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1、(10)申请公布号 CN 102827783 A (43)申请公布日 2012.12.19 CN 102827783 A *CN102827783A* (21)申请号 201210360165.0 (22)申请日 2012.09.25 CGMCC No. 6329 2012.07.12 C12N 1/18(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市无锡滨湖区蠡湖 大道 1800 号江南大学生物工程学院 (72)发明人 徐岩 黄笃厚 陈双 (74)专利代理机构 无锡市大为专利商标事务所 32104 代理人 时旭丹 刘品超 。
2、(54) 发明名称 一种选育快速发酵黄酒酿酒酵母的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种选育快速发酵黄酒酿酒酵母 （Saccharomycescerevisiae） 的方法。属于微生 物育种领域。其主要步骤是通过前处理得到稳定 的药物 （真菌抑制剂） 抗性酵母菌， 再从抗性酵母 中筛选获得快速发酵黄酒酿酒酵母。本发明是筛 选稳定的药物抗性黄酒酿酒酵母的方法， 此方法 能减少普通筛选工作时带来的盲目性， 提高筛选 效率， 对优良酵母的筛选具有一定的指导意义， 为 我国黄酒酿酒酵母的育种提供了重要资料。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 。
3、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 1/1 页 2 1.一种选育快速发酵黄酒酿酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae） 的方法， 其特征在于 包括以下步骤 ： （1） 将被筛选的黄酒酿酒酵母接种至含有对酵母致死剂量克霉唑的药物筛选培养基 中 ； 药物筛选培养基成分为 ： 2% 葡萄糖， 2% 琼脂， 0.67%YNB， 致死剂量克霉唑， 不同酵母致 死剂量不一致， 用去离子水定容至 100% ； 其中被筛选的酵母包括经过基因修饰的黄酒酿酒 酵母或未经基因修饰的黄酒酿酒酵母 ； （2） 挑取可在筛选培养。
4、基中生长的菌落进行发酵试验， 进行还原糖利用能力、 发酵力、 发酵速率的测定， 发酵速率提升的黄酒酿酒酵母即为所选育的菌株。 2. 用权利要求 1 所述方法所获得的快速发酵黄酒酿酒酵母菌株 （Saccharomyces cerevisiae） XY-3， 已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号 为 ： CGMCC No. 6329， 该菌株具有克霉唑药物抗性的特点， 也具有发酵速率提升的特点。 3. 用权利要求 1 所述方法所获得的黄酒酿酒酵母， 其特征在于具有 1 种以上药物抗性 即多药物抗性， 或药物抗性增强的特性。 权 利 要 求 书 CN 102827783 A。
5、 2 1/3 页 3 一种选育快速发酵黄酒酿酒酵母的方法 技术领域 0001 本发明是一种对黄酒酿酒酵母进行选育， 提高筛选效率， 获得快速发酵黄酒酿酒 酵母菌的方法， 属于微生物育种领域。 背景技术 0002 黄酒是我国民族特色酒精饮料的典型代表， 与啤酒和葡萄酒并称世界三大古酒。 麦曲糖化， 酒母发酵的独特酿造方式使得黄酒酿造技术成为中华民族智慧的杰出代表 （曲 被誉为中国的第五大发明） 。随着现代黄酒酿造技术的发展， 传统的缸坛发酵的操作方式逐 步被以大罐发酵为代表的现代化、 机械化黄酒生产技术所取代。黄酒酿造机理的明晰也逐 步确立了黄酒酵母在黄酒发酵过程中的关键作用。 黄酒酵母菌株的性。
6、能往往成为影响黄酒 发酵效率， 黄酒品质的重要因素， 因此优良黄酒酵母的开发对于提升黄酒生产效率， 促进黄 酒品质具有重要意义。 0003 当前国际与我国政策的规定， 对于食品生产用菌的改造仅限于用传统手段， 如菌 种诱变， 细胞融合等。虽然细胞融合能突破种间甚至属间进行育种， 但就单一提高菌株 某方面特性， 诱变方式具有细胞融合无法比拟的优点， 如高效简单， 成本低。目前我国对 于黄酒酵母菌种的研究工作相对滞后， 对黄酒酵母的选育多采用自然分离筛选， 传统诱 变， TTC 筛选等操作方式 1 谢广发 , 郑志强 快速发酵黄酒酵母的筛选 J. 中国酿 造 ,2010,221(8):12-14.。
7、2 王梅 , 张彭湃 , 帅桂兰等 .TTC 在黄酒酵母选育中的应用 J. 酿酒 ,2001,28(5):62-64.3 王晓娟 . 低产尿素黄酒酵母的选育及黄酒发酵工艺研 究 D. 新疆 : 新疆农业大学 ,2009.4 张建炜 , 肖冬光 , 张翠英等 . 优良黄酒酵母单 倍体的分离筛选 J.2010,191(5):36-41.， 缺少一种有效的筛选指标， 故存在技术手段单 一， 盲目性大， 过程繁琐， 筛选工作量大， 效率低下等缺点， 这也造成我国黄酒酵母菌种的改 良选育成果较少。 发明内容 0004 本发明的主要目的在于克服我国现阶段对于黄酒酿酒酵母育种中存在的手段单 一， 盲目性大，。
8、 过程繁琐， 筛选工作量大， 效率低下等缺点， 提供一种筛选快速发酵优良黄酒 酿酒酵母的方法。 0005 本 发 明 的 技 术 方 案 ： 一 种 选 育 快 速 发 酵 黄 酒 酿 酒 酵 母 （Saccharomyces cerevisiae） 的方法， 由以下步骤组成 ： （1） 将被筛选的黄酒酿酒酵母接种至含有对酵母致死剂量克霉唑的药物筛选培养基 中 ； （2） 挑取可在筛选培养基中生长的菌落后进行发酵试验 （还原糖利用能力、 发酵力、 发 酵速率的测定） ， 发酵速率提升的黄酒酿酒酵母即为所选育的菌株。 0006 药物筛选培养基成分为 ： 2% 葡萄糖， 2% 琼脂， 0.67%Y。
9、NB， 致死剂量克霉唑 （不同酵 母致死剂量不一致） ， 用去离子水定容至100% ； 其中被筛选的酵母包括经过基因修饰的黄酒 说 明 书 CN 102827783 A 3 2/3 页 4 酿酒酵母或未经基因修饰的黄酒酿酒酵母。 0007 所述方法所获得的快速发酵黄酒酿酒酵母菌株 （Saccharomyces cerevisiae） XY-3， 已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为 ： CGMCC No. 6329， 该菌株具有克霉唑药物抗性的特点， 也具有发酵速率提升的特点。 0008 所述方法所获得的黄酒酿酒酵母具有 1 种以上药物抗性即多药物抗性， 或药物抗 。
10、性增强的特性。 0009 本发明的有益效果 ： 利用药物抗性作为筛选指标， 能有效提高筛选效率。 因此药物 抗性酿酒酵母是快速发酵酿酒酵母筛选的新方法， 提高了筛选效率， 对优良酵母的筛选具 有一定的指导意义， 为我国酿酒酵母的育种提供了重要资料。 0010 生物材料样品保藏 ： 一种酿酒酵母菌株 （Saccharomyces cerevisiae） XY-3， 已保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 简称 CGMCC， 地址 ： 北京市朝阳区北 辰西路 1 号院 3 号 中国科学院微生物研究所， 保藏编号为 ： CGMCC No. 6329， 保藏日期 2012 年 7 月 。
11、12 日。 附图说明 0011 图 1 实施例所获得优良酵母 XY-3 与原始酵母 XY 发酵速率比较。 0012 图 2 实施例所获得优良酵母 XY-3 与原始酵母 XY 酿酒小试中乙醇与甘油变化曲 线。 具体实施方式 0013 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明， 具体实施例应理解为仅为举例说 明， 而非限定性， 不能以下述举例说明来限定本发明的保护范围。 0014 本发明的技术路线为 ： 对原始黄酒酿酒酵母菌株 XY（某浙江地区某黄酒厂生产所 用酵母） 进行 UV 诱变， 筛选克霉唑抗性 （CTZr） 酵母菌， 并对 CTZr酵母进行两级筛选， 最终筛 选出高效发酵速率酵母。实施此方。
12、法具体步骤如下 ： （1） 糖液培养基制备 ： 称取糯米 500g 浸泡 3d 后蒸熟， 依次加水 1L， 糖化酶、 液化酶、 酸 性蛋白酶各 200L， 麦曲 45g 后混匀， 60水浴 10h 后取清液， -20保存待用。 0015 （2） 不同浓度梯度 CTZ 平板配制 ： 浓度分别为 0， 5mg/L， 10mg/L， 15mg/L， 20mg/L， 30mg/L， 40mg/L的CTZ平板， 其它物质浓度为2%葡萄糖， 2%琼脂， 0.67%YNB （Yeast Nitrogen Base without amino acids） 。 0016 （3） XY 生长曲线测定 ： 将活化。
13、后的黄酒酿酒酵母 XY 以 5% 的接种量接种至 100mL YPD， 30摇床培养， 定时测量OD600， 绘制细胞生长曲线， 以确定 XY 对数生长期时间。 0017 （4） CTZ 致死浓度试验 ： 将活化后的黄酒酿酒酵母 XY 培养至对数期， 涂布不同浓度 梯度的 CTZ 平板， 30培养， 观察酵母生长情况。 0018 （5） UV 诱变时间试验 ： 用 UV 灯对数期黄酒酿酒酵母 XY 照射不同时间， 计算不同时 间的死亡率。取细胞致死率 70% 左右所对应 UV 照射时间为诱变条 件。 0019 （6） CTZr酵母获得及抗性稳定性检测 ： 以上述确定的 UV 照射时间对 XY 。
14、进行诱变， 诱变后的酵母涂布于含致死浓度CTZ平板， 避光培养。 将CTZr菌传代后种点种CTZ平板上， 说 明 书 CN 102827783 A 4 3/3 页 5 以原始菌株为对照， 比较菌落大小， 淘汰抗性不稳定菌株， 共获 28 株 CTZr菌。此步骤能淘 汰大量负突变株。 0020 （7） 经糖液发酵后筛选出 XY-3， XY-16， XY-18， XY-28 进入下一轮发酵筛选。 0021 （8） 快速发酵酵母二级筛选及发酵力稳定性检测 ： 测量各菌株发酵力及发酵速率， 确定快速发酵黄酒酿酒酵母。将获得的酵母传 20 代， 检测各代酵母与原始菌 XY 发酵力并 比较。最终获得优良菌。
15、 XY-3。 0022 （9） 黄酒酿造小试 ： 取 1000g 糯米浸泡后蒸熟后加入水 1000mL， 麦曲 125g， 液化酶 与糖化酶各 300L， 酵母 200mL 后拌匀。30前酵 4d， 17后酵 10d。定时取样， 测量乙醇 浓度及甘油浓度。 0023 （10） 乙醇及甘油浓度测量方法 ： 利用 HPLC 检测， 液相条件为 ： 柱 Bio-Rad Aminex HPX-87H， 柱温 60， 流动相 3mmol/L H2SO4， 流量 0.6mL/min， 检测器为示差折光检测器 （RID） 。 0024 （11） 其它药物抗性测试结果 ： （12） 最后获得稳定的， 最大发酵。
16、速率 （以每 h 失重 CO2重量计） 较 XY 提升的多药物抗性 酵母菌株XY-3， 并以XY-3进行2L黄酒酿造小试， 以乙醇产量为指标， 发现XY-3能提前结束 发酵， 从 10d 缩短到 7d， 且副产物甘油减少。 0025 通过此方法筛选获得的 CTZr酵母 XY-3 具有发酵速度提升、 克霉唑抗性特点， 同 时对其它抑制机理不同于克霉唑的真菌抑制剂 （如氯霉素、 放线菌酮等） 也具有药物抗性特 点。XY-3 于 CGMCC（中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心） 保藏， 保藏编号为 ： CGMCC No. 6329。 说 明 书 CN 102827783 A 5 1/1 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102827783 A 6 。