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1、(10)申请公布号 CN 102912013 A (43)申请公布日 2013.02.06 CN 102912013 A *CN102912013A* (21)申请号 201210348050.X (22)申请日 2012.09.19 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 长沙三济生物科技有限公司 地址 410205 湖南省长沙市高新开发区麓谷 国际工业园 A5 栋 3 楼 (72)发明人 周姗 (74)专利代理机构 长沙正奇专利事务所有限责 任公司 43113 代理人 卢宏 (54) 发明名称 定性检测细胞色素氧化酶 CYP2C19 基。
2、因分型 的测序引物对及其试剂盒 (57) 摘要 本发明提供一种定性检测细胞色素氧化酶 CYP2C19 基因分型的测序引物对及其试剂盒， 属 于体外核酸检测领域， 所述试剂盒包括尿嘧啶 DNA 糖基化酶、 Taq 聚合酶、 PCR 反应液、 PCR 扩增 引物、 焦磷酸测序引物、 以及阳性对照品 ； 本发明 提供的试剂盒灵敏度高， 特异性好， PCR 产物简单 处理即可上焦磷酸测序仪测序， 操作简便， 反应时 间短， 比金标准毛细管电泳测序灵敏度高， 更 适合用于突变分析。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 3 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产。
3、权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 3 页 附图 4 页 1/1 页 2 1. 一种定性检测细胞色素氧化酶 CYP2C19 基因分型的测序引物对， 其特征在于， 所述 引物对为 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.4 所示的正向扩增引物， SEQ ID NO.2 和 SEQ IDNO.5 所示的反向扩增引物， SEQ ID NO.3 和 SEQ ID NO.6 所示的测序引物 ； 其中， SEQID NO.1 和 SEQ ID NO.5 所示引物的 5 端进行生物素标记。 2. 一种定性检测细胞色素氧化酶 CYP2C19 基因分型的测序试剂盒， 。
4、其特征在于， 所述 试剂盒包括含有 SEQ ID NO.2 所示反向扩增引物的 PCR 反应液 1， 含有 SEQ ID NO.4 所示 正向扩增引物的 PCR 反应液 2， SEQ ID NO.1 所示的正向扩增引物， SEQ ID NO.5 所示的反 向扩增引物， SEQ ID NO.3 和 SEQ ID NO.6 所示的测序引物 ； 其中， SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO.5 所示引物的 5 端进行生物素标记。 3.如权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中还包括SEQ ID NO.7所示的 质控品和空白对照品。 4. 如权利要求 3 所述的试剂盒， 其特征在。
5、于， 所述空白对照品为水。 5.如权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括CYP2C19*2阳性对照品 1， CYP2C19*2 阳性对照品 2， CYP2C19*2 阳性对照品 3 ； CYP2C19*3 阳性对照品 1， CYP2C19*3 阳性对照品 2， CYP2C19*3 阳性对照品 3 ； 所述 CYP2C19*2 阳性对照品 1 为插有 SEQ ID NO.8 所示核苷酸序列的 CYP2C19*2 野 生纯合子质粒 ； 所述 CYP2C19*2 阳性对照品 2 为插有 SEQ ID NO.9 所示核苷酸序列的 CYP2C19*2突变纯合子质粒 ； CYP2C19*。
6、2阳性对照品3为由所述CYP2C19*2突变纯合子质粒 和所述 CYP2C19*2 野生纯合子质粒组成的 CYP2C19*2 质粒混合物 ； 所述CYP2C19*3阳性对照品1为插有SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的CYP2C19*3野生 纯合子质粒 ； CYP2C19*3 阳性对照品 2 为插有 SEQ ID NO.11 所示核苷酸序列的 CYP2C19*3 突变纯合子质粒 ； CYP2C19*3 阳性对照品 3 为由所述 CYP2C19*3 突变纯合子质粒和所述 CYP2C19*3 野生纯合子质粒组成的 CYP2C19*3 质粒混合物 ； 其中， 质粒载体为 pMD18-T 质粒。 。
7、6. 如权利要求 5 所述的试剂盒， 其特征在于， 所述 CYP2C19*2 质粒混合物中 CYP2C19*2 突变纯合子质粒和所述 CYP2C19*2 野生纯合子质粒的数量比为 1:1。 7. 如权利要求 5 所述的试剂盒， 其特征在于， 所述 CYP2C19*3 质粒混合物中 CYP2C19*3 突变纯合子质粒和所述 CYP2C19*3 野生纯合子质粒的数量比为 1:1。 权 利 要 求 书 CN 102912013 A 2 1/8 页 3 定性检测细胞色素氧化酶 CYP2C19 基因分型的测序引物对 及其试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及体外核酸检测领域， 尤其涉及一种在临床样本中检。
8、测常用药物代谢 的细胞色素氧化酶 CYP2C19 基因的两个位点的基因分型的测序引物对及其试剂盒， 即 CYP2C19*2（681G/A） 与 CYP2C19*3（636G/A） 两个位点的基因分型。 背景技术 0002 细胞色素 P450 （CytochromeP450， CYP450） 是由一组结构和功能相关的超家族基因 （Superfamily gene） 编码的同工酶， 在人类身体中， 其主要存在于肝细胞微粒中。 在CYP450 超家族中， CYP2是最大的家族， 有15个亚家族， 它们代谢约20%目前临床使用的药物。 其中 CYP2C19（S- 美芬妥英羟化酶） 是 CYP450 的。
9、主要成分之一， CYP2C19 基因 cDNA 全长 1940， 含有 9 个外显子， 编码区为 1473bp。其编码的蛋白 S- 美芬妥英羟化酶代谢一系列临床药 物， 如氯吡格雷、 美芬妥英、 奥美拉唑、 普萘洛尔、 地西泮、 去甲地西泮、 舍曲林等。 0003 研究表明很多药物代谢表型的差异源于 CYP2C19 基因突变， 中国人常见的两种单 核苷酸突变为 CYP2C19*2 型和 CYP2C19*3 型， 分别为 CYP2C19 基因的第 5 外显子 G681A 和 第4外显子G636A的突变。 其中CYP2C19*2型G681A点突变产生了一个异常的拼接位点， 使 外显子 5 端的前 。
10、40bp 核苷酸发生缺失， 改变了随后 mRNA 的阅读框， 从而使蛋白的合成过 早终止， 使其合成的S-美芬妥英羟化酶缺乏血红素结合位点， 使其失去活性。 CYP2C19*3型 G636A 点突变使编码色氨酸密码子变为终止子， 也导致蛋白合成提前终止， 使合成的酶缺乏 血红素及底物结合区而失去活性。这些点突变引起了 S- 美芬妥英羟化酶的活性和下降， 代 谢底物的能力减弱， 使血药浓度增高， 从而引起与血药浓度相关的药品不良反应。 0004 根据 CYP2C19 基因型改变而引起酶代谢活性的改变， 可将人群根据对药物代谢能 力分为三大类 ： 药物强代谢型 (EM， extensive met。
11、abolisers)CYP2C19 野生型， CYP2C19 杂 合型代表的是中间代谢型 （IM） ， 弱代谢型 (PM) 为突变型纯合子。CYP2C19*2 在中国人中发 生率是 30， CYP2C19*3 是 5， 而这两种突变几乎涵盖了中国人所有的弱代谢型 （PM） 。 0005 CYP2C19 基因型与肿瘤发病危险性 ： 0006 CYP2C19 基因的遗传多态性与多种肿瘤癌症的发生有关。研究结果表明， CYP2C19 可能参与食管癌、 胃癌、 肺癌、 急性白血病鳞状细胞肺癌、 肝癌等前致癌物的活化， 即 CYP2C19 基因的突变将增加患食管癌、 胃癌、 肺癌、 急性白血病鳞状细胞肺。
12、癌、 肝癌的危险 性。因此， 对人群中 CYP2C19 基因进行分型检测， 能为临床上对某些肿瘤的易感性预测以及 早期癌变预警提供重要的理论依据， 有助于肿瘤癌症的前期预防。 0007 CYP2C19 基因主要影响的几种药物代谢有 ： 0008 氯吡格雷 ： 氯吡格雷为噻吩并吡啶衍生物， 是一类新型的抗血小板药物， 氯吡格雷 本身无治疗效应， 它由细胞色素 P450 氧化生成活性代谢产物 （一种硫醇衍生物） 而发挥作 用。CYP2C19 的变异是目前发现的氯吡格雷疗效个体差异的主要原因。CYP2C19 基因的突 变降低了氯吡格雷抗血小板聚集的疗效， 并呈现出基因剂量效应。 说 明 书 CN 1。
13、02912013 A 3 2/8 页 4 0009 美芬妥英 ： 美芬妥英是临床常用广谱抗癫痫药， 其血药浓度、 疗效和不良反应存在 显著个体差异， 主要与药物代谢及反应的遗传多态性有密切关系。其中 CYP2C19 基因多态 性可引起不同个体服用美芬妥英后出现特异性的药理及毒理作用， 造成药物治疗效果的差 异。 0010 奥美拉唑 ： 奥美拉唑是目前应用最为广泛的质子泵抑制剂 （PPI） 之一， 能抑制胃 酸分泌， 但长期大剂量使用将增加患者骨折的危险。在 CYP2C19 强代谢型人群中， 奥美拉唑 80% 都是由 CYP2C19 代谢。故此， CYP2C19 基因突变型人群使用奥美拉唑的疗效。
14、显著低于 CYP2C19 基因野生型人群。 0011 CYP2C19 基因参与的药物代谢还包括普萘洛尔、 地西泮、 去甲地西泮、 舍曲林等， 患者对这些药物的敏感性、 耐药性以及不良反应状况都与患者本身 CYP2C19 基因多态性相 关。因此根据检测 CYP2C19 基因型的多态性来选择用药或者选择最小有效剂量治疗方案有 重要的临床意义。 0012 目前医院用于 CYP2C19 基因分型检测的 “金标准” 是 PCR- 直接测序法 , 但直接测 序法的敏感性不高， 只能检测出突变细胞比率在10-20%以上的肿瘤组织， 对于含A Ex4 636GA 0055 表 2. 特异性扩增引物与测序引物序。
15、列 0056 说 明 书 CN 102912013 A 6 5/8 页 7 0057 2对照品选择 0058 使用人工合成的一段寡聚核苷酸链 control oligo 为质控品 SEQ ID NO:7 （TAYGGTTTGCA） ； DNAase RNA-free 水为空白对照 ； 阳性对照品为本公司自制。 0059 4PCR 反应液组成 0060 表 3.PCR 反应液 1 组成 0061 原料名称体积 （L） 10 xPCRBuffer5 dNTP3 CYP2C19*2 反向扩增引物1 H2O38.5 总体积47.5L 0062 表 4.PCR 反应液 2 组成 0063 说 明 书 C。
16、N 102912013 A 7 6/8 页 8 原料名称体积 （L） 10 xPCRBuffer5 dNTP3 CYP2C19*3 正向扩增引物1 H2O38.5 总体积47.5L 0064 本试剂盒提供 PCR 反应液， 用于细胞色素氧化酶 CYP2C19 基因分型检测。 0065 实施例 2 ： 试剂盒的使用 0066 1样本扩增 0067 分别取空白对照、 阳性对照和样本 DNA， 作为 PCR 反应模板， 加入 UNG 酶、 Taq 聚合 酶、 特异性 PCR 扩增引物 1 或 2、 及 PCR 反应液 1 或 2 中， 组成 PCR 反应体系， 进行 PCR 扩增。 0068 CYP。
17、2C19*2 体系各主要成分如下 ： 0069 0070 CYP2C19*3 体系各主要成分如下 ： 0071 0072 2PCR 反应程序 说 明 书 CN 102912013 A 8 7/8 页 9 0073 设置好 PCR 反应程序， 将反应管放入荧光 PCR 仪 （ABI7500） 开始扩增， 反应程序如下 ： 0074 表 5.PCR 反应程序 0075 0076 检测位点一 （CYP2C19*2） 退火温度设置为 61， 检测位点二 （CYP2C19*3） 退火温 度设置为 59。 0077 1. 焦磷酸测序 0078 PCR 扩增产物预处理 0079 分 别 取 PCR 扩 增 。
18、产 物 20L，加 入 含 Binding Buffer 40L、水 18L 及 2LBeads 的体系中， 按照 QIAGEN PyroMark Q24 测序仪的标准操作规程开机， 对产物进行 预处理。 0080 产物检测 0081 分别添加 Annealing Buffer 24L、 测序引物 1.2L 到 PyroMark Q24 板上。质 控品 Control Oligo 为自带测序引物， 加 Annealing buffer 25L 到 PyroMarkQ24 板上。 0082 运行程序 0083 在QIAGEN PyroMark Q24测序仪上按下表选择对应的工作模式， 输入待检序。
19、列， 在 USB 存储器上选择运行程序运行。 0084 表 4. 工作模式及待检序列 0085 说 明 书 CN 102912013 A 9 8/8 页 10 0086 4结果判断 0087 仪器软件自动给出频率分析结果 ； 0088 CYP2C19*2 的 DNA 测序峰值图中， G 的频率 90%， A 的频率 10%， 即认为 CYP2C19*2 野生型 ； 30% G 的频率 70%， 30% A 的频率 70%， 即认为 CYP2C19*2 突变 杂合型 ； A 的频率 90%， G 的频率 10%， 即认为 CYP2C19*2 突变纯合型 ； 0089 CYP2C19*3 的 DN。
20、A 测序峰值图中， G 的频率 90%， A 的频率 10%， 即认为 CYP2C19*3 野生型 ； 30% G 的频率 70%， 30% A 的频率 70%， 即认为 CYP2C19*3 突变 杂合型 ； A 的频率 90%， G 的频率 10%， 即认为 CYP2C19*3 突变纯合型 ； 0090 5质控标准 0091 各类对照质控品判断结果如下表 ： 0092 表 5. 质控品标准检测结果 0093 质控品检出率 1空白对照0 2质控品100% 0094 6. 结果报告 ： 0095 结果如图 1、 图 2、 图 3、 图 4 所示， 样本结果的判断标准如下 ： 0096 表 6. 。
21、报告样本检测结果 0097 样本检测结果报告结果 1C:0%T:100%CYP2C19*2 突变纯合型 2C:43%T:57%CYP2C19*2 突变杂合型 3C:95%T:5%CYP2C19*2 野生型 4C:2%T:98%CYP2C19*3 野生型 5C:58%T:42%CYP2C19*3 突变杂合型 0098 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 并非用来限定本发明的实施范围 ； 如果不脱 离本发明的精神和范围， 对本发明进行修改或者等同替换， 均应涵盖在本发明权利要求的 保护范围当中。 说 明 书 CN 102912013 A 10 1/3 页 11 SEQUENCE LISTING 长沙。
22、三济生物科技有限公司 定性检测细胞色素氧化酶 CYP2C19 基因分型的测序引物对及其试剂盒 11 PatentIn version 3.3 1 24 DNA 智人 1 ccagagcttg gcatattgta tcta 24 2 23 DNA 智人 2 cgcaagcagt cacataacta agc 23 3 20 DNA 智人 3 aagtaatttg ttatgggttc 20 4 24 DNA 智人 4 gcaatgtgat ctgctccatt attt 24 5 22 DNA 智人 序 列 表 CN 102912013 A 11 2/3 页 12 5 gcaaaaaact t。
23、ggccttacc tg 22 6 15 DNA 智人 6 ttgtaagcac cccct 15 7 11 DNA 智人 7 tayggtttgc a 11 8 289 DNA 智人 8 ccagagcttg gcatattgta tctatacctt tattaaatgc ttttaattta ataaattatt 60 gttttctctt agatatgcaa taattttccc actatcattg attatttccc gggaacccat 120 aacaaattac ttaaaaacct tgcttttatg gaaagtgata ttttggagaa agtaaaagaa 。
24、180 caccaagaat cgatggacat caacaaccct cgggacttta ttgattgctt cctgatcaaa 240 atggagaagg taaaatgtta acaaaagctt agttatgtga ctgcttgcg 289 9 289 DNA 智人 9 ccagagcttg gcatattgta tctatacctt tattaaatgc ttttaattta ataaattatt 60 gttttctctt agatatgcaa taattttccc actatcattg attatttccc aggaacccat 120 aacaaattac tta。
25、aaaacct tgcttttatg gaaagtgata ttttggagaa agtaaaagaa 180 caccaagaat cgatggacat caacaaccct cgggacttta ttgattgctt cctgatcaaa 240 atggagaagg taaaatgtta acaaaagctt agttatgtga ctgcttgcg 289 序 列 表 CN 102912013 A 12 3/3 页 13 10 138 DNA 智人 10 gcaatgtgat ctgctccatt attttccaga aacgtttcga ttataaagat cagcaatttc 。
26、60 ttaacttgat ggaaaaattg aatgaaaaca tcaggattgt aagcaccccc tggatccagg 120 taaggccaag ttttttgc 138 11 138 DNA 智人 11 gcaatgtgat ctgctccatt attttccaga aacgtttcga ttataaagat cagcaatttc 60 ttaacttgat ggaaaaattg aatgaaaaca tcaggattgt aagcaccccc tgaatccagg 120 taaggccaag ttttttgc 138 序 列 表 CN 102912013 A 13 1/4 页 14 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102912013 A 14 2/4 页 15 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102912013 A 15 3/4 页 16 图 5 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102912013 A 16 4/4 页 17 图 8 说 明 书 附 图 CN 102912013 A 17 。