酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌在制备治疗肠易激综合征、冷凉泻、喝酒泻药物中的应用.pdf

本发明公开了酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌的药物新用途，具体涉及酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌单独或组合作为药物活性成分制成活菌制剂在制备治疗肠易激综合征、冷凉泻、喝酒泻药物中的应用。

权利要求书
1.  酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌在制备治疗肠易激综合征、冷凉泻、喝酒泻的药物中的应用，其中所述的酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌单独应用或组合应用作为药物活性成份制成活菌制剂。

2.  按权利要求1所述应用，其特征在于双歧杆菌包括婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、两歧双歧杆菌。

3.  按权利要求1所述应用，其特征在于将有效剂量的权利要求1所述的酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌三种菌和药学上可接受的不同载体制成口服剂型、肛门栓剂、灌肠剂。

4.  按权利要求1所述应用，其特征在于将有效剂量的权利要求1所述的酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌两种菌和药学上可接受的不同载体制成口服剂型、肛门栓剂、灌肠剂。

5.  按权利要求1所述应用，其特征在于将有效剂量的权利要求1所述的酪酸梭菌、双歧杆菌两种菌和药学上可接受的不同载体制成口服剂型、肛门栓剂、灌肠剂。

6.  按权利要求1所述应用，其特征在于将有效剂量的权利要求1所述的凝结芽孢杆菌、双歧杆菌两种菌和药学上可接受的不同载体制成口服剂型、肛门栓剂、灌肠剂。

7.  按权利要求1所述应用，其特征在于将有效剂量的权利要求1所述的酪酸梭菌和药学上可接受的不同载体制成口服剂型、肛门栓剂、灌肠剂。

8.  按权利要求1所述应用，其特征在于将有效剂量的权利要求1所述的凝结芽孢杆菌和药学上可接受的不同载体制成口服剂型、肛门栓剂、灌肠剂。

9.  按权利要求1所述应用，其特征在于将有效剂量的权利要求1所述的双歧杆菌和药学上可接受的不同载体制成口服剂型、肛门栓剂、灌肠剂。

10.  按权利要求3、4、5、6、7、8或9所述，其特征在于所述有效剂量是指制剂包含的总活菌数不能低于1×106CFU/g，一般在1×107CFU/g以上，最高可达到1×1012CFU/g或1×1012CFU/g以上。

说明书酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌在制备治疗肠易激综合征、冷凉泻、喝酒泻药物中的应用
技术领域
本发明涉及酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌的药物新用途，具体涉及酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌作为药物活性成份在制备治疗肠易激综合征、冷凉泻、喝酒泻药物中的应用，属于生物药领域。
背景技术
肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)指的是一组包括腹痛、腹胀、排便习惯改变和大便性状异常、黏液便等表现的经检查排除可引起这些症状的器质性疾病的临床综合征，持续存在或反复发作。本病已经发展为常见病，在普通人群进行问卷调查，有IBS症状者欧美报道为10％～20％，我国北京一组报道为8.7％。目前，传统的胃肠病理论认为其病因和发病机制不清楚，所以腹泻型IBS又被称为不明原因腹泻。
冷凉泻，即冷凉性腹泻，是指人体受寒着凉、饮用冷饮料或食用生冷瓜果食物后，而引发的腹泻，有时伴有腹痛、腹胀等症状。喝酒泻，既喝酒性腹泻，是指喝酒(啤酒、白酒等)后，由于酒精的刺激等原因而导致的腹泻，有时伴有腹痛、腹胀等症状。由青岛市微生态工程技术研究中心和青岛东海药业有限公司联合组织医学人员和统计学人员，对通过肠道健康热线由医学专业人员详细记录的629例腹泻患者的资料进行回顾性统计分析发现：冷凉泻和喝酒泻发病率很高，分别占到慢性腹泻患者的85.6％和89.1％，许多患者受凉、喝酒后就腹泻的病史，反反复复持续了十几年，甚至几十年，部分患者后来到医院检查已经发展为溃疡性结肠炎，甚至肠癌。
肠易激综合征、冷凉泻、喝酒泻长期反复发作给患者的生活、学习和工作带来很多不便，降低了患者的生活质量。对于肠易激综合征、冷凉泻、喝酒泻，目前的治疗药物主要为抗菌消炎药、止泻药和中药等，但都疗效不高，只能缓解一时的症状，治疗后易复发，且长期应用副作用大。因此，寻找能根治肠易激综合征、冷凉泻、喝酒泻，且没有副作用的药物是临床迫切需求的，本发明的药物新用途解决了这一难题，社会意义巨大。
发明内容
本发明人通过研究和分析发现大部分肠易激综合征、冷凉泻、喝酒泻患者的发病机制是各种原因导致的肠道菌群紊乱，有害菌增多，产生的氨、粪臭素、吲哚等毒素增加，使肠道的生物屏障、粘膜免疫屏障、机械屏障乃至化学屏障均轻度受损，处于亚健康状态，肠镜检查不出明显的器质性损伤，但此时的肠道耐受能力减弱，受到一些不良刺激，就会发生腹泻、便秘、腹胀、腹痛等症状。
本发明人经临床研究证实，酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌由于能够恢复肠道菌群平衡，减少有害菌及其产生的毒素，产生短链脂肪酸修复肠黏膜，从而恢复肠道功能。所以，把这三种菌单独或组合制成活菌制剂对治疗肠易激综合征、冷凉泻、喝酒泻疗效显著。
本发明以酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌为药物活性成份制成的制剂，可以是以酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌单独为药物活性成份分别制成相关剂型；也可以是酪酸梭菌与凝结芽孢杆菌组合，酪酸梭菌与双歧杆菌组合，凝结芽孢杆菌与双歧杆菌组合作为药物活性成份分别制成相关剂型；也可以是酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌与双歧杆菌三种菌组合制成相关剂型。
本发明所述酪酸梭菌选自但不限于酪酸梭菌(Clostridium butyricum)、CGMCC、保藏编号0313.1。
本发明所述凝结芽孢杆菌选自但不限于凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、CGMCC、保藏编号1207。
本发明所述双歧杆菌选自但不限于婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、CGMCC、保存编号0313.2，长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、CGMCC、保存编号0313.5，短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、CGMCC、保存编号0313.6，两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、CGMCC、保存编号0313.7。
本发明所述的酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌指活生物个体。
本发明是以有效剂量的酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌根据上面所述单独或组合作为药物活性成份，按照一定的制剂工艺，加入常规的赋性剂、调味剂、崩解剂、防腐剂、润滑剂、湿润剂、黏合剂、溶剂、增稠剂、增溶剂等药物辅料，制成任何一种适合于临床上使用的剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液体制剂等口服剂型，或肛门栓剂、灌肠剂型等。
本发明所指有效剂量是指以酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌根据上面所述单独或组合作为药物活性成份，即以酪酸梭菌；凝结芽孢杆菌；双歧杆菌；酪酸梭菌和凝结芽孢杆菌；酪酸梭菌和双歧杆菌；凝结芽孢杆菌和双歧杆菌；酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌和双歧杆菌分别为药物活性成份制成的活菌制剂包含的总活菌数不能低于1×106CFU/g，一般在1×107CFU/g以上，最高可达到1×1012CFU/g或1×1012CFU/g以上。
本发明优选的制剂工艺为，先在液体培养基中接种菌种，进行培养或多级扩增培养，然后将液态培养物离心，收集湿菌泥，并将所述菌泥干燥、粉碎，得到干燥菌粉。将所得干燥菌粉与药用载体混合，制成最终剂型。
由于本发明首次公开了以酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌为药物活性成份治疗肠易激综合征、冷凉泻、喝酒泻的药物作用，特别是对冷凉泻和喝酒泻的药物作用，因此，酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌按上面所述单独或组合作为药物活性成份或主要药物活性成份与辅料组合制成药剂，只要是该药剂用于治疗肠易激综合征，特别是用于治疗冷凉泻或喝酒泻，均属于本发明的保护范围。
本发明的酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌在制成任何一种剂型时，均具有治疗肠易激综合征、冷凉泻或喝酒泻的作用。任何药剂，如果其组份中含有酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌中的一种或几种成份制备成药，在其包装或说明书等标识上或者在其他任何宣传品上只要注明或提示具有治疗肠易激综合征、冷凉泻、喝酒泻的作用，则落入本发明的保护范围之内。
本发明的酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌是益生菌。因此，也可以将酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌制成保健食品或保健药品。将酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌制成的保健食品，如果在其包装或说明书等标识上或者在其他任何宣传品上只要注明或提示具有治疗肠易激综合征、冷凉泻、喝酒泻的作用，则落入本发明的保护范围之内。
具体实施方式
药物制备例说明：以酪酸梭菌为药物活性成分制成胶囊剂为例，说明制备方法。酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌按上面所述单独或组合作为药物活性成份，制备方法同下，制备方法不只局限以下的方法，公知的方法均可以。所配成的制剂含两种菌以上活性成份可分别发酵或混合发酵，然后制成单一组分菌粉或混合组分菌粉，最后按常规方法制备成所需的剂型。
实施例1  酪酸梭菌活菌菌粉制备
取酪酸梭菌活菌菌种管一支，溶于已灭菌装有10ml生理盐水和璃珠的100ml三角瓶中，活化10分钟，用1ml无菌吸管吸取1ml菌悬液接种装有50ml扩增培养基的250ml三角瓶中，置摇摆床内37℃恒温振荡(190rpm)培养24小时，转接装有450ml扩增培养基2500ml档板三角瓶中，37℃恒温振荡培养24小时，镜检无杂菌后再转接于装有4.5L扩增培养基的种子罐中，厌氧培养(充气量3∶1)24小时，镜检无杂菌后转接有45L发酵培养基的发酵罐中，37℃厌氧培养24小时，镜检芽孢率达80％以上，停止培养。用连续离心机，12000rpm离心。收集湿菌泥，称重，按1∶1(w/v)添加适量脱脂奶粉等保护剂后，干燥，粉碎，常温保存备用。
实施例2  酪酸梭菌活菌胶囊制备
成份                ％(重量)
酪酸梭菌活菌菌粉    20.00份
微晶纤维素          40.00份
葡萄糖              40.00份
将上述组份中1～3组中充分拌匀，然后利用常规灌装胶囊技术按单位剂量制成胶囊。
试验例说明：我们以口服酪酸梭菌活菌胶囊、口服凝结芽孢杆菌活菌片、口服双歧杆菌活菌片为例，介绍以酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌按上面所述单独或组合为药物活性成份制成的活菌制剂治疗肠易激综合征、冷凉泻、喝酒泻的临床效果。由于酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌都是益生菌，作用机理相同，所以酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌按上面所述组合作为药物活性成份制成的活菌制剂与单独作为药物活性成份制成的活菌制剂治疗肠易激综合征、冷凉泻、喝酒泻的临床效果相同或相近，所以在这里只介绍单独作为药物活性成份制成的口服酪酸梭菌活菌胶囊、口服凝结芽孢杆菌活菌片、口服双歧杆菌活菌片的临床研究效果为代表。
试验例1  酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌治疗肠易激综合征疗效观察
1对象与方法
1.1观察对象  选择2005～2006年就诊的按1999年提出的罗马II诊断标准诊断明确的肠易激综合征患者随机分入口服酪酸梭菌活菌胶囊治疗组、口服凝结芽孢杆菌活菌片治疗组和口服双歧杆菌活菌片治疗组。
1.2疗效判定标准
1.2.1症状分级①腹痛：0级：无疼痛；1级：(轻度)有疼痛，但不影响日常活动或工作，亦不需服药；2级：(中度)有疼痛，部分影响日常活动或工作，并需服药；3级：(重度)有疼痛，影响日常活动或工作，需休息，并需服药。②腹胀：0级：无症状；1级：偶有症状；2级：间断发生；3级：经常有症状。③排便费力、急迫感、排便不净感：0级：无症状；1级：轻度，偶有；2级：中度，间断有；3级：重度，经常有。④肠鸣音：0级：正常；1级：稍活跃；2级：活跃；3级：亢进。⑤腹部压痛：0级：无压痛；1级：压痛轻微；2级：压痛较明显；3级：压痛明显。
1.2.2疗效分级
(1)治愈  治疗后患者粪便性状及排便次数恢复正常(每天排1～2次黄色条状软便)，全身症状消失。
(2)显效  治疗后患者粪便性状及排便次数明显好转(每天排2～3次黄色软便)或每周排便>3次，全身症状明显改善。
(3)进步  治疗后患者粪便性状及排便次数有好转(每天排3次黄色烂便)或每周排便等于3次，全身症状有好转。
(4)无效  治疗后患者粪便性状和排便次数及全身症状无好转，甚至恶化。
1.3安全性评价
治疗中认真观察可能与治疗药有关的不良反应，记录发生时间、症状及持续时间、处理结果。
1.4统计学分析
采用SAS统计分析软件，数据分别用百分率或均数±标准差表示，治疗前后的差异显著性测验，用x2检验和精确概率法，或t检验，差异的显著性水平为p<0.05。
2结果  口服酪酸梭菌活菌胶囊治疗组治疗50例，口服凝结芽孢杆菌活菌片治疗组治疗46例，口服双歧杆菌活菌片治疗组治疗57例。详细疗效观察结果如下：
2.1口服酪酸梭菌活菌胶囊治疗肠易激综合征50例疗效观察结果
2.1.1临床资料  男性33例，女性17例，男∶女＝2∶1，平均年龄41.8岁，平均病程19.9月。IBS分型，腹泻为主型34例，便秘为主型8例，腹泻便秘交替型8例。
2.1.2给药方法  口服酪酸梭菌活菌胶囊，每粒420mg(含酪酸梭菌活菌数不低于1.0×106cfu/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3粒/次，一天2次，疗程14～21天。对脱水者补充水、电解质等支持疗法。
2.1.3疗效观察结果
2.1.3.1肠易激综合征患者治疗前后的症状改善比较  50例IBS患者的腹泻和便秘等症状，治疗后均有显著的改善(p<0.05)，见表1。
表1肠易激综合征患者治疗前后的症状改善比较
症状治疗前(50例)治疗后(50例)※显著性检验(p值)例数构成比例数构成比腹泻便秘腹泻+便秘水样、稀烂便或软便硬便腹痛腹胀排便不净感排便费力排便急迫感腹压痛肠鸣音348841937403292730366816168218748064185460723002012913210712600402418264201424<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05
※用卡方检验或精确概率法
2.1.3.2肠易激综合征患者治疗前后的排便次数、疗程与疗效  治疗后IBS患者的腹泻为主型和腹泻便秘交替型的排便次数有显著的减少(p<0.01)，而便秘为主型的则有显著的增加(p<0.01)，型间疗效无明显不同，21天的疗效比14天的要好，见表2。
表2肠易激综合征患者治疗前后的排便次数、疗程与疗效

※自身对比t检验，an＝42；bn＝8
2.1.3.3肠易激综合征患者的总疗效  50例IBS患者，痊愈31例，显效16例，总有效率为94％，无效为0，见表3。
表3肠易激综合征患者的总疗效、平均起效时间
总例数痊愈显效进步无效总有效率平均起效时间例％例％例   ％例   ％例   ％(天)50316216323    60    047   942.22
总疗效＝痊愈+显效，合计为总有效率
2.2口服凝结芽孢杆菌活菌片治疗肠易激综合征46例疗效观察结果
2.2.1临床资料  男性29例，女性17例，平均年龄43.5±11.9岁，平均病程22.9月。IBS分型，腹泻为主型30例，便秘为主型6例，腹泻便秘交替型10例。
2.2.2给药方法  口服凝结芽孢杆菌活菌片，每片350mg(含凝结芽孢杆菌活菌数不低于1.0×106cfu/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3片/次，一天3次，疗程14～21天。对脱水者补充水、电解质等支持疗法。
2.2.3疗效观察结果
2.2.3.1肠易激综合征患者治疗前后的症状改善比较  46例IBS患者的腹泻和便秘等症状，治疗后均有显著的改善(p<0.05)，见表1。
表1肠易激综合征患者治疗前后的症状改善比较
症状治疗前(46例)治疗后(46例)※显著性检验(p值)例数构成比例数构成比腹泻便秘腹泻+便秘水样、稀烂便或软便硬便腹痛腹胀排便不净感排便费力排便急迫感腹压痛肠鸣音3061038103035305202530651322832265766511435465201208670451040240171315091122<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05
※用卡方检验或精确概率法
2.2.3.2肠易激综合征患者治疗前后的排便次数、疗程与疗效  治疗后IBS患者的腹泻为主型和腹泻便秘交替型的排便次数有显著的减少(p<0.01)，而便秘为主型的则有显著的增加(p<0.01)，型间疗效无明显不同，21天的疗效比14天的要好，见表2。
表2肠易激综合征患者治疗前后的排便次数、疗程与疗效

※自身对比t检验，an＝40；bn＝6
2.2.3.3肠易激综合征患者的总疗效  46例IBS患者，痊愈30例，显效13例，总有效率为93％，无效为0，见表3。
表3肠易激综合征患者的总疗效、平均起效时间
总例数痊愈显效进步无效总有效率平均起效时间例％例％例％例％例％(天)4630651328370043932.12
总疗效＝痊愈+显效，合计为总有效率
2.3口服双歧杆菌活菌片治疗肠易激综合征57例疗效观察结果
2.3.1临床资料  男性35例，女性22例，平均年龄40.5±10.8岁，平均病程20.5月。IBS分型，腹泻为主型38例，便秘为主型9例，腹泻便秘交替型10例。
2.3.2给药方法  口服双歧杆菌活菌片，每片350mg(含双歧杆菌活菌数不低于1.0×106cfu/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3片/次，一天3次，疗程14～21天。对脱水者补充水、电解质等支持疗法。
2.3.3疗效观察结果
2.3.3.1肠易激综合征患者治疗前后的症状改善比较  57例IBS患者的腹泻和便秘等症状，治疗后均有显著的改善(p<0.05)，见表1。
表1肠易激综合征患者治疗前后的症状改善比较
症状治疗前(57例)治疗后(57例)※显著性检验(p值)例数构成比例数构成比腹泻便秘腹泻+便秘水样、稀烂便或软便硬便腹痛腹胀排便不净感排便费力排便急迫感腹压痛肠鸣音38910411332352512253028671618722356614421445349302309720556504501612409911<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05
※用卡方检验或精确概率法
2.3.3.2易激综合征患者治疗前后的排便次数、疗程与疗效  治疗后IBS患者的腹泻为主型和腹泻便秘交替型的排便次数有显著的减少(p<0.01)，而便秘为主型的则有显著的增加(p<0.01)，型间疗效无明显不同，21天的疗效比14天的要好，见表2。
表2肠易激综合征患者治疗前后的排便次数、疗程与疗效

※自身对比t检验，an＝48；bn＝9
2.4肠易激综合征患者的总疗效  57例IBS患者，痊愈35例，显效16例，总有效率为89％，无效为0，见表3。
表3肠易激综合征患者的总疗效、平均起效时间
总例数痊愈显效进步无效总有效率平均起效时间例％例％例％例％例％(天)57356116286110051892.40
总疗效＝痊愈+显效，合计为总有效率
3讨论
本发明人通过临床研究和分析发现IBS的真正病因是由各种原因导致的肠道菌群紊乱，有害菌增多，产生的氨、粪臭素、吲哚等毒素增加，使肠道的生物屏障、粘膜免疫屏障、机械屏障乃至化学屏障均轻度受损，肠道处于亚健康状态，肠镜检查不出明显的器质性损伤，但此时的肠道耐受能力减弱，从而导致肠易激综合征各种症状的发生。本发明正是利用酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌能恢复肠道菌群平衡达到从根源治疗肠易激综合征的目的。本试验发现酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌单独应用治疗肠易激综合征疗效显著，有效率分别达到了94％、93％、89％。且彼此之间的疗效没有显著性差异，并且它们都是益生菌作用机理相似，所以可以预计把它们按上面所述的组合制成活菌制剂一样会达到同样的结果，所以组合制成活菌制剂的试验例在此省略。
而由酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌按上面所述单独或组合作为药物活性成份制成的药物之所以对治疗肠易激综合征有效，主要是以下几方面原因：
1、酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌都是有益菌，可以恢复肠道菌群平衡，恢复生物屏障对于恢复正常的肠道功能非常有益。同时减少了肠道有害菌及其产生的毒素，从而减少了肠道的损伤因素，消除了毒素对肠麻痹作用，是治疗腹泻和便秘的机理之一。
2、酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌在肠道可以产生消化酶，有助于消化，消除腹胀。
3、酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌可以在肠道产生丁酸、乙酸等短链脂肪酸。短链脂肪酸是肠黏膜再生和修复的营养物质及能量来源，有助于修复肠黏膜，恢复肠道功能，是治疗IBS的重要机理之一；短链脂肪酸还可以刺激肠蠕动，是治疗便秘症状的重要机理之一。
4、同时酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌还可以促进肠道内源有益菌的增殖，肠道内源有益菌也具有上述作用，可以起到协同作用。
试验例2  酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌治疗冷凉泻疗效观察
1对象与方法
1.1观察对象  选择符合以下标准的就诊的腹泻患者，随机分入口服酪酸梭菌活菌胶囊治疗组、口服凝结芽孢杆菌活菌片治疗组和口服双歧杆菌活菌片治疗组。
入组标准：(1)受凉或食用生冷等食物后24小时内，腹痛或腹部不适伴有排便频率异常(排便>3次/24小时)，年龄在18～70岁；(2)受凉或食用生冷等食物后24小时内，腹痛或腹部不适伴有粪便性状改变(糊状便、水样便或粘液便)；(3)因受凉或食用生冷等食物引发腹泻，持续或间断性发作在2周～2个月以上者；(4)无严重的心、肝、肾、神经系统等疾患者。
1.2给药方法
口服酪酸梭菌活菌胶囊，每粒420mg(含酪酸梭菌活菌数不低于1.0×106cfu/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3粒/次，一天2次。
口服凝结芽孢杆菌活菌片，每片350mg(含凝结芽孢杆菌活菌数不低于1.0×106cfu/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3片/次，一天3次。
口服双歧杆菌活菌片，每片350mg(含双歧杆菌活菌数不低于1.0×106cfu/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3片/次，一天3次。
以上疗程均为14～21天。
1.3观察方法设自身对照，观察治疗前后的大便次数、大便性状、腹痛、腹胀、腹部压痛、肠鸣音等症状变化。治疗前做血常规、大便常规检查。
1.4疗效判定标准
治愈  治疗后患者粪便性状及次数恢复正常，全身症状消失；
显效  治疗后患者粪便性状及次数明显好转(每天排2～3次黄色软便)，全身症状明显好转；
进步  治疗后患者粪便性状及次数有好转(每天排3次以上黄色糊便)；
无效  治疗后患者粪便性状、次数及全身症状无好转，甚至恶化。
2结果  共收治127例，男79例，女48例，平均年龄39岁。
2.1综合疗效显著，但三组间比较无显著性差异，见表1。
表1酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌治疗冷凉泻综合疗效
组别例数痊愈显效进步无效有效率％酪酸菌组4526154091.1凝结菌组4025123092.5双歧菌组4223145088.1
痊愈和显效合计为有效，计算有效率。
2.2腹泻症状治疗前后比较，绝大部分症状明显减少，与治疗前比较有显著性差异，见表2。
表2酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌治疗冷凉泻前后症状改变
症状酪酸梭菌凝结芽孢杆菌双歧杆菌治疗前例数(％)治疗后例数(％)治疗前例数(％)治疗后例数(％)治疗前例数(％)治疗后例数(％)大便性状腹痛腹胀腹部压痛肠鸣音45(100)29(64.4)8(17.8)11(24.4)16(35.6)5(11.1)3(6.7)00040(100)18(45.0)6(15.0)12(30.0)11(27.5)05(11.1)00042(100)25(59.5)10(23.8)6(14.3)15(35.7)8(19.0)8(19.0)1(2.4)02(4.8)
2.3腹泻次数治疗前后有显著性差异(P<0.05)，见表3
表3酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌治疗冷凉泻前后腹泻次数(次/天)
组别治疗前治疗后酪酸梭菌组4.20±1.231.30±1.12凝结芽孢杆菌组4.11±1.181.54±1.43双歧杆菌组3.94±1.151.72±1.28
3讨论
在收治的127例冷凉泻患者中大部分都有长期的抗菌药应用史，抗菌药的应用导致肠道菌群紊乱，生物屏障及免疫屏障造到破坏，有害菌及其产生的毒素增多，使肠黏膜遭到不同程度的破坏，耐受冷凉刺激减弱，受到冷凉刺激就容易腹泻、腹痛、腹胀。应用酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌按上面所述方法单独或组合制成的活菌制剂：一方面可增加肠道有益菌，恢复肠道菌群平衡，修复生物屏障和免疫屏障，消除病源；另一方面可产生短链脂肪酸，修复肠黏膜。从而彻底治愈冷凉泻。
试验例3  酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌治疗喝酒泻疗效观察
1对象与方法
1.1观察对象  选择符合以下标准的就诊的腹泻患者，随机分入口服酪酸梭菌活菌胶囊治疗组、口服凝结芽孢杆菌活菌片治疗组和口服双歧杆菌活菌片治疗组。
入组标准：(1)饮酒(啤酒、白酒等)后24小时内，腹痛或腹部不适伴有排便频率异常(排便>3次/24小时)，年龄在18～70岁；(2)饮酒(啤酒、白酒等)后24小时内，腹痛或腹部不适伴有粪便性状改变(稀烂便、水样便或粘液便)；(3)因饮酒(啤酒、白酒等)引发腹泻，持续或间断性发作在2周～2个月以上者；(4)无严重的心、肝、肾、神经系统等疾患者。
1.2给药方法
口服酪酸梭菌活菌胶囊，每粒420mg(含酪酸梭菌活菌数不低于1.0×106cfu/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3粒/次，一天2次。
口服凝结芽孢杆菌活菌片，每片350mg(含凝结芽孢杆菌活菌数不低于1.0×106cfu/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3片/次，一天3次。
口服双歧杆菌活菌片，每片350mg(含双歧杆菌活菌数不低于1.0×106cfu/g)，由青岛东海药业有限公司提供。3片/次，一天3次。
以上疗程均为14～21天。
1.3观察方法设自身对照，观察治疗前后的大便次数、大便性状、腹痛、腹胀、腹部压痛、肠鸣音等症状变化。治疗前做血常规、大便常规检查。
1.4疗效判定标准
治愈  治疗后患者粪便性状及次数恢复正常，全身症状消失；
显效  治疗后患者粪便性状及次数明显好转(每天排2～3次黄色软便)，全身症状明显好转；
进步  治疗后患者粪便性状及次数有好转(每天排3次以上黄色糊便)；
无效  治疗后患者粪便性状、次数及全身症状无好转，甚至恶化。
2结果  共收治114例，男100例，女14例。平均年龄42岁。
2.1综合疗效显著，但三组间比较无显著性差异，见表1。
表1酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌治疗喝酒泻综合疗效
组别例数痊愈显效进步无效有效率％酪酸菌组3520114088.6凝结菌组412795087.8双歧菌组3821134089.5
痊愈和显效合计为有效，计算有效率。
2.2腹泻症状治疗前后比较，绝大部分症状明显减少，与治疗前比较有显著性差异，见表2。
表2酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌治疗喝酒泻前后症状改变
症状酪酸梭茵凝结芽孢杆菌双歧杆菌治疗前例数(％)治疗后例数(％)治疗前例数(％)治疗后例数(％)治疗前例数(％)治疗后例数(％)大便性状腹痛腹胀腹部压痛肠鸣音35(100)21(60)6(17.1)8(22.9)13(37.1)1(2.9)02(5.7)2(5.7)041(100)17(41.5)5(12.2)15(36.6)21(51.2)2(4.9)2(4.9)03(7.3)038(100)15(39.5)11(28.9)9(23.7)14(36.8)5(13.2)3(7.9)01(2.6)0
2.3腹泻次数治疗前后有显著性差异(P<0.05)，见表3
表3酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌治疗喝酒泻前后腹泻次数(次/天)
组别治疗前治疗后酪酸梭菌组4.50+1.411.25+1.18凝结芽孢杆菌组4.6±1.281.60±1.13双歧杆菌组3.80±1.111.12±1.01
3讨论
治疗的喝酒泻患者几乎都有抗菌药使用史，有的甚至常年用抗菌药，导致肠道菌群严重紊乱，生物屏障和免疫屏障造到破坏，有害菌及其产生的毒素增多，使肠黏膜遭到不同程度的破坏，耐受力减弱，肠道处于亚健康状态。喝酒泻和冷凉泻的发病机制一样，有的患者冷凉泻和喝酒泻交替发生。应用酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌按上面所述方法单独或组合制成的活菌制剂通过增加肠道有益菌，恢复肠道菌群平衡，修复生物和免疫屏障，消除病根，并产生短链脂肪酸，修复肠黏膜，而使喝酒泻治愈。治疗因病史而异，病程短的，治疗周期短，病程长而严重的，随治疗周期的延长，治愈率进一步提高。
本发明在实施过程中所使用的微生物菌种已分别于1997年7月28日和2004年8月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所邮编100080)保藏，共六个下述微生物菌种，但本发明所述的酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌、双歧杆菌并不局限于这六种微生物菌种。
(1)分类命名：酪酸梭菌Clostridium butyricum，         保存编号0313.1。
(2)分类命名：婴儿双歧杆菌Bifidobacterium infantis， 保存编号0313.2。
(3)分类命名：长双歧杆菌Bifidobacterium longum，      保存编号0313.5。
(4)分类命名：短双歧杆菌Bifidobacterium breve，       保存编号0313.6。
(5)分类命名：两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum，   保存编号0313.7。
(6)分类命名：凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，        保存编号1207。
上述六个微生物菌种经该微生物中心检测，检测结果均为存活。