一种类志贺邻单胞菌的快速诊断方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102827928 A (43)申请公布日 2012.12.19 CN 102827928 A *CN102827928A* (21)申请号 201210262462.1 (22)申请日 2012.07.27 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) (71)申请人 中国疾病预防控制中心传染病预防 控制所 地址 102208 北京市昌平区昌百路 155 号传 染病所 (72)发明人 孟双 徐建国 叶长芸 (74)专利代理机构 北京市颐合律师事务所 11383 代理人 李新军 (54) 发明名称 一种类志贺邻单胞菌的快速诊断方法 (57。

2、) 摘要 本发明提供了一种检测类志贺邻单胞菌的方 法， 所述方法利用环介导等温扩增技术， 以 hugA 基因为目标基因， 通过设计 3 对 DNA 引物， 与待检 测的 DNA 模板放入包括 MgSO4和甜菜碱在内的扩 增缓冲液中， 在 65恒温环境中扩增， 再以 80 恒温环境终止反应， 并对扩增产物进行检测。 该方 法设备简单， 易操作、 具有良好的特异性、 灵敏度 和重复性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 3 页 附图 2 页。

3、 1/1 页 2 1. 一种检测类志贺邻单胞菌的方法， 所述方法包括如下步骤 ： (1)将待检测样本、 序列如SEQ ID NO 1-2所示的一对外引物、 序列如SEQ ID NO 3-4所 示的一对内引物、 序列如 SEQ ID NO 5-6 所示的一对环引物、 dNTP、 Bst DNA 聚合酶、 MgSO4、 甜菜碱以及环介导等温扩增缓冲液加入到反应容器中 ； (2) 将步骤 (1) 所得的混合液放置于 65恒温环境中进行 DNA 扩增反应 ； (3) 将步骤 (2) 获得的产物放置于 80恒温环境中， 以终止步骤 (2) 所述的 DNA 扩增 反应 ； (4) 检测步骤 (3) 获得的。

4、产物。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述 MgSO4的浓度为 6mM， 所述甜菜碱的 浓度为 10mM。 3.根据权利要求1-2所述的方法， 其特征在于， 步骤(1)中所述待检测样本为DNA提取 物。 4.根据权利要求1-2所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)中所述的DNA扩增反应时间为 1 小时。 5.根据权利要求1-2所述的方法， 其特征在于， 步骤(3)中所述的终止反应时间为5分 钟。 6.根据权利要求1-2所述的方法， 其特征在于， 步骤(4)所述的检测方法可以是电泳检 测法、 浊度检测法、 或染色检测法。 7. 根据权利要求 6 所述的方法， 其特征在于， 。

5、所述染色检测使用的染料为 SYBR green I 荧光染料。 8. 一种检测类志贺邻单胞菌的试剂盒， 所述试剂盒包括 ： 序列如 SEQID NO 1-2 所示的 一对外引物、 序列如SEQ ID NO 3-4所示的一对内引物、 序列如SEQ ID NO 5-6所示的一对 环引物、 dNTP、 Bst DNA 聚合酶、 MgSO4、 甜菜碱、 环介导等温扩增缓冲液。 9. 根据权利要求 8 所述的试剂盒， 其特征在于， 所述 MgSO4的浓度为 6mM， 所述甜菜碱 的浓度为 10mM。 10. 根据权利要求 9 所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括 DNA 提取试剂盒。 权 利 。

6、要 求 书 CN 102827928 A 2 1/7 页 3 一种类志贺邻单胞菌的快速诊断方法 技术领域 0001 本发明涉及一种类志贺邻单胞菌的快速诊断方法， 属于微生物快速诊断领域。 背景技术 0002 类志贺邻单胞菌 (Plesiomonas shigelloides) 是一种革兰氏阴性、 能运动、 兼性 厌氧、 氧化酶阳性的非孢子繁殖的细菌， 曾与对人类致病的弧菌属和气单胞菌属一起归属 于弧菌科， 后研究发现其在分子水平跟类志贺邻单胞菌和变形杆菌属更为接近， 在第二版 系统细菌学伯杰氏手册 中， 类志贺邻单胞菌划归到肠杆菌科， 邻单胞菌属。 0003 淡水水源和江河水生态环境是类志贺邻。

7、单胞菌的主要储存地， 鱼类是类志贺邻单 胞菌常见的宿主。最近几年由该菌引起的婴幼儿、 老年人以及免疫功能不全病人的胃肠道 感染病例逐渐增加， 是人类肠胃炎的主要病因之一， 世界各地屡有报道。 类志贺邻单胞菌亦 可引起人类菌血症、 蜂窝组织炎、 脑膜炎等肠外感染， 该菌亦与旅行者腹泻密切相关。来自 日本的一项研究发现在 1994 至 1996 年间所有引起旅行者腹泻的肠杆菌中， 类志贺邻单胞 菌位居第一 (66.7 )。由类志贺邻单胞菌引起的死亡率也在逐渐增高。一些类志贺邻单 胞菌的感染者由于未能快速准确的诊断和合理的应用抗生素， 而没有得到及时的治疗而产 生了严重的后果， 甚至死亡。 0004。

8、 虽然类志贺邻单胞菌诱发肠胃炎的致病机理并未完全阐明， 但研究者已经对一些 潜在的毒力因子进行了深入的研究。摄取铁离子与一些病原菌的毒力密切相关， 人体中的 亚铁血红素是病原菌铁离子的一个重要来源， 并且许多病原菌本身就具有亚铁血红素运输 系统， hugA 基因是编码类志贺邻单胞菌亚铁血红素铁离子利用系统的重要基因之一， 并且 编码外膜蛋白受体， 是影响类志贺邻单胞菌毒力的一个重要基因， 因此也是一个理想的检 测目的基因。 0005 目前类志贺邻单胞菌的检测方法主要有分离培养、 生化鉴定， 普通 PCR 和实时荧 光 PCR 等分子生物学方法。分离培养方法操作步骤繁琐， 检测周期长， 一般需要。

9、 3-5 天完 成， 不能满足快速检测的需求。并且该菌缺少特异的筛选培养基， 在一些肠道培养基上形 成的菌落性状与嗜水气单胞相似， 难以区别， 这也影响了类志贺邻单胞菌的分离率。 最近几 年， PCR 和实时荧光 PCR 分子生物学检测方法在病原菌检测中的应用越来越广， 但这些方法 的检测成本高， 需要精密昂贵的热循环仪器， 且对实验环境和操作者的技术也有严格的要 求， 因此限制了该技术的普遍适用性， 不利于在农村地区以及基层实验室的推广应用。 类志 贺邻单胞菌做为一种新发的传染性疾病对流行病学家和临床医生造成的最大困难就是缺 少能够对其进行早期、 快速、 准确检测的方法， 以满足农村地区和基。

10、层实验室的实际工作需 求。 0006 环介导等温扩增技术 (Loop-mediated isothermal amplification， LAMP) 是 Notomi 等建立的一种新的核酸扩增方法。LAMP 是针对靶序列的 6 个特异部位设计 4 条引 物， 利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成， 从而使靶序列高效 扩增。4 条引物之中 2 条为内引物， 即 FIP(ForWard inner primer， FIP) 和 BIP(Backward 说 明 书 CN 102827928 A 3 2/7 页 4 inner primer， BIP)。FTP 包含 F。

11、lc 和 F2(F2c 区域的互补序列 )， 即 5 -Flc-F2 ； BIP 包含 B1c(B1 区域的互补序列 ) 和 B2， 即 5 -Blc-B2。外引物为 F3 和 B3。 0007 LAMP 反应过程包括哑铃状模板合成阶段、 循环扩增阶段。LAMP 反应中 60 65 是双链DNA复性及延伸的中间温度， DNA在65左右处于动态平衡状态， 任何一个引物向双 链 DNA 的互补部位进行碱基配对延伸时， 另一条链就会解离， 变成单链。在链置换型 DNA 聚 合酶的作用下， 以 FIP 引物 F2 区段的 3末端为起点， 与模板 DNA 互补序列配对， 启动链置 换 DNA 合成。F3。

12、 引物与 F2c 前端 F3c 序列互补， 以 3末端为起点， 通过链置换活性 DNA 聚 合酶的作用， 一边置换先头 FIP 引物合成的 DNA 链。一边合成自身 DNA， 如此向前延伸。最 终 F3 引物合成而得的 DNA 链与模板 DNA 形成双链。由 FIP 引物先合成的 DNA 链被 F3 引物 进行链置换产生一单链， 这条单链在5末端存在互补的F1c和F1区段， 于是发生自我碱基 配对， 形成茎环结构。同时， BIP 引物同该单链杂交结合， 以 BIP 引物的 3端为起点， 合成 互补链， 在此过程中茎环结构被打开。接着， 类似于 F3， B3 引物从 BIP 引物外侧插入， 进行。

13、 碱基配对， 以 3端为起点， 在聚合酶的作用下， 合成新的互补链。通过上述 2 个过程， 形成 双链DNA。 被置换的单链DNA两端存在互补序列， 自然发生自我碱基配对， 形成环状结构， 于 是整条链呈现哑铃状结构， 该结构是LAMP法基因扩增循环的起始结构。 LAMP法基因扩增循 环阶段 ： 首先在哑铃状结构中， 以 3末端的 F1 区段为起点， 以自身为模板， 进行 DNA 合成 延伸。与此同时， FIP 引物 F2 与环上单链 F2c 杂交， 启动新一轮链置换反应， 解离由 F1 区 段合成的双链核酸。同样， 在解离出的单链核酸上也会形成茎环结构。在茎环结构上存在 单链形式B2c， B。

14、IP引物上的B2与其杂交， 启动新一轮扩增， 经过相同的过程， 又形成茎环结 构。通过此过程， 结果在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构。为了进一步 缩短LAMP的反应时间， 还可以在F1c-F2c/B1c-B2c之间设计一对环引物LF/LB， 环引物通过 结合在茎环结构的环状区域互补序列上， 大大加速了整个链置换反应过程， 从而提高了反 应效率。LAMP 可以特异、 高效、 快速的扩增 DNA， 在 1 小时之内使产物的量达到 109个拷贝。 0008 LAMP 方法最大的缺点就是容易出现假阳性， 由于 LAMP 采用了多条引物， 而且是在 同一温度条件下进行扩增， 引物之间有可能。

15、互补而扩增出非特异性条带， 造成假阳性。 因此 LAMP 方法对引物的特异性要求很高， 设计也更为复杂。由于 LAMP 省略了 94变性步骤， 同 时退火和延伸步骤在同一温度 ( 等温 ) 条件下进行， 反应体系的组成也较传统 PCR 复杂， 除 了反应体系中必须的缓冲液、 dNTP 引物、 酶等成分外， 还需要加入甜菜碱 (betaine)、 硫酸 镁等必需成分， 反应体系较为复杂， 对体系中主要成分的配比优化液要求较高， 否则会降低 反应的特异性和灵敏性。 0009 本发明的目的就是通过引物设计和组分优化， 建立一种类志贺邻单胞菌的方便、 快速、 特异、 灵敏的 LAMP 检测方法， 以能。

16、够在基层实验室进行大规模的推广使用。 发明内容 0010 本发明提供了一种检测类志贺邻单胞菌的方法， 所述方法包括如下步骤 ： 0011 (1) 将待检测样本、 序列如 SEQ ID NO 1-2 所示的一对外引物、 序列如 SEQ ID NO 3-4 所示的一对内引物、 序列如 SEQ ID NO 5-6 所示的一对环引物、 dNTP、 Bst DNA 聚合酶、 MgSO4、 甜菜碱以及环介导等温扩增缓冲液加入到反应容器中 ； 0012 (2) 将步骤 (1) 所得的混合液放置于 65恒温环境中进行 DNA 扩增反应 ； 说 明 书 CN 102827928 A 4 3/7 页 5 0013。

17、 (3) 将步骤 (2) 获得的产物放置于 80恒温环境中， 以终止步骤 (2) 所述的 DNA 扩增反应 ； 0014 (4) 检测步骤 (3) 获得的产物。 0015 其中， SEQ ID NO 1 为引物 F3， SEQ ID NO 2 为引物 B3， SEQ ID NO3 为引物 FIP， SEQ ID NO 4 为引物 BIP， SEQ ID NO 5 为引物 LF， SEQ IDNO 6 为引物 LB。 0016 本方法检测的目的基因为类志贺邻单胞菌的 hugA 基因， 引物设计所依据的基因 序列为 (Gene Bank ID 号 ： AY008342.1)， SEQ ID NO 。

18、1-6 在 hugA 基因序列中的位置如表 1 所示。 0017 表 1 实验中所用到的 LAMP 引物序列 0018 0019 在一个优选的技术方案中， 步骤 (1) 中所述 MgSO4的浓度为 6mM， 所述甜菜碱的浓 度为 10mM。 0020 步骤 (1) 中所述待检测样本可以是临床送检标本， 优选为 DNA 提取物。 0021 在本发明的一个优选技术方案中， 步骤 (2) 中所述的 DNA 扩增反应时间为 1 小时。 0022 在本发明的一个优选技术方案中， 步骤 (3) 中所述的终止反应时间为 5 分钟。 0023 在本发明的又一个优选技术方案中， 步骤 (4) 所述的检测方法可以。

19、是电泳检测 法、 浊度检测法、 或染色检测法。 0024 电泳检测法 ： 由于扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花 椰菜样结构的 DNA 片段混合物， 电泳后在凝胶上显现不同大小区带组成的阶梯式图谱， 可 以根据片段大小进行判定。 0025 浊度检测法 ： LAMP 在合成 DNA 的同时还产生大量的焦磷酸根离子， 它们能与镁离 子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀， 可根据反应体系中是否形成白色沉淀来定性判断 LAMP 反应是否发生， 以及根据浊度值对结果进行定量分析。 0026 染色检测法 ： 可以向扩增产物中加入能掺入到双链 DNA 中的荧光染料， 例如 SYBY Green 。

20、I， 有阳性扩增者电泳结果显示为绿色， 无阳性扩增者， 则不显色。 0027 本发明还提供了一种检测类志贺邻单胞菌的试剂盒， 所述试剂盒包括 ： 序列如SEQ ID NO 1-2所示的一对外引物、 序列如SEQ ID NO 3-4所示的一对内引物、 序列如SEQ ID NO 说 明 书 CN 102827928 A 5 4/7 页 6 5-6 所示的一对环引物、 dNTP、 Bst DNA 聚合酶、 MgSO4、 甜菜碱、 环介导等温扩增缓冲液。 0028 在一个优选技术方案中， 所述 MgSO4的浓度为 6mM， 所述甜菜碱的浓度为 10mM。 0029 优选地， 所述试剂盒还可以包括 DN。

21、A 提取试剂盒。 0030 发明人建立了使用了 LAMP 技术对类志贺邻单胞菌进行检测的方法。在 LAMP 反应 体系的建立过程中对 MgSO4， 反应添加剂甜菜碱的浓度进行了筛选， 通过对反应时间、 反应 灵敏度以及产物生成量等方面进行比较， 最终确定了 MgSO4， 甜菜碱的最佳浓度， 从而建立 了类志贺邻单胞菌的LAMP检测试剂盒。 通过对LAMP检测和实时荧光PCR的检测进行比较， 我们发现LAMP检测无论在检测灵敏度上还是在检测速度上都明显的优于实时荧光PCR。 一 般情况下， 以分子水平为基础的检测方法例如 PCR 和 LAMP 都会受临床标本中抑制物的影 响， 一些研究者报导 L。

22、AMP 使用的 Bst 聚合酶对样品中抑制物的耐受能力比实时荧光 PCR 中 的 Taq 酶要强， 并且比实时荧光 PCR 的反应速度至少快 20 分钟以上， 可以显著缩短总体检 测时间。 0031 相比之下， LAMP 检测技术具有很多的优势 ： 0032 (1)LAMP 对靶序列扩增效率高， 体系中其他共存非靶 DNA 对其扩增的影响较小。 LAMP 的检测下限为几个拷贝， 灵敏度远远高于普通 PCR 技术， 有研究者证实 LAMP 的灵敏度 等于甚至高于实时荧光 PCR 的检测灵敏度。 0033 (2)产物检测方便、 快捷。 因为LAMP在合成各种茎环DNA的同时还产生大量的副产 物 -。

23、 焦磷酸盐， 并且生成白色的焦磷酸镁沉淀物。Mori 等利用这些特性来检测 LAMP 产物， 可以直接根据沉淀的形成来定性判断扩增反应是否发生， 还可以通过检测其产物浊度的变 化进行实时定量检测。 0034 (3)LAMP 对靶序列扩增的特异性高。由于 LAMP 通过 2 对引物 (F3、 B3、 FIP 和 BIP) 与靶序列上相应的 6 个特异部位准确结合来产生扩增效应， 因此可以获得比 PCR 更高的特 异性， 并且可以部分减少一般核酸扩增技术中不可避免的背景干扰。 0035 (4) 设备简单， 易操作。LAMP 反应只需要一个普通的水浴锅或者恒温装置， 不需要 昂贵的 PCR 仪， 易。

24、于在基层实验室和农村地区推广应用。 0036 (5) 反应速度快。LAMP 是恒温扩增反应， 没有 PCR 反应中温度变化大的耗时， 一般 在 30min 60min 内即可完成， 比普通 PCR 和实时荧光 PCR 反应速度更快， 能更好地满足临 床快速检测的要求。另外， 在 LAMP 反应体系中增加 2 条环引物 (LF 和 LB) 可使反应所需时 间比原来缩短一半， 整个反应可以在 30min 内完成， 大大提高了检测效率。这些特性使得 LAMP 技术更适用于在基层实验室、 地方疾控、 广大农村地区以及现场处理疫情时使用。 0037 总之， 本发明建立的 LAMP 方法是首次将 LAMP。

25、 技术运用到了类志贺邻单胞菌的检 测， 该方法在 1 小时内就可以观察结果， 满足了临床快速诊断的需要， 并且该方法对临床样 本的灵敏度高于实时荧光 PCR 法， 反应时间更快， 所需仪器设备简单， 可作为一种快速的筛 查方法在临床检验检疫、 基层实验室及农村地区进行大规模的推广使用 附图说明 0038 图 1 ： LAMP 反应的浊度值检测结果图 ； 0039 图 2 ： LAMP 反应电泳检测结果图 ； 0040 图 3 ： LAMP 反应的染色检测结果图 ； 说 明 书 CN 102827928 A 6 5/7 页 7 0041 图 4 ： 4 份类志贺邻单胞菌标本的检测结果图。 具体实。

26、施方式 0042 下面结合具体实施例来进一步描述本发明， 本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的， 并不对本发明权利要求所定义的保护范围构成任 何限制。 0043 本发明实施例所用标准菌株购自中国药品生物制品检定所， 其他菌株分离自食 品、 粪便和呕吐物等样品， 均经德灵 WALKAWAY-40SI 全自动微生物分析仪鉴定。用于特异性 评价的菌株见表 1。 0044 实施例 1 ： 4 份类志贺邻单胞菌的检测 0045 通过对 GenBank 中已知的类志贺邻单胞菌 hugA 基因序列 (GeneBank ID 号 ) 进行比对， 我们选择 hugA 基因上的一段。

27、保守序列作为检测靶标。使用引物设计软件 PrimerExplorer V4 software(http:/primerexplorer.jp)(Eiken Chemical Co.Ltd.， Tokyo， Japan) 在线进行 LAMP 引物设计。引物由上海生工有限公司合成 ( 见表 2)。LAMP 的反应体系如下 ： 引物 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 的浓度为 5pmol， 引物 SEQ ID NO 3 和 SEQ ID NO4 的浓度为 40pmol， 引物 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 6 的浓度为 20pmol， 10mM 的 Betain，。

28、 6mM 的 MgSO4， 1mM 的 dNTP， 2.5L 的 10Bst DNA 聚合酶缓冲液， 8U 的链置换 DNA 聚合酶， 2L 的模板， 补加去离子水至 25l。整个反应在 LA320 实时浊度仪 (Teramecs， Tokyo， Japan) 中进行， 等温扩增 65 1h， 80 5min 终止反应。结果可以根据沉淀的形成 来定性判断， 也可以通过检测产物浊度的变化进行实时定量检测。 0046 图 4 为 4 份类志贺邻单胞菌的检测结果。图 4 中， 4 份类志贺邻单胞菌和一份大 肠杆菌的标本采用本研究建立的LAMP检测体系进行检测， 结果4份类志贺邻单胞菌标本均 在 60。

29、 分钟以内出现了阳性扩增曲线， 而大肠杆菌标本则无扩增曲线出现， 说明本研究建立 的 LAMP 检测体系可以对类志贺邻单胞菌进行快速、 有效的检测。 0047 实施例 2 ： LAMP 检测的灵敏度评价 ： 0048 1. 含 hugA 基因的质粒标准品的构建与制备 0049 (1) 使用 hugA 特异引物进行 PCR 扩增后得到目的片段 ； 0050 (2) 切胶回收， 纯化 PCR 产物 ； 0051 (3) 连接到 T 载体 ； 0052 (4) 转化 JM109 感受态细胞 ； 0053 (5) 筛选阳性克隆子， 用 PCR 进行验证， 最终测序确认 ； 0054 (6) 提取质粒，。

30、 根据质粒的分子量将质粒样品浓度换算为拷贝数浓度 ： 每 L 样 品中检测基因的拷贝数浓度 (ng/L) 阿佛加德罗常数 10-9/(660 重组质粒碱基 数 ) ； 0055 (7) 用 Easy Dilution 将上述质粒依次稀释成 1.0100拷贝 /L 1.0106拷 贝 /L， 共 7 个浓度梯度。 0056 2.LAMP 检测体系的灵敏度 0057 取质粒标准品每反应体系 100拷贝至 106拷贝为模板， 每个浓度进行 3 次重复， 以 实时荧光 PCR 为对照， 评价 LAMP 检测体系的灵敏度。 说 明 书 CN 102827928 A 7 6/7 页 8 0058 评价结果。

31、 ： 0059 LAMP 和实时荧光 PCR 针对 hugA 基因的检测下限分别为 20 拷贝 / 反应 ( 图 1) 和 200拷贝/反应(copies/reaction)。 这个结果说明LAMP在检测类志贺邻单胞菌DNA时比实 时荧光PCR更灵敏。 图1为将类志贺邻单胞菌质粒标准品进行10倍系列稀释后， 用LAMP检 测体系进行扩增， 评价该体系的灵敏度。图中扩增曲线的浓度分别为 2.0106 2.0101 拷贝 / 反应。 0060 可以用电泳的方法来检测 LMAP 的扩增结果 ( 图 2)， 也可以加入 1L 的 1,000SYBR green I( 图 3) 通过肉眼观察颜色的改变来。

32、检测。图 1 为 hugA-LAMP 的灵敏 度通过浊度仪实时监测的结果。检测下限为每个反应 20 拷贝。 0061 图 2 为用琼脂糖凝胶电泳分析 hugA-LAMP 的扩增产物。泳道 M ： DL2000marker ； 泳 道 1 ： 2106拷贝 / 反应 ； 泳道 2 ： 2105拷贝 / 反应 ； 泳道 3 ： 2104拷贝 / 反应 ； 泳道 4 ： 2103拷贝 / 反应 ； 泳道 5 ： 2102拷贝 / 反应 ； 泳道 6 ： 2101拷贝 / 反应 ； 泳道 7 ： 2100 拷贝 / 反应 ； 泳道 8 ： 无模板。 0062 图 3 为用 SYBR green I 荧。

33、光染料检测 hugA-LAMP 扩增产物 . 当存在阳性扩增时， SYBR Green I染料的桔色快速变为绿色， 在黑色背景下更为显著 ； 当扩增为阴性时， 管内颜 色维持桔色不变。 0063 实施例3 ： LAMP检测的特异性评价 ： 以常见致病菌及条件致病菌DNA(见表2)为模 板评价 LAMP 体系的特异性。 0064 LAMP 检测的特异性使用 52 株常见致病菌及条件致病菌 DNA( 见表 2) 进行评价。 20 株类志贺邻单胞菌均在 1 小时内出现了阳性扩增， 32 株非类志贺邻单胞菌都未出现扩 增， 说明该 LAMP 检测技术的特异性好。 0065 表 1 实验中所用到的菌株 。

34、0066 说 明 书 CN 102827928 A 8 7/7 页 9 0067 0068 实施例 4 ： LAMP 检测的重复性评价 ： 0069 进行批内实验时， 在一次实验中将3份不同浓度的质粒标准品(106， 104， 102)做10 次重复测定， 将所得检测结果进行分析， 求出 CVi ； 进行批内实验时， 将 3 份不同浓度的质粒 标准品 (106， 104， 102) 做 10 个重复测定， 10 天时间内分 10 次进行， 将所得检测结果进行分 析， 求出 CVo。 0070 LAMP 检测重复性通过 3 份不同浓度的质粒标准品 (106， 104， 102) 来评价。批内变 。

35、异系数为 1.21 -1.54， 批间变异系数为 2.17 -3.23。数据显示， 本发明的 LAMP 具 有良好的重复性。 0071 实施例 5 ： 评价 LAMP 技术在粪便模拟样本中的应用 0072 (1) 类志贺邻单胞菌 (ATCC51903) 摇菌至对数生长期 ； 0073 (2) 用磷酸盐缓冲液将该菌进行连续 10 倍稀释， 并进行平板计数 ； 0074 (3) 取健康人新鲜粪便 0.2g/ 管， 分别加入 100l 不同浓度的类志贺邻单胞菌稀 释悬液， 制成 5101 5107CFU/g 梯度浓度的粪便模拟标本 ； 0075 (4) 应用 QIAamp DNA stool min。

36、i kit(QIAGEN， Venlo， Netherlands) 试剂盒抽提 所有粪便标本， 每个菌量浓度进行 3 次重复， 平行独立提取 DNA 进行 LAMP 检测。 0076 结果 ： LAMP 检测在粪便模拟标本中的检测下限为 5103CFU/g， 相比之下， 实时荧 光 PCR 针对 hugA 基因在粪便模拟标本中的检测下限为 5104CFU/g， 说明 LAMP 比实时荧光 PCR 对粪便模拟标本的检测更灵敏。 说 明 书 CN 102827928 A 9 1/3 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 102827928 A 10 2/3 页 11 0003 序 列 表 CN 102827928 A 11 3/3 页 12 序 列 表 CN 102827928 A 12 1/2 页 13 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102827928 A 13 2/2 页 14 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102827928 A 14 。