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1、(10)申请公布号 CN 102796786 A (43)申请公布日 2012.11.28 CN 102796786 A *CN102796786A* (21)申请号 201210335437.1 (22)申请日 2012.09.11 C12P 19/18(2006.01) (71)申请人 山东大学 地址 250061 山东省济南市历城区山大南路 27 号 (72)发明人 侯丙凯 金尚卉 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 李健康 (54) 发明名称 拟南芥糖基转移酶 UGT74D1 在催化合成生长 素糖酯中的应用 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 。
2、一 种 拟 南 芥 糖 基 转 移 酶 UGT74D1 在催化合成生长素糖酯中的应用 ； 其 中所述糖基转移酶 UGT74D1 的氨基酸序列如 SEQIDNo.2 所示， 所述生长素是吲哚甲酸、 吲哚乙 酸、 吲哚丙酸、 吲哚丁酸、 萘乙酸、 2,4- 二氯苯氧 乙酸， 将糖基转移酶 UGT74D1 与所述生长素任一 种放于反应管中进行酶促反应， 即可催化合成相 应的生长素糖酯。本发明的公开为利用酶催化方 法高效、 专一性地合成这些生长素物质的糖酯物 提供了可行的方法， 本发明实施后将为生长素糖 酯合成工业带来巨大经济效益。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 。
3、3 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 3 页 附图 5 页 1/1 页 2 1. 拟南芥糖基转移酶 UGT74D1 在催化合成生长素糖酯中的应用。 2. 如权利要求 1 所述的应用， 其特征在于 ： 所述糖基转移酶 UGT74D1 的氨基酸序列如 SEQ ID No.2 所示。 3. 如权利要求 1 所述的应用， 其特征在于 ： 所述生长素是吲哚甲酸 (ICA)、 吲哚乙酸 （IAA） 、 吲哚丙酸 （IPA） 、 吲哚丁酸 （IBA） 、 萘乙酸 （NAA） 、 2,4- 二氯苯氧乙酸 （2,4-D） 。。
4、 权 利 要 求 书 CN 102796786 A 2 1/5 页 3 拟南芥糖基转移酶 UGT74D1 在催化合成生长素糖酯中的应 用 技术领域 0001 本发明涉及一种糖基转移酶的应用， 尤其涉及一种拟南芥糖基转移酶 UGT74D1 在 催化合成生长素糖酯中的应用 ； 属于生物技术领域。 背景技术 0002 生长素是植物的重要激素之一， 它对植物的生长发育有重要的调节控制作用。 天然存在的生长素如吲哚乙酸 (IAA)、 吲哚丁酸 (IBA) 以及人工合成的生长素类物质如 2,4- 二氯苯氧乙酸 （2,4-D） 、 萘乙酸 （NAA） 等都被广泛应用在科研和农业生产中。这些生 长素类物质都含。
5、有一个羧基基团 （-COOH） 。在植物体内， 该羧基上的羟基可与葡萄糖以共 价键结合， 从而形成生长素的糖酯。生长素的糖酯被认为是生长素的失活形式和贮藏形式 （Bartel,1997)。当前， 生长素的糖酯常作为标准品被用在生长素糖基化修饰等科学研究 中。在化学和生物技术产业， 获得生长素糖酯的途径主要有两种 ： 从植物中提取和化学合 成。由于在植物中生长素糖酯的天然含量很低， 提取量非常有限， 纯度难以保证， 并且提取 过程复杂。如果用化学方法合成， 也有过程复杂、 成本高、 环境污染等缺点。相比之下， 生物 酶法合成生长素糖酯化合物则具有效率高、 成本低、 环境清洁等优点。 0003 植。
6、物体内有一类酶， 被称为糖基转移酶， 它们专门负责植物体众多化合物的糖基 化修饰， 即催化某些化合物形成相应的糖酯 （或糖苷） 。糖基化是一种普遍的生理现象， 是植 物细胞维持代谢平衡的主要机制之一， 在维持植物正常生长发育、 应对环境压力等方面具 有重要的作用 (Lim et al， 2004; 王军等， 2009)。到目前为止， 生物界存在的糖基转移酶按 照催化的底物性质和序列相关性可以分为 94 个家族。其中家族 1（GT1） 的酶所催化的底 物是一些亲脂性的小分子化合物， 在其 -OH、 -COOH、 -NH2、 -SH 或 C-C 基团上能催化结合上一 个或多个糖基 (Bowles 。
7、et al.2005)。 0004 针对生长素糖酯化合物的合成， 目前已经从拟南芥发现了一个糖基转移酶， 即 UGT84B1（Jackson et al.2001） ， 该酶对 IAA 具有最大的酶催化活性。然而， 经过检索， 目 前尚未发现其他的拟南芥糖基转移酶在催化合成生长素糖酯中的作用， 特别是拟南芥糖基 转移酶 UGT74D1 在催化合成生长素糖酯中的应用的报道。 发明内容 0005 （1） 本发明的目的 0006 针对现有技术的不足， 本发明的目的是提供一种拟南芥糖基转移酶 UGT74D1 在催 化合成生长素糖酯中的应用。 0007 （2） 实现本发明的具体技术方案 0008 本发明。
8、所述的拟南芥糖基转移酶 UGT74D1 在催化合成生长素糖酯中的应用。 0009 其中 ： 0010 所述糖基转移酶 UGT74D1 的氨基酸序列如 SEQ ID No.2 所示。该糖基转移酶是通 说 明 书 CN 102796786 A 3 2/5 页 4 过糖基转移酶基因 UGT74D1 在大肠杆菌中表达和纯化后获得的。糖基转移酶基因 UGT74D1 是通过 RT-PCR 方法从拟南芥中克隆的。 0011 所述生长素是指吲哚甲酸 (ICA)、 吲哚乙酸 （IAA） 、 吲哚丙酸 （IPA） 、 吲哚丁酸 （IBA） 、 萘乙酸 （NAA） 、 2,4- 二氯苯氧乙酸 （2,4-D） 。 0。
9、012 本发明提供新的糖基转移酶 UGT74D1 能够催化多种生长素物质形成糖酯。 0013 将糖基转移酶 UGT74D1 与生长素之一放于反应管中， 按实施例 2 中所指出的条件 进行酶促反应， 即可催化合成相应的生长素糖酯。与已经报道的 UGT84B1 不同的是， 本发明 所述糖基转移酶 UGT74D1 对 IBA 具有最大催化活性。 0014 （3） 本发明实施后可能带来的有益效果 0015 本发明是在国内外首次证明拟南芥的糖基转移酶 UGT74D1 可以催化多种生长素 化合物生成其糖酯物质。 本发明的公开为体外利用酶催化方法合成这些生长素物质的糖酯 物提供了可行的方法。用提取方法或化学。
10、合成方法获得生长素糖酯物不仅效率低， 而且缺 乏专一性。而用糖基转移酶 UGT74D1 催化方法则可以高效、 专一性的合成吲哚丁酸、 吲哚丙 酸、 吲哚乙酸、 萘乙酸等相对应的的糖酯 （见附图 1 至附图 6） 。本发明实施后将为生长素糖 酯合成工业带来巨大经济效益。 附图说明 0016 图 1. 纯化的融合蛋白 GST-UGT74D1 用 SDS-PAGE 检测。 0017 其中， M 为蛋白质分子量标记 ； 序号 1 泳道为 GST 标签蛋白， 作为对照 ； 序号 2 泳道 为纯化的 GST-UGT74D1 融合蛋白， 其中有微弱的 GST 带， 是一种在 pGEX 纯化系统中比较常 见的。
11、现象。 0018 图2.纯化后的融合蛋白GST-UGT74D1催化吲哚丁酸形成糖酯， 催化产物用高效液 相色谱 （HPLC） 分析。 0019 其中 1 为对照组， 纯化的 GST 标签蛋白与吲哚丁酸和 UDP- 葡萄糖的反应体系， 无 糖苷合成 ； 2 为实验组， 纯化的 GST-UGT74D1 融合蛋白与吲哚丁酸和 UDP- 葡萄糖的反应体 系， 比只含有 GST 标签蛋白的对照反应体系多出一个明显的产物峰 （箭头 b 所指） ， 该产物被 推测为吲哚丁酸糖酯。图中的 a 为底物吲哚丁酸。 0020 图 3. 吲哚丁酸的催化产物用质谱 （LC-MS） 鉴定。 0021 其中上图表示吲哚丁酸。
12、糖酯的标准质谱图， 下图表示吲哚丁酸的催化产物 （图 2 中的 peakb） 的质谱图。两图特征峰相同， 证明吲哚丁酸在酶的催化下形成了糖酯。 0022 图4.纯化后的融合蛋白GST-UGT74D1催化吲哚丙酸形成糖酯， 催化产物用高效液 相色谱 （HPLC） 分析。 0023 其中 1 为对照组， 纯化的 GST 标签蛋白与吲哚丙酸和 UDP- 葡萄糖的反应体系， 无 糖苷合成 ； 2 为实验组， 纯化的 GST-UGT74D1 融合蛋白与吲哚丙酸和 UDP- 葡萄糖的反应体 系， 比只含有 GST 标签蛋白的对照反应体系多出一个明显的产物峰 （箭头 c 所指） ， 该产物即 为吲哚丙酸糖酯。
13、。 0024 图5.纯化后的融合蛋白GST-UGT74D1催化吲哚乙酸形成糖酯， 催化产物用高效液 相色谱 （HPLC） 分析。 0025 其中 1 为对照组， 纯化的 GST 标签蛋白与吲哚乙酸和 UDP- 葡萄糖的反应体系， 无 说 明 书 CN 102796786 A 4 3/5 页 5 糖苷合成 ； 2 为实验组， 纯化的 GST-UGT74D1 融合蛋白与吲哚乙酸和 UDP- 葡萄糖的反应体 系， 比只含有 GST 标签蛋白的对照反应体系多出一个明显的产物峰 （箭头 d 所指） ， 该产物即 为吲哚乙酸糖酯。 0026 图6.纯化后的融合蛋白GST-UGT74D1催化萘乙酸形成糖酯，。
14、 催化产物用高效液相 色谱 （HPLC） 分析。 0027 其中 1 为对照组， 纯化的 GST 标签蛋白与萘乙酸和 UDP- 葡萄糖的反应体系， 无糖 苷合成 ； 2 为实验组， 纯化的 GST-UGT74D1 融合蛋白与萘乙酸和 UDP- 葡萄糖的反应体系， 比 只含有 GST 标签蛋白的对照反应体系多出一个明显的产物峰 （箭头 e 所指） ， 该产物即为萘 乙酸糖酯。 具体实施方式 0028 实施例 1 拟南芥糖基转移酶基因 UGT74D1 的克隆、 原核表达与酶蛋白纯化 0029 1. 拟南芥糖基转移酶基因 UGT74D1 的克隆 0030 本发明涉及的糖基转移酶基因 UGT74D1 。
15、是通过 RT-PCR 扩增技术从拟南芥中克隆 的。首先利用 TRIzol 方法从拟南芥幼嫩叶片提取 RNA， 然后用 RT-PCR 方法扩增得到该基 因的编码区 cDNA。扩增时用的一对引物是 ： UGT74D1-a: 5 -cgccatatgggagagaaagcgaaag c-3 ； UGT74D1-b:5 -ccgctcgagttacctcacaattttagc-3 。RT-PCR 扩增程序为 ： 94（预 变性） ， 5min ； 94（变性） ， 10s ； 55（退火） ， 15s ； 72（延伸） ， 2min ； 35cycle ； 72（终延 伸） ， 10min。回收并纯化。
16、扩增产物。将扩增获得的目的基因 UGT74D1 与 EcoRV 单酶切的中 间载体 pBluescript SK 连接， 获得载体 pB74D1， 对克隆到的基因进行测序。 0031 2.UGT74D1 的序列信息与特性 0032 对克隆的糖基转移酶基因 UGT74D1 测序后发现， 该基因的 cDNA 编码区长度为 1371bp， 编码 456 个氨基酸， 编码的蛋白质分子量为 51.1KD， 其氨基酸序列如 SEQ ID No.2 所示。其 C 端有一个含 44 个氨基酸的 PSPG 盒， 该盒是催化小分子化合物的糖基转移酶共 同具有的保守序列， 说明克隆的基因是拟南芥的糖基转移酶基因。 。
17、0033 3. 拟南芥糖基转移酶基因 UGT74D1 的原核表达载体构建 0034 在公开通用的原核表达载体 pGEX-2T 的基础上， 按照 分子克隆 （Sambrook 等编 著） 所示的方法， 对该载体进行改造， 使其多克隆位点包含 NdeI 和 XhoI。用 NdeI 和 XhoI 双酶切该表达载体， 回收载体片段备用。 同时用NdeI和XhoI双酶切前述载体pB74D1， 回收 得到目的基因片段， 并将其连入上述原核表达载体中， 得到拟南芥糖基转移酶基因 UGT74D1 的原核表达载体 pGEX-74D1。 0035 4. 转化大肠杆菌、 诱导蛋白表达及酶蛋白的纯化 0036 将上述。
18、原核表达载体 pGEX-74D1 转化大肠杆菌菌株 XL1-Blue， PCR 和酶切验证正 确后， 保存菌种， 此菌种用于融合蛋白 (GST-UGT74D1) 的表达纯化。 0037 在添加了氨苄青霉素 （100mg/L） 的 2YT 液体培养基中过夜培养上述菌种， 以活 化该菌种。然后将过夜培养物按照 1:100（过夜培养物 : 新的 2YT 液体培养基） 的比例 扩大至 75ml 培养液中， 37培养至 OD600=0.8。然后加入 IPTG 至 0.2mM， 转到 20震荡培养 24h 以诱导目的蛋白表达。到时间后通过离心收集菌体。 0038 菌体加入 2ml Blast Buffer。
19、 （0.5mM EDTA， 750mM 蔗糖， 200mM Tris-HCl， pH=8.0） 说 明 书 CN 102796786 A 5 4/5 页 6 重悬， 立即加入 14ml 稀释的 （1/2） Blast Buffer( 事先添加 2mg 溶菌酶 )， 混匀后于冰上 放置 30min， 离心收集菌体， 用 PBS （内含 0.2mM 的 PMSF） 重悬 , 冰上放置 30min 后 10000rpm 离心 20min, 取上清。在上清中加入 100l 的谷胱甘肽琼脂糖珠子， 按照 pGEX 蛋白纯化手 册操作， 最后用 Elution Buffer（50mM Tris-HCl， 。
20、10mM 还原型谷胱甘肽， pH=8.0） 洗脱目 的蛋白。目的蛋白的纯度用 SDS-PAGE 方法检测， 蛋白浓度按照 Bradford 试剂盒说明书中 的方法进行测定 （用 BSA 作为蛋白标准） 。 0039 实施例 2 拟南芥糖基转移酶 UGT74D1 催化生长素糖酯的合成 0040 1. 生长素的酶催化反应 0041 用纯化到的拟南芥糖基转移酶 UGT74D1 的融合蛋白 （GST-UGT74D1， 能够反映 UGT74D1 的催化活性， 属于常用的做法） 进行体外的酶催化反应， 选取 6 种生长素化合物 作为底物， 包括吲哚甲酸 (ICA)、 吲哚乙酸 （IAA） 、 吲哚丙酸 （。
21、IPA） 、 吲哚丁酸 （IBA） 、 萘乙酸 （NAA） 、 2,4- 二氯苯氧乙酸 （2,4-D） 。催化反应中用 UDP- 葡萄糖作为糖的供体。酶促反应 体系如下 ： 0042 0043 将以上混合好的反应体系放于 37恒温水浴锅中， 反应 3 小时。然后加入 20l 浓度为240mg/ml的三氯乙酸终止反应。 将反应管用液氮速冻后存放在-20， 直到HPLC分 析。 0044 2. 酶催产物的 HPLC 鉴定 0045 用高效液相色谱 (HPLC) 分析以上的反应混合体系， 所用的仪器为岛津 LC-20AT， 柱子为 C18（Ultimate， 4.6150mm， 5m） ， 工作站为。
22、 Ver 1.21， 二极管阵列检测器。流动 相为甲醇和水 （均含有 0.1% 的磷酸） ， 二元高压梯度洗脱， 其中有机相的比例分别为 ： 吲哚 丁酸、 吲哚丙酸、 萘乙酸为 10%-70%， 吲哚乙酸为 10%-48%。洗脱时间为 22min。上样量为 20l。 0046 HPLC 分析显示， 与对照 （反应体系中只含有纯化的 GST 标签蛋白） 相比， UGT74D1 融 说 明 书 CN 102796786 A 6 5/5 页 7 合蛋白对 6 种生长素化合物都能催化合成相应的糖酯 （附图中图 1 图 6 只显示其中 4 种 生长素的 HPLC 分析结果） 。 0047 3. 酶催产物。
23、的质谱鉴定 0048 对酶催化产物进行 LC-MS 鉴定， 仪器为 Surveyor MSQ， 所用的流动相为甲醇和水 （均含有 0.1% 的磷酸） ， 有机相梯度和洗脱时间同上述 HPLC 方法。 0049 结果发现酶促反应生成的产物为各自生长素的糖酯产物 （作为代表， 附图只出示 了吲哚丁酸糖酯的质谱结果， 见附图 3） 。由此得出结论 ： 拟南芥糖基转移酶 UGT74D1 可用 于催化合成生长素的糖酯。 说 明 书 CN 102796786 A 7 1/3 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 102796786 A 8 2/3 页 9 0003 序 列 表 CN 102796786 A 9 3/3 页 10 序 列 表 CN 102796786 A 10 1/5 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102796786 A 11 2/5 页 12 图 3 说 明 书 附 图 CN 102796786 A 12 3/5 页 13 图 4 说 明 书 附 图 CN 102796786 A 13 4/5 页 14 图 5 说 明 书 附 图 CN 102796786 A 14 5/5 页 15 图 6 说 明 书 附 图 CN 102796786 A 15 。