，0.019mmol)在无水THF(4mL)中的混合物中。混合物经过脱气并用氩气吹扫3次并在85℃的DrySyn中加热2h使得压力建立于小烧瓶内。此时通过LC/MS(方法C)的分析表明原料完全消耗并且绝大部分产物形成于1.97min保留时间处(ES+)m/z1083.45([M+H]+.,5％相对强度)。容许反应混合物冷却至室温并用乙酸乙酯(50mL)稀释。有机物用水(2×25mL)和盐水(25mL)洗涤之后，用MgSO4干燥，过滤并减压除去挥发性物质。通过硅胶色谱柱纯化粗物质(梯度洗脱：100％CHCl3至9:1v/vCHCl3/MeOH)并分离出为白色泡沫的纯物质(210mg，91％收率)。
(b)(11aS,11a'S)-8,8'-(((5-(哌嗪-1-基)-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(7-甲氧基-2,3-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂5(11aH)-酮)(12)
在0℃(冰/水)下将95:5v/vTFA/H2O(1mL)的溶液加入Boc/THP-保护的化合物11(100mg，0.084mmol)的样品中。在0℃下搅拌1h之后，通过LC/MS(方法C)判断认为反应进行完全，所需的产品峰在1.02min保留 时间处(对于该化合物没有观察到离子化)。反应混合物保持冰冷并逐滴加入NaHCO3的冷冻饱和水溶液(50mL)中。用DCM(3×15mL)萃取混合物并且合并的有机层用盐水(40mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空蒸发以提供粗产物，其如此原样用于下一步骤中。
(c)N-(15-(4-(3,5-二((((S)-7-甲氧基-5-氧代-2,3,5,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基)氧基)甲基)苯基)哌嗪-1-基)-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺(13)
室温下将MAL--酸(35mg，0.084mmol)加入EDCI(16mg，0.084mmol)和粗伯胺12在无水DCM(3mL)中的搅拌溶液中。反应混合物在氩气氛下搅拌3h，此时通过LC/MS(方法C)的分析表明绝大部分的所需产品量在1.24min保留时间处(ES+)m/z1077.40([M+H]+.,90％相对强度)。用DCM(30mL)稀释反应混合物并用H2O(3×10mL)、盐水(20mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空蒸发以提供粗产物。通过制备UPLC纯化(梯度洗脱：11min内87:13v/vH2O/CH3CN至15:75v/vH2O/CH3CN)提供为淡褐色油的最终产物13(4.7mg，两个步骤内5％收率)。
实施例4
(a)(S)-(2-氨基-5-甲氧基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-甲基-2,3-二氢-1H-吡咯-1-基)甲酮(17)
(i)(S)-5-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-1-(5-甲氧基-2-硝基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯甲酰基)-4,5-二氢-1H-吡咯-3-基三氟甲磺酸酯(15)
在-50℃(丙酮/干冰浴)下将三氟甲磺酸酐(26mL，155mmol，3当量)在2,6-二甲基吡啶(24mL，207mmol，4当量，筛上干燥)存在下注射(温控的)到酮14(30g，52mmol，1当量)在无水二氯甲烷(500mL)中的强力搅拌悬浮液中。反应混合物容许搅拌1h。将水加入至仍然冷的反应混合物中并将有机层分离，用饱和碳酸氢钠、盐水和硫酸镁洗涤。有机相经过过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量溶剂。残余物进行快速柱色谱(硅胶；5％乙酸乙酯/己烷)。收集纯馏分并合并，并且通过在减压下旋转蒸发除去过量洗脱液提供产品15(31.5g，86％)。LC/MS，方法B，4.32min(ES+)m/z(相对强度)712.89([M+H]+.,100)；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.71(s，1H)，6.75(s，1H)，6.05(d，J＝1.8Hz，1H)，4.78(dd，J＝9.8，5.5Hz，1H)，4.15–3.75(m，5H)，3.17(ddd，J＝16.2，10.4，2.3Hz，1H)，2.99(ddd，J＝16.3，4.0，1.6Hz，1H)，1.45–1.19(m，3H)，1.15–1.08(m，18H)，1.05(s，6H)，0.95–0.87(m，9H)，0.15–0.08(m，6H)。
(ii)(S)-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-甲基-2,3-二氢-1H-吡咯-1-基)(5-甲氧基-2-硝基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)甲酮(16)
在氩气氛下将三苯基胂(1.71g，5.60mmol，0.4当量)加入至三氟甲磺酸酯15(10.00g，14mmol，1eq)、甲基硼酸(2.94g，49.1mmol，3.5eq)、氧化银(13g，56mmol，4当量)和磷酸三钾(17.8g，84mmol，6当量)在无水二噁烷(80mL)中的混合物中。反应用氩气吹扫3次并加入氯化二(苯甲腈)钯(II)(540mg，1.40mmol，0.1当量)。反应用氩气吹扫3次以上之后瞬时回暖至110℃。10min之后将反应冷却至室温并通过硅藻土垫过滤。通过在减压下旋转蒸发除去溶剂。获得的残余物进行快速柱色谱(硅胶；10％乙酸乙酯/己烷)。收集纯馏分并合并，并且通过在减压下旋转蒸发除去过量洗脱液以提供产品16(4.5g，55％)。LC/MS，方法B，4.27min(ES+)m/z(相对强度)579.18([M+H]+.,100)；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.70(s，1H)，6.77(s，1H)，5.51(d，J＝1.7Hz，1H)，4.77–4.59(m，1H)，3.89(s，3H)，2.92–2.65(m，1H)，2.55(d，J＝14.8Hz，1H)，1.62(d，J＝1.1Hz，3H)，1.40–1.18(m，3H)，1.11(s，9H)，1.10(s，9H)，0.90(s，9H)，0.11(d，J＝2.3Hz，6H)。
(iii)(S)-(2-氨基-5-甲氧基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-甲基-2,3-二氢-1H-吡咯-1-基)甲酮(17)
在约15℃下将锌粉(5.6g，86mmol，5当量)加入至化合物3(10g，17.3mmol)在5％甲酸的甲醇v/v溶液(100mL)中的溶液中。在30min后反应混合物通过硅藻土垫过滤。滤液用乙酸乙酯稀释并且有机相用水、饱和碳酸氢钠和盐水洗涤。有机相用硫酸镁干燥，过滤并通过旋转蒸发减压除去过量溶剂。获得的残余物进行快速柱色谱(硅胶；10％乙酸乙酯在己烷中)。收集纯馏分并且合并并且通过在减压下旋转蒸发除去过量溶剂以提供产品17(5.1g，80％)。LC/MS，方法B，4.23min(ES+)m/z(相对强度)550.21([M+H]+.,100)；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.28(s，1H)，6.67(s，1H)，6.19(s，1H)，4.64–4.53(m，J＝4.1Hz，1H)，4.17(s，1H)，3.87(s，1H)，3.77–3.69(m，1H)，3.66(s，3H)，2.71–2.60(m，1H)，2.53–2.43(m，1H)，2.04–1.97(m，J＝11.9Hz，1H)，1.62(s，3H)，1.26–1.13(m，3H)，1.08–0.99(m，18H)，0.82(s，9H)，0.03–-0.03(m，J＝6.2Hz，6H)。
(b)(11S,11aS)-叔丁基11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-8-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-羧酸酯(22)
(i)(S)-叔丁基(2-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-甲基-2,3-二氢-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)氨基甲酸酯(18)
将二碳酸二-叔丁酯(2.8g，12.90mmol，1.2当量)用胺17(5.9g，10.75mmol)在100℃下熔化。在10min之后，观察到完全转化并且残余物进行快速柱色谱(硅胶；5％乙酸乙酯在己烷中)。收集纯馏分并合并并且通过在减压下旋转蒸发除去过量溶剂以提供产品18(6g，86％)。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ8.22(s，1H)，7.72(s，1H)，6.72(s，1H)，6.15(s，1H)，4.63(s， 1H)，3.91(s，1H)，3.79(s，1H)，3.73(s，3H)，2.71(dd，J＝16.1，10.2Hz，1H)，2.60–2.46(m，1H)，1.64(s，3H)，1.46(s，9H)，1.33–1.15(m，3H)，1.10(s，9H)，1.08(s，9H)，0.87(s，9H)，0.02(s，6H)。
(ii)(S)-叔丁基(2-(2-(羟基甲基)-4-甲基-2,3-二氢-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-5-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)氨基甲酸酯(19)
将18(9.87g，15.2mmol)溶解于乙酸/甲醇/四氢呋喃/水(168:24:24:48mL)的7:1:1:2混合物中并容许进行室温搅拌。在1h之后，观察到完全转化。通过在减压下旋转蒸发除去溶剂。残余物用乙酸乙酯稀释并按序用水(2×500mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(200mL)和盐水洗涤。有机相用硫酸镁干燥，过滤并且通过旋蒸减压除去过量乙酸乙酯以提供所需的产品19(7.91g，97％)。LC/MS，方法C，2.13min(ES+)m/z(相对强度)1092.45[[2M+Na]+；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.93(s，1H)，7.60(s，1H)，6.74(s，1H)，6.11(s，1H)，4.69(br，1H)，4.55(br，1H)，3.84–3.76(m，2H)，3.74(s，3H)，2.84(dd，J＝16.6，10.3Hz，1H)，2.19(dd，J＝16.4，4.0Hz，1H)，1.67(s，3H)，1.46(s，9H)，1.32–1.19(m，3H)，1.09(s，9H)，1.08(s，9H)。
(iii)(11S,11aS)-叔丁基11-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-8-((三异丙基甲硅烷基)氧基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-羧酸酯(20)
在-78℃(干冰/丙酮浴)下将二甲基亚砜(2.3mL，32.2mmol，2.5当量)在氩气氛下逐滴滴加至草酰卤(1.3mL，15.5mmol，1.2当量)在无水二氯甲烷(70mL)中的溶液中。在10min之后，缓慢加入19(6.9g，12.9mmol)在无水二氯甲烷(50mL)中的溶液而温度仍维持于-78℃。在15min之后，逐滴加入三乙胺(9mL，在分子筛上干燥，64.5mmol，5当量)并除去干冰/丙酮浴。容许反应混合物达到室温并用冷盐酸(0.1M)、饱和碳酸氢钠水溶液和盐水萃取。有机相用硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量二氯甲烷以提供产物20(4.36g，63％)。LC/MS，方法C，2.01min(ES+)m/z(相对强度)1087.45([2M+Na]+)；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.17(s，1H)，6.70(d，1H)，6.65(s，1H)，5.74–5.61(m，1H)，4.03(s，1H)，3.82(s，3H)，3.75(td，J＝9.9，3.3Hz，1H)，2.94(dd，J＝17.1，10.2Hz，1H)，2.57(d，J＝18.5Hz，1H)，1.75(d，J＝7.5Hz，3H)，1.37(s，9H)，1.30–1.19(m，3H)，1.08(s，9H)，1.06(s，9H)。
(iv)(11S,11aS)-叔丁基11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-8-((三异丙基甲硅烷基)氧基)-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸酯(21)
0℃氩气氛下将三氟甲磺酸叔丁基二甲基甲硅烷基酯(Tert-butyldimethylsilyltriflate)(6.5mL，28.39mmol，3当量)加入至化合物20(5.04g，9.46mmol)和2,6-二甲基吡啶(4.4mL，37.86mmol，4当量)在无水二氯甲烷(60mL)中的溶液中。在10min之后，移除冷浴而反应混合物室温搅拌持续1h。反应混合物用水、饱和碳酸氢钠水溶液和盐水萃取。有机相用硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量溶剂以获得产物21(5.18g，85％)。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.17(s，1H)，6.67(s，1H)，6.63(s，1H)，5.79(d，J＝8.9Hz，1H)，3.84(s，3H)，3.65(td，J＝9.9，3.8Hz，1H)，2.89(dd，J＝16.9，10.3Hz，1H)，2.35(d，J＝16.7Hz，1H)，1.75(s，3H)，1.31(s，9H)，1.28–1.18(m，3H)，1.09(s，9H)，1.08(s，9H)，0.85(s，9H)，0.25(s，3H)，0.18(s，3H)。
(v)(11S,11aS)-叔丁基11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-8-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-羧酸酯(22)
将乙酸锂(800mg，7.73mmol)加入至化合物21(5g，7.73mmol)在湿二甲基甲酰胺(50mL，50:1DMF/水)中的溶液中。在2h之后，反应完全并且反应混合物用乙酸乙酯稀释(250mL)并用柠檬酸水溶液(pH～3)、水和盐水洗涤。有机层用硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量乙酸乙酯。获得的残余物进行快速柱色谱(硅胶；梯度，25％至50％乙酸乙酯在己烷中)。收集纯馏分，合并并且通过在减压下旋转蒸发除去过量洗脱液以获得产物22(3.14g，83％)。LC/MS，方法C，(1.92min(ES+)m/z(相对强度)491.25([M+H]+)。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.20(s，1H)，6.68(s，2H)，6.08(s，1H)，5.81(d，J＝8.9Hz，1H)，3.91(s，3H)，3.71(td，J＝9.8，3.8Hz，1H)，2.89(dd，J＝16.9，10.3Hz，1H)，2.36(d，J＝16.9Hz，1H)，1.75(s，3H)，1.31(s，9H)，0.85(s，9H)，0.23(s，3H)，0.21(s，3H)。
(c)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-(1-氨基-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂-16-氮杂十九烷-18-炔-19-基)-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(11-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸酯)(25)
(i)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-碘代-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-羧酸酯)(23)
将1,3-二(溴甲基)-5-碘苯(400mg，1.02mmol)加入至22(1g，2.04mmol，2当量)、TBAI(38mg，0.102mmol，0.1当量)和K2CO3(282mg，2.04mmol，2当量)在无水DMF(10mL)中的搅拌溶液中。反应混合物加热至60℃并在氩气氛下搅拌持续2h，此时通过TLC分析表明完全转化。容许反应混合物冷却至室温并且通过在减压下旋转蒸发除去DMF。获得的残余物稀释于EtOAc中并用水、盐水洗涤。有机层用硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量乙酸乙酯。获得的残余物进行快速柱色谱(硅胶；梯度，50％至80％乙酸乙酯在己烷中)。收集纯馏分并合并并且通过在减压下旋转蒸发除去过量洗脱液以获得产物22(1.27g，定量)。LC/MS，方法C，(2.38min(ES+)m/z(相对强度)1232.35.([M+Na]+)，1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.75(s，2H)，7.50(s，1H)，7.24(s，2H)，6.67(s，2H)，6.51(s，2H)，5.78(d，J＝8.8Hz，2H)，5.03(dd，J＝34.2，12.8Hz，4H)，3.93(s，6H)，3.68(td，J＝9.8，3.7Hz，2H)，2.89(dd，J＝16.9，10.3Hz，2H)，2.34(d，J＝17.0Hz，2H)，1.75(s，6H)，1.22(d，J＝8.5Hz，16H)，0.84(s，18H)，0.22(s，6H)，0.16(s，6H)。
(ii)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-(2,2-二甲基-4,20-二氧代-3,8,11,14,17-五氧杂-5,21-二氮杂二十四烷-23-炔-24-基)-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-羧酸酯)(24)
将催化量的Pd(PPh3)4(22.8mg，19.9μmol，0.02当量)加入至23(1.2g，0.995mmol，1当量)、I3(400mg，0.995mmol，1当量)、CuI(7.6mg，39.6μmol，0.04当量)、二乙胺(0.20mL，1.99mmol，2当量)和烘箱干燥的分子筛丸粒在无水DMF中(1mL)中的混合物中。混合物经过脱气并用氩气吹扫3次随后在微波中100℃下加热10min。通过在减压下旋转蒸发除去DMF。反应混合物稀释于乙酸乙酯中并用水和盐水洗涤。有机层用硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量乙酸乙酯。获得的残余物进行快速柱色谱(硅胶；5％甲醇在二氯甲烷中)。收集纯馏分并合并并且通过在减压下旋转蒸发除去过量洗脱液以获得产物24(1.17g，79％)。LC/MS，方法D，(2.43min(ES+)m/z(相对强度)未离子化；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.49(s，1H)，7.47(s，2H)，7.24(s，2H)，6.68(s，2H)，6.56(s，2H)，5.79(d，J＝8.9Hz，2H)，5.04(dd，J＝28.9，12.3Hz，4H)，4.25(d，J＝5.4Hz，2H)，3.93(s，6H)，3.79–3.56(m，16H)，3.52(t，J＝5.2Hz，2H)，3.29(d，J＝5.0Hz，2H)，2.97–2.83(m，2H)，2.51(t，J＝5.7Hz，2H)，2.35(d，J＝16.1Hz，2H)，1.76(s，6H)，1.43(s，9H)，1.22(s，18H)，0.85(s，18H)，0.22(s，6H)，0.17(s，6H)。
(iii)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-(1-氨基-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂-16-氮杂十九烷-18-炔-19-基)-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(11-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸酯)(25)
三氟甲磺酸叔丁基二甲基甲硅烷基酯(0.77mL，3.37mmol，10当量)加入至化合物24(500g，0.337mmol)和2,6-二甲基吡啶(0.51mL，4.38mmol，12当量)在无水二氯甲烷中(10mL)的溶液中。反应室温下搅拌12h。用饱和氯化铵水溶液和盐水洗涤反应混合物。有机相用硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量溶剂以提供TBS氨基甲酸酯中间产物。残余物溶解于四氢呋喃(10mL)并加入氟化四-正丁基铵(1M，1.7mL，1.685mmol，5当量)和乙酸(0.1mL，1.685mmol，5当量)的混合物。反应 混合物室温下搅拌3h；随后用水、饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤。有机相用硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量溶剂以提供为粗产物的25。LC/MS，方法D，(1.27min(ES+)m/z(相对强度)1155.30.([M+H]+))。
(d)N-(3-(3,5-二((((S)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)甲基)苯基)丙-2-炔-1-基)-1-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五-15-酰胺27[SG3376]
(i)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-(1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,19-二氧代-7,10,13,16-四氧杂-4,20-二氮杂二十三烷-22-炔-23-基)-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(11-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-羧酸酯)26
将EDCI(65mg，0.34mmol，1当量)加入至粗产物25(0.34mmol，1当量)和3-马来酰亚胺丙酸(57.5mg，0.34mmol，1当量)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中。在室温搅拌反应12h在此之后通过LCMS观察到完全转化。 反应混合物稀释于二氯甲烷中并用水和盐水洗涤。有机层用硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量二氯甲烷以提供为粗产物的化合物26。LC/MS，方法D，(1.49min(ES+)m/z(相对强度)未离子化)。
(ii)N-(3-(3,5-二((((S)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)甲基)苯基)丙-2-炔-1-基)-1-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五-15-酰胺27
在0℃下将三氟乙酸(9.5mL)加入至粗产物26(0.337mmol)在水(0.5mL)中的混合物中。反应0℃下搅拌2h。随后反应混合物逐滴加入冷的饱和碳酸氢钠水溶液中。用二氯甲烷萃取反应混合物。有机层随后用盐水洗涤，硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量二氯甲烷。获得的残余物进行快速柱色谱(硅胶；梯度；2％至5％甲醇在二氯甲烷中)。收集纯馏分并合并并且通过在减压下旋转蒸发除去过量洗脱液以获得产物27(70.4mg，20％)。LC/MS，方法E，(4.96min(ES+)m/z(相对强度)1070.25.([M+H]+)；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.78(d，J＝4.0Hz，2H)，7.52(s，2H)，7.44(s，2H)，7.40(s，1H)，7.02–6.93(m，1H)，6.88(s，1H)，6.77(s，2H)，6.74(s，2H)，6.65(s，2H)，5.22–5.01(m，4H)，4.31–4.15(m，4H)，3.94(s，6H)，3.89–3.72(m，4H)，3.65–3.54(m，10H)，3.54–3.45(m，4H)，3.43–3.34(m，2H)，3.25–3.12(m，2H)，2.94(dd，J＝27.0，10.2Hz，2H)，2.51(dd，J＝13.6，6.7Hz，4H)，1.83(s，6H)。
(e)N-(3-(3,5-二((((S)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)甲基)苯基)丙-2-炔-1-基)-1-(2-碘乙酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五-15-酰胺29[SG3378]
(i)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-(1-碘代-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,19-二氮杂二十二-21-炔-22-基)-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(11-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸酯)28
将碘代乙酸酐(53mg，0.150mmol，1当量)加入至粗产物25(0.150mmol，1当量)在二氯甲烷(5mL)中的溶液中。室温搅拌反应20min，在此之后通过LCMS观察到完全转化。反应混合物稀释于二氯甲烷中并用水洗涤。有机层用硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量二氯甲烷以提供为粗产物的化合物28。LC/MS，方法D，(1.50min(ES+)m/z(相对强度)未离子化)。
(ii)N-(3-(3,5-二((((S)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)甲基)苯基)丙-2-炔-1-基)-1-(2-碘代乙酰胺基)-3,6,9,12-四氧杂十五-15-酰胺29
在0℃下将三氟乙酸(0.45mL)加入至粗产物28(0.337mmol)在水(0.05mL)中的混合物中。反应0℃下搅拌30min。随后反应混合物逐滴加入冷饱和碳酸氢钠水溶液。用二氯甲烷萃取反应混合物。有机层随后用盐水洗 涤，硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量二氯甲烷。获得的残余物进行快速柱色谱(硅胶；梯度；2％至5％甲醇在二氯甲烷中)。收集纯馏分并合并并且通过在减压下旋转蒸发除去过量洗脱液以获得产物29(4.23mg，5％)。LC/MS，方法D，(1.35min(ES+)m/z(相对强度)1087.20([M+H]+)；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.79(d，J＝4.0Hz，2H)，7.53(s，2H)，7.45(s，3H)，7.07(br，1H)，6.94(br，1H)，6.78(s，2H)，6.73(s，2H)，5.15(q，J＝12.6Hz，4H)，4.32–4.19(m，4H)，3.96(s，6H)，3.76(dd，J＝12.0，6.4Hz，2H)，3.69(s，2H)，3.64(d，J＝3.6Hz，8H)，3.60(s，4H)，3.55–3.49(m，2H)，3.42(dd，J＝10.3，5.2Hz，2H)，3.23–3.11(m，2H)，3.00–2.89(m，2H)，2.53(t，J＝5.7Hz，2H)，1.83(s，6H)。
实施例5
(a)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-(1-(20-氨基-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸酯)32
(i)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸酯)30
将催化量的Pd(PPh3)4(11mg，0.01mmol，0.02当量)加入至23(600mg，0.496mmol)、TMS-乙炔(0.21mL，1.488mmol，3当量)、CuI(4.0mg，0.02mmol，0.04当量)、二乙胺(0.1mL，0.992mmol，2当量)和烘箱干燥的分子筛丸粒在无水DMF(4mL)中的混合物中。混合物经过脱气并用氩气吹扫3次随后在微波中100℃下加热10min。通过在减压下旋转蒸发除去DMF。反应混合物稀释于乙酸乙酯并用水和盐水洗涤。有机层用硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量乙酸乙酯。获得的残余物进行快速柱色谱(硅胶；50％乙酸乙酯在己烷中)。收集纯馏分并合并并且通过在减压下旋转蒸发除去过量洗脱液以获得产物30(530mg，91％)。 LC/MS，方法C，(2.45min(ES+)；未离子化)；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.52(s，1H)，7.49(s，2H)，7.23(s，2H)，6.67(s，2H)，6.54(s，2H)，5.78(d，J＝8.8Hz，2H)，5.06(dd，J＝41.6，12.8Hz，4H)，3.93(s，6H)，3.68(td，J＝9.8，3.7Hz，2H)，2.90(dd，J＝17.0，10.4Hz，2H)，2.35(d，J＝17.0Hz，2H)，1.76(s，6H)，1.20(s，18H)，0.84(s，18H)，0.22(s，15H)，0.17(s，6H)。
(ii)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-乙炔基-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-羧酸酯)31
将固体K2CO3(124mg，0.90mmol，2当量)加入至TMS-保护的化合物30(530mg，0.449mmol)在MeOH(10mL)中的搅拌溶液中。在室温搅拌1h之后反应完成。通过在减压下旋转蒸发除去甲醇。反应混合物稀释于二氯甲烷中并用水和盐水洗涤。有机层用硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量二氯甲烷以获得产物31(477mg，95％)。LC/MS，方法C，(2.32min(ES+)；未离子化)；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.53(s，3H)，7.24(s，2H)，6.68(s，2H)，6.54(s，2H)，5.79(d，J＝8.7Hz，2H)，5.07(dd，J＝33.2，12.8Hz，4H)，3.93(s，6H)，3.69(td，J＝9.7，3.6Hz，2H)，3.08(s，1H)，2.90(dd，J＝16.9，10.3Hz，2H)，2.35(d，J＝16.8Hz，2H)，1.76(s，6H)，1.25–1.13(m，18H)，0.85(s，18H)，0.22(s，6H)，0.16(m，6H)。
(iii)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-(1-(20-氨基-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸酯)32
室温下将固体CuSO4.5H2O(5mg，0.021mmol，0.05当量)和(+)-L-抗坏血酸钠(17.0mg，0.086mmol，0.2当量)加入至20-叠氮基-3,6,9,12,15,18-六氮杂二十烷-1-胺(151mg，0.43mmol，1当量)和炔烃31(477mg，0.43mmol1当量)在t-BuOH(5mL)和H2O(5mL)中的搅拌溶液中。混合物经过脱气并用氩气吹扫。在搅拌2h之后，反应完全。反应混合物稀释于乙酸乙酯中并用水和盐水洗涤。有机层用硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量乙酸乙酯以获得产物32(640mg，定量)。LC/MS，方法 C，(1.67min(ES+)m/z(相对强度)1457.35([M+H]+))；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ8.10(s，1H)，7.93(br，3H)，7.54(s，1H)，7.25(s，2H)，6.68(s，2H)，6.62(s，2H)，5.79(d，J＝8.6Hz，2H)，5.14(dd，J＝30.6，11.8Hz，4H)，4.68–4.59(m，2H)，4.00–3.94(m，2H)，3.94(s，6H)，3.75–3.47(m，24H)，2.91(dd，J＝16.9，10.3Hz，2H)，2.35(d，J＝16.7Hz，2H)，1.76(s，6H)，1.31–1.11(m，18H)，0.85(d，J＝8.1Hz，18H)，0.20(s，6H)，0.16(s，6H)。
(b)N-(20-(4-(3,5-二((((S)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十烷基)-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺(34)[SG3387]
(i)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-(1-(24-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-22-氧代-3,6,9,12,15,18-六氧杂-21-氮杂二十四基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸酯)33
将EDCI(40mg，0.21mmol，1当量)加入至32(300mg，0.206mmol，1当量)和3-马来酰亚胺丙酸(35mg，0.21mmol，1当量)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中。室温搅拌反应12h，在此之后通过LCMS观察到完全转化。反应混合物稀释于二氯甲烷中并用水和盐水洗涤。有机层用硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量二氯甲烷以提供为粗产物的化合物33(320mg，quant)，LC/MS，方法C，(2.13min(ES+)m/z(相对强度)1609.55([M+H]+)。
(ii)N-(20-(4-(3,5-二((((S)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十烷基)-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺34
在0℃下将三氟乙酸(19mL)加入至粗产物33(0.186mmol)在水(1mL)中的混合物。0℃下搅拌反应30min。随后反应混合物逐滴加入冷的饱和碳酸氢钠水溶液(～2L)中。用二氯甲烷(～1L)萃取反应混合物。有机层随后用盐水洗涤，硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量二氯甲烷。获得的残余物进行快速柱色谱(硅胶；梯度；2％至10％甲醇在二氯甲烷中)。收集纯馏分并合并并且通过在减压下旋转蒸发除去过量洗脱液以获得产物34(56mg，26％)。LC/MS，方法E，(4.99min(ES+)m/z(相对强度)1144.35([M+H]+)；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ8.01(s，1H)，7.86(s，2H)，7.75(d，J＝3.9Hz，2H)，7.50(s，2H)，7.48(s，1H)，6.81(s，2H)，6.71(s，2H)，6.65(s，2H)，6.39(br，1H)，5.21(q，J＝12.4Hz，4H)，4.58(t，J＝4.8Hz，2H)，4.25–4.17(m，2H)，3.96–3.87(m，8H)，3.85–3.77(m，2H)，3.65–3.43(m，22H)，3.37(dd，J＝9.9，4.8Hz，2H)，3.20–3.08(m，2H)，2.92(dd，J＝16.9，4.6Hz，2H)，2.49(t，J＝7.2Hz，2H)，1.81(s，6H)。
(c)N-(20-(4-(3,5-二((((S)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十烷基)-2-碘代乙酰胺36[SG3389]
(i)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-(1-(1-碘代-2-氧代-6,9,12,15,18,21-六氧杂-3-氮杂二十三烷-23-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-羧酸酯)35
将碘代乙酸酐(37mg，0.103mmol，1当量)加入至32(150mg，0.103mmol，1当量)在二氯甲烷(5mL)中的溶液中。在室温搅拌反应20min，在此之后通过LCMS观察到完全转化。反应混合物稀释于二氯甲烷中并用水洗涤。有机层用硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量二氯甲烷以提供为粗产物的化合物35。
LC/MS，方法C，(2.17min(ES+)m/z(相对强度)1625.35([M+H]+)。
(ii)N-(20-(4-(3,5-二((((S)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基)氧基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十烷基)-2-碘代乙酰胺36
在0℃下将三氟乙酸(4.95mL)加入至粗产物35(0.103mmol)在水(0.05mL)中的混合物中。在0℃下搅拌反应30min。随后反应混合物逐滴加入 冷的饱和碳酸氢钠水溶液(200mL)中。用二氯甲烷萃取反应混合物。有机层随后用盐水洗涤，硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量二氯甲烷。获得的残余物进行快速柱色谱(硅胶；梯度；2％至10％甲醇在二氯甲烷中)。收集纯馏分并合并并且通过在减压下旋转蒸发除去过量洗脱液以获得产物36(32mg，27％)。LC/MS，方法E，(5.16min(ES+)m/z(相对强度)1161.10([M+H]+)；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ8.03(s，1H)，7.87(s，2H)，7.76(d，J＝3.9Hz，2H)，7.51(s，2H)，7.48(s，1H)，6.95(br，1H)，6.82(s，2H)，6.72(s，2H)，5.21(q，J＝12.4Hz，4H)，4.59–4.58(m，2H)，4.24–4.20(m，2H)，3.96–3.87(m，8H)，3.70(s，2H)，3.66–3.47(m，22H)，3.41(dd，J＝10.3，5.2Hz，2H)，3.19–3.07(m，2H)，2.98–2.85(m，2H)，1.78(d，J＝22.4Hz，6H)。
实施例6
N-(20-(4-(3,5-二((((S)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-8-基)氧基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十烷基)戊-4-炔酰胺(38)
(i)(11S,11aS,11'S,11a'S)-二-叔丁基8,8'-(((5-(1-(22-氧代-3,6,9,12,15,18-六氧杂-21-氮杂二十六-25-炔-1-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))二(11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸酯)37
将EDCI(20mg，0.103mmol，1当量)加入至32(150mg，0.103mmol，1当量)和戊-4-炔酸(20mg，0.103mmol，1当量)在二氯甲烷(5mL)中的溶液中。在室温搅拌反应12h，在此之后通过LCMS观察到完全转化。反应混合物稀释于二氯甲烷中并用水和盐水洗涤。有机层用硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量二氯甲烷以提供为粗产物的化合物37。LC/MS，方法C，(2.16min(ES+)m/z(相对强度)未离子化)。
(ii)N-(20-(4-(3,5-二((((S)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)甲基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十烷基)戊-4-炔酰胺38
在0℃下将三氟乙酸(4.95mL)加入至粗产物37(0.103mmol)在水(0.05mL)中的混合物中。0℃下搅拌反应30min。随后将反应混合物逐滴加入冷的饱和碳酸氢钠水溶液(200mL)。用二氯甲烷萃取反应混合物。有机层随后用盐水洗涤，硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量二氯甲烷。获得的残余物进行快速柱色谱(硅胶；梯度；2％至10％甲醇在二氯甲烷中)。收集纯馏分并合并并且通过在减压下旋转蒸发除去过量洗脱液以获得产物38(40mg，36％)。LC/MS，方法E，(5.11min(ES+)m/z(相对强度)1073.30([M+H]+)；1HNMR(400MHz，CDCl3)δ8.01(s，1H)，7.87(s，2H)，7.77(d，J＝3.8Hz，2H)，7.52(s，2H)，7.49(s，1H)，6.82(s，2H)，6.72(s，2H)，6.42(s，1H)，5.22(q，J＝12.3Hz，4H)，4.59(t，J＝4.8Hz，2H)，4.28–4.17(m，2H)，3.99–3.88(m，8H)，3.57(dt，J＝9.5，8.0Hz，22H)，3.50–3.39(m，2H)，3.20–3.07(m，2H)，2.93(dd，J＝16.7，3.9Hz，2H)，2.51(t，J＝6.1Hz，2H)，2.39(t，J＝7.2Hz，2H)，2.01(dd，J＝11.6，5.4Hz，1H)，1.82(s，6H)。
实施例7
(i)二-叔丁基8,8'-(((5-甲酰基-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))(11S,11aS,11'S,11a'S)-二(11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-羧酸酯)40
将3,5-二(溴甲基)苯甲醛39(30mg，0.102mmol)加入至22(100mg，0.204mmol，2当量)、TBAI(7mg，0.02mmol，0.1当量)和K2CO3(28mg，0.204mmol，2当量)在无水DMF(2mL)中的搅拌溶液中。反应混合物加热至60℃并在氩气氛下搅拌4h和室温下搅拌12h。混合物稀释于EtOAc中并用水、盐水洗涤。有机层用硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量乙酸乙酯。获得的残余物进行快速柱色谱(硅胶；梯度，50％至70％乙酸乙酯在己烷中)。收集纯馏分并合并并且通过在减压下旋转蒸发除去过量洗脱液以获得产物40(90mg，79％)。LC/MS，方法C，(2.27min(ES+)m/z(相对强度)1111.35.([M+H]+)，1HNMR(400MHz，CDCl3)δ10.05(s，1H)，7.95(s，2H)，7.86(s，1H)，7.26(s，2H)，6.69(s，2H)，6.58(s，2H)，5.80(d，J＝8.5Hz，2H)，5.17(s，4H)，3.94(s，6H)，3.72–3.68(m， 2H)，2.91(dd，J＝16.7，10.3Hz，2H)，2.36(d，J＝17.4Hz，2H)，1.77(s，6H)，1.25(s，18H)，0.84(s，18H)，0.22(s，6H)，0.15(s，6H)。
(ii)(E)-3-(3,5-二((((11S,11aS)-10-(叔丁氧基羰基)-11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-5,10,11,11a-四氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)甲基)苯基)丙烯酸41
将丙二酸(14mg，0.138mmol，2.2当量)和化合物40溶解于哌啶(1μL)和吡啶(0.1mL)的混合物中。反应混合物加热至95℃并在氩气氛下搅拌2h。混合物稀释于EtOAc中并用水、盐水洗涤。有机层用硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量乙酸乙酯。获得的残余物进行快速柱色谱(硅胶；梯度，50％至100％乙酸乙酯在己烷中结合至是2％MeOH在EtOAc中)。收集纯馏分并合并并且通过在减压下旋转蒸发除去过量洗脱液以获得产物41(50mg，53％)。LC/MS，方法C，(2.21min(ES+)m/z(相对强度)1153.35.([M+H]+)，1HNMR(400MHz，CDCl3)δ7.73(d，J＝15.9Hz，1H)，7.58(s，2H)，7.55(s，1H)，7.26(s，2H)，6.68(s，2H)，6.54(s，2H)，6.46(d，J＝16.0Hz，1H)，5.77(d，J＝8.6Hz，2H)，5.11(dd，J＝27.4，12.3Hz，4H)，3.94(s，6H)，3.68(dd，J＝8.9，6.4Hz，2H)，2.89(dd，J＝16.8，10.3Hz，2H)，2.34(d，J＝16.7Hz，2H)，1.75(s，6H)，1.29–1.09(m，18H)，0.82(s，18H)，0.21(s，6H)，0.13(s，6H)。
(iii)二-叔丁基8,8'-(((5-((E)-2,2-二甲基-4,15-二氧代-3,8,11-三氧杂-5,14-二氮杂十七-16-烯-17-基)-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))(11S,11aS,11'S,11a'S)-二(11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-羧酸酯)42
将EDCI(9mg，0.045mmol，1当量)加入至41(50mg，0.043mmol，1当量)和(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(11mg，0.045mmol，1当量)在二氯甲烷(2mL)中的溶液中。在室温搅拌反应1h，在此之后通过LCMS观察到完全转化。反应混合物稀释于二氯甲烷中并用水和盐水洗涤。有机层用硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量二氯甲烷以提供为粗产物的化合物42。LC/MS，方法C，(2.29min(ES+)m/z(相对强度)1384.35([M+H]+))。
(iv)二-叔丁基8,8'-(((5-((E)-3-((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))(11S,11aS,11'S,11a'S)-二(11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂-10(5H)-羧酸酯)43
将三氟甲磺酸叔丁基二甲基甲硅烷基酯(0.10mL，0.43mmol，10当量)加入至化合物42(0.043mmol)和2,6-二甲基吡啶(0.07mL，0.56mmol，13当量)在无水二氯甲烷(2mL)中的溶液中。反应室温下搅拌2h。反应混合物用饱和氯化铵水溶液，水和盐水洗涤。有机相用硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量溶剂以提供为粗产物的胺43和单TBS-脱保护的化合物的混合物。LC/MS，方法C，(1.72min(ES+)m/z(相对强度)1283.35([M+H]+))。
(v)二-叔丁基8,8'-(((5-((E)-16-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,14-二氧代-7,10-二氧杂-4,13-二氮杂十六-1-烯-1-基)-1,3-亚苯基)二(亚甲基))二(氧基))(11S,11aS,11'S,11a'S)-二(11-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂10(5H)-羧酸酯)44
将EDCI(9mg，0.045mmol，1当量)加入至43(0.043mmol，1当量)和3-马来酰亚胺丙酸(8mg，0.045mmol，1当量)在二氯甲烷(2mL)中的溶液中。在室温搅拌反应12h，在此之后通过LCMS观察到完全转化。反应混合物稀释于二氯甲烷中并用水和盐水洗涤。有机层用硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量二氯甲烷以提供为粗产物的化合物44，LC/MS，方法C，(2.19min(ES+)m/z(相对强度)1435.40([M+H]+)。
(vi)(E)-3-(3,5-二((((S)-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-5,11a-二氢-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮杂8-基)氧基)甲基)苯基)-N-(2-(2-(2-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)乙氧基)乙氧基)乙基)丙烯酰胺45
在0℃下将三氟乙酸(4.95mL)加入至粗产物44(0.043mmol)在水(0.05mL)中的混合物中。反应0℃下搅拌1h。随后反应混合物逐滴加入冷的饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)中。用二氯甲烷萃取反应混合物。有机层随后用盐水洗涤，硫酸镁干燥，过滤并且通过在减压下旋转蒸发除去过量二氯甲烷。获得的残余物进行制备HPLC。收集纯馏分并合并并且通过冻干 除去过量洗脱液以获得产物45(4.26mg，10％)。LC/MS，方法C，(1.35min(ES+)m/z(相对强度)968.25([M+H]+)。
实施例8
通用的抗体结合步骤
在还原缓冲溶液(实例：磷酸盐缓冲生理盐水PBS、组氨酸缓冲溶液、硼酸钠缓冲溶液、TRIS缓冲溶液)中将抗体稀释至1-5mg/mL。将新鲜制备的TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)的溶液添加至选择性还原的半胱氨酸二硫化物桥中。TCEP的量与还原(减少，reduction)的靶向水平成比例，在1至4摩尔当量/抗体内，产生2至8个反应性硫醇。在37℃还原数小时后，将混合物冷却至室温并且添加过量的药物-接头(7、10)作为稀释的DMSO溶液(最终的DMSO含量高达10％体积/反应混合物的体积)。在4℃或室温下轻轻摇晃混合物适当的时间，通长是1-3小时。在结合最后，过量反应性硫醇可以与“硫醇封端试剂”(如N-乙基马来酰亚胺(NEM))反应。使用具有10kDa或更高的分子量截止值的离心过滤器浓缩抗体-药物结合物，然后通过切向流过滤(TFF)或快速蛋白质液相色谱(FPLC)纯化。使用与UV-可见光、荧光或质谱仪检测结合的反向色谱(RP)或疏水作用色谱(HIC)，可以通过高效液相色谱(HPLC)或超高效液相色谱(UHPLC)分析确定对应的抗体-药物结合物以评估药物/抗体比值(DAR)；使用与UV-可见光、荧光或质谱仪检测结合的尺寸排阻，可以通过HPLC或UHPLC分析聚集水平和单体纯度。可以通过光谱(在280，214和330nm处吸收)和生物化学测定的组合确定最终的结合物浓度(bicinchonicacidassayBCA；Smith,P.K.,etal.(1985)Anal.Biochem.150(1):76–85；使用已知浓度的IgG抗体作为参考)。通常在防腐条件下使用0.2μm过滤器无菌过滤抗体-药物结合物并将其存储在+4℃、-20℃或-80℃。
具体结合物的实例描述如下。
结合物A(Ab-7，ConjA)
抗体(Ab)(2.0mg，13.3nmol)稀释至1.8mL的包含10mM硼酸钠的pH8.4、2.5mMEDTA的还原缓冲液中并且最终抗体浓度为1.11mg/mL。加入10mMTCEP溶液(2摩尔当量/抗体，26.6nmol，2.66μL)并且还原混合物在加热块上37℃加热2.3h。在冷却至室温后，加入作为DMSO溶液(3.5摩尔当量/抗体，46.7nmol，在0.2mLDMSO中)的化合物7。溶液室温混合 1h，随后通过加入N-乙基马来酰亚胺(1μmol，10μL，100mM)淬灭结合作用，接着15min后加入N-乙酰半胱氨酸(1.5μmol，15μL，100mM)，随后使用填充有Superdex200PG的GEHealthcareXK16/70柱注入AKTATMFPLC，用1.5mL/min无菌过滤的磷酸盐缓冲的盐水(PBS)洗脱。合并对应于ConjA单峰的馏分，使用15mLAmiconUltracell50KDaMWCO自旋过滤器浓缩，分析和无菌过滤。BCA分析检在1.4mL中以1.25mg/mL给出最终ConjA浓度，获得ConjA的质量为1.75mg(87％的收率)。
采用PhenomenexAeris3.6uXB-C18150×2.1mm柱子、以水和乙腈的梯度洗脱、在ShimadzuProminence系统上对ConjA的还原的(减少的，reduced)样品在280nm和330nm(化合物7特征波长)的UHPLC分析表明轻链和重链的混合物连接至化合物7的数个分子，与2.8分子的化合物7/抗体的药物-每-抗体比率(DAR)是一致的。
采用WatersAcquityUPLCBEH200SEC1.7um4.6×150mm柱子、以包含5％异丙醇(v/v)的无菌过滤磷酸盐缓冲的盐水(PBS)洗脱、在ShimadzuProminence系统上对ConjA的样品在280nm处的UHPLC分析表明单体纯度超过99％，而未检测到杂质。
结合物B(Ab-10，ConjB)
抗体(Ab)(2.0mg，13.3nmol)稀释至1.8mL的包含10mM硼酸钠的、pH8.4、2.5mMEDTA的还原缓冲液中并且最终抗体浓度为1.11mg/mL。加入10mMTCEP溶液(2摩尔当量/抗体，26.6nmol，2.66μL)并且还原混合物在加热块上37℃加热1.5h。在冷却至室温后，加入作为DMSO溶液(3.5摩尔当量/抗体，46.7nmol，在0.2mLDMSO中)的化合物10。室温混合溶液2h，随后通过加入N-乙基马来酰亚胺(1μmol，10μL，100mM)淬灭结合作用，接着15min后加入N-乙酰半胱氨酸(1.5μmol，15μL，100mM)，随后使用填充有Superdex200PG的GEHealthcareXK16/70柱注入AKTATMFPLC，用1.5mL/min无菌过滤的磷酸盐缓冲的盐水(PBS)洗脱。合并对应于ConjB单峰的馏分，使用15mLAmiconUltracell50KDaMWCO自旋过滤器浓缩，分析和无菌过滤。BCA分析检在1.4mL中以0.99mg/mL给出最终ConjB浓度，获得ConjB的质量为1.39mg(70％的收率)。
采用PhenomenexAeris3.6uXB-C18150×2.1mm柱子、以水和乙腈洗脱、在ShimadzuProminence系统上对ConjB的样品在280nm和330nm(化 合物10特征波长)的UHPLC分析表明轻链和重链的混合物连接至化合物B的数个分子，与3.8分子化合物10/抗体的药物-每-抗体比率(DAR)是一致的。
采用WatersAcquityUPLCBEH200SEC1.7um4.6×150mm柱子、以包含5％异丙醇(v/v)的无菌过滤磷酸盐缓冲的盐水(PBS)洗脱、在ShimadzuProminence系统上对ConjB的样品在280nm处的UHPLC分析表明单体纯度超过99％，而未检测到杂质。
结合物C(Ab-27，ConjC)
抗体(2.5mg，16.7nmol)稀释至2.25mL包含10mM硼酸钠的、pH8.4、2.5mMEDTA的还原缓冲液中并且最终抗体浓度为1.11mg/mL。加入10mMTCEP溶液(1.65摩尔当量/抗体，27.5nmol，2.75μL)并且还原混合物在培养箱中+37℃加热1.6h。在冷却至室温后，加入作为DMSO溶液(7.5摩尔当量/抗体，125nmol，在0.25mLDMSO中)的化合物27。溶液室温混合1.3h，随后通过加入N-乙酰半胱氨酸(250nmol，25mL，10mM)淬灭结合作用，随后使用填充有Superdex200PG的GEHealthcareHiLoadTM26/600柱注入AKTATMPureFPLC，用2.6mL/min无菌过滤的磷酸盐缓冲的盐水(PBS)洗脱。合并对应于ConjC单峰的馏分，使用15mLAmiconUltracell50KDaMWCO自旋过滤器浓缩，分析和无菌过滤。
采用PhenomenexAeris3.6uXB-C18150×2.1mm柱子、以水和乙腈洗脱、在ShimadzuProminence系统上对ConjC的样品在280nm和330nm(化合物27特征波长)的UHPLC分析表明轻链和重链的混合物连接至数个分子的化合物27，与2.56分子化合物27/抗体的药物-每-抗体比率(DAR)是一致的。
采用TosohBioscienceTSKgelG3000SWXL5μm7.8×300mm柱子(具有7μm6.0×40mm保护柱)、以包含200mM磷酸钾pH6.95、250mM氯化钾和10％异丙醇(v/v)的无菌过滤SEC缓冲液洗脱、在ShimadzuProminence系统上对ConjC的样品在280nm处的UHPLC分析表明单体纯度超过99％，而未检测到杂质。UHPLCSEC分析给出2.5mL中最终ConjC浓度0.77mg/mL，获得ConjC质量为1.93mg(77％收率)。
结合物D(Ab-29，ConjD)
抗体(3.5mg，22.3nmol)稀释至3.15mL包含10mM硼酸钠的、pH8.4、2.5mMEDTA的还原缓冲液中并且最终抗体浓度为1.11mg/mL。加入10mMTCEP溶液(2.0摩尔当量/抗体，46.7nmol，4.67mL)并且还原混合物在培养箱中+37℃加热1.6h。在冷却至室温后，加入作为DMSO溶液(10摩尔当量/抗体，233nmol，在0.175mLDMSO中)的化合物29。溶液室温混合另外19h。通过加入N-乙酰半胱氨酸(933nmol，93.3mL，10mM)淬灭结合作用，随后使用填充有Superdex200PG的GEHealthcareHiLoadTM26/600柱注入AKTATMPureFPLC，用2.6mL/min无菌过滤的磷酸盐缓冲的盐水(PBS)洗脱。合并对应于ConjD单峰的馏分，使用15mLAmiconUltracell50KDaMWCO自旋过滤器浓缩，分析和无菌过滤。
采用PhenomenexAeris3.6uXB-C18150×2.1mm柱子、以水和乙腈洗脱、在ShimadzuProminence系统上对ConjD的样品在280nm和330nm(化合物29特征波长)的UHPLC分析表明轻链和重链的混合物连接至数个分子的化合物29，与2.43分子化合物29/抗体的药物-每-抗体比率(DAR)是一致的。
采用TosohBioscienceTSKgelG3000SWXL5μm7.8×300mm柱子(具有7μm6.0×40mm保护柱)、以包含200mM磷酸钾pH6.95、250mM氯化钾和10％异丙醇(v/v)的无菌过滤SEC缓冲液洗脱、在ShimadzuProminence系统上对ConjB的样品在280nm处的UHPLC分析表明单体纯度超过99％，而未检测到杂质。UHPLCSEC分析给出3.3mL中最终ConjB浓度0.73mg/mL，获得ConjB质量为2.42mg(69％收率)。
结合物E(Ab-34，ConjE)
抗体(2.5mg，16.7nmol)稀释至2.25mL包含10mM硼酸钠的、pH8.4、2.5mMEDTA的还原缓冲液中并且最终抗体浓度为1.11mg/mL。加入10mMTCEP溶液(1.65摩尔当量/抗体，27.5nmol，2.75mL)并且还原混合物在培养箱中+37℃加热1.6h。在冷却至室温后，加入作为DMSO溶液(7.5摩尔当量/抗体，125nmol，在0.25mLDMSO中)的化合物34。溶液室温混合另外1.3h，随后通过加入N-乙酰半胱氨酸(250nmol，25mL，10mM)淬灭结合作用，随后使用填充有Superdex200PG的GEHealthcareHiLoadTM26/600柱注入AKTATMPureFPLC，用2.6mL/min无菌过滤的磷酸盐缓冲的盐水(PBS)洗脱。合并对应于ConjE单峰的馏分，使用15mLAmiconUltracell50KDaMWCO自旋过滤器浓缩，分析和无菌过滤。
采用PhenomenexAeris3.6uXB-C18150×2.1mm柱子、以水和乙腈洗脱、在ShimadzuProminence系统上对ConjCE的样品在280nm和330nm(化合物34特征波长)的UHPLC分析表明轻链和重链的混合物连接至数个分子的化合物34，与2.45分子化合物34/抗体的药物-每-抗体比率(DAR)是一致的。
采用TosohBioscienceTSKgelG3000SWXL5μm7.8×300mm柱子(具有7μm6.0×40mm保护柱)、以包含200mM磷酸钾pH6.95、250mM氯化钾和10％异丙醇(v/v)的无菌过滤SEC缓冲液洗脱、在ShimadzuProminence系统上对ConjE的样品在280nm处的UHPLC分析表明单体纯度超过99％，而未检测到杂质。UHPLCSEC分析给出2.0mL中最终ConjE浓度1.05mg/mL，获得ConjE质量为2.09mg(84％收率)。
结合物F(Ab-36，ConjF)
抗体(3.5mg，23.3nmol)稀释至3.15mL包含10mM硼酸钠的、pH8.4、2.5mMEDTA的还原缓冲液中并且最终抗体浓度为1.11mg/mL。加入10mMTCEP溶液(2.0摩尔当量/抗体，46.7nmol，4.67mL)并且还原混合物在培养箱中+37℃加热1.6h。在冷却至室温后，加入作为DMSO溶液(10摩尔当量/抗体，233nmol，在0.175mLDMSO中)的化合物36。溶液室温混合另外3.9h，此时加入作为DMSO溶液(10摩尔当量/抗体，233nmol，在0.175mLDMSO中)的化合物36，而溶液室温下混合另外19h。通过加入N-乙酰半胱氨酸(933nmol，93.3mL，10mM)淬灭结合作用，随后使用填充有Superdex200PG的GEHealthcareHiLoadTM26/600柱注入AKTATMPureFPLC，用2.6mL/min无菌过滤的磷酸盐缓冲的盐水(PBS)洗脱。合并对应于ConjF单峰的馏分，使用15mLAmiconUltracell50KDaMWCO自旋过滤器浓缩，分析和无菌过滤。
采用PhenomenexAeris3.6uXB-C18150×2.1mm柱子、以水和乙腈洗脱、在ShimadzuProminence系统上对ConjF的样品在280nm和330nm(化合物36特征波长)的UHPLC分析表明轻链和重链的混合物连接至数个分子的化合物36，与2.57分子化合物36/抗体的药物-每-抗体比率(DAR)是一致的。
采用TosohBioscienceTSKgelG3000SWXL5μm7.8×300mm柱子(具有7μm6.0×40mm保护柱)、以包含200mM磷酸钾pH6.95、250mM氯 化钾和10％异丙醇(v/v)的无菌过滤SEC缓冲液洗脱、在ShimadzuProminence系统上对ConjF的样品在280nm处的UHPLC分析表明单体纯度超过99％，而未检测到杂质。UHPLCSEC分析给出3.8mL中最终ConjF浓度0.75mg/mL，获得ConjF质量为2.84mg(81％收率)。
结合物G(Ab-45，ConjG)
抗体(2.5mg，16.7nmol)稀释至2.25mL包含10mM硼酸钠的、pH8.4、2.5mMEDTA的还原缓冲液中并且最终抗体浓度为1.11mg/mL。加入10mMTCEP溶液(1.65摩尔当量/抗体，27.5nmol，2.75mL)并且还原混合物在培养箱中+37℃加热1.6h。在冷却至室温后，加入作为DMSO溶液(7.5摩尔当量/抗体，125nmol，在0.25mLDMSO中)的化合物45。溶液室温混合另外1.3h，随后通过加入N-乙酰半胱氨酸(250nmol，25mL，10mM)淬灭结合作用，随后使用填充有Superdex200PG的GEHealthcareHiLoadTM26/600柱注入AKTATMPureFPLC，用2.6mL/min无菌过滤的磷酸盐缓冲的盐水(PBS)洗脱。合并对应于ConjG单峰的馏分，使用15mLAmiconUltracell50KDaMWCO自旋过滤器浓缩，分析和无菌过滤。
采用PhenomenexAeris3.6uXB-C18150×2.1mm柱子、以水和乙腈洗脱、在ShimadzuProminence系统上对ConjG的样品在280nm和330nm(化合物45特征波长)的UHPLC分析表明轻链和重链的混合物连接至数个分子的化合物45，与2.13分子化合物45/抗体的药物-每-抗体比率(DAR)是一致的。
采用TosohBioscienceTSKgelG3000SWXL5μm7.8×300mm柱子(具有7μm6.0×40mm保护柱)、以包含200mM磷酸钾pH6.95、250mM氯化钾和10％异丙醇(v/v)的无菌过滤SEC缓冲液洗脱、在ShimadzuProminence系统上对ConjG的样品在280nm处的UHPLC分析表明单体纯度超过99％，而未检测到杂质。UHPLCSEC分析给出2.9mL中最终ConjG浓度0.67mg/mL，获得ConjG质量为1.94mg(78％收率)。
在以上结合中所使用的抗体是HERCEPTIN。
实施例9：体内ADC效力研究
CB.17SCID小鼠，8至12周龄，可以在胁腹皮下注射1mm3的肿瘤片段。当肿瘤大小平均达到100至150mg时开始治疗。小鼠可以每周称重2次。肿瘤大小可以每周测定两次。动物可以各个监测。实验的终点是 1000mm3肿瘤体积或60天，无论哪一个先达到。响应者可以跟踪较长时间。
10个异种移植小鼠的组可以静脉注射0.2mL在磷酸盐缓冲盐水(媒介物)中的抗体-药物结合物(ADC)，或裸抗体，或0.2mL仅媒介物。ADC的浓度可以经过调节以提供例如单个剂量中的0.3或1mgADC/kg体重。可以以例如1个周的间隔提供三个相同剂量于每只小鼠。
实施例10：体外ADC效力研究
在T75烧瓶中抽吸来自亚汇合(约80％至90％汇合率)SK-BR-3细胞的培养基并加入PBS(约20mL)以冲洗掉培养基。抽吸PBS并加入胰蛋白酶-EDTA(5mL)。烧瓶返回至37℃气体培养箱中最多达约5min。烧瓶急剧敲击以从塑料上驱出和分离出细胞。细胞悬液转移到无菌50mL螺旋盖离心管中。加入培养基(麦考伊(McCoy)氏+10％FCS)至最终体积15mL，随后将管离心(400g持续5min)。抽吸上清液并且将颗粒再悬浮于10mL培养基介质中。反复抽吸(10mL移液管向上和向下)可能有必要打破细胞团块并产生适用于计数的单分散细胞悬浮液。细胞悬浮液(10μL)与台盼(Trypan)蓝(10μL)混合而用血细胞计数仪计数活/死细胞以确定细胞的浓度和活性。细胞悬浮液稀释至20×104/mL并且将50μL分散到干净的96-孔平底板中。细胞培养过夜而容许在使用前回收。
通过将过滤灭菌的ADC稀释至细胞培养基介质中以制备抗体药物结合物(ADC)的原液(1mL)(20μg/mL)。通过将100μL系列转移至900μL细胞培养基介质中在24-孔板中制备原液ADC的一组8×10倍稀释液。
将50μL的每种ADC稀释液分散到96-孔板的4个重复的孔中，孔中含50μL前一天接种的细胞悬浮液。对照物孔接收50μL细胞培养基介质。包含细胞和ADC的96孔板在37℃下于CO2气体处理的培养箱中培养4天。在培养期结束时，通过MTS分析检测法测定存活细胞。将MTS(Promega)分散(20μL/孔)至每个孔中并在37℃下于CO2气体处理的培养箱中培养4h。在490nm下测定孔吸光度。由4种ADC-处理的孔中的平均吸光度相比于4个对照物孔的平均吸光度(100％)计算细胞存活百分率。
ADCEC50(μg/mL)
ConjD0.001696
ConjE0.002766
ConjF0.003576
ConjG0.006163
ConjC0.0006929
缩写
Ac乙酰基
Acm乙酰氨基甲基
Alloc烯丙氧基羰基
Boc二碳酸二叔丁基酯
t-Bu叔丁基
Bzl苄基，其中，Bzl-OMe是甲氧基苄基以及Bzl-Me是甲基苄基
Cbz或Z苄氧基-羰基，其中Z-Cl和Z-Br分别是氯苄氧基羰基和溴苄氧基羰基
DMFN,N-二甲基甲酰胺
Dnp二硝基苯基
DTT二硫苏糖醇
Fmoc9H-芴-基甲氧基羰基
impN-10亚胺保护基团：3-(2-甲氧基乙氧基)丙酸酯-Val-Ala-PAB
MC-OSu马来酰亚胺己酰基-O-N-琥珀酰亚胺
Moc甲氧基羰基
MP马来酰亚胺丙酰胺
Mtr4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基
PAB对氨基苄氧基羰基
PEG乙烯氧基
PNZ对硝基苄基氨基甲酸酯
Psec2-(苯基磺酰基)乙氧基羰基
TBDMS叔丁基二甲基甲硅烷基
TBDPS叔丁基二苯基甲硅烷基
Teoc2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基
Tos甲苯磺酰基
Troc2,2,2-三氯乙氧基羰基氯化物
Trt三苯甲基
Xan呫吨基
参考文献
EP0522868
EP0875569
EP1295944
EP1347046
EP1394274
EP1394274
EP1439393
JP05003790
JP2004113151
JP58180487
US2001/055751
US2002/034749
US2002/042366
US2002/150573
US2002/193567
US2003/0228319
US2003/060612
US2003/064397
US2003/065143
US2003/091580
US2003/096961
US2003/105292
US2003/109676
US2003/118592
US2003/119121
US2003/119122
US2003/119125
US2003/119126
US2003/119128
US2003/119129
US2003/119130
US2003/119131
US2003/124140
US2003/124579
US2003/129192
US2003/134790-A1
US2003/143557
US2003/157089
US2003/165504
US2003/185830
US2003/186372
US2003/186373
US2003/194704
US2003/206918
US2003/219806
US2003/224411
US2003/224454
US2003/232056
US2003/232350
US20030096743
US20030130189
US2003096743
US2003130189
US2004/0001827
US2004/005320
US2004/005538
US2004/005563
US2004/005598
US2004/0101899
US2004/018553
US2004/022727
US2004/044179
US2004/044180
US2004/101874
US2004/197325
US2004/249130
US20040018194
US20040052793
US20040052793
US20040121940
US2005/271615
US2006/116422
US4816567
US5362852
US5440021
US5583024
US5621002
US5644033
US5674713
US5700670
US5773223
US5792616
US5854399
US5869445
US5976551
US6011146
US6153408
US6214345
US6218519
US6268488
US6518404
US6534482
US6555339
US6602677
US6677435
US6759509
US6835807
US7223837
US7375078
US7521541
US7723485
WO00/012508
WO00/12507
WO00/12508
WO01/16318
WO01/45746
WO02/088172
WO03/026577
WO03/043583
WO04/032828
WO2000/12130
WO2000/14228
WO2000/20579
WO2000/22129
WO2000/32752
WO2000/36107
WO2000/40614
WO2000/44899
WO2000/55351
WO2000/75655
WO200053216
WO2001/00244
WO2001/38490
WO2001/40269
WO2001/40309
WO2001/41787
WO2001/46232
WO2001/46261
WO2001/48204
WO2001/53463
WO2001/57188
WO2001/62794
WO2001/66689
WO2001/72830
WO2001/72962
WO2001/75177
WO2001/77172
WO2001/88133
WO2001/90304
WO2001/94641
WO2001/98351
WO2002/02587
WO2002/02624
WO2002/06317
WO2002/06339
WO2002/101075
WO2002/10187
WO2002/102235
WO2002/10382
WO2002/12341
WO2002/13847
WO2002/14503
WO2002/16413
WO2002/16429
WO2002/22153
WO2002/22636
WO2002/22660
WO2002/22808
WO2002/24909
WO2002/26822
WO2002/30268
WO2002/38766
WO2002/54940
WO2002/59377
WO2002/60317
WO2002/61087；
WO2002/64798
WO2002/71928
WO2002/72596
WO2002/78524
WO2002/81646
WO2002/83866
WO2002/86443
WO2002/88170
WO2002/89747
WO2002/92836
WO2002/94852
WO2002/98358
WO2002/99074
WO2002/99122
WO2003/000842
WO2003/002717
WO2003/003906
WO2003/003984
WO2003/004989
WO2003/008537
WO2003/009814
WO2003/014294
WO2003/016475
WO2003/016494
WO2003/018621
WO2003/022995
WO2003/023013
WO2003/024392
WO2003/025138
WO2003/025148
WO2003/025228
WO2003/026493
WO2003/029262
WO2003/029277
WO2003/029421
WO2003/034984
WO2003/035846
WO2003/042661
WO2003/045422
WO2003/048202
WO2003/054152
WO2003/055439
WO2003/055443
WO2003/062401
WO2003/062401
WO2003/072035
WO2003/072036
WO2003/077836
WO2003/081210
WO2003/083041
WO2003/083047
WO2003/083074
WO2003/087306
WO2003/087768
WO2003/088808
WO2003/089624
WO2003/089904
WO2003/093444
WO2003/097803
WO2003/101283
WO2003/101400
WO2003/104270
WO2003/104275
WO2003/105758
WO2003004529
WO2003042661
WO2003104399
WO2004/000997
WO2004/001004
WO2004/009622
WO2004/011611
WO2004/015426
WO2004/016225
WO2004/020595
WO2004/022709
WO2004/022778
WO2004/027049
WO2004/031238
WO2004/032828
WO2004/032842
WO2004/040000
WO2004/043361
WO2004/043963
WO2004/044178
WO2004/045516
WO2004/045520
WO2004/045553
WO2004/046342
WO2004/047749
WO2004/048938
WO2004/053079
WO2004/063355
WO2004/063362
WO2004/063709
WO2004/065577
WO2004/074320
WO2004000221
WO2004020583
WO2004042346
WO2004065576
WO2005/023814
WO2005/082023
WO2005/085251
WO2006/111759
WO2007/044515
WO2007/085930
WO2009/052249
WO2010/091150
WO91/02536
WO92/07574
WO92/17497
WO94/10312
WO94/28931
WO9630514
WO97/07198
WO97/44452
WO98/13059
WO98/37193
WO98/40403
WO98/51805
WO98/51824
WO99/28468
WO99/46284
WO99/58658
Am.J.Hum.Genet.49(3):555-565(1991)
AmielJ.,etalHum.Mol.Genet.5,355-357,1996
Amiretal(2003)Angew.Chem.Int.Ed.42:4494-4499
Amsberry,etal(1990)J.Org.Chem.55:5867
AngewChem.Intl.Ed.Engl.(1994)33:183-186
Annu.Rev.Neurosci.21:309-345(1998)
AraiH.,etalJ.Biol.Chem.268,3463-3470,1993
AraiH.,etalJpn.Circ.J.56,1303-1307,1992
Arima,etal.,J.Antibiotics,25,437-444(1972)
AttieT.,etal,Hum.Mol.Genet.4,2407-2409,1995
AuricchioA.,etalHum.Mol.Genet.5:351-354,1996
BarelM.,etalMol.Immunol.35,1025-1031,1998
Barellaetal(1995)Biochem.J.309:773-779
BarnettT.,etalGenomics3,59-66,1988
Becketal(1992)J.Mol.Biol.228:433-441
Becketal(1996)J.Mol.Biol.255:1-13
Berge,etal.,J.Pharm.Sci.,66,1-19(1977)
Biochem.Biophys.Res.Commun.(2000)275(3):783-788
Biochem.Biophys.Res.Commun.255(2),283-288(1999)
Blood(2002)100(9):3068-3076
Blood99(8):2662-2669(2002)
BlumbergH.,etalCell104,9-19,2001
Bose,etal.,Tetrahedron,48,751-758(1992)
BourgeoisC.,etalJ.Clin.Endocrinol.Metab.82,3116-3123,1997
Brinsteretal(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:836
BuchmanandBerg(1988)Mol.Cell.Biol.8:4395
CancerRes.61(15),5857-5860(2001)
Carletal(1981)J.Med.Chem.24:479-480
Carlssonetal(1978)Biochem.J.173:723-737
Carter,P.(2006)NatureReviewsImmunology6:343-357
Cell109(3):397-407(2002)
CellTiterGloLuminescentCellViabilityAssay,PromegaCorp.Technical
BulletinTB288
Chakravartyetal(1983)J.Med.Chem.26:638-644
Chan,J.andWatt,V.M.,Oncogene6(6),1057-1061(1991)
Childetal(1999)J.Biol.Chem.274:24335-24341
ChoH.-S.,etalNature421,756-760,2003
Ciccodicola,A.,etalEMBOJ.8(7):1987-1991(1989)
Clacksonetal(1991)Nature,352:624-628
ClarkH.F.,etalGenomeRes.13,2265-2270,2003
CoreyE,QuinnJE,BuhlerKR,etal.LuCap35:anewmodelofprostatecancerprogressiontoandrogenindependence.TheProstate2003；55:239-46
CoussensL.,etalScience(1985)230(4730):1132-1139
Creeetal(1995)AntiCancerDrugs6:398-404
Crouchetal(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88
Davisetal(2001)Proc.Natl.Acad.SciUSA98(17):9772-9777
deGrootetal(2001)J.Org.Chem.66:8815-8830
deGrootetal(2003)Angew.Chem.Int.Ed.42:4490-4494
Dennisetal.(2002)"AlbuminBindingAsAGeneralStrategyForImproving
ThePharmacokineticsOfProteins"JBiolChem.277:35035-35043
Dobneretal(1992)Eur.J.Immunol.22:2795-2799
Dornanetal(2009)Blood114(13):2721-2729
Doroninaetal(2006)Bioconj.Chem.17:114-124
Dubowchiketal.BioconjugateChemistry,2002,13,855-869
Dubowchik,etal.(1997)TetrahedronLetters,38:5257-60
DumoutierL.,etalJ.Immunol.167,3545-3549,2001
E.andK.Lübke,ThePeptides,volume1,pp76-136(1965)
AcademicPress
EhsaniA.,etal(1993)Genomics15,426-429
Eliel,E.andWilen,S.,"StereochemistryofOrganicCompounds",JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,1994
ElshourbagyN.A.,etalJ.Biol.Chem.268,3873-3879,1993
Ericksonetal(2006)CancerRes.66(8):1-8
Feild,J.A.,etal(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.258(3):578-582
Fields,G.andNoble,R.(1990)"Solidphasepeptidesynthesisutilizing9-fluoroenylmethoxycarbonylaminoacids",Int.J.PeptideProteinRes.35:161-214
FuchsS.,etalMol.Med.7,115-124,2001
Fujisakuetal(1989)J.Biol.Chem.264(4):2118-2125)
GaryS.C.,etalGene256,139-147,2000
Gaugitsch,H.W.,etal(1992)J.Biol.Chem.267(16):11267-11273)
Geiseretal"Automationofsolid-phasepeptidesynthesis"inMacromolecular
SequencingandSynthesis,AlanR.Liss,Inc.,1988,pp.199-218
GenomeRes.13(10):2265-2270(2003)
Genomics62(2):281-284(1999)
Geoghegan&Stroh,(1992)BioconjugateChem.3:138-146
Getzetal(1999)Anal.Biochem.Vol273:73-80
Glynne-Jonesetal(2001)IntJCancer.Oct15；94(2):178-84
Gregsonetal.,Chem.Commun.1999,797-798
Gregsonetal.,J.Med.Chem.2001,44,1161-1174
GuZ.,etalOncogene19,1288-1296,2000
Haetal(1992)J.Immunol.148(5):1526-1531
HaendlerB.,etalJ.Cardiovasc.Pharmacol.20,s1-S4,1992
HamannP.(2005)ExpertOpin.Ther.Patents15(9):1087-1103
Hamblettetal(2004)Clin.CancerRes.10:7063-7070
HandbookofPharmaceuticalAdditives,2ndEdition(eds.M.AshandI.Ash),2001(SynapseInformationResources,Inc.,Endicott,NewYork,USA)
HandbookofPharmaceuticalExcipients,2ndedition,1994
Hara,etal.,J.Antibiotics,41,702-704(1988)
Hashimotoetal(1994)Immunogenetics40(4):287-295
Hayetal.(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237
Herdwijn,P.etal.,CanadianJournalofChemistry.1982,60,2903-7
Hermanson,G.T.(1996)BioconjugateTechniques；AcademicPress:NewYork,p234-242
Hochlowski,etal.,J.Antibiotics,40,145-148(1987)
HofstraR.M.W.,etalEur.J.Hum.Genet.5,180-185,1997
HofstraR.M.W.,etalNat.Genet.12,445-447,1996
Horieetal(2000)Genomics67:146-152
Hubert,R.S.,etal(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(25):14523-14528)
HurleyandNeedham-VanDevanter,Acc.Chem.Res.,19,230-237(1986)
Immunogenetics54(2):87-95(2002)
Int.Rev.Cytol.196:177-244(2000)
Itoh,etal.,J.Antibiotics,41,1281-1284(1988)
J.Biol.Chem.270(37):21984-21990(1995)
J.Biol.Chem.276(29):27371-27375(2001)
J.Biol.Chem.277(22):19665-19672(2002)
J.Biol.Chem.278(33):30813-30820(2003)
Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)ImmunoBiology,5thEd.,GarlandPublishing,NewYork
Jeffreyetal(2005)J.Med.Chem.48:1344-1358
Jonssonetal(1989)Immunogenetics29(6):411-413
Junutula,etal.,2008bNatureBiotech.,26(8):925-932
Kang,G-D.,etal.,Chem.Commun.,2003,1680-1689
Kasaharaetal(1989)Immunogenetics30(1):66-68
Kingetal(2002)TetrahedronLetters43:1987-1990
Kingsburyetal(1984)J.Med.Chem.27:1447
Kohleretal(1975)Nature256:495
Kohn,inAntibioticsIII.Springer-Verlag,NewYork,pp.3-11(1975).
Konishi,etal.,J.Antibiotics,37,200-206(1984)
Kovtunetal(2006)CancerRes.66(6):3214-3121
KuhnsJ.J.,etalJ.Biol.Chem.274,36422-36427,1999
Kuminoto,etal.,J.Antibiotics,33,665-667(1980)
Kurebayashietal(1999)Brit.Jour.Cancer79(5-6):707-717
Lab.Invest.82(11):1573-1582(2002)
LambertJ.(2005)CurrentOpin.inPharmacol.5:543-549
LangleyandThurston,J.Org.Chem.,52,91-97(1987)
Larhammaretal(1985)J.Biol.Chem.260(26):14111-14119
Lawetal(2006)CancerRes.66(4):2328-2337
Leetal(1997)FEBSLett.418(1-2):195-199
Leber,etal.,J.Am.Chem.Soc.,110,2992-2993(1988)
Leimgruber,etal.,J.Am.Chem.Soc.,87,5791-5793(1965)
Leimgruber,etal.,J.Am.Chem.Soc.,87,5793-5795(1965)
Levensonetal(1997)CancerRes.57(15):3071-3078
Liangetal(2000)CancerRes.60:4907-12
Manfré,F.etal.,J.Org.Chem.1992,57,2060-2065
Marksetal(1991)J.Mol.Biol.,222:581-597
McDonagh(2006)ProteinEng.Design&Sel.,19(7):299-307
Mendozaetal(2002)CancerRes.62:5485-5488
Milleretal(2003)Jour.ofImmunology170:4854-4861
Miuraetal(1996)Genomics38(3):299-304
Miuraetal(1998)Blood92:2815-2822
MooreM.,etalProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84,9194-9198,1987
Morrisonetal(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855
Mulleretal(1992)Eur.J.Immunol.22(6):1621-1625
MungallA.J.,etalNature425,805-811,2003
NagaseT.,etal(2000)DNARes.7(2):143-150)
NakamutaM.,etalBiochem.Biophys.Res.Commun.177,34-39,1991
Nakayamaetal(2000)Biochem.Biophys.Res.Commun.277(1):124-127
Naruseetal(2002)TissueAntigens59:512-519
Nature395(6699):288-291(1998)
NeubergerandWilliams(1988)NucleicAcidsRes.16:6713
NovabiochemCatalog2006/2007
OgawaY.,etalBiochem.Biophys.Res.Commun.178,248-255,1991
OkamotoY.,etalBiol.Chem.272,21589-21596,1997
Oncogene10(5):897-905(1995)
Oncogene14(11):1377-1382(1997))
Parrish-NovakJ.,etalJ.Biol.Chem.277,47517-47523,2002
Payne,G.(2003)CancerCell3:207-212
Phillipsetal(2008)CancerRes.68(22):9280-9290
PingaultV.,etal(2002)Hum.Genet.111,198-206
PletnevS.,etal(2003)Biochemistry42:12617-12624
Preud'hommeetal(1992)Clin.Exp.Immunol.90(1):141-146
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(7):4126-4131
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(1):136-140(1996)
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(17):9772-9777(2001)
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26):16899-16903(2002)
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(20):11531-11536(1999)
ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,GreeneandWuts,3rdEdition,1999, JohnWiley&SonsInc.
PuffenbergerE.G.,etalCell79,1257-1266,1994
Raoetal(1997)BreastCancerRes.andTreatment45:149-158
ReiterR.E.,etalProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,1735-1740,1998
Remington'sPharmaceuticalSciences,20thedition,pub.Lippincott,Williams&Wilkins,2000
Rodriguesetal(1995)ChemistryBiology2:223
Rossetal(2002)CancerRes.62:2546-2553
S.P.Parker,Ed.,McGraw-HillDictionaryofChemicalTerms(1984)
McGraw-HillBookCompany,NewYork
Sakaguchietal(1988)EMBOJ.7(11):3457-3464
SakamotoA.,YanagisawaM.,etalBiochem.Biophys.Res.Commun.178,656-663,1991
Sandersonetal(2005)Clin.CancerRes.11:843-852
SembaK.,etalProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82,6497-6501,1985
Serveniusetal(1987)J.Biol.Chem.262:8759-8766
Shamisetal(2004)J.Am.Chem.Soc.126:1726-1731
SheikhF.,etal(2004)J.Immunol.172,2006-2010
Shimizu,etal,J.Antibiotics,29,2492-2503(1982)
SinhaS.K.,etal(1993)J.Immunol.150,5311-5320
Stormetal(1972)J.Amer.Chem.Soc.94:5815
Strausbergetal(2002)Proc.Natl.Acad.SciUSA99:16899-16903
Sunetal(2002)Bioorganic&MedicinalChemistryLetters12:2213-2215
Sunetal(2003)Bioorganic&MedicinalChemistry11:1761-1768
SvenssonP.J.,etalHum.Genet.103,145-148,1998
SwierczJ.M.,etalJ.CellBiol.165,869-880,2004
SyrigosandEpenetos(1999)AnticancerResearch19:605-614
Takeuchi,etal.,J.Antibiotics,29,93-96(1976)
TawaragiY.,etalBiochem.Biophys.Res.Commun.150,89-96,1988
tenDijke,P.,etalScience264(5155):101-104(1994)
Thompson,J.S.,etalScience293(5537),2108-2111(2001)WO2004/058309
Thurston,etal.,Chem.Brit.,26,767-772(1990)
Thurston,etal.,Chem.Rev.1994,433-465(1994)
Tokietal(2002)J.Org.Chem.67:1866-1872
Tonnelleetal(1985)EMBOJ.4(11):2839-2847
Touchmanetal(2000)GenomeRes.10:165-173
Trailetal(2003)CancerImmunol.Immunother.52:328-337
Tsunakawa,etal.,J.Antibiotics,41,1366-1373(1988)
TsutsumiM.,etalGene228,43-49,1999
Uchidaetal(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.266:593-602
VerheijJ.B.,etalAm.J.Med.Genet.108,223-225,2002
VonHoegenetal(1990)J.Immunol.144(12):4870-4877
Websteretal(1994)Semin.CancerBiol.5:69-76
WeisJ.J.,etalJ.Exp.Med.167,1047-1066,1988
WeisJ.J.,etalProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83,5639-5643,1986
Wilsonetal(1991)J.Exp.Med.173:137-146
Wuetal(2005)NatureBiotech.23(9):1137-1145
Xieetal(2006)Expert.Opin.Biol.Ther.6(3):281-291
Xu,M.J.,etal(2001)Biochem.Biophys.Res.Commun.280(3):768-775WO2004/016225
Xu,X.Z.,etalProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(19):10692-10697(2001)
Yamaguchi,N.,etalBiol.Chem.269(2),805-808(1994)
YamamotoT.,etalNature319,230-234,1986
Yuetal(1992)J.Immunol.148(2)633-637