两个棉花纤维发育起始优势表达的强启动子及其应用 技术领域 本发明属于植物基因工程技术领域。 具体涉及两个棉纤维发育起始时期胚珠及纤 维高效、 优势表达启动子， 含有该启动子的植物表达载体与转化子， 还涉及该启动子在棉花 基因工程中的应用 ： 包括改良棉花纤维品质， 改良种子中棉酚、 蛋白质、 油分等不同物质的 积累等各个方面。
背景技术
棉花因为其纤维是重要的纺织工业原材料而成为世界性重要的经济作物之一。 此 外， 棉籽富含蛋白质与油分， 是价值极高的饲料与食用油来源。 由于成熟棉花纤维是长度可 达到 6cm 单细胞， 并且纤维素含量高达 80％， 因而是细胞快速伸长研究的模式材料， 也是细 胞壁合成以及纤维素积累方向研究的重要材料。
启动子是决定目的基因表达模式重要的顺式作用元件之一。 基因转录之前， RNA 聚 合酶首先该基因的启动子区结合。 通过启动子上的顺式作用元件协同反式作用因子的相互 作用来共同控制基因的表达， 以对细胞内外的信号及时做出反应， 决定基因表达的时间、 部 位和表达丰度。
通过基因工程手段对农作物进行遗传改良， 就需要外源基因在受体内以高度受控 的方式表达， 也就是能控制外源基因在目标组织的特定发育时期表达。诱导型或者组织器 官特异表达启动子可以满足这个要求， 它们能控制外源基因以适当的方式表达并最终产生 期望的表型。
在改良棉纤维的遗传工程中， 让外源基因在棉花纤维细胞特异表达有很多优点 ： 首先， 外源基因的特异表达是保存受体植株能量的一种有效方式， 并且可以达到高水平地 表达 ； 其次， 可以避免基因在非纤维组织表达可能导致的负面影响。 最后通过调控外源基因 在纤维细胞的表达时间以及表达水平可以控制外源基因表达对纤维特性的影响。
国内外各单位在棉花基因功能研究的同时也报道了一些组织特异性启动子的分 离、 鉴定与应用的情况。其中最为成功的范例之一当为 Sunilkumar 等用分离得到的未成熟 种子特异表达的 alpha-globulin 启动子 (Cotton alpha-globulin promoter ： isolation and functional characterization in transgenic cotton， Arabidopsis， andtobacco. Transgenic Research， 2002， 11 ： 347-359)。后来， 他们用这一启动子构建了 RNAi 载体以 特异降低棉籽中棉酚合成的关键酶并最终减少了棉籽中棉酚的含量而不影响其余组织， 这 使得棉籽蛋白的安全、 充分利用成为可能 (Engineering cottonseed for use in human nutrition by tissue-specific reduction oftoxic gossypol.Proc NatlAcadSci USA， 2002， 103(48) ： 18054-18059)。
此 外， 还 获 得 了 棉 花 纤 维 特 异 或 优 势 表 达 的 E6、 GhTUB1、 GhACT1、 GhTUA9、 GhFSltp4 等基因的启动子， 但是几乎都是在纤维发育的第二阶段即伸长期优势表达 (Gene expression in cotton(Gossypiumhirsutum L.)fiber ： cloning of the mRNAs. Proc Natl Acad Sci USA， 1992， 89(13) ： 5769-5673， Molecularcharacterization of thecotton GhTUB 1gene that is preferentially expressed in fiber.Plant Physiol.， 2002， 130(2) ： 666-674， The cotton ACTIN 1gene is functionally expressed in fibers and participates in fiber elongation.PlantCell， 2005， 17(3) ： 859-875， Molecular characterization of cotton GhTUA9gene specifically expressed in fibre andinvolved in cell elongation.J Exp Bot， 2007， 58(12) ： 3227-3238， The fiber specificity of the cotton FSltp4 genepromoter is regulated by an AT-rich promoter region and the AT-hook transcription factor GhATl.Plant CellPhysiol， 2007， 48(10) ： 1426-1437)。2009 年 还 分 离 得 到 了 维 管 组 织 特 异 表 达 且 受 生 长 素 诱 导 的 GhCesA4 基因启动子 (Functional analysis of a cotton cellulose synthase A4 gene promoter in transgenic tobacco plants.PlantCell Reports， 2009， 28(10) ： 1539-1548)。 目前较为缺乏的是在纤维发育起始阶段即开花前 3 天到开花后 2 天 (-3DPA ～ 2DPA) 高效表达的启动子， 用这样的启动子驱动纤维发育后期表达基因的异位表达也是基 因工程改良途径之一。
本 发 明 所 述 启 动 子 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2 是 根 据 GbPDF1 基 因 的 cDNA 序 列 ( 来 源 于 本 室 所 构 建 的 海 岛 棉 -2 ～ 25DPA 纤 维 cDNA 平 衡 化 文 库， Genes expression analyses of sea-island cotton(Gossypiumbarbadense L.)fiber development.Plant CellReports， 2007， 26 ： 1309-1320) 向 5’ 方向扩增得到的。这两个启动子驱动目的基因在 胚珠及纤维中优势表达， 开花前的胚珠中即可检测得到， 且开花当天在胚珠中的表达量就 高于组成型启动子 CaMV35S， 是纤维及棉籽内含物改良的有用生物学元件。 发明内容
本发明的目的在于克服现有棉纤维发育起始阶段启动子的不足， 在海岛棉 3-79 开花前 2 天到开花后 25 天 (-2 ～ 25DPA) 纤维 cDNA 平衡化文库的基础上鉴定出具有棉纤 维起始期优势高效表达的启动子 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2， 并将这些启动子应用到棉花的 基因工程改良， 以最终改良棉花纤维品质或者改良种子中棉酚、 蛋白质、 油分等不同物质的 积累等。
本发明通过下列技术方案实现 ：
申请人通过基因克隆方法， 从海岛棉中克隆得到两个棉花纤维发育起始优势表达 的强启动子 PGbPDF1-1 和 PGbPDF1-2， 其核苷酸序列分别如序列表 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2 所示。
上述启动子 PGbPDF1-1 和 PGbPDF1-2 的核苷酸序列包括上述启动子序列的全部或 部分序列。所述的部分序列是指大于或等于所述启动子起始密码子上游 236bp 的序列， 其 中启动子 PGbPDF1-1 的 236bp 序列位于序列表 SEQ ID NO ： 1 所示序列的 1444-1679bp 处 ； 启动子 PGbPDF1-2 的 236bp 序列位于序列表 SEQ ID NO ： 2 所示序列的 1116-1351bp 处。
与此同时， 申请人获得两种棉花纤维发育起始优势表达的强启动子 PGbPDF1-1、 PGbPDF1-2 的表达载体 pGWB407-PGbPDF1-1 和 pGWB407-PGbPDF1-2， 其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2 所示。
含有本发明启动子的表达盒、 重组载体、 转基因细胞系和重组菌的制备方法也属 于本发明的保护范围。所述表达盒从上游至下游依次为本发明的启动子、 目的基因和转录终止子， 如图 7所示。
所述植物表达载体具体为包含有如图 7 所示表达盒的表达载体或将其它元件替 换但包含 PGbPDF1-1 或 PGbPDF1-2 的全长或部分启动子的表达载体。附图说明
序列表 SEQ ID NO ： 1 是本发明克隆的启动子 PGbPDF1-1 的核苷酸序列。
序列表 SEQ ID NO ： 2 是本发明克隆的启动子 PGbPDF1-2 的核苷酸序列。
图1： 是 PGbPDF1-1 或 PGbPDF1-2 启动子克隆和验证的技术路线。
图2： 是 GbPDF1 实时定量 PCR 的表达分析。分析表明该基因在纤维起始和伸长早 期表达， 5DPA( 开花后 5 天 ) 是其表达高峰。-1、 0、 3、 5、 10、 15、 20、 25、 根、 叶表示开花前 1 天 的胚珠、 开花当天胚珠、 开花后 3 天胚珠、 开花后 5 天胚珠及纤维、 开花后 10 天纤维、 开花后 15 天纤维、 开花后 20 天纤维、 开花后 25 天纤维、 根和叶的 RNA 为模板。
图3： 是 PGbPDF1-1 启动子驱动 GUS 基因在棉花中的表达情况， PGbPDF1-1 启动 子驱动 GUS 在棉花起始期的胚珠纤维中优势表达， 在花药花丝及刚萌发的胚中也检测到表 达。 第一、 二排分别为 GUS 在 -1、 0、 1、 2、 5、 10、 15、 20、 25DPA 胚珠及纤维中的表达情况， 第三、 四排是其在其他组织中的表达情况。 图4 ： 是 PGbPDF1-1 启动子在纤维发育不同时期 GUS 定量结果， 表明 GUS 在 0DPA 的 胚珠蛋白量最高。 X 轴表示纤维发育的不同时期， 分别为 0DPA、 3DPA 的胚珠， 5、 10、 15、 20DPA 的纤维。
图5： 是 PGbPDF1-2 启动子驱动 GUS 基因在棉花表达情况， 表达模式与 PGbPDF1-1 一致。第一排分别为 GUS 在 0、 、 5、 30DPA 胚珠及纤维中的表达情况， 第二排是其在其他组织 中的表达情况。
图6 ： 是 PGbPDF1-2 不同截短区段的启动子驱动能力分析。 结果表明起始密码子上 游 236bp 就具备了驱动 GUS 在纤维 / 胚珠优势表达的能力， 但驱动能力较弱。 起始密码子上 游 390bp 的区段具备了较强的驱动能力， 但在纤维伸长中后期的驱动能力高于 PGbPDF1-1 和 PGbPDF1-2 这两个区段的驱动能力。 表明起始密码子上游 236bp 为该启动子的核心序列。 A 为启动子 PGbPDF1-2 的截短策略 ； B 为不同截短区段转基因棉花 GUS 染色结果 ； C 为不同 截短区段的 GUS 定量结果， 0、 3、 5DPA 为带纤维的胚珠， 10、 15DPA 为纤维。
图7： 是用启动子 PGbPDF1-1/2 构建的驱动下游基因超表达载体示意图。图中 PGbPDF1-1/2 表示本发明所述的启动子 ； ORF 为目的基因 ； Terminator 表示转录终止子。
图8： 是本发明克隆的启动子 PGbPDF1-1 的核苷酸的全序列， 其中下划线部分是启 动子的核心序列， 片段长度为 236bp。
图9： 是本发明克隆的启动子 PGbPDF1-2 的核苷酸的全序列， 其中下划线部分是启 动子的核心序列， 片段长度为 236bp。
具体实施方式
实施例 1 ： 启动子 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2 的克隆
本发明的启动子 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2 的克隆是基于基因 GbPDF1( 登录号为DQ912946)， 该基因是海岛棉纤维起始和伸长早期特异 / 优势表达基因 ( 图 2)。 在这个基因 序列基础上申请人采用 GenomeWalking 方法克隆了本发明的两个启动子。所述启动子的制 备方法参照 GenomeWalkerTM Universal Kit(Protocol No.PT3042-2， 购自 Clontech 公司， 美国 ) 操作手册， 根据 GbPDF1 基因的 cDNA 序列设计了两条反向的基因特异巢式 PCR 引物 PDF1-GSP1、 PDF1-GSP2( 序列见下所述 ) 分别与所用试剂盒中的的接头引物 AP1、 AP2 组合 进行 PCR 扩增。
将 PCR 扩增片段通过凝胶回收试剂盒 (QIAquickGelExtractionKit， 购自 Qiagen 公司， 德国 ) 及说明书介绍的的方法纯化以后连接到 pMD-18T 载体 ( 购自宝生物工程大连 有限公司 ) 上并进行测序。将所有片段的测序结果去载体以后通过 BLAST 等在线工具的拼 接及比对以后得到两条长度分别为 1679bp 和 1351bp 的启动子 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2。 Clustal_X 比对发现 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2 在距 GbPDF1 基因翻译起始位点 ATG 上游约 390bp 的序列几乎完全一致。详细序列见序列表 1 和序列表 2。
通过 NNPP 及 TSSP 预测发现所述序列具备植物启动子的结构， 而 PLACE 分析发现 了譬如 L1BOX， HDZIP2ATATHB2， BIHD1OS BOX 等在发育过程中可能起重要作用的顺式元件及 对激素和光照等环境起响应的元件。
以上所述所用引物为 ：
PDF1-GSP1 ： CAAAACCCACATCAACAAACAAACCTG
PDF1-GSP2 ： CTTCTTTGCCTCTCCATCTCTGTATGCTAT
以上所述在线工具详细网站及文献如下 ：
BLAST ： http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi， Clustal_X ： http://www. clustal.org/，
Thompson JD， Gibson TJ， Plewniak F， Jeanmougin F， Higgins DG(1997)， The CLUSTAL X windowsinterface ： flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools， Nucleic AcidsResearch.25(24) ： 4876-82
NNPP ： http://www.fruitfiy.org/seq_tools/promoter.htmL
Reese MG(2001)， Application of a time-delay neural network to promoter annotation in the Drosophilamelanogaster genome， Computers & Chemistry.26(1) ： 51-56 ；
TSSP ： http://www.softberry.com/berry.phtmL ？ topic ＝ tssp&group ＝ programs&subgroup ＝ promoter&advanced ＝ on ；
Shahmuradov IA ， Solovyev VV ， Gammolerman AJ(2005) ， Plant promoter prediction with confidenceestimation.NucleicAcids Research.33(3) ： 1069-1076 ；
PLACE ： http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.htmL，
K.Higo ， Y.Ugawa ， M.Iwamoto and T.Korenaga(1999).Plant cis-acting regulatory DNA elements(PLACE)database ： 1999.NucleicAcids Research.27(1) ： 297-300.
实施例 2 ： 启动子 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2 驱动报告基因的表达载体构建
用高保真 DNA 聚合酶分别以引物对 PGbPDF1-1-F 与 pBI121-R 及 PGbPDF1-2-F 与 pBI121-R 扩增得到两端分别带有 Hind III 和 XbaI( 购自 New England Biolabs 公司， 美国 ) 酶切位点启动子片段， 经双酶切消化、 回收纯化以后通过 DNA 连接酶 ( 购自 Promega 公 司， 美国 ) 连接到经过相同双酶切消化回收的载体 pBI121( 购自 Clontech 公司， 美国 ) 骨 架上以替代原有 CaMV35S 启动子从而得到驱动报告基因 GUS 的表达载体 PGbPDF1-1::GUS 和 PGbPDF1-2::GUS。
所用引物序列如下， 下划线所示为酶切位点识别序列 ：
PGbPDF1-1-F ： AGAGAAGCTTCATATAAAAGTTTAGGGGATTGGAG
PGbPDF1-2-F ： TACGAAGCTTTGTACAGTCGTAA
pBI121-R ： ACATCTAGACTCTGTATGCTATAGATATTACTACTTCAA
实施例 3 ： 启动子表达载体 PGbPDF1-1::GUS 及 PGbPDF1-2::GUS 转化棉花
将验证无误的实施例 2 中所构建的 2 个载体的质粒 DNA 通过电击转化法转入 到 农 杆 菌 菌 株 LBA4404(Octopine Ti-plasmid deletion mutants of Agrobacterium tumefaciens with emphasis on the right side of theT-region， Plasmid， 1982， 7： 15-29) 中。本发明中所涉及的棉花转基因采用的方法为农杆菌介导的遗传转化法， 所采用 的农杆菌菌株为 LBA4404， 转化受体材料为 YZ-1(Jin( 金双侠 ) 等的文献 (Identification of anovelelite genotype for in vitro culture and genetic transformation of cotton.Biologia Plantarum， 2006， 50 ： 519-524)。 转化方法和程序参照 Jin 等建立的高效 转化体系 (Identication of a novel elite genotype forin vitro culture andgenetic transformation of cotton.Biologia Plantarum， 2006， 50 ： 519-524 ； An efficient grafting system fortransgenic plant recovery in cotton(Gossypium hirsutum L.).Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2006， 85 ： 181-185 ； Factors affecting stable transformation and plant regeneration during transforming embryogenic callusof Upland cotton(Gossypium hirsutum L.)via Agrobacterium tumefaciens， Plant Cell， Tissueand Organ Culture， 2005， 81 ： 229-237)， 并作了相应的调整和修改， 具 体方法和流程如下 ：
1、 无菌苗的培养
将棉籽壳去掉， 用 0.1/100 的升汞灭菌十分钟， 无菌水冲洗三遍， 接种于无菌苗培 养基中配方如下 ： 1/2MS 大量元素 + 葡萄糖 15g/L+phytagel( 购自 Sigma 公司， 美国 )2.5g/ L， 三至六天暗培养。
2. 农杆菌的活化和保存
2.1 准备 ：
农杆菌 LBA4404， 含卡那霉素 50mg/L 的 MGL 液体培养基 ( 胰化蛋白胨 5g/L， 氯化钠 5g/L， MgSO4.7H2O 0.1g/L， KH2PO40.25g/L， 甘露醇 5g/L， 甘氨酸 1.0g/L， pH 值 7.0)， 无菌三 角瓶， LB( 固、 液 ) 培养基 ( 含卡那霉素 50mg/L)， 灭菌甘油， 无菌枪头， 无菌 1.5mL 离心管。
2.2 操作 ：
2.2.1 活化， 悬浮 ：
超低温冰箱内取出保存菌株的甘油管在冰上融化， LB 平皿上划线， 26.5 ℃暗培 养 36-48h， 待皿内长出清晰的单菌落， 挑取单菌落在另外的 LB 平皿划线， 26.5 ℃暗培养 36-48h， 待皿内长出足够的菌落结束培养， 把培养基表面菌落刮入三角瓶内的 MGL 培养基 中， 27℃、 200rpm 摇 2h， OD 值在 0.5-1.5 之间即可用于浸染。2.2.2 菌株的保存 ：
从培养皿内挑取单菌落接于 LB 液体培养基中 150rpm、 26℃摇 48h， 按菌液和甘油 1 ∶ 1 加入 1.5mL 离心管混匀， -70℃保存。
3. 浸染， 共培养 ：
3.1 准备 ：
暗培养 5 天左右幼嫩健壮的 YZ-1 幼苗， 经活化农杆菌， 无菌培养皿， 无菌滤纸。
3.2 操作 ：
无菌条件下将 YZ-1 幼苗下胚轴用锋利的刀片切成 0.5-1cm 长的切段， 转入到经活 化的菌液中， 搅匀， 静置 5-10 分钟， 倒掉菌液， 滤纸吸干残余菌液， 吹 5 分钟使表面稍为干 燥， 分散布于垫有滤纸的共培养培养基中， 19-21℃暗培养 38-42h。
4. 愈伤组织的诱导
将侵染共培养后的下胚轴切段接种于诱导培养基上配方如下 ： MS 无机盐 +B5 有机 物 +2， 4-D 0.1mg/L+KT0.1mg/L+ 葡萄糖 30g/L+phytagel 2.5g/L， pH5.8。
5、 非胚性愈伤组织的增殖
MS 无机盐 ( 硝酸钾加倍， 硝酸铵减半 )+B5 有机物 +2， 4-D 0.05mg/L+KT0.1mg/L+ 葡萄糖 30g/L+phytagel2.5g/L， pH5.8。 6、 愈伤组织的分化
愈伤组织经继代 ( 一个月继代一次 ) 几次后， 有的愈伤组织转成米粒状颗粒， 将其 转入分化培养基 (MS+B5 有机物 +KT0.15mg/L+IBA0.5mg/L+ 葡萄糖 30g/L+phytagel 2.5g/ L， pH5.8) 中， 进一步分化成胚状体。
7、 胚性愈伤组织的继代
MS 无 机 盐 ( 硝 酸 钾 加 倍， 硝 酸 铵 减 半 )+B5 有 机 物 +KT0.15mg/L+IBA0.5mg/ L+Gln( 谷 胺 酰 胺 )1.0mg/L+Asn( 天 冬 酰 胺 )0.5mg/L+ 葡 萄 糖 30g/L+phytagel( 购 自 Sigma-Aldrich 公司， 美国 )2.5g/L， pH5.8。
8、 成苗生根培养
将分化出的小苗继代到 1/2MS 培养基中成苗生长 (1/2MS 无机盐 +B5 有机物 + 葡 萄糖 15g/L+phytagel2.5g/L， pH5.8)。
9、 炼苗移栽
将生根良好的小苗揭开三角瓶封口膜， 炼苗 2-3 天， 然后移栽到小土钵中， 遮荫缓 苗一周左右移栽大田。
附： MS 培养基母液配制 ：
1. 配制大量元素时各种药品分别称量， 分别充分溶解， 逐一加到容量瓶中， 一定要 最后加入 CaCl2 否则容易产生沉淀， 定容到一升。
2. 配制微量元素时几种极微量药品先可以配成一级母液 ( 浓缩 10000 倍 )， 再稀 释成二级母液 ( 浓缩 100 倍 )， 母液配制完毕后放置于室温下 10h 以上， 看是否有沉淀产生， 然后才能使用。
3. 配制铁盐时， 两种盐用热水分别溶解， 然后混合， 放置于室温下 10h 以上看是否 有沉淀产生， 然后才能使用。
4. 各种生长激素一般可以用 1mol/L 的 NaOH 或 HCl 溶解后， 再定容。
5. 配制 B5 有机物时要用无菌水来配制， 一次不要配太大体积， 及时用完以防污染 6. 各种母液配制好后应存放在 4℃冰箱中， 发现有沉淀后， 不得使用。 大量元素 (20 倍 ) 母液 (g/L) KNO3 38 NH3NO3 33 MgSO4·7H2O( 无水 MgSO4) 7.4(3.8) KH2PO4 3.4 CaCl2·2H2O( 无水 CaCl2) 8.8(6.6) 微量元素 (100 倍 ) 母液 (g/L) CoCl2·6H2O 0.0025 CuSO4·5H2O 0.0025 H3BO3 0.62 KI 0.083 MnSO4·4H2O 2.23 NaMO4·2H2O 0.025ZnSO4·7H2O 0.86
铁盐 (100 倍 ) 母液 (g/L)
FeSO4·7H2O 2.78
Na2EDTA 3.73
B5 有机物
VB1( 硫胺素 ) 10mg/L
VB5( 盐酸吡哆醇 ) 1mg/L
VB6( 烟酸 ) 1mg/L
肌醇 100mg/L
甘氨酸 2mg/L
转化植株通过 PCR 检测， 阳性植株通过自交保存收种， 取不同组织用于 GUS 染色与 定量分析。
实施例 4 ： 启动子 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2 表达特性
将 转 基 因 植 株 的 不 同 组 织 材 料 取 下 以 后， 迅 速 用 预 冷 的 80 ％ 丙 酮 进 行 固 定 30min， 在移除丙酮后用预冷的 ddH2O 冲洗后转移到含有反应底物 X-Gluc 的染色液中于 37℃培养箱中放置 8-16h 至完全显色， 随后在 42℃条件下加入 75％酒精使样品充分脱色， 最后用 FAA 组织固定液 (100mL 配方为 ： 90mL 70％乙醇、 5mL 冰醋酸、 5mL 甲醛 ) 材料固定。 体式显微镜 (Leika MZFLIII) 观察并照相。染色液的配方如下 ：
0.9g/LX-gluc， 50mmol pH 为 7.0 的磷酸钾缓冲液， 20％ (v/v) 甲醇和 100mg/L 氯 霉素。
组织总蛋白提取及定量分析参见 Jefferson R.A. 所述方法 (Assaying chimeric genes in plant ： the GUS genefusion system.PlantMolecular Biology Reporter.1987， 5： 387-405)。定量分析用 Tecan Infinite M200 型多功能酶标仪 ( 购自 Tecan 公司， 奥地 利 ) 进行测量。定量分析每次至少 3 次重复， 数据处理及分析用 MicrosoftExcel 程序。通过对 GUS 蛋白的定性及定量分析， 得出如下结论 ：
PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2 这两个启动子主要在棉花的胚珠及纤维发育过程中 优势表达 ： 从 -1DPA ～ 30DPA 的胚珠及纤维中都能检测得到， 在花药及胚中也有表达， 且 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2( 图 5) 这两个启动子在表达模式上几乎没有差别。
在表达丰度上 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2 这两个启动子存在一定的差异。以开花当 天样本为例， 在胚珠中启动子 PGbPDF1-2 表达能力更强 ( 图 6C)。
实施例 5 ： 启动子 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2 核心启动子序列确定
根据顺式作用元件预测结果将 PGbPDF1-1 从 5’端截短 ( 图 6A)， 将不同截短 区 段 的 启 动 子 序 列 与 GUS 融 合 构 建 植 物 表 达 载 体 ( 载 体 构 建 程 序 同 于 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2)， 转化转基因棉花， 取样进行 GUS 染色组织化学定位及 GUS 定量分析 ( 程序同实 施例 4)。结果表明起始密码子上游 236bp 就具备了驱动 GUS 在纤维 / 胚珠优势表达的能 力， 但驱动能力较弱。起始密码子上游 390bp 的区段具备了较强的驱动能力， 但在纤维伸长 中后期的驱动能力高于 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2 这两个启动子的驱动能力。表明起始密码 子上游 236bp 为该启动子的核心序列 ( 图 6BC)。
实施例 6 ： 启动子 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2 构建到植物载体上
设计含有 HindIII 和 Xba I 酶切位点的引物扩增了 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2 序列， 其引物序列如下， 下划线所示为酶切位点识别序列 ：
PGbPDF1-1-F ： AGAGAAGCTTCATATAAAAGTTTAGGGGATTGGAG
PGbPDF1-2-F ： TACGAAGCTTTGTACAGTCGTAA
pGWB407-R ： ACATCTAGACTCTGTATGCTATAGATATTACTACTTCAA
背景技术
棉花因为其纤维是重要的纺织工业原材料而成为世界性重要的经济作物之一。 此 外， 棉籽富含蛋白质与油分， 是价值极高的饲料与食用油来源。 由于成熟棉花纤维是长度可 达到 6cm 单细胞， 并且纤维素含量高达 80％， 因而是细胞快速伸长研究的模式材料， 也是细 胞壁合成以及纤维素积累方向研究的重要材料。
启动子是决定目的基因表达模式重要的顺式作用元件之一。 基因转录之前， RNA 聚 合酶首先该基因的启动子区结合。 通过启动子上的顺式作用元件协同反式作用因子的相互 作用来共同控制基因的表达， 以对细胞内外的信号及时做出反应， 决定基因表达的时间、 部 位和表达丰度。
通过基因工程手段对农作物进行遗传改良， 就需要外源基因在受体内以高度受控 的方式表达， 也就是能控制外源基因在目标组织的特定发育时期表达。诱导型或者组织器 官特异表达启动子可以满足这个要求， 它们能控制外源基因以适当的方式表达并最终产生 期望的表型。
在改良棉纤维的遗传工程中， 让外源基因在棉花纤维细胞特异表达有很多优点 ： 首先， 外源基因的特异表达是保存受体植株能量的一种有效方式， 并且可以达到高水平地 表达 ； 其次， 可以避免基因在非纤维组织表达可能导致的负面影响。 最后通过调控外源基因 在纤维细胞的表达时间以及表达水平可以控制外源基因表达对纤维特性的影响。
国内外各单位在棉花基因功能研究的同时也报道了一些组织特异性启动子的分 离、 鉴定与应用的情况。其中最为成功的范例之一当为 Sunilkumar 等用分离得到的未成熟 种子特异表达的 alpha-globulin 启动子 (Cotton alpha-globulin promoter ： isolation and functional characterization in transgenic cotton， Arabidopsis， andtobacco. Transgenic Research， 2002， 11 ： 347-359)。后来， 他们用这一启动子构建了 RNAi 载体以 特异降低棉籽中棉酚合成的关键酶并最终减少了棉籽中棉酚的含量而不影响其余组织， 这 使得棉籽蛋白的安全、 充分利用成为可能 (Engineering cottonseed for use in human nutrition by tissue-specific reduction oftoxic gossypol.Proc NatlAcadSci USA， 2002， 103(48) ： 18054-18059)。
此 外， 还 获 得 了 棉 花 纤 维 特 异 或 优 势 表 达 的 E6、 GhTUB1、 GhACT1、 GhTUA9、 GhFSltp4 等基因的启动子， 但是几乎都是在纤维发育的第二阶段即伸长期优势表达 (Gene expression in cotton(Gossypiumhirsutum L.)fiber ： cloning of the mRNAs. Proc Natl Acad Sci USA， 1992， 89(13) ： 5769-5673， Molecularcharacterization of thecotton GhTUB 1gene that is preferentially expressed in fiber.Plant Physiol.， 2002， 130(2) ： 666-674， The cotton ACTIN 1gene is functionally expressed in fibers and participates in fiber elongation.PlantCell， 2005， 17(3) ： 859-875， Molecular characterization of cotton GhTUA9gene specifically expressed in fibre andinvolved in cell elongation.J Exp Bot， 2007， 58(12) ： 3227-3238， The fiber specificity of the cotton FSltp4 genepromoter is regulated by an AT-rich promoter region and the AT-hook transcription factor GhATl.Plant CellPhysiol， 2007， 48(10) ： 1426-1437)。2009 年 还 分 离 得 到 了 维 管 组 织 特 异 表 达 且 受 生 长 素 诱 导 的 GhCesA4 基因启动子 (Functional analysis of a cotton cellulose synthase A4 gene promoter in transgenic tobacco plants.PlantCell Reports， 2009， 28(10) ： 1539-1548)。 目前较为缺乏的是在纤维发育起始阶段即开花前 3 天到开花后 2 天 (-3DPA ～ 2DPA) 高效表达的启动子， 用这样的启动子驱动纤维发育后期表达基因的异位表达也是基 因工程改良途径之一。
本 发 明 所 述 启 动 子 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2 是 根 据 GbPDF1 基 因 的 cDNA 序 列 ( 来 源 于 本 室 所 构 建 的 海 岛 棉 -2 ～ 25DPA 纤 维 cDNA 平 衡 化 文 库， Genes expression analyses of sea-island cotton(Gossypiumbarbadense L.)fiber development.Plant CellReports， 2007， 26 ： 1309-1320) 向 5’ 方向扩增得到的。这两个启动子驱动目的基因在 胚珠及纤维中优势表达， 开花前的胚珠中即可检测得到， 且开花当天在胚珠中的表达量就 高于组成型启动子 CaMV35S， 是纤维及棉籽内含物改良的有用生物学元件。 发明内容
本发明的目的在于克服现有棉纤维发育起始阶段启动子的不足， 在海岛棉 3-79 开花前 2 天到开花后 25 天 (-2 ～ 25DPA) 纤维 cDNA 平衡化文库的基础上鉴定出具有棉纤 维起始期优势高效表达的启动子 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2， 并将这些启动子应用到棉花的 基因工程改良， 以最终改良棉花纤维品质或者改良种子中棉酚、 蛋白质、 油分等不同物质的 积累等。
本发明通过下列技术方案实现 ：
申请人通过基因克隆方法， 从海岛棉中克隆得到两个棉花纤维发育起始优势表达 的强启动子 PGbPDF1-1 和 PGbPDF1-2， 其核苷酸序列分别如序列表 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2 所示。
上述启动子 PGbPDF1-1 和 PGbPDF1-2 的核苷酸序列包括上述启动子序列的全部或 部分序列。所述的部分序列是指大于或等于所述启动子起始密码子上游 236bp 的序列， 其 中启动子 PGbPDF1-1 的 236bp 序列位于序列表 SEQ ID NO ： 1 所示序列的 1444-1679bp 处 ； 启动子 PGbPDF1-2 的 236bp 序列位于序列表 SEQ ID NO ： 2 所示序列的 1116-1351bp 处。
与此同时， 申请人获得两种棉花纤维发育起始优势表达的强启动子 PGbPDF1-1、 PGbPDF1-2 的表达载体 pGWB407-PGbPDF1-1 和 pGWB407-PGbPDF1-2， 其核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2 所示。
含有本发明启动子的表达盒、 重组载体、 转基因细胞系和重组菌的制备方法也属 于本发明的保护范围。所述表达盒从上游至下游依次为本发明的启动子、 目的基因和转录终止子， 如图 7所示。
所述植物表达载体具体为包含有如图 7 所示表达盒的表达载体或将其它元件替 换但包含 PGbPDF1-1 或 PGbPDF1-2 的全长或部分启动子的表达载体。附图说明
序列表 SEQ ID NO ： 1 是本发明克隆的启动子 PGbPDF1-1 的核苷酸序列。
序列表 SEQ ID NO ： 2 是本发明克隆的启动子 PGbPDF1-2 的核苷酸序列。
图1： 是 PGbPDF1-1 或 PGbPDF1-2 启动子克隆和验证的技术路线。
图2： 是 GbPDF1 实时定量 PCR 的表达分析。分析表明该基因在纤维起始和伸长早 期表达， 5DPA( 开花后 5 天 ) 是其表达高峰。-1、 0、 3、 5、 10、 15、 20、 25、 根、 叶表示开花前 1 天 的胚珠、 开花当天胚珠、 开花后 3 天胚珠、 开花后 5 天胚珠及纤维、 开花后 10 天纤维、 开花后 15 天纤维、 开花后 20 天纤维、 开花后 25 天纤维、 根和叶的 RNA 为模板。
图3： 是 PGbPDF1-1 启动子驱动 GUS 基因在棉花中的表达情况， PGbPDF1-1 启动 子驱动 GUS 在棉花起始期的胚珠纤维中优势表达， 在花药花丝及刚萌发的胚中也检测到表 达。 第一、 二排分别为 GUS 在 -1、 0、 1、 2、 5、 10、 15、 20、 25DPA 胚珠及纤维中的表达情况， 第三、 四排是其在其他组织中的表达情况。 图4 ： 是 PGbPDF1-1 启动子在纤维发育不同时期 GUS 定量结果， 表明 GUS 在 0DPA 的 胚珠蛋白量最高。 X 轴表示纤维发育的不同时期， 分别为 0DPA、 3DPA 的胚珠， 5、 10、 15、 20DPA 的纤维。
图5： 是 PGbPDF1-2 启动子驱动 GUS 基因在棉花表达情况， 表达模式与 PGbPDF1-1 一致。第一排分别为 GUS 在 0、 、 5、 30DPA 胚珠及纤维中的表达情况， 第二排是其在其他组织 中的表达情况。
图6 ： 是 PGbPDF1-2 不同截短区段的启动子驱动能力分析。 结果表明起始密码子上 游 236bp 就具备了驱动 GUS 在纤维 / 胚珠优势表达的能力， 但驱动能力较弱。 起始密码子上 游 390bp 的区段具备了较强的驱动能力， 但在纤维伸长中后期的驱动能力高于 PGbPDF1-1 和 PGbPDF1-2 这两个区段的驱动能力。 表明起始密码子上游 236bp 为该启动子的核心序列。 A 为启动子 PGbPDF1-2 的截短策略 ； B 为不同截短区段转基因棉花 GUS 染色结果 ； C 为不同 截短区段的 GUS 定量结果， 0、 3、 5DPA 为带纤维的胚珠， 10、 15DPA 为纤维。
图7： 是用启动子 PGbPDF1-1/2 构建的驱动下游基因超表达载体示意图。图中 PGbPDF1-1/2 表示本发明所述的启动子 ； ORF 为目的基因 ； Terminator 表示转录终止子。
图8： 是本发明克隆的启动子 PGbPDF1-1 的核苷酸的全序列， 其中下划线部分是启 动子的核心序列， 片段长度为 236bp。
图9： 是本发明克隆的启动子 PGbPDF1-2 的核苷酸的全序列， 其中下划线部分是启 动子的核心序列， 片段长度为 236bp。
具体实施方式
实施例 1 ： 启动子 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2 的克隆
本发明的启动子 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2 的克隆是基于基因 GbPDF1( 登录号为DQ912946)， 该基因是海岛棉纤维起始和伸长早期特异 / 优势表达基因 ( 图 2)。 在这个基因 序列基础上申请人采用 GenomeWalking 方法克隆了本发明的两个启动子。所述启动子的制 备方法参照 GenomeWalkerTM Universal Kit(Protocol No.PT3042-2， 购自 Clontech 公司， 美国 ) 操作手册， 根据 GbPDF1 基因的 cDNA 序列设计了两条反向的基因特异巢式 PCR 引物 PDF1-GSP1、 PDF1-GSP2( 序列见下所述 ) 分别与所用试剂盒中的的接头引物 AP1、 AP2 组合 进行 PCR 扩增。
将 PCR 扩增片段通过凝胶回收试剂盒 (QIAquickGelExtractionKit， 购自 Qiagen 公司， 德国 ) 及说明书介绍的的方法纯化以后连接到 pMD-18T 载体 ( 购自宝生物工程大连 有限公司 ) 上并进行测序。将所有片段的测序结果去载体以后通过 BLAST 等在线工具的拼 接及比对以后得到两条长度分别为 1679bp 和 1351bp 的启动子 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2。 Clustal_X 比对发现 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2 在距 GbPDF1 基因翻译起始位点 ATG 上游约 390bp 的序列几乎完全一致。详细序列见序列表 1 和序列表 2。
通过 NNPP 及 TSSP 预测发现所述序列具备植物启动子的结构， 而 PLACE 分析发现 了譬如 L1BOX， HDZIP2ATATHB2， BIHD1OS BOX 等在发育过程中可能起重要作用的顺式元件及 对激素和光照等环境起响应的元件。
以上所述所用引物为 ：
PDF1-GSP1 ： CAAAACCCACATCAACAAACAAACCTG
PDF1-GSP2 ： CTTCTTTGCCTCTCCATCTCTGTATGCTAT
以上所述在线工具详细网站及文献如下 ：
BLAST ： http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi， Clustal_X ： http://www. clustal.org/，
Thompson JD， Gibson TJ， Plewniak F， Jeanmougin F， Higgins DG(1997)， The CLUSTAL X windowsinterface ： flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools， Nucleic AcidsResearch.25(24) ： 4876-82
NNPP ： http://www.fruitfiy.org/seq_tools/promoter.htmL
Reese MG(2001)， Application of a time-delay neural network to promoter annotation in the Drosophilamelanogaster genome， Computers & Chemistry.26(1) ： 51-56 ；
TSSP ： http://www.softberry.com/berry.phtmL ？ topic ＝ tssp&group ＝ programs&subgroup ＝ promoter&advanced ＝ on ；
Shahmuradov IA ， Solovyev VV ， Gammolerman AJ(2005) ， Plant promoter prediction with confidenceestimation.NucleicAcids Research.33(3) ： 1069-1076 ；
PLACE ： http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.htmL，
K.Higo ， Y.Ugawa ， M.Iwamoto and T.Korenaga(1999).Plant cis-acting regulatory DNA elements(PLACE)database ： 1999.NucleicAcids Research.27(1) ： 297-300.
实施例 2 ： 启动子 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2 驱动报告基因的表达载体构建
用高保真 DNA 聚合酶分别以引物对 PGbPDF1-1-F 与 pBI121-R 及 PGbPDF1-2-F 与 pBI121-R 扩增得到两端分别带有 Hind III 和 XbaI( 购自 New England Biolabs 公司， 美国 ) 酶切位点启动子片段， 经双酶切消化、 回收纯化以后通过 DNA 连接酶 ( 购自 Promega 公 司， 美国 ) 连接到经过相同双酶切消化回收的载体 pBI121( 购自 Clontech 公司， 美国 ) 骨 架上以替代原有 CaMV35S 启动子从而得到驱动报告基因 GUS 的表达载体 PGbPDF1-1::GUS 和 PGbPDF1-2::GUS。
所用引物序列如下， 下划线所示为酶切位点识别序列 ：
PGbPDF1-1-F ： AGAGAAGCTTCATATAAAAGTTTAGGGGATTGGAG
PGbPDF1-2-F ： TACGAAGCTTTGTACAGTCGTAA
pBI121-R ： ACATCTAGACTCTGTATGCTATAGATATTACTACTTCAA
实施例 3 ： 启动子表达载体 PGbPDF1-1::GUS 及 PGbPDF1-2::GUS 转化棉花
将验证无误的实施例 2 中所构建的 2 个载体的质粒 DNA 通过电击转化法转入 到 农 杆 菌 菌 株 LBA4404(Octopine Ti-plasmid deletion mutants of Agrobacterium tumefaciens with emphasis on the right side of theT-region， Plasmid， 1982， 7： 15-29) 中。本发明中所涉及的棉花转基因采用的方法为农杆菌介导的遗传转化法， 所采用 的农杆菌菌株为 LBA4404， 转化受体材料为 YZ-1(Jin( 金双侠 ) 等的文献 (Identification of anovelelite genotype for in vitro culture and genetic transformation of cotton.Biologia Plantarum， 2006， 50 ： 519-524)。 转化方法和程序参照 Jin 等建立的高效 转化体系 (Identication of a novel elite genotype forin vitro culture andgenetic transformation of cotton.Biologia Plantarum， 2006， 50 ： 519-524 ； An efficient grafting system fortransgenic plant recovery in cotton(Gossypium hirsutum L.).Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2006， 85 ： 181-185 ； Factors affecting stable transformation and plant regeneration during transforming embryogenic callusof Upland cotton(Gossypium hirsutum L.)via Agrobacterium tumefaciens， Plant Cell， Tissueand Organ Culture， 2005， 81 ： 229-237)， 并作了相应的调整和修改， 具 体方法和流程如下 ：
1、 无菌苗的培养
将棉籽壳去掉， 用 0.1/100 的升汞灭菌十分钟， 无菌水冲洗三遍， 接种于无菌苗培 养基中配方如下 ： 1/2MS 大量元素 + 葡萄糖 15g/L+phytagel( 购自 Sigma 公司， 美国 )2.5g/ L， 三至六天暗培养。
2. 农杆菌的活化和保存
2.1 准备 ：
农杆菌 LBA4404， 含卡那霉素 50mg/L 的 MGL 液体培养基 ( 胰化蛋白胨 5g/L， 氯化钠 5g/L， MgSO4.7H2O 0.1g/L， KH2PO40.25g/L， 甘露醇 5g/L， 甘氨酸 1.0g/L， pH 值 7.0)， 无菌三 角瓶， LB( 固、 液 ) 培养基 ( 含卡那霉素 50mg/L)， 灭菌甘油， 无菌枪头， 无菌 1.5mL 离心管。
2.2 操作 ：
2.2.1 活化， 悬浮 ：
超低温冰箱内取出保存菌株的甘油管在冰上融化， LB 平皿上划线， 26.5 ℃暗培 养 36-48h， 待皿内长出清晰的单菌落， 挑取单菌落在另外的 LB 平皿划线， 26.5 ℃暗培养 36-48h， 待皿内长出足够的菌落结束培养， 把培养基表面菌落刮入三角瓶内的 MGL 培养基 中， 27℃、 200rpm 摇 2h， OD 值在 0.5-1.5 之间即可用于浸染。2.2.2 菌株的保存 ：
从培养皿内挑取单菌落接于 LB 液体培养基中 150rpm、 26℃摇 48h， 按菌液和甘油 1 ∶ 1 加入 1.5mL 离心管混匀， -70℃保存。
3. 浸染， 共培养 ：
3.1 准备 ：
暗培养 5 天左右幼嫩健壮的 YZ-1 幼苗， 经活化农杆菌， 无菌培养皿， 无菌滤纸。
3.2 操作 ：
无菌条件下将 YZ-1 幼苗下胚轴用锋利的刀片切成 0.5-1cm 长的切段， 转入到经活 化的菌液中， 搅匀， 静置 5-10 分钟， 倒掉菌液， 滤纸吸干残余菌液， 吹 5 分钟使表面稍为干 燥， 分散布于垫有滤纸的共培养培养基中， 19-21℃暗培养 38-42h。
4. 愈伤组织的诱导
将侵染共培养后的下胚轴切段接种于诱导培养基上配方如下 ： MS 无机盐 +B5 有机 物 +2， 4-D 0.1mg/L+KT0.1mg/L+ 葡萄糖 30g/L+phytagel 2.5g/L， pH5.8。
5、 非胚性愈伤组织的增殖
MS 无机盐 ( 硝酸钾加倍， 硝酸铵减半 )+B5 有机物 +2， 4-D 0.05mg/L+KT0.1mg/L+ 葡萄糖 30g/L+phytagel2.5g/L， pH5.8。 6、 愈伤组织的分化
愈伤组织经继代 ( 一个月继代一次 ) 几次后， 有的愈伤组织转成米粒状颗粒， 将其 转入分化培养基 (MS+B5 有机物 +KT0.15mg/L+IBA0.5mg/L+ 葡萄糖 30g/L+phytagel 2.5g/ L， pH5.8) 中， 进一步分化成胚状体。
7、 胚性愈伤组织的继代
MS 无 机 盐 ( 硝 酸 钾 加 倍， 硝 酸 铵 减 半 )+B5 有 机 物 +KT0.15mg/L+IBA0.5mg/ L+Gln( 谷 胺 酰 胺 )1.0mg/L+Asn( 天 冬 酰 胺 )0.5mg/L+ 葡 萄 糖 30g/L+phytagel( 购 自 Sigma-Aldrich 公司， 美国 )2.5g/L， pH5.8。
8、 成苗生根培养
将分化出的小苗继代到 1/2MS 培养基中成苗生长 (1/2MS 无机盐 +B5 有机物 + 葡 萄糖 15g/L+phytagel2.5g/L， pH5.8)。
9、 炼苗移栽
将生根良好的小苗揭开三角瓶封口膜， 炼苗 2-3 天， 然后移栽到小土钵中， 遮荫缓 苗一周左右移栽大田。
附： MS 培养基母液配制 ：
1. 配制大量元素时各种药品分别称量， 分别充分溶解， 逐一加到容量瓶中， 一定要 最后加入 CaCl2 否则容易产生沉淀， 定容到一升。
2. 配制微量元素时几种极微量药品先可以配成一级母液 ( 浓缩 10000 倍 )， 再稀 释成二级母液 ( 浓缩 100 倍 )， 母液配制完毕后放置于室温下 10h 以上， 看是否有沉淀产生， 然后才能使用。
3. 配制铁盐时， 两种盐用热水分别溶解， 然后混合， 放置于室温下 10h 以上看是否 有沉淀产生， 然后才能使用。
4. 各种生长激素一般可以用 1mol/L 的 NaOH 或 HCl 溶解后， 再定容。
5. 配制 B5 有机物时要用无菌水来配制， 一次不要配太大体积， 及时用完以防污染 6. 各种母液配制好后应存放在 4℃冰箱中， 发现有沉淀后， 不得使用。 大量元素 (20 倍 ) 母液 (g/L) KNO3 38 NH3NO3 33 MgSO4·7H2O( 无水 MgSO4) 7.4(3.8) KH2PO4 3.4 CaCl2·2H2O( 无水 CaCl2) 8.8(6.6) 微量元素 (100 倍 ) 母液 (g/L) CoCl2·6H2O 0.0025 CuSO4·5H2O 0.0025 H3BO3 0.62 KI 0.083 MnSO4·4H2O 2.23 NaMO4·2H2O 0.025ZnSO4·7H2O 0.86
铁盐 (100 倍 ) 母液 (g/L)
FeSO4·7H2O 2.78
Na2EDTA 3.73
B5 有机物
VB1( 硫胺素 ) 10mg/L
VB5( 盐酸吡哆醇 ) 1mg/L
VB6( 烟酸 ) 1mg/L
肌醇 100mg/L
甘氨酸 2mg/L
转化植株通过 PCR 检测， 阳性植株通过自交保存收种， 取不同组织用于 GUS 染色与 定量分析。
实施例 4 ： 启动子 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2 表达特性
将 转 基 因 植 株 的 不 同 组 织 材 料 取 下 以 后， 迅 速 用 预 冷 的 80 ％ 丙 酮 进 行 固 定 30min， 在移除丙酮后用预冷的 ddH2O 冲洗后转移到含有反应底物 X-Gluc 的染色液中于 37℃培养箱中放置 8-16h 至完全显色， 随后在 42℃条件下加入 75％酒精使样品充分脱色， 最后用 FAA 组织固定液 (100mL 配方为 ： 90mL 70％乙醇、 5mL 冰醋酸、 5mL 甲醛 ) 材料固定。 体式显微镜 (Leika MZFLIII) 观察并照相。染色液的配方如下 ：
0.9g/LX-gluc， 50mmol pH 为 7.0 的磷酸钾缓冲液， 20％ (v/v) 甲醇和 100mg/L 氯 霉素。
组织总蛋白提取及定量分析参见 Jefferson R.A. 所述方法 (Assaying chimeric genes in plant ： the GUS genefusion system.PlantMolecular Biology Reporter.1987， 5： 387-405)。定量分析用 Tecan Infinite M200 型多功能酶标仪 ( 购自 Tecan 公司， 奥地 利 ) 进行测量。定量分析每次至少 3 次重复， 数据处理及分析用 MicrosoftExcel 程序。通过对 GUS 蛋白的定性及定量分析， 得出如下结论 ：
PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2 这两个启动子主要在棉花的胚珠及纤维发育过程中 优势表达 ： 从 -1DPA ～ 30DPA 的胚珠及纤维中都能检测得到， 在花药及胚中也有表达， 且 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2( 图 5) 这两个启动子在表达模式上几乎没有差别。
在表达丰度上 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2 这两个启动子存在一定的差异。以开花当 天样本为例， 在胚珠中启动子 PGbPDF1-2 表达能力更强 ( 图 6C)。
实施例 5 ： 启动子 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2 核心启动子序列确定
根据顺式作用元件预测结果将 PGbPDF1-1 从 5’端截短 ( 图 6A)， 将不同截短 区 段 的 启 动 子 序 列 与 GUS 融 合 构 建 植 物 表 达 载 体 ( 载 体 构 建 程 序 同 于 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2)， 转化转基因棉花， 取样进行 GUS 染色组织化学定位及 GUS 定量分析 ( 程序同实 施例 4)。结果表明起始密码子上游 236bp 就具备了驱动 GUS 在纤维 / 胚珠优势表达的能 力， 但驱动能力较弱。起始密码子上游 390bp 的区段具备了较强的驱动能力， 但在纤维伸长 中后期的驱动能力高于 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2 这两个启动子的驱动能力。表明起始密码 子上游 236bp 为该启动子的核心序列 ( 图 6BC)。
实施例 6 ： 启动子 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2 构建到植物载体上
设计含有 HindIII 和 Xba I 酶切位点的引物扩增了 PGbPDF1-1 及 PGbPDF1-2 序列， 其引物序列如下， 下划线所示为酶切位点识别序列 ：
PGbPDF1-1-F ： AGAGAAGCTTCATATAAAAGTTTAGGGGATTGGAG
PGbPDF1-2-F ： TACGAAGCTTTGTACAGTCGTAA
pGWB407-R ： ACATCTAGACTCTGTATGCTATAGATATTACTACTTCAA
将 PCR 产 物 和 载 体 pGWB407(Improved gateway binary vectors ： high-performance vectors for creation offusion constructs in transgenic analysis of plants ， Bioscience ， biotechnology ， and biochemistry ， 2007 ， 71 ： 2095-100) 分别用 Hind III 和 Xba I 酶双酶切。带有启动子的 PCR 产物酶切后用 PCR 产 物回收试剂盒 (QIAquick Gel Extraction Kit， 购自 Qiagen 公司， 德国 ) 回收。pGWB407 酶切产物进行 1％琼脂糖凝胶电泳分析， 回收载体骨架。用 T4DNA 连接酶连接。连接产物 转化大肠杆菌 TOP10 感受态细胞， 挑取具有壮观霉素抗性单克隆， PCR 鉴定阳性克隆提取质 粒进行酶切和测序鉴定。将获得的两个植物表达载体分别命名为 pGWB407-PGbPDF1-1 和 pGWB407-PGbPDF1-2， 其物理图谱如图 7 所示。10CN 102485893 A
序列表1/2 页11CN 102485893 A
序列表2/2 页