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1、(10)申请公布号 CN 102787103 A (43)申请公布日 2012.11.21 CN 102787103 A *CN102787103A* (21)申请号 201110128723.6 (22)申请日 2011.05.18 C12N 9/00(2006.01) (71)申请人 北京化工大学 地址 100029 北京市朝阳区北三环东路 15 号 (72)发明人 苑丽辉 许伟坚 张淑荣 张鹏 陈畅 (54) 发明名称 一种从黄单胞菌中提取 - 葡萄糖基化丁香 酚合成酶的方法 (57) 摘要 一种从黄单胞菌中提取 - 葡萄糖基化丁香 酚合成酶的方法， 属于生物制品分离纯化领域。 工 艺流。
2、程为 ： 细胞培养超声破碎硫酸铵沉淀 透析DEAE-离子交换层析Sephadex G75凝胶 层析冷冻干燥， 使用该方法提取的纯酶酶活最 高可达127.1U/mg， 收率为11.1。 本发明操作简 单， 所用仪器少， 可快速实现 -EG 合成酶的分离 纯化。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 1/1 页 2 1. 一种从黄单胞菌中提取 - 葡萄糖基化丁香酚合成酶的方法， 其特征包括以下步 骤 ： (1) 粗酶液的获得 将培养一定时间的黄单胞菌发酵液离心， 弃上清， 沉淀即为。
3、菌体细胞。 细胞沉淀用适量 缓冲液回溶， 在冰浴中破碎30min(5s/5s， 300w)， 而后8000r/min离心15min， 上清液即为粗 酶液。 (2) 硫酸铵沉淀 在粗酶液中缓慢加入固体硫酸铵粉末至 30 (w/v) 饱和度， 期间不断搅拌， 4下静置 4-24h， 12000r/min 离心 15min， 弃沉淀 ； 上清液加硫酸铵至 45 (w/v) 饱和度， 4下静置 4-24h， 12000r/min 离心 15min， 弃上清液， 沉淀即为所需酶液。 (3) 透析除盐 将酶沉淀用适量的缓冲液溶解， 并在相同缓冲液中透析， 期间不断更换缓冲液， 直到检 测不出 SO42-为。
4、止。8000r/min 离心 5min， 弃沉淀。 (4)DEAE- 纤维素离子交换层析 待酶液全部进入离子交换纤维素后， 用 3 倍柱体积的缓冲液 (pH7.0) 洗脱至 A280不变。 然后分别用含有0-1.0mol/LNaCl的缓冲液(pH7.0)进行梯度洗脱， 流速为1.5mL/min， 收集 具有酶活部分。 (5)Sephadex G-75 凝胶层析 将收集到的有活性的酶液用超滤离心管 ( 截留分子量 10KDa) 浓缩至 2mL 左右， 加入经 缓冲液平衡后的葡聚糖凝胶 Sephadex G-75 层析柱进行层析。待样品完全进入凝胶后， 以 流速为 0.5mL/min 进行洗脱， 。
5、收集具有酶活性的部分， 即得电泳纯 -EG 合成酶。 所述步骤 (2) 中硫酸铵第一次添加浓度为 30 (w/v) 饱和度， 第二次添加浓度为 45 (w/v) 饱和度。 步骤 (4) 中所述 NaCl 浓度梯度洗脱采用 0.1mol/L、 0.2mol/L、 0.3mol/L、 0.4mol/L、 0.5mol/L 和 1.0mol/L 浓度的 NaCl 缓冲液。 权 利 要 求 书 CN 102787103 A 2 1/4 页 3 一种从黄单胞菌中提取 - 葡萄糖基化丁香酚合成酶的方 法 技术领域 0001 一种胞内酶的分离纯化方法， 本发明涉及一种以离子交换色谱和凝胶色谱相结合 的方法，。
6、 从黄单胞菌中提取 - 葡萄糖基化丁香酚合成酶的的方法属于生物制品分离纯化 领域。 背景技术 0002 丁香酚是丁香及丁香罗勒油的主要成分， 广泛存在于丁香油、 肉豆蔻油、 樟脑油等 芳香油中。因其具有其抗氧化、 镇痛、 抑菌、 抗肿瘤、 促进透皮吸收及芳香气味等作用及优 点， 在医药、 食品及日化领域已有应用。但其易升华、 有刺激性气味、 难溶于水等性质， 限制 了它的进一步应用。已有研究表明经经葡萄糖基化修饰的丁香酚溶解度有大幅增加， 且可 用作生发剂中的添加剂。 0003 目前， 合成 a- 葡萄糖基化丁香酚 (eugenyl-D-glucopyranonside， -EG) 的主 要途。
7、径仍是采用微生物发酵法。由于丁香酚具有杀菌作用， 利微生物发酵法合成 -EG 时 受到底物浓度的限制 ； 同时， 这种方法操作复杂， 后期纯化困难， 不利于大规模生产。因此， 对 -EG 合成酶进行分离纯化， 不仅利于 -EG 的大规模生产， 同时为研究 -EG 合成酶的 性质及后期进行蛋白质测序、 构建基因工程菌打下基础。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种 -EG 合成酶的分离纯化方法， 该方法采用离子交换 色谱和凝胶色谱相结合的手段对胞内 -EG 合成酶进行分离纯化， 使之达到电泳纯， 该方 法操作简单， 所用仪器少， 可快速实现 -EG 合成酶的分离纯化。 0005 本发明是。
8、提取黄单胞菌内的 -EG 合成酶， 工艺步骤为 ： 0006 (1) 粗酶液的获得 0007 将培养一定时间的黄单胞菌发酵液离心， 弃上清， 沉淀即为菌体细胞。 细胞沉淀用 适量缓冲液回溶， 在冰浴中超声破碎， 而后 8000r/min 离心 15min， 上清液即为粗酶液。 0008 (2) 硫酸铵沉淀 0009 在粗酶液中缓慢加入固体硫酸铵粉末至 30 (w/v) 饱和度， 期间不断搅拌， 4下 静置 4-24h， 12000r/min 离心 15min， 弃沉淀 ； 上清液加硫酸铵至 45 (w/v) 饱和度， 4下 静置 4-24h， 12000r/min 离心 15min， 弃上清液。
9、， 沉淀即为所需酶液。 0010 (3) 透析除盐 0011 将酶沉淀用适量的缓冲液溶解， 并在相同缓冲液中透析， 期间不断更换缓冲液， 直 到检测不出 SO42-为止。8000r/min 离心 5min， 弃沉淀。 0012 (4)DEAE- 纤维素离子交换层析 0013 待酶液全部进入离子交换纤维素后， 用3倍柱体积的缓冲液(pH7.0)洗脱至A280不 变。 然后分别用含有0-1.0mol/LNaCl的缓冲液(pH7.0)进行梯度洗脱， 流速为1.5mL/min， 说 明 书 CN 102787103 A 3 2/4 页 4 收集具有酶活的部分。 0014 (5)Sephadex G-7。
10、5 凝胶层析 0015 将收集到的有活性的酶液用超滤离心管 ( 截留分子量 10KDa) 浓缩至 2mL， 加入经 缓冲液平衡后的葡聚糖凝胶 Sephadex G-75 层析柱进行层析。待样品完全进入凝胶后， 以 流速为 0.5mL/min 进行洗脱， 收集具有酶活性的部分， 即得电泳纯 -EG 合成酶。 0016 本发明中， 所用缓冲液 0.05mol/L 的 Tris-HCl 或磷酸盐缓冲液 (pH7.0)。 0017 本发明中， 步骤 (4) 所用的离子交换纤维可为 DEAE-32 型或 DEAE-52 型机子交换 纤维， 但 DEAE-52 型离子交换纤维属预溶胀纤维素， 在分离和再生。
11、过程中表现出良好的性 能， 优选 DEAE-52 作为离子交换吸附。 具体实施方案 ： 0018 实施例 1 0019 (1) 粗酶液的获得 0020 将培养 48h 的黄单胞菌发酵液 1L 于 5000r/min 离心， 弃上清， 沉淀即为菌体细 胞。细胞沉淀用适量缓冲液回溶， 在冰浴中破碎 30min(5s/5s， 300w)， 而后 8000r/min 离心 15min， 上清液即为粗酶液。 0021 (2) 硫酸铵沉淀 0022 在粗酶液中加入固体硫酸铵粉末至 30 (w/v) 饱和度， 期间不断搅拌， 4下静置 4-24h， 12000r/min 离心 15min， 弃沉淀 ； 上清。
12、液加硫酸铵至 45 (w/v) 饱和度， 4下静置 4-24h， 12000r/min 离心 15min， 弃上清液， 沉淀即为所需酶液。 0023 (3) 透析除盐 0024 将酶沉淀用适量的缓冲液溶解， 并在相同缓冲液中透析， 期间不断更换缓冲液， 直 到检测不出 SO42-为止。8000r/min 离心 5min， 弃沉淀。 0025 (4)DEAE- 纤维素离子交换层析 0026 将一定量的 DEAE-52 离子交换树纤维加入到经透析的酶液中， 1200r/min 振荡 30min， 待酶液全部进入离子交换纤维素后， 将将酶液过滤， 收集离子交换纤维， 双蒸水清 洗数次， 使用标准操作。
13、装柱。然后分别用含有 0-1.0mol/L NaCl 的缓冲液 (pH7.0) 进行 梯度洗脱， 流速为1.5mL/min， 收集具有酶活的部分， 所得酶液酶活为79U/mg， 蛋白浓度为 1.29mg/mL。 0027 (5)Sephadex G-75 凝胶层析 0028 将收集到的有活性的酶液用超滤离心管 ( 截留分子量 10KDa) 浓缩至 2mL， 加入经 缓冲液平衡后的葡聚糖凝胶 Sephadex G-75 层析柱中进行层析， 以流速为 0.5mL/min 进行 洗脱， 收集具有酶活性的部分， 即得电泳纯 -EG 合成酶， 所得酶液酶活为 125.4U/mg， 蛋白 浓度为 0.45。
14、5mg/mL。 0029 冻干后得干酶 0.1367g， 蛋白收率为 10.7， 比活较未纯化之前提高了 115.9U/mg， 酶活提高了 20 倍。 0030 实施例 2 0031 (1) 粗酶液的获得 0032 将培养 48h 的黄单胞菌发酵液 1L 于 5000r/min 离心， 弃上清， 沉淀即为菌体细 说 明 书 CN 102787103 A 4 3/4 页 5 胞。细胞沉淀用适量缓冲液回溶， 在冰浴中破碎 30min(5s/5s， 300w)， 而后 8000r/min 离心 15min， 上清液即为粗酶液。 0033 (2) 硫酸铵沉淀 0034 在粗酶液中加入固体硫酸铵粉末至 。
15、30 (w/v) 饱和度， 期间不断搅拌， 4下静置 4-24h， 12000r/min 离心 15min， 弃沉淀 ； 上清液加硫酸铵至 45 (w/v) 饱和度， 4下静置 4-24h， 12000r/min 离心 15min， 弃上清液， 沉淀即为所需酶液。 0035 (3) 透析除盐 0036 将酶沉淀用适量的缓冲液溶解， 并在相同缓冲液中透析， 期间不断更换缓冲液， 直 到检测不出 SO42-为止。8000r/min 离心 5min， 弃沉淀。 0037 (4)DEAE- 纤维素离子交换层析 0038 将透析过的酶液用聚乙二醇6000包埋浓缩至2mL， 8000r/min离心弃沉淀，。
16、 加入经 平衡后的 DEAE-52 离子交换柱。待酶液全部进入离子交换纤维素后， 用 3 倍柱体积的缓冲 液(pH7.0)洗脱至A280不变。 然后分别用含有0-1.0mol/L NaCl的缓冲液进行梯度洗脱， 流 速为 1.5mL/min， 收集具有酶活的部分。所得酶液酶活为 83U/mg， 蛋白浓度为 1.30mg/mL。 0039 (5)Sephadex G-75 凝胶层析 0040 将收集到的有活性的酶液用超滤离心管 ( 截留分子量 10KDa) 浓缩至 2mL， 加入经 缓冲液平衡后的葡聚糖凝胶 Sephadex G-75 层析柱中进行层析。待样品完全进入凝胶后， 以流速为 0.5m。
17、L/min 进行洗脱， 收集具有酶活性的部分， 即得电泳纯 -EG 合成酶。所得酶 液酶活为 127.1U/mg， 蛋白浓度为 0.450mg/mL。 0041 冻干后得干酶 0.1371g， 蛋白收率为 11.1， 比活较未纯化之前提高了 117.6U/mg， 酶活提高了 21 倍。 0042 实例 3 0043 (1) 粗酶液的获得 0044 将培养 48h 的黄单胞菌发酵液 1L 于 5000r/min 离心， 弃上清， 沉淀即为菌体细 胞。细胞沉淀用适量缓冲液回溶， 在冰浴中破碎 20min(2s/2s， 200w)， 而后 8000r/min 离心 15min， 上清液即为粗酶液。 。
18、0045 (2) 硫酸铵沉淀 0046 在粗酶液中加入固体硫酸铵粉末至 30 (w/v) 饱和度， 期间不断搅拌， 4下静置 4-24h， 12000r/min 离心 15min， 弃沉淀 ； 上清液加硫酸铵至 45 (w/v) 饱和度， 4下静置 4-24h， 12000r/min 离心 15min， 弃上清液， 沉淀即为所需酶液。 0047 (3) 透析除盐 0048 将酶沉淀用适量的缓冲液溶解， 并在相同缓冲液中透析， 期间不断更换缓冲液， 直 到检测不出 SO42-为止。8000r/min 离心 5min， 弃沉淀。 0049 (4)DEAE- 纤维素离子交换层析 0050 将透析过的。
19、酶液用聚乙二醇6000包埋浓缩至2mL， 8000r/min离心弃沉淀， 加入经 平衡后的 DEAE-52 离子交换柱。待酶液全部进入离子交换纤维素后， 用 3 倍柱体积的缓冲 液 (pH7.0) 洗脱至 A280不变。然后分别用含有 0-1.0mol/LNaCl 的缓冲液进行梯度洗脱， 流 速为 1.5mL/min， 收集具有酶活的部分。所得酶液酶活为 73U/mg， 蛋白浓度为 1.34mg/mL。 0051 (5)Sephadex G-75 凝胶层析 说 明 书 CN 102787103 A 5 4/4 页 6 0052 将收集到的有活性的酶液用超滤离心管 ( 截留分子量 10KDa) 浓缩至 2mL， 加入经 缓冲液平衡后的葡聚糖凝胶 Sephadex G-75 层析柱中进行层析。待样品完全进入凝胶后， 以流速为 0.5mL/min 进行洗脱， 收集具有酶活性的部分， 即得电泳纯 -EG 合成酶。所得酶 液酶活为 121.4U/mg， 蛋白浓度为 0.458mg/mL。 0053 冻干后得干酶 0.1385g， 蛋白收率为 11.6， 比活较未纯化之前提高了 115.1U/mg， 酶活提高了 19 倍。 说 明 书 CN 102787103 A 6 。