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改进的 β- 葡萄糖苷酶基因及其重组酶的制备
     技术领域 本发明涉及一种编码 β- 葡萄糖苷酶基因及其重组质粒和构建方法， 克隆、 突变 及其高效表达， 涉及分子生物学、 生物信息学、 酶学以及基因工程等领域。具体涉及对原 始黑曲霉的 β- 葡萄糖苷酶基因进行生物信息学分析和基因的定向改造， 以及重组酶的制 备。
     技术背景 β- 葡萄糖苷酶 （β-glucosidase） 又称 β-D- 葡萄糖苷水解酶， 别名纤维二糖酶、 龙胆二糖酶和苦杏仁苷酶。 是一种能催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成 葡萄糖的酶。β- 葡萄糖苷酶按其底物特异性可以分为三类 ： 第一类是能水解烃基 -β- 葡 萄糖苷或芳香基 -β- 葡萄糖苷的酶， 此类 β- 葡萄糖苷酶能水解的底物有纤维二糖、 对硝 基苯 -β-D- 葡萄糖苷等 ； 第二类是只能水解烃基 -β- 葡萄糖苷的酶， 这类 β- 葡萄糖苷 酶能水解纤维二糖等 ； 第三类是只能水解芳香基 -β- 葡萄糖苷的酶， 这类酶能水解对硝基 苯 -β-D- 葡萄糖苷等类似物。而根据 β- 葡萄糖苷酶的基因序列的不同， 又可分为 β- 葡 萄糖苷酶 A 和 β- 葡萄糖苷酶 B 之分。β- 葡萄糖苷酶在自然界广泛分布， 几乎在所有的 生物体中都有存在， 但来源不同， 其性质各异 （J Biological Chemistry, 1996, 271(39): 23749-23755） 。
     β- 葡萄糖苷酶在植物纤维原料制备燃料乙醇及食品工业中具有重要的应用。 目前， 影响木质纤维资源生物转化技术实用化的主要障碍之一就是纤维素降解酶的生产 效率和使用效率都很低， 从而导致纤维素酶的使用成本要占到酶糖化纤维材料总成本的 25~50%。 在用于制备生产纤维素酶的微生物大多属于真菌， 如木霉属、 曲霉属、 青霉属等， 其 中木霉特别是里氏木霉突变株产生的纤维素酶的活力较高、 酶系较全、 应用最为广泛。 但木 霉纤维素酶的高活力主要表现在含有高活力的内切型和外切型葡聚糖酶， 而 β- 葡萄糖苷 酶的活力明显。 研究表明， 天然纤维素的有效降解需要由纤维素酶系中内切型葡聚糖酶、 外 切型葡聚糖酶和 β- 葡萄糖苷酶这三大主要组分充分发挥协同作用才能完成， 仅用木霉纤 维素酶降解时， 纤维素二糖会大量积累在水解液中， 并强烈反馈抑制内切型和外切型葡聚 糖酶的催化活性。所以， 低活力的 β- 葡萄糖苷酶是造成酶水解纤维资源得率低、 酶用量 大、 成本高的关键因素之一。此外， β- 葡萄糖苷酶可作为风味酶应用于 （果） 酒、 茶叶、 果汁 中起到增香作用 ； 可应用于乳品工业中分解乳糖 ； 也可应用于催化葡萄糖发生转移反应和 缩合反应合成功能性低聚糖等。因此， 高活力、 低成本的 β- 葡萄糖苷酶制备技术已成为国 内外在这些领域中的研究热点 （Phytochemistry, 1988, 27: 1973-1976） 。
     黑曲霉是 β- 葡萄糖苷酶的高产菌株。但是， 通过营养条件和培养条件的优化， 黑 曲霉 β- 葡萄糖苷酶的活力仍不能满足工业上的需要， 而且成本较高。研究表明， 对 β- 葡
     萄糖苷酶的基因进行克隆、 改造和重组表达被认为可以从根本上显著提高 β- 葡萄糖苷酶 活力的最有效方法。到目前为止， 在 GenBank 和 DDJB 数据库中已有两条黑曲霉 β- 葡萄糖 苷酶基因序列 （bgl1 和bgl2 ） 被报道。 国内外也有实现了 β- 葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中 表达的研究报道， 但均未进行高效表达的研究 （J Biol Chem., 2000, 275: 4973-4980） 。
     研究表明， 外源蛋白表达的差异， 一方面是受到表达条件的影响， 另一方面， 由外 源基因本身的特性决定。从现有的国内外研究现状来看， 对外源基因表达的优化基本上集 中在发酵条件的优化。主要包括 ： （1） 酵母菌的生长密度， 培养温度和 pH ； （2） 甲醇诱导的 浓度和诱导时间。通过这些培养条件的优化， 提高了外源目的蛋白的表达量。但实际上， 要 显著提高外源目的蛋白的表达量， 其上游技术至关重要。其技术主要包括 ： （1） 基因内部结 构的优化。 外源基因在巴斯德毕赤酵母中能否表达或表达高低首先受到外源基因内部结构 的影响， 也是表达成功的前提和首要因素。其中 , 外源基因在宿主中表达时 , 同一种氨基 酸可有 1~6 个密码子， 但不同的宿主对编码同一氨基酸的密码子使用频率不同， 有些密码 子使用频率很高， 有些几乎不使用， 高效表达的基因倾向于使用部分特定的同义密码子， 这 些密码子即为改种生物高效表达基因的优越密码子。 这就是密码子的偏爱性。 目前， 国内外 都有学者对毕赤酵母部分密码子的用法进行了分析。 以 Arg 为例， 编码 6 种密码子在酵母高 效表达基因、 低效表达基因使用频率明显不同， 密码子 CGA 和 CGG 使用频率为 0， 密码子 CGC 几乎不使用， 而 AGA 使用频率最高。研究表明， 在酵母中表达较高的基因往往是采用酵母本 身所偏爱的密码子 ； 那些富含毕赤酵母稀有密码子的外源基因在毕赤酵母中很难得到高效 表达。 在不改变氨基酸组成的前提下， 将编码外源蛋白的密码子优化为酵母的偏爱密码子， 可以实现外源蛋白在酵母体内表达或表达量的显著提高。到目前为止， 对黑曲霉 β- 葡萄 糖苷酶基因进行定向改造以及该重组酶的高效表达在国内外还未见研究报道。
     发明内容 解决的技术问题 ： 本发明的目的是大幅度提高黑曲霉 β- 葡萄糖苷酶基因的表达 水平， 获得在毕赤酵母中超量表达的黑曲霉 β- 葡萄糖苷酶基因bgl II， 以及对重组 β- 葡 萄糖苷酶的制备进行研究。因此提供了一种改进的 β- 葡萄糖苷酶基因及其重组酶的制 备。
     技术方案 ： 改进的 β- 葡萄糖苷酶基因， 核苷酸序列 bglII 如 SEQ ID NO.1 所述。
     包含上述核苷酸序列的重组质粒。
     包含上述核苷酸序列的重组质粒 pPICZα-bglII。
     包含 SEQ ID NO.1 所述 β- 葡萄糖苷酶基因的重组质粒制备方法， 步骤为 ： bgl II 的合成 ： 设计一组 98 条寡核苷酸， 所述 98 条寡核苷酸序列如 SEQ ID NO.2 ～ SEQ ID NO.99 所述 ； 黑曲霉的 β- 葡萄糖苷酶基因 bgl II 的获得， 采取两步 PCR 扩增技术 ； 第一步， 反应 体系 50 μL ： 5 μL 的全部 98 条寡核苷酸引物 100 nM， 4 μL dNTP Mixture， 各 2.5 mM， 5 μL 10 × PCR Buffer， 2.5 U Ex Taq， 加水补足 50 μL， 反应条件为 ： 94℃预变性 5 min， 94℃变性 30 s， 59℃退火 3 min， 72℃延伸 1 min， 30 个循环， 72℃延伸 10 min ； 第二步， PCR 扩增基因 bgl II， 反应体系 50 μL ： 包含上面的反应物 2 μL， 引物 SEQ ID NO.2， 10 µM
     1μL， 引物 SEQ ID NO.99， 10 µM 1 μL，dNTP Mixture ， 各 2.5 mM， 4 μL， 5×PCR Buffer 10μL， 2.5 U Ex Taq， 加水补足 50 μL， 反应条件为 : 94℃预变性 5 min， 94℃变性 30 s， 59℃退火 30 s， 72℃ 3 min， 30 个循环， 72℃延伸 10 min ； 重组质粒 pPICZα-bglII 的构建 ： 将获得的改造后的基因 bgl II 和 pPICZα-A 分别用内切酶 Eco R I、 Sac II 进行分步酶切， 并分别割胶回收， 浓缩后 16℃连接过夜， 宿主菌使用 Top10F’ 的感受态细胞， 涂布在 LLB 平 板， LLB 平板含 25μg/mL Zeocin， 倒置平板过夜， 挑选单菌落到 5 mL 液体 LLB 中， 液体 LLB 中含 25μg /mL Zeocin， 37℃， 200 rpm 培养 8 h， 得到重组质粒 pPICZα-bglII。
     含有上述重组质粒的宿主细胞为毕赤酵母。
     利用含有上述改进的 β- 葡萄糖苷酶基因宿主细胞制备重组酶的方法， 发酵培养 基为 ： 质量浓度为 85% 的 H3PO4 26.7 mL， CaSO4·2H2O 0.93 g， K2SO4 18.2 g， MgSO4·7H2O 14.9 g， KOH 4.13 g， Glycerol 50 mL， 100 mM K2PO4-KH2PO4 缓冲液 100 mL， 加入超纯水至 1L ； PTM1 微量元素 ： CuSO4· 5H2O 6.0 g， NaI 0.08 g， MnSO4· H2O 3.0 g， NaMoO4· 2H2O 0.2g， H3BO3 0.02 g， CoCl2 0.5 g， ZnCl2 20.0 g， FeSO4·7H2O 65.0 g， H2SO4 5.0 mL， 加入超纯水 至 1 L， 用 0.22 μm 的滤膜过滤除菌 ； 诱导表达 β- 葡萄糖苷酶的适宜条件为 ： 发酵培养 基的 pH 值 6.0， 发酵温度 28-30℃， DO 值 （溶解氧） 在 30% 左右， 并适时添加 PTM1， 组氨酸和 甲醇， 诱导时间为 108 h。
     具体方案内容为 ： 包括原始基因的克隆、 基因的分析和定向改造以及重组酶的制备。
     1. 参 照 Genebank 上 已 发 表 的 黑 曲 霉 β- 葡 萄 糖 苷 酶 基 因 序 列 （登 录 号 为 AJ132386） 设计引物， 以提取的黑曲霉的 RNA 为模板进行 RT-PCR， 获得目的基因， 并将基因 克隆到 PMD-18T 载体， 再以克隆得到的基因为模板， PCR 获得去除信号肽的基因， 并将去除 信号肽的基因克隆到毕赤酵母表达载体 pPICZα， 得到重组质粒 pPICZα-bglI， 转化毕赤 酵母诱导表达后酶活达到 4 U/mL（具体见实施例 1） 。
     2. 根据以下原则对黑曲霉 β- 葡萄糖苷酶基因 （bgl I） 序列进行人工进化 ： 1) 选 用在毕赤酵母中使用频率较高的密码子 ； 2) 由于毕赤酵母糖基化程度较低 , bgl I 基因中 的糖基化位点保持不变 ； 3) 为降低 mRNA 二级结构的最小自由能 (MFE), 在碱基编排过程中 去除了富含 GC 区和富含 AT 区域 ； 4) 使得 GC 含量接近毕赤酵母自身实际含量 ； 5) 提高翻译 终止效率。 在 DNAWorks 软件的辅助下， 以毕赤酵母密码子使用频率表为基准 , 以提高该基 因密码子使用频率为主要目的 , 采用高度或中度使用频率的密码子对 bgl I 的密码子进 行优化。并通过设计一组 98 条用于新基因合成的寡核苷酸， 运用 DNA 合成仪经过化学合成 获得这组寡核苷酸引物， 该组寡核苷酸引物在同一条链上是相邻的， 而与其互补的链有若 干碱基是重叠的， 重叠区域的解链温度控制在 60℃左右。用两步 PCR 法获得全新的黑曲霉 β- 葡萄糖苷酶基因 bgl II（具体见实施例 2） 。
     3. 为进一步提高降低制备 β- 葡萄糖苷酶的成本， 本研究优化了以基础盐工业培 养基为原料的发酵条件。结果表明， 在基础盐培养基的发酵培养时， 诱导表达 β- 葡萄糖苷 酶的适宜条件为 ： 初始 pH 值 6.0， 发酵温度 28-30℃， DO 值 （溶解氧） 在 30% 左右， 适时加入 PTM1 和组氨酸， 并加入甲醇诱导， 最终 β- 葡萄糖苷酶的活力达到 137 U/mL（具体见实施 例 3） 。
     有益效果 ： 通过对基因的定向改造和重组菌的高密度发酵， 改造后的黑曲霉 β- 葡萄 糖苷酶基因 bgl II 在毕赤酵母中的表达量较原始基因 bgl I 提高了 33.6 倍， 酶活达到 137 U/mL（图 -2） 。
     附图说明 图 1 为重组质粒 pPICZα-bglII ； 图 2 为 5 L 发酵罐的高密度发酵结果， △表示菌的浓度 （OD600） ， ○表示 β- 葡萄糖苷酶 的活性， ﹡表示蛋白浓度 ； 图 3 为重组酵母表达 β- 葡萄糖苷酶的蛋白电泳图， 1 ～ 7 泳道分别为 48h， 60h, 72h, 84h, 90h, 96h, 108h 发酵液样品 ； 第 8 泳道为 Mark。
     具体实施方式
     实施例 1 ： 黑曲霉 β- 葡萄糖苷酶基因的克隆及重组质粒 pPICZα-bglI 的构建和 表达 1.1 RNA 提取 （精编分子生物学实验指南 ( 第四版 ) 北京 : 科学出版社 , 2005） ： (1) 耗材处理 ： 所用的塑料耗材经 0.1% 的 DEPC 溶液 37℃浸泡处理。过夜后， 经 1.05 kg/cm3、 121℃条件下灭菌 30 min 以去除残余的 DEPC。研钵、 玻璃器皿在 200℃下干热法烘 8 h 以上灭活 RNA 酶。
     (2) 提 取 方 法 ： 采 用 Invitrogen Micro-to-midi Total RNA purification system， 具体方法如下 ： 用 1×PBS 洗涤新鲜的菌丝体 3 ～ 4 次， 抽干后用锡纸包好后放入液 氮中冷冻。
     (a) 用液氮预冷研钵。 取出冷冻好的黑曲霉菌丝体， 称好 200 mg 放入研钵中， 用研 杵研磨， 其间不断加入液氮直至研磨成粉状 （无明显可见颗粒， 如没有研磨彻底会影响 RNA 的收率和质量） 。
     (b) 向研钵中加入 500 μl RNA Lysis Solution， 将研磨成粉末状的样品完全覆 盖， 室温静置， 直至样品完全融化， 再继续研磨至裂解液呈透明状。
     (c) 把研磨好的液体转移到 1.5 mL 离心管中， 用 1mL 注射器反复吸取 3 ～ 4 次， 然后在 25℃、 12,000 rpm 的条件下离心 2 min， 将悬浮液转移至新的 1.5 mL 离心管。
     (d) 加入 70% 乙醇于样品中， 反复吸取 5 次混匀。
     (e) 将一半的匀浆液 （约 500 μL） 加入到 RNA Spin Cartridge， 在 25℃、 12,000 rpm 的条件下离心 15 s， 弃清液， 将剩余的样品加入同一根离心管中重复离心。
     (f) 加 700 μL Wash Buffer Ⅰ于 Cartridge 中， 在 25℃、 12,000 rpm 的条件下离 心 15 s， 弃清液和 Tube， 将 Spin Cartridge 装入一个干净的 RNA Wash Tube (2 mL)。
     (g) 在 Cartridge 中加入 500 μL Wash Buffer Ⅱ， 在 25℃、 12,000 rpm 的条件 下离心 15 s， 弃清液。
     (h) 重复步骤 (g) 一次， 再离心 1 min。
     (i) 从 Tbue 中取出 Cartridge， 装入一个 RNA Recovery Tube 中。(j) 添加 50 μL RNase-free water 到离心管的膜上， 静置 1 min， 在 25℃、 12,000 rpm 的条件下离心 2 min， 弃除 Cartridge。
     (k) 立即使用或于 -80℃冰箱保存。用紫外分光光度计测定 RNA 含量 A260/A280。
     1.2 引物设计 参照 Genebank 上已发表的黑曲霉 β- 葡萄糖苷酶基因序列 （登录号为 AJ132386） 设计 引物。 （引物 1 ： CCCGAATTCATGAGGTTCACTTTGATCG ； 引物 2 ： CCCAAGCTTTTAGTGAACAGTAGGCAG） 1.3 RT-PCR RT 反 应 体 系 为 10 μL， 含 有 MgCl2 2 μL， 10×RT Buffer1μL， RNase Free dH2O 3.75 μL， dNTP Mixture 1μL， RNase Inhibitor 0.25μL， AMV Reverse Transcriptase， 0.5μL， Oligo dT-Adaptor primer 0.5 μL，total RNA ≤ 500 ng。进行反转录条件为 ： 42℃ 20 min， 99℃ 5 min， 5℃ 5 min。
     PCR 反转录反应液 40μL。含有 5×PCR Buffer 10μL， dH2O 28.75 μL， TaKaRa EX Taq HS， 0.25 μL， 引物 1（10 µM） 0.5 μL， 引物 2（10 µM） 0.5 μL， 加入上述 RT 反 应液进行 PCR， 条件为 ： 94℃预变性 5 min， 94℃变性 30 s， 58℃退火 30 s， 72℃ 2.5 min， 30 个循环， 72℃延伸 10 min， 取 5 μL 反应产物电泳检测。
     反应结束后， PCR 反应产物采用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测， 回收与目的片断大小相 近的条带。1.4 TA 克隆 采用 TaKaRa 公司的 PMD-18T Vector。反应体系 10 μL， 其中 pMD-18T Vector DNA 1μL， Insert DNA 4μL， Solution Ⅰ 5 μL， 16℃反应过夜。转化大肠杆菌 JM109 的感受 态细胞， 并涂布在含 X-Gal、 IPTG、 Amp 的 LB 培养基上， 37℃培养， 观察菌落颜色进行平板筛 选， 挑选若干白色菌落至 5 mL LB 培养基 （含 Amp） 中， 37℃下培养 8 h， 提取重组质粒进行 测序验证， 得到含有原始基因 bgl I 的重组质粒 PMD-18T-bglI。
     1.5 重组质粒 pPICZα-bglI 的构建和表达 设 计 去 除 黑 曲 霉 β- 葡 萄 糖 苷 酶 基 因 信 号 肽 的 引 物 （引 物 3 ： CCCGAATTCGCTGATGAATTGGCCTACTCCC ； 引物 4 ： CCCCCGCGGTTAGTGAACAGTAGGCAGAGACGCC） ， 以 上述构建好的 pMD18-T-bgl I 质粒为模板进行 PCR 扩增， 使用 TaKaRa 公司的 Prime STAR HS DNA 聚合酶， 反应体系 50 μL。包含 PMD-18T-bglI 0.5 μL， 引物 3 （10 µM） 2μL， 引物 4（10 µM） 2μL，dNTP Mixture ( 各 2.5 mM) 4μL， 5×PCR Buffer 10μL， Prime STARHS 0.5μL， 加 ddH2O 至 50 μL。
     反应条件 : 94℃预变性 5 min， 94℃变性 30 s， 58℃退火 30 s， 72℃ 2.5 min， 30 个循环， 72℃延伸 10 min， 取 5 μL 反应产物电泳检测。
     将获得的目的基因和 pPICZα-A 分别用内切酶 Eco R I、 Sac II 进行分步酶切， 并 分别割胶回收， 浓缩后 16℃连接过夜。宿主菌使用 Top10F’ 的感受态细胞， 涂布在 LLB 平板 （含 25µg/mL Zeocin） , 倒置平板过夜， 挑选单菌落到 5 mL 液体 LLB（含 25µg/mL Zeocin） 中， 37℃， 200 rpm 培养 8 h。 提取重组质粒进行测序验证， 得到含有原始基因 bgl I 的重组质粒 pPICZα-bglI。使用 Pme I 对重组质粒 pPICZα-bglI 进行单酶切。电泳检测， 酶切 完全后， 纯化酶切产物， 用 10 μL ddH2O 重悬浓缩后的 DNA。
     取 80 μL 感受态毕赤酵母细胞与 10 μL 线性化的重组质粒 pPICZα-bglI 混合， 转入预冷的 0.2 cm 电转杯中。冰浴 5 min。根据所使用装置推荐的毕赤酵母参数进行电 击。电击结束后， 立即加入 1 mL 预冷的 1 M 山梨醇， 将内容物转移至灭菌离心管中。30℃ 水浴静置 1 ～ 2 h 后， 将 200 μL 转化后的细胞涂布在含 500 µg/mL Zeocin YPDS 平板上， 30℃倒置培养 2 ～ 4 d。
     挑取单菌落， 在 MMH 及 MDH 平板上按顺序点转化子。以 GS115/HIS+ Muts Ablumin 及 GS115/ HIS+ Mut+β-gal 为对照菌株。30℃培养 2 天。在 MDH 上生长正常而在 MMH 上生 长缓慢或不生长的转化子为阳性转化子。挑取阳性转化子。
     将阳性转化子接种到 YPD 平板上活化， 28℃培养 2 d， 接单菌落到 10 mL BMGY 液 体培养基中， 30℃ , 200 rpm 摇床培养 48 h， 当 OD600 达到 2 ～ 6 之间时， 离心， 弃上清， 用 无菌超纯水洗涤菌体 1 ～ 2 次。将用 BMMY 诱导培养基稀释菌体至 OD600=1， 用 4 层纱布代 替棉塞， 于 30℃， 250 rpm 摇床培养。定时取样 1 mL 菌液， 同时补加 1 mL BMMY、 0.5% (V/ V) 甲醇。样品于 12000 rpm 下离心 5 min， 取上清检测酶活， 酶活测定采用 pNPG （对硝基苯 酚 -β-D- 葡萄糖苷） 法测定 （Arch. Biochem. Biophys., 1964, 108: 22-29） 。
     实施例 2 ： 黑曲霉 β- 葡萄糖苷酶基因的定向改造及重组质粒 pPICZα-bglII 的构建 2.1 黑曲霉 β- 葡萄糖苷酶基因的定向改造 毕赤酵母表达系统是近年来发展很快的一个真核表达系统， 非常适合真核蛋白的表 达， 表现在其很强的真核蛋白质修饰功能上， 能对蛋白质进行翻译后正确的加工、 折叠和糖 基化修饰等。不同宿主间密码子使用频率的差异是影响基因在异源宿主中表达效率的主 要因素。与其他微生物一样， 毕赤酵母表达外源基因具有密码子偏好性。来源于黑曲霉的 β- 葡萄糖苷酶基因 bgl I 中存在有很多毕赤酵母利用率较低的稀有密码子， 从而使得 bgl I 不能获得更高效的表达。因此 , 为实现 bgl I 在毕赤酵母中的高效表达 , 在不改变氨 基酸序列的前提下， 本研究首先对 bgl I 进行了密码子优化 （生物工程学报， 2000, 16(3): 308-311） 。
     在 DNAWorks 软件的辅助下 （Nucleic Acids Res., 2002, 30(10): e43） ， 以毕赤 酵母密码子使用频率表为基准 , 以提高该基因密码子使用频率为主要目的 , 采用高度或 中度使用频率的密码子对 β- 葡萄糖苷酶基因 （bgl I） 的密码子进行优化。经优化后， bgl II 的密码子在毕赤酵母中的最适使用频率从 0.64 增加到 0.84。高频密码子使用率在 60% 以上。平均 GC 含量从 56.49% 下降至 44.61%， 与酵母自身 GC 含量相近。
     通过对 mRNA 二级结构进行分析， 对位于基因 1294 bp 和 1478 bp 处的基因进行 优化， 避免了由于出现回文序列而导致翻译提前终止的可能。同时对 β- 葡萄糖苷酶基因 （bgl I） 中出现的重复序列进行了优化， 破坏影响核糖体结合和 mRNA 稳定的茎环结构。并 以来源于黑曲霉的 β- 葡萄糖苷酶基因 （bgl I） 序列为基础， 使用 DNAMAN 软件， 设计了一 组 98 条寡核苷酸， 运用 DNA 合成仪经过化学合成获得这组寡核苷酸。
     人工进化的黑曲霉 β- 葡萄糖苷酶基因 bgl II 的获得采取两步 PCR 扩增技 术。第一步， 反应体系 50 μL ： 5 μL 的全部 98 条寡核苷酸引物 （100 nM） ， 4 μL dNTPMixture( 各 2.5 mmol/L)， 5μL 10 × PCR Buffer， 2.5 U Ex Taq， 加水补足 50μL， 反应条 件为 ： 94℃预变性 5 min， 94℃变性 30 s， 59℃退火 3 min， 72℃ 1 min， 30 个循环， 72℃延伸 10 min ； 第二步， PCR 扩增基因 bgl II， 反应体系 50ul ： 包含上面的反应物 2 μL， 引物 SEQ ID NO.2， 10 µM 1μL， 引物 SEQ ID NO.99， 10 µM 1 μL， dNTP Mixture ( 各 2.5 mM)4μL， 5×PCR Buffer10μL， 2.5 U Ex Taq， 加水补足 50μL， 反应条件为 : 94℃预变性 5 min， 94℃变性 30 s， 59℃退火 30 s， 72℃ 3 min， 30 个循环， 72℃延伸 10 min， 取 5 μL 反应产 物电泳检测。
     2.2 重组质粒 pPICZα-bglII 的构建 将获得的改造后的基因 bgl II 和 pPICZα-A 分别用内切酶 Eco R I、 Sac II 进行分步 酶切， 并分别割胶回收， 浓缩后 16℃连接过夜。宿主菌使用 Top10F’ 的感受态细胞， 涂布在 LLB 平板 （含 25 µg/mL Zeocin） , 倒置平板过夜， 挑选单菌落到 5 mL 液体 LLB（含 25 µg/ mL Zeocin） 中， 37℃， 200 r/min 培养 8 h。提取重组质粒进行测序验证， 得到含有优化后 的基因 bgl II 的重组质粒 pPICZα-bglII（图 -1） 。
     实施例 3 ： 重组质粒 pPICZα-bglII 转化毕赤酵母及重组酶的制备 3.1 表达载体的酶切线性化及其质粒的回收 将 鉴 定 正 确 的 阳 性 转 化 子 大 量 培 养， 采用大提质粒的方法提取重组质粒 pPICZα-bglII。使用 Pme I 对重组质粒 pPICZα-bglII 进行单酶切。电泳检测， 酶切完全 后， 纯化酶切产物， 用 10 μL ddH2O 重悬浓缩后的 DNA。
     3.2 毕赤酵母的电击转化 将毕赤酵母菌株 GSl15 活化后， 接种到 500 mL YPD 培养基中， 30℃培养至 OD600 为 1.3 ～ 1.5。4℃， 1500 rpm 条件下离心 5 min， 收集细胞， 分别用 500 mL、 250 mL 预冷的灭菌水洗 涤细胞。4℃， 1500 rpm 条件下离心， 用 20 mL 预冷的 1 M 山梨醇悬浮、 洗涤细胞。最后用 1 mL 预冷的 1 M 山梨醇悬浮细胞， 至终体积约 1.5 mL。取 80 μL 上述细胞与 10 μL 线性 化的重组质粒 pPICZα-bglII 混合， 转入预冷的 0.2 cm 电转杯中。冰浴 5 min。根据所使 用装置推荐的毕赤酵母参数进行电击。 电击结束后， 立即加入 1mL 预冷的 1 M 山梨醇， 将内 容物转移至灭菌离心管中。30℃水浴静置 1 ～ 2 h 后， 将 200 μL 转化后的细胞涂布在含 500 µg/mL Zeocin YPDS 平板上， 30℃倒置培养 2 ～ 4 d。
     3.3 重组毕赤酵母的筛选和鉴定 挑取单菌落， 在 MMH 及 MDH 平板上按顺序点转化子。以 GS115/HIS+ Muts Ablumin 及 GS115/ HIS+ Mut+β-gal 为对照菌株。30℃培养 2 天。在 MDH 上生长正常而在 MMH 上生长 缓慢或不生长的转化子为阳性转化子。挑取阳性转化子。
     3.4 重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达 将阳性转化子接种到 YPD 平板上活化， 28℃培养 2 d， 接单菌落到 10 mL BMGY 液体培养 基中， 30℃ , 200 r/min 摇床培养 48h， 当 OD600 达到 2 ～ 6 之间时， 离心， 弃上清， 用无菌超纯水洗涤菌体 1 ～ 2 次。将用 BMMY 诱导培养基稀释菌体至 OD600=1， 用 4 层纱布代替棉塞， 于 30℃ ,250 r/min 摇床培养。定时取样 1 mL 菌液， 同时补加 1 mL BMMY、 0.5% (V/V) 甲 醇。样品于 12000 rpm 下离心 5 min， 取上清贮存于 4℃用于检测酶活。
     3.5 重组毕赤酵母的高密度发酵 发酵培养基 （FM21） （85％ wt） ： H3PO4 26.7 mL， CaSO4·2H2O 0.93 g， K2SO4 18.2 g， MgSO4·7H2O 14.9 g， KOH 4.13 g， Glycerol 50 mL， 100 mM K2PO4-KH2PO4 缓冲液 100 mL， 加 入超纯水至 1L。
     PTM1 微量元素 ： CuSO4·5H2O 6.0 g， NaI 0.08 g， MnSO4·H2O 3.0 g， NaMoO4·2H2O 0.2g， H3BO3 0.02 g， CoCl2 0.5 g， ZnCl2 20.0 g， FeSO4·7H2O 65.0 g， H2SO4 5.0mL， 加入超 纯水至 1L， 用 0.22μm 的滤膜过滤除菌。
     3.5.1 种子培养 1） 将重组毕赤酵母在 YPD 琼脂板上 28℃划线培养。
     2） 至菌落长到 2 mm 左右， 挑取单克隆菌落加入到 10 mL YPD 培养液 （种子培养基） 中， 28℃， 190 rpm 震荡培养 16 ～ 24 h。 3） 将上述培养物加入到 300 mL BMGY 培养液中， 28℃， 190 rpm 震荡培养 24h 左 右， OD600 ≈ 7。
     3.5.2 生物量的累积 1） 调校设备 ： 校准发酵罐的 pH 计、 溶氧计 （在 28℃时进行） ， 并进行蠕动泵的流量校 准。
     2） 配制 2.5 L FM21 培养基， 加入 5L 发酵罐， 121℃， 30 min 高压灭菌培养基、 发酵 罐及管道。
     3） 待发酵罐内培养基冷却到室温时， 用 28% 的氨水调节 FM21 培养基的 pH 值为 6.0， 而后加入 0.8%(V/V) PTM1 微量元素。
     4） 将上述 300 mL BMGY 培养菌种加入发酵罐， 开始发酵罐培养， 此为第一阶段， 即甘油培养扩增菌体。
     5） 此阶段每隔 6 h 取样 1 次， 测 OD600 和细胞湿重， 分析酵母菌生长状态， 肉眼和 镜下观察菌液， 排除杂菌污染， 并留上清用于蛋白及酶活分析。
     6） 约 18 h 后 DO 值上升至接近 100%， 说明培养基中甘油已消耗殆尽， 转入补充甘 油阶段以进一步增加菌体密度。
     7） 在高压灭菌后的 50% 甘油中加入 1.2% (V/V) PTM1 微量元素， 混匀后， 以 18.2 mL/h/L 初始发酵液即 546 mL/h 的速率加入到发酵罐中， 至菌体湿重达 180 ～ 220 g/L。
     在接种 20 小时左右， 向发酵液中加入组氨酸， 至终浓度为 0.1%。
     8） 此阶段适时调整发酵罐的搅拌速度， 维持 DO 值 （溶解氧） 在 30% 以上 ； 自动调控 温度、 pH 是其值分别为 28℃、 6.0。
     9） 停止补加甘油后， 观测 DO 值上升至接近 100% 后， 继续维持 “甘油饥饿” 状态 30min， 转入甲醇诱导表达阶段。
     3.5.3 甲醇诱导 β- 葡萄糖苷酶的合成
     1） 在甲醇中加入 1.2% PTM1 微量元素， 混匀后， 以 3.6 mL/h/L 初始发酵液即 108 mL/h 的速率加入到发酵罐中诱导表达， 维持此低速率 2 ～ 3 h， 以使酵母适应以甲醇为唯一碳源 的环境。
     2） 在首次流加甲醇的同时， 向发酵液中加入组氨酸， 至终浓度为 0.1%。
     3） 当酵母适应以甲醇为唯一碳源的环境后， DO 值即保持稳定， 继续维持此低速率 补加甲醇 1h。补加甲醇的速率升为 7.2 mL/h/L 初始发酵液即 216 mL/h， 以此速率维持 2 h。
     4） 升高补加甲醇的速率为 11mL/h/L 初始发酵液即 330 mL/h， 同时监测 DO 值和发 酵液温度并判断甲醇是否过量 （停补甲醇观测 DO 值变化， 若停补甲醇后， DO 值在 1min 内 上升幅度大于 10%， 说明碳源受限， 反之说明甲醇过量） ， 若碳源受限， 则加快补甲醇的速率， 若甲醇过量则应调慢补甲醇的速率， 直到合适的速度。
     5） 开始诱导表达后， 每隔 6 h 取样 1 次， 测 OD600 和细胞湿重， 分析酵母菌生长状 态， 并留上清用于蛋白分析 （图 3） 。
     6） 此阶段适时调整发酵罐的搅拌速度， 维持 DO 值 （溶解氧） 在 30% 以上 ； 自动调控 温度、 pH 使其值分别为 30℃、 5.0。 7）当发现酶活和目的蛋白量维持稳定， 即结束发酵， 最终酶活达到 137 U/mL （图 -2） 。
     11102399803 A CN 102399802序列表1/20 页SEQUENCE LISTING <110> 改进的 β- 葡萄糖苷酶基因及其重组酶的制备 <120> 改进的 β- 葡萄糖苷酶基因及其重组酶的制备 <130> <160> 103 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 2529 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 1 gcagatgagt tggcttattc accaccttac tatccttcac cttgggcaaa cggacaggga gattgggcac aggcttatca gagagcagtt gacattgtct cacaaatgac attggatgaa aaggtcaatc ttactacagg aaccggttgg gaattggagc tttgtgttgg tcagactggt ggagttccaa gatagtgact aatttggctt attcaattgg gaaggttttt atccaagatg tttagacagg aatttggatg gcaggagctg aattcttaca tccgactggg atgccaggag tccgttctta gctgcctact acaagagatg aaccagtatg tcaactgttt gcacttattg ggttgcgata ttggttactc accgctactg tcattggttt ggagatagaa agtaattgta gattgggtgt acaattctgc atcttcgtgg gaccagcagc ccccagatcc ccggagttgt ccccagaagc acaagactat gtgccgttat ctttgaacaa ccgcacatca atgttgacta acggtactgt ataaagttgg aatacggtta ttaatgtcca tgcttaagaa gagaggatgc acggaacttt ctgaacaggc acaattgggc ttgtcaacgc gaaacttgac acaataccat ccctggaatg atttcctgct taaagccatg tggtcctctt tgccttgtca cgccaccgca 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