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1、(10)申请公布号 CN 102839207 A (43)申请公布日 2012.12.26 CN 102839207 A *CN102839207A* (21)申请号 201210343404.1 (22)申请日 2012.09.17 C12P 21/06(2006.01) (71)申请人 温州大学 地址 325035 浙江省温州市茶山高教园区 (72)发明人 周茂洪 赵肖为 (74)专利代理机构 北京汇泽知识产权代理有限 公司 11228 代理人 张秋越 (54) 发明名称 一种从鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种从鱼鳞制备胶原蛋白肽的 方法， 其特征在于， 包括如下。
2、步骤 ： 1） 取鱼鳞， 用 盐酸浸泡脱钙后， 清洗至中性， 干燥粉碎 ； 2） 取步 骤 1） 得到的脱钙干燥粉碎后的鱼鳞加入酶反应 器中， 再加入水和混合蛋白酶以提取胶原蛋白肽， 提取结束后， 灭酶， 离心， 得酶解液， 其中混合蛋白 酶为中性蛋白酶、 木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的混 合物 ； 3） 步骤 2） 得到的酶解液进行膜浓缩， 浓缩 液冷冻干燥后得到鱼鳞胶原蛋白肽粉。本发明用 中性蛋白酶、 木瓜蛋白酶和风味蛋白酶一次性酶 法提取鱼鳞胶原蛋白肽， 不仅降低酶解时间 （酶解 时间 9h） 、 提高胶原蛋白肽提取率 （72.72%） ， 而且 解决胶原蛋白肽的苦味等风味问题。 (51)In。
3、t.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种从鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： 1） 取鱼鳞， 用盐酸浸泡脱钙后， 清洗至中性， 干燥粉碎 ； 2） 取步骤 1） 得到的脱钙干燥粉碎后的鱼鳞加入酶反应器中， 再加入水和混合蛋白酶以 酶解提取胶原蛋白肽， 提取结束后， 灭酶， 离心， 得酶解液， 其中混合蛋白酶为中性蛋白酶、 木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的混合物 ； 3） 步骤 2） 得到的酶解液进行膜浓缩， 浓缩液冷冻干燥。
4、后得到鱼鳞胶原蛋白肽粉。 2. 根据权利要求 1 所述的鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法， 其特征在于， 步骤 1） 中鱼鳞用 浓度 0.31 molL-1的盐酸浸泡脱钙， 鱼鳞与盐酸的比为 10:10040:100 g/mL， 脱钙时间 520 h。 3. 根据权利要求 2 所述的鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法， 其特征在于， 步骤 1） 中鱼鳞用 浓度 0.5 molL-1的盐酸浸泡脱钙， 鱼鳞与盐酸的比为 1:5 g/mL， 脱钙时间 5h。 4. 根据权利要求 1 所述的鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法， 其特征在于， 步骤 2） 中所述脱 钙干燥粉碎后的鱼鳞与水的比例为 1:1004:100 g/mL ；。
5、 混合蛋白酶中 ： 中性蛋白酶为脱钙 干燥粉碎后的鱼鳞重量的 16%， 木瓜蛋白酶为脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的 0.54%， 风 味蛋白酶为脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的 0.252% ； 酶解时间 920 h ； 酶解温度 3550、 pH 6.57.5。 5. 根据权利要求 4 所述的鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法， 其特征在于， 步骤 2） 中所述脱 钙干燥粉碎后的鱼鳞与水的比例为 3:100 g/mL。 6. 根据权利要求 4 所述的鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法， 其特征在于， 所述中性蛋白酶 20 万 U/g， 所述木瓜蛋白酶为 98 万 U/g， 所述风味蛋白酶为 20 U/mg。 7. 根据权。
6、利要求 5 所述的鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法， 其特征在于， 所述中性蛋白酶 为脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的 4%， 所述木瓜蛋白酶为脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的 2%， 所述风味蛋白酶为脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的 1%。 8. 根据权利要求 1 所述的鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法， 其特征在于， 灭酶步骤为 ： 将酶 解液加热到 90以上。 9. 根据权利要求 1 所述的鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法， 其特征在于， 步骤 3） 中上清液 进行二级膜浓缩 ： 上清液在组合膜设备中进行浓缩， 一级膜选用分子量 2000Da 的卷式膜， 在常温、 1.01.5Mpa 下进行浓缩， 二级膜选用分子量 400Da 。
7、的卷式膜， 在常温、 2.5-3.0Mpa 下进行浓缩。 10. 根据权利要求 1 所述的鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法， 其特征在于， 所述鱼鳞为淡水 鱼鳞。 权 利 要 求 书 CN 102839207 A 2 1/5 页 3 一种从鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法 技术领域 0001 本发明属于胶原蛋白肽制备领域， 具体涉及一种从鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法。 背景技术 0002 胶原蛋白广泛存在于动物体内， 约占动物体内总蛋白的 30%， 对于组织和器官的机 械性保护与细胞微环境的调节有极为重要的作用。胶原蛋白的类型比较复杂， 已报道的就 有27种左右， 较为常见的有型、 型、 型、 型、 型， 其中I。
8、型胶原蛋白最有应用价值。 I 型胶原蛋白在食品加工与包装、 生物医学材料、 制药、 皮革、 造纸、 影像、 生物合成和美容护 肤品等领域中都有十分广泛的应用， 特别是在美容护肤和生物医学材料方面的应用发展迅 速。 0003 鱼鳞占鱼体重量的 1-5%， 含丰富的蛋白质、 卵鳞脂和多种矿物质 ； 其中有机物占 41 55， 而蛋白质占总有机物的 70%， 主要为胶原蛋白和鱼鳞角蛋白， 其中胶原蛋白以 I 型胶原蛋白为主， 其在免疫原性、 生物相容性、 机械性能、 生物可降解性、 消化吸收性、 保湿 性、 抗菌性、 抗氧性、 安全性等方面的性状优良 ； 鱼鳞灰分含量约 30， 主要成分是羟基磷 灰。
9、石， 绝大部分集中在骨质层。 0004 我国是世界上最大的淡水鱼生产国， 据估计每年产生的鱼鳞约达 5 万吨， 目前大 部分只作为生活垃圾对待， 生产鱼鳞胶原蛋白产品既能有效地解决环境污染问题， 又能充 分利用生物资源。同时， BSE、 TSE、 FMD 等的爆发使传统上从牛皮、 猪皮中提取的胶原蛋白 的安全性受到威胁。因此从鱼鳞中提取胶原蛋白变得更有发展前景。 0005 提取鱼鳞胶原蛋白的主要方法有酸提取法、 碱提取法、 酶提取法、 联合提取法 等。酸碱提取法为传统方法， 日本于 1993 年最早公开的专利就是酸法提取鱼鳞胶原蛋白 （JP5155900） 。但因其生产周期长， 对环境造成污染。
10、， 因此酶提取法受到重视。 0006 鱼鳞骨质层含有主要以羟基磷灰石形式存在的灰分， 用酶法提取胶原蛋白肽时需 首先破坏骨质层灰分， 一般都用盐酸分解法。 为减少盐酸对环境的污染， 也有报道直接用蛋 白酶提取， 但存在提取效率低或所用蛋白酶不是常用的蛋白酶而难以工业化的问题。提取 鱼鳞胶原蛋白肽一般都用碱处理鱼鳞的油脂和杂蛋白。 用蛋白酶提取的鱼鳞胶原蛋白肽一 般都有苦味， 限制了其在诸如食品等方面的应用， 而胶原蛋白肽的脱苦是比较困难的。 对酶 解产物进行浓缩， 以提高胶原蛋白肽的纯度也是一个有待解决的问题。 发明内容 0007 为了解决上述技术问题， 本发明提供一种从淡水鱼鳞制备胶原蛋白肽。
11、的新方法， 其主要特点为用盐酸对鱼鳞进行一次性短时间的浸泡脱钙预处理 ； 用中性蛋白酶、 木瓜蛋 白酶和风味蛋白酶混合一步提取鱼鳞胶原蛋白肽， 不仅降低提取时间、 提高胶原蛋白肽提 取率， 而且解决苦味等风味问题 ； 用膜浓缩酶提取液以提高鱼鳞胶原蛋白肽产品的肽含量 和纯度。 0008 本发明提供的从鱼鳞制备胶原蛋白肽的方法， 包括如下步骤 ： 说 明 书 CN 102839207 A 3 2/5 页 4 1） 取鱼鳞， 用盐酸浸泡脱钙后， 清洗至中性， 干燥粉碎 ； 2） 取步骤 1） 得到的脱钙干燥粉碎后的鱼鳞加入酶反应器中， 再加入水和混合蛋白酶以 酶解提取胶原蛋白肽， 提取结束后， 灭。
12、酶， 离心， 得酶解液， 其中混合蛋白酶为中性蛋白酶、 木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的混合物 ； 3） 步骤 2） 得到的酶解液进行膜浓缩， 浓缩液冷冻干燥后得到鱼鳞胶原蛋白肽粉。 0009 作为优选技术方案， 步骤 1） 中鱼鳞用浓度 0.31 molL-1的盐酸浸泡脱钙， 鱼鳞 与盐酸的比为 10:10040:100 g/mL， 脱钙时间 520 h。 0010 更优选地， 步骤 1） 中鱼鳞用浓度 0.5 molL-1的盐酸浸泡脱钙， 鱼鳞与盐酸的比 为 1:5 g/mL， 脱钙时间 5h。 0011 作为优选技术方案， 步骤 2）中所述脱钙干燥粉碎后的鱼鳞与水的比例为 1:1004:100 。
13、g/mL ； 混合蛋白酶中 ： 中性蛋白酶为脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的 16%， 木 瓜蛋白酶为脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的 0.54%， 风味蛋白酶为脱钙干燥粉碎后的鱼鳞 重量的 0.252% ； 酶解时间 920 h ； 酶解温度 3550、 pH 6.57.5。 0012 更优选地， 步骤 2） 中所述脱钙干燥粉碎后的鱼鳞与水的比例为 3:100 g/mL。 0013 更优选地， 所述中性蛋白酶 20 万 U/g， 所述木瓜蛋白酶为 98 万 U/g， 所述风味蛋白 酶为 20 U/mg。 0014 进一步优选地， 所述中性蛋白酶为脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的 4%， 所述木瓜蛋 白酶为脱钙。
14、干燥粉碎后的鱼鳞重量的 2%， 所述风味蛋白酶为脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量 的 1%。 0015 作为优选技术方案， 灭酶步骤为 ： 将酶解液加热到 90以上。 0016 作为优选技术方案， 步骤 3） 中上清液进行二级膜浓缩 ： 上清液在组合膜设备中进 行浓缩， 一级膜选用分子量 2000Da 的卷式膜， 在常温、 1.01.5Mpa 下进行浓缩， 二级膜选用 分子量 400Da 的卷式膜， 在常温、 2.5-3.0Mpa 下进行浓缩。 0017 优选地， 所述鱼鳞为淡水鱼鳞。 0018 本发明的能够达到以下效果 ： 用盐酸一次性短时间处理 （0.5moLL-1HCL 浸泡 5 h） 鱼鳞脱钙。
15、， 省略了鱼鳞的脱脂与脱杂蛋白工艺 ； 用中性蛋白酶、 木瓜蛋白酶和风味蛋白酶 一次性酶法提取鱼鳞胶原蛋白肽， 不仅降低酶解时间 （酶解时间 9 h） 、 提高胶原蛋白肽提取 率 （72.72%） ， 而且解决胶原蛋白肽的苦味等风味问题 ； 用两级膜分离浓缩胶原蛋白肽以提 高胶原蛋白肽产品的肽含量和纯度， 产品的肽含量 96%、 分子量为 400-1000Da 肽含量为 73.5%。 附图说明 0019 图 1 是鱼鳞的盐酸脱钙进程。 0020 图 2 是本发明的混合酶提取鱼鳞胶原蛋白肽进程。 0021 图 3 是中性蛋白酶提取鱼鳞胶原蛋白肽进程。 0022 图 4 是木瓜蛋白酶提取鱼鳞胶原蛋。
16、白肽进程。 0023 图 5 是风味蛋白酶提取鱼鳞胶原蛋白肽进程。 具体实施方式 说 明 书 CN 102839207 A 4 3/5 页 5 0024 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明， 以使本领域的技术人员可以 更好的理解本发明并能予以实施， 但所举实施例不作为对本发明的限定。 0025 实施例一 ： 鱼鳞预处理 鱼鳞为收集自菜市场的以鲫鱼鱼鳞为主的淡水混合鱼鳞， 用自来水清洗干净后用盐酸 进行浸泡脱钙， 脱钙后用自来水洗涤至中性， 然后在 60下干燥 （2448 h） 后用粉碎机粉 碎。 0026 通过检测浸泡液钙浓度分析盐酸脱钙的适宜料液比、 盐酸浓度和脱钙时间 （浸泡 液。
17、中钙浓度趋于稳定的时间） ， 钙浓度采用 EDTA 滴定法测定。 0027 不同实验条件下实验结果如下表 1 ： 表 1 不同实验条件下鱼鳞脱钙实验结果 实验编号1234 鱼鳞和盐酸的比例 （g/mL）10:100 20:100 30:100 40:100 盐酸浓度 （mol/L）0.30.50.71.0 脱钙时间 （h）2051015 浸泡液钙浓度 （mol/L）0.1283 0.3208 0.4985 0.6233 在实验 2 料液比 20:100（W/V） 、 盐酸浓度 0.5moL/L 下进行浸泡脱钙， 定时测量浸泡液 钙浓度， 其钙浓度随时间变化曲线如图1所示。 由图1可知， 3 h。
18、后浸泡液钙浓度趋于稳定， 其适宜时间为 3-7 h， 优选 5 h。 0028 实施例二 ： 混合酶提取鱼鳞胶原蛋白肽 取实施例一的实验 2 制得的脱钙干燥粉碎后的鱼鳞加入酶反应器中， 再加入水和混合 蛋白酶进行混合酶提取鱼鳞胶原蛋白肽， 混合酶提取结束后灭酶， 经 4000rpm 离心 10min 后得酶解液， 其中混合蛋白酶为中性蛋白酶、 木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的混合物。 灭酶具体 步骤为 ： 将酶解液加热至 90以上， 维持 10min。 0029 以鱼鳞胶原蛋白肽的提取率、 水解度和酶解液游离氨基酸量作为检测分析指标。 提取过程中， 当溶液中的鱼鳞胶原蛋白肽的提取率趋于稳定最大值时， 。
19、即判断为提取结束， 记录为酶解时间。 0030 胶原蛋白肽提取率 (%)= 每 g 鱼鳞酶解液的总羟脯氨酸量 （g） / 每 g 鱼鳞总的羟脯 氨酸量 （g） 100。 0031 鱼鳞总的羟脯氨酸测定 ： 准确称取原料鱼鳞 1g ( 脱钙并干燥粉碎后的鱼鳞 粉末 ), 加入 50mL 6mol/L HCl 于 120 130下水解 8h， 4000rpm 离心 10min 后取上清 液定容至 100mL, 取 2mL 调 pH 至 6.0, 再定容至 100mL 作为样品液。取样品液 （按需要稀 释） 4.0mL（对照用 4mL 蒸馏水） 于 25ml 具塞比色管中， 加氯胺 T 溶液 （用时。
20、现配） 2.0mL 摇 匀后常温下放置 20min， 然后加入显色剂 2.0mL 充分混匀， 于 60水浴反应 20min 后取出冷 却， 于 558nm 下测定 OD 值， 从标准曲线求得羟脯氨酸量 （张俊杰， 淮海工学院学报 ( 自然科 学版 )， 2004， 13（1） ： 53-55） 。 0032 酶解液羟脯氨酸测定 ： 取离心后的酶解上清液 （按需要稀释） 4.0ml（对照用 4mL 蒸馏水） 于 25ml 具塞比色管中， 加氯胺 T 溶液 （用时现配） 2.0mL 摇匀后常温下放置 20min， 然后加入显色剂 2.0mL 充分混匀， 于 60水浴反应 20min 后取出冷却， 。
21、于 558nm 下测定 OD 值， 从标准曲线求得羟脯氨酸量 （张俊杰， 淮海工学院学报 ( 自然科学版 )， 2004， 13（1） ： 53-55） 。 说 明 书 CN 102839207 A 5 4/5 页 6 0033 水解度 （DH 值） /%= 酶解液氨基酸态氮含量 / 鱼鳞总氮含量 100 酶解液氨基酸态氮含量测定采用甲醛滴定法。 0034 鱼鳞总氮含量测定采用凯氏定氮法。 0035 酶解液游离氨基酸量测定采用分光光度法。 0036 不同的条件及配比下的实验结果如下表 2 ： 表 2 不同条件和配比下混合蛋白酶提取鱼鳞胶原蛋白肽实验结果 实验编号1234 脱钙干燥粉碎后的鱼鳞与。
22、水的比例 （g/mL）1:100 2:100 3:100 4:100 中性蛋白酶添加量 （占脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的百分比）1%2%4%6% 木瓜蛋白酶添加量 （占脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的百分比）0.5%1%2%4% 风味蛋白酶添加量 （占脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的百分比）0.25% 0.5%1%2% 酶解温度 （）35404550 pH6.06.57.07.5 酶解时间 （h）2010915 鱼鳞胶原蛋白肽提取率 （%）15.28 71.64 82.32 83.65 水解度 （%）25.64 58.74 62.52 64.79 酶解液游离氨基酸量 （mg/g）36.57 80.54 88。
23、.56 89.65 表 2 中， 综合提取效果和成本考量， 实验 3 的效果最佳。实验 3 脱钙干燥粉碎后的鱼鳞 和水比例 （料液比） 3:100（W/V， g/mL） 、 中性蛋白酶添加量为脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的 4%、 木瓜蛋白酶添加量为脱钙干燥粉碎后的鱼鳞重量的 2%、 风味蛋白酶添加量为脱钙干燥 粉碎后的鱼鳞重量的 1%、 酶解温度 45、 pH 7.0 的条件下结果如图 2 所示。 0037 由图 2 可知， 酶解 6h 后鱼鳞胶原蛋白肽提取率、 水解度和酶解液游离氨基酸量 逐渐趋于稳定， 酶解 9h 后已接近达到最大， 酶解 12h 后达到最大 ； 因此适宜的酶解时间为 6-1。
24、2h， 优选 9h。酶解 9h 后鱼鳞胶原蛋白肽提取率、 水解度和酶解液游离氨基酸量分别为 82.32%、 62.52%、 88.56mg/g。 0038 本实施例所用中性蛋白酶购自北京鸿润宝顺科技有限公司， 酶活力为 20 万 U/g。 所用木瓜蛋白酶购自北京鸿润宝顺科技有限公司， 酶活力为 98 万 U/g。所用风味蛋白酶购 自北京鸿润宝顺科技有限公司， 酶活力为 20 U/mg。 0039 对比例一 中性蛋白酶提取鱼鳞胶原蛋白肽 在实施例一的实验 2 制得的脱钙干燥粉碎后的鱼鳞和水比例 （料液比） 3:100（W/V） 、 酶 添加量 4%、 酶解温度 45、 pH 7.0 的条件下进行。
25、验证试验， 定时测定胶原蛋白肽的提取率， 胶原蛋白肽水解度和游离氨基酸量， 结果如图 3 所示。由图 3 看出， 酶解 12h 后， 提取率趋 于稳定， 而胶原蛋白肽水解度和游离氨基酸量略有升高。酶解 12 h 胶原蛋白肽提取率、 水 解度和游离氨基酸量分别为 48.86%、 45.74% 和 40.26mg/g。 0040 对比例二 木瓜蛋白酶提取鱼鳞胶原蛋白肽 在实施例一的实验 2 制得的脱钙干燥粉碎后的鱼鳞和水比例 （料液比） 3:100（W/V） 、 酶 添加量 2%、 酶解温度 45、 pH 7.0 下进行验证试验， 定时测定胶原蛋白肽提取率、 水解度和 酶解液游离氨基酸量， 结果如。
26、图 4 所示。由图 4 看出， 酶解 24h 后胶原蛋白肽提取率、 水解 度和游离氨基酸量均趋于稳定， 分别为 ： 20.03%、 37.41% 和 28.42mg/g。 0041 对比例三 风味蛋白酶提取鱼鳞胶原蛋白肽 在实施例一的实验 2 制得的脱钙干燥粉碎后的鱼鳞和水比例 （料液比） 3:100（W/V） 、 酶 添加量 10%、 酶解温度 45、 pH 7.0 下进行验证试验， 定时测定胶原蛋白肽提取率、 水解度 说 明 书 CN 102839207 A 6 5/5 页 7 和酶解液游离氨基酸量， 结果如图 5 所示。由图 5 看出， 酶解 12h 后提取率、 水解度趋于稳 定， 而游。
27、离氨基酸量在酶解 18h 后趋于稳定。酶解 12h 时胶原蛋白肽提取率、 水解度和游离 氨基酸量分别为 4.86%、 52.03% 和 3.14mg/g。因此风味蛋白酶单独提取鱼鳞胶原蛋白肽的 提取率很低。 0042 实施例三 ： 膜浓缩鱼鳞胶原蛋白肽 按实施实例二的实验 3 制得的酶解液在 4000rpm 下离心 10min 得上清液， 然后将滤液 在组合膜设备中进行浓缩。一级膜选用分子量 2000Da 的卷式膜， 在常温、 1.0-1.5Mpa 下进 行。二级膜选用分子量 400Da 的卷式膜， 在常温、 2.53.0Mpa 下进行。二级膜浓缩后进行冷 冻干燥得到鱼鳞胶原蛋白肽粉。 004。
28、3 表3为二级膜浓缩的胶原蛋白肽得率， 表4为胶原蛋白肽粉的肽含量、 分子量分布 和苦味。 0044 膜浓缩的胶原蛋白肽得率 （%） = 浓缩后羟脯氨酸总量 / 浓缩前羟脯氨酸总 量 100。 0045 羟脯氨酸测定同实施例二， 胶原蛋白肽粉肽含量测定采用凯氏定氮法， 胶原蛋白 肽分子量分布测定采用高效液相色谱法。 0046 表 3 膜浓缩鱼鳞胶原蛋白肽得率 膜浓缩一级膜浓缩二级膜浓缩 胶原蛋白肽得率 /%95.4292.58 表 4 胶原蛋白肽粉肽含量、 分子量分布和苦味 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例， 本发明的保护范围 不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换， 均在本发明的 保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。 说 明 书 CN 102839207 A 7 1/3 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102839207 A 8 2/3 页 9 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102839207 A 9 3/3 页 10 图 5 说 明 书 附 图 CN 102839207 A 10 。