一种人尿激肽原酶及其制备方法.pdf

本发明涉及一种人尿激肽原酶(Human Urinary Kallidinogenase)的结构确定、酶学性质等理化性质研究及其新的制备方法。本发明的人尿激肽原酶为首次从人尿中分离的主要为单一成分的蛋白质物质，人尿激肽原酶作为药用活性成分在治疗多种疾病时有着广泛的用途。

权利要求书
1.  一种人尿激肽原酶，采用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，即SDS-PAGE电泳法测定显示单一条带，具有以下特征：
1)SDS-PAGE电泳测定的分子量为43000±3000Da；
2)高效液相层析(HPLC)仅得到单一峰；
3)比活性不低于8PNA单位/毫克·蛋白，其主要活性成分的氨基酸序列：


2.  制备根据权利要求1所述的人尿激肽原酶的方法，其步骤为：
1)将鲜的男性尿液中加入3％脱乙酰甲壳素吸附，调节pH至4.5～5.5，用1～25％的硫酸铵溶液，调节pH至5.0～13.0洗脱，加入50％硫酸铵，沉淀蛋白，得到人尿激肽原酶粗品；
2)将人尿激肽原酶粗品溶解，经扩张床强阴离子交换柱(Streamline Q XL)层析；再经苯基交联琼脂糖快速流凝胶柱(phenyl Sepharose 6 Fast Flow)层析；人尿激肽原酶溶液60℃恒温加热10小时，得到纯度较高的、去除病毒的人尿激肽原酶中间体；
3)将上述人尿激肽原酶中间体溶液上亲和层析柱，作为亲和层析的介质为苯扎嘧啶交联琼脂糖凝胶(Benzami dine Sepharose 6B，GE Healthcare公司)，用平衡缓冲溶液冲洗柱子，去除杂蛋白，缓冲溶液的pH值为3-11，利用不同浓度的盐洗脱液，分别将人尿激肽原酶的两个组分洗脱下来，洗脱是在电导值5-50ms/cm和20-80ms/cm分别进行，收集电导值5-50ms/cm下洗脱得到的高分子人尿激肽原酶。

3.  根据权利要求2所述的人尿激肽原酶的制备方法，其中步骤1)中，用8～12％的硫酸铵溶液，调节pH至7～9洗脱。

4.  根据权利要求3所述的人尿激肽原酶的制备方法，其中步骤3)中使用的平衡缓冲溶液包括Tris-HCl缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液或柠檬酸钠缓冲溶液；优选，Tris-HCl缓冲溶液。

5.  根据权利要求3所述的人尿激肽原酶的制备方法，其中步骤3)中洗脱是在电导值20-25ms/cm下进行以获得高分子人尿激肽原酶。

说明书一种人尿激肽原酶及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物化学和药物化学领域。具体而言，本发明涉及人尿激肽原酶(Human Urinary Kallidinogenase)的结构组成、酶学性质及制备方法。
背景技术
1909年，Abelous和Bardier观察到：将人尿中一种水不溶成分注射到麻醉的犬中，其血压下降。1929年，Frey和Kraut从尿液中分离出该物质，还发现其在胰腺中有较高的浓度，认为胰腺为其主要合成场所，被命名为“kallikrein”。1937年发现kallikrein的蛋白酶功能，认为其为一种新蛋白，不是单独起作用，而是一个系统的一部分(Werle et al.，1937)。研究表明，从人尿中来源的该物质为组织型的激肽原酶。
众多研究者从人尿中分离制备了人尿激肽原酶，并进行了大量研究，但其多为两个或者两个以上组分的混合物。
现有技术纯化的人尿激肽原酶SDS-PAGE电泳测定有两条带，一条约43,000Da，一条约39,000Da。根据电泳的条件或计算方法的不同，得到的两个SDS-PAGE电泳条带分子量也有所不同，有40000Da和34000Da；41000Da和31000Da等，实际上是人尿激肽原酶中的两种组分，这两种组分的理化性质非常相似，分离十分困难，无论用抑肽酶或慈菇蛋白酶抑制剂作配基的亲和层析，还是用离子交换层析，均无法将两个组分完全分离；当两个组分混合在一起时HPLC图谱显示出一个单峰，所以用凝胶过滤的方法也无法将两个组分分开。在以前的纯化人尿激肽原酶方法中，一些研究未提及有两个组分。用HPLC的方法或不敏感的电泳方法无法分辨两个组分。
人尿激肽原酶具有激活人血浆激肽原转化为激肽、扩张血管增加血流量、改善血液循环的作用，促进缺血区新生血管生成，并且还有增加红细胞的变形性和抑制血小板聚集、延长再钙化时间改善血液粘稠的作用。本申请人的在先专利申请“ZL02116783.4人尿激肽原酶在制备治疗和预防脑梗塞药物中的应用”、“ZL200410088441.8人尿激肽原酶在制备脓毒症药物中的应用”、“ZL200410088440.3人尿激肽原酶在制备急性冠脉疾病药物中的应用”公开了它的三种医药用途。在“ZL 200410096060.4一种用于提高人尿激肽原酶稳定性的药物组合物”中公开了它制备药物制剂的一种方法。
由于以上的研究均采用抑肽酶或慈菇蛋白酶抑制剂作配基的亲和层析，得到的人尿激肽原酶产品为两种以上蛋白组分的混合物，对研究和应用带来很多限制。
人尿激肽原酶具有激活人血浆激肽原转化为激肽、扩张血管增加血流量、改善血液循环的作用。表明了人尿激肽原酶改善血液循环的同时会引起血压的下降。研究表明含有SDS-PAGE电泳两条带的人尿激肽原酶药品会引起血压的明显下降，既用现有技术获得的表明含有SDS-PAGE电泳单两条带的人尿激肽原酶药品临床使用是会有更大的副作用。
药品的活性成份如果含有两个组分，而这两个组分的比例无法控制，对于药品的疗效和安全性也就无法控制。因此，生产SDS-PAGE电泳单一条带的药品活性成份是非常重要的。
日本株式会社三和化学研究所是世界上最先将人尿激肽原酶用于人的临床研究的公司，他们的人尿激肽原酶药物仍然含有SDS-PAGE电泳测定的两个条带；比活性不低于5 PNA单位/毫克·蛋白(PNA U/mg·protein)。他们的人尿激肽原酶药物最终没能获得批准。(特開平5-163158.人尿性キニノゲナ—ゼを有効成分とすゐ皮膚潰瘍の予防及び治料劑.)
能够发现人尿激肽原酶SDS-PAGE电泳测定有两条带，并且能有效地将这两种物质分离，得到SDS-PAGE电泳单一条带的人尿激肽原酶的研究未见报导。
发明内容
本发明的目的通过一种层析材料，并结合其他层析技术，从人尿中分离出SDS-PAGE电泳单一条带的人尿激肽原酶。这种人尿激肽原酶在临床使用时副作用小。
发明人采用苯扎嘧啶交联琼脂糖凝胶(Benzamidine Sepharose)亲和层析的方法。人尿激肽原酶是一种丝氨酸蛋白水解酶，能够与苯扎嘧啶(Benzami dine)、抑肽酶、慈菇蛋白酶抑制剂等配基结合，抑肽酶、慈菇蛋白酶抑制剂等配基与人尿激肽原酶的结合力较强，洗脱条件剧烈，无法达到分离两个组分的目的，而苯扎嘧啶是小分子化合物，空间位阻小，人尿激肽原酶与其结合后，还会受到介质上其他电荷的影响，结合力较弱，洗脱条件温和，在此条件下两个组分有所差别。利用这一差别，我们用电导值较低的溶液将高分子组分洗脱下，低分子组分仍结合在介质上。用电导值较高的溶液将低分子组分洗脱下。这样可以获得SDS-PAGE电泳单一条带的人尿激肽原酶。
本发明的目的是提供一种人尿激肽原酶，采用十二烷基硫酸钠(SDS)一聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，即SDS-PAGE电泳法测定显示单一条带，具有以下特征：
1.SDS-PAGE电泳测定的分子量为43000±3000Da(见附图1)；
2.高效液相层析(HPLC)仅得到单一峰(见附图2)；
3.比活性不低于8PNA单位/毫克·蛋白(PNA U/mg·protein)，其主要活
性成分的氨基酸序列：

该人尿激肽原酶是从人尿中提取的糖蛋白，含有238个氨基酸；含有5对S-S键；含有3个糖基化位点；
这种人尿激肽原酶通过以下方法制备：
1.新鲜的男性尿液中加入3％脱乙酰甲壳素吸附，调节pH至4.5～5.5，用1～25％的硫酸铵溶液，调节pH至5.0～13.0洗脱，优选用8～12％的硫酸铵溶液，调节pH至7～9洗脱，加入50％硫酸铵，沉淀蛋白，得到人尿激肽原酶粗品；此步骤的特点是洗脱条件温和，得到的粗品质量好，有利于后面的纯化.
2.将人尿激肽原酶溶解，经扩张床强阴离子交换(Streaml ine Q XL，GEHeal thcare公司)柱层析；再经苯基交联琼脂糖快速流凝胶(phenyl Sepharose6 Fast Flow，GE Healthcare公司)柱层析；人尿激肽原酶溶液60℃恒温加热10小时，得到纯度较高的、去除病毒的人尿激肽原酶中间体。
3.将上述人尿激肽原酶中间体溶液上亲和层析柱，作为亲和层析的介质为苯扎嘧啶交联琼脂糖凝胶(Benzami dine Sepharose 6B，GE Healthcare公司)，用平衡缓冲溶液冲洗柱子，去除杂蛋白，使用的平衡缓冲溶液包括Tris-HCl缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液、柠檬酸钠缓冲溶液，优选，Tris-HCl缓冲溶液；缓冲溶液的pH值为3-11，优选，7-9。利用不同浓度的盐洗脱液，分别将人尿激肽原酶的两个组分洗脱下来，洗脱是在电导值5-50ms/cm和20-80ms/cm分别进行；分别洗脱得到高分子组分和低分子组分，高分子组分即本发明的人尿激肽原酶。
研究表明，含有SDS-PAGE电泳两条带的人尿激肽原酶药品会引起血压的明显下降，即用现有技术获得的表明含有SDS-PAGE电泳两条带的人尿激肽原酶药品临床使用是会有更大的副作用。
本发明采用的制备方法所获得SDS-PAGE电泳单一条带的人尿激肽原酶，其也是一种混合物，但几乎不引起血压下降，其同现有技术获得的含有SDS-PAGE电泳两条带的人尿激肽原酶药品相比副作用明显降低。
发明人对这种SDS-PAGE电泳单一条带的人尿激肽原酶进行了化学结构的确证以及其他理化性质、酶学性质的研究。
附图说明：
附图1：SDS-PAGE电泳图。图中1为高分子人尿激肽原酶和低分子人尿激肽原酶的混合物，(采用传统技术方法制备，即慈菇蛋白酶抑制剂方法制备的人尿激肽原酶，详见实施例4)；2为低分子人尿激肽原酶(含有部分高分子人尿激肽原酶)；3为分子量标准品；4为高分子人尿激肽原酶(采用本发明方法制备，即苯扎嘧啶亲和层析法，详见实施例1)。高分子和低分子人尿激肽原酶分子量分别约为43000Da和39000Da。
附图2：SDS-PAGE电泳单一条带(高分子)的人尿激肽原酶HPLC图。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 SDS-PAGE电泳测定显示单一条带的人尿激肽原酶的制备
其由以下步骤制备(苯扎嘧啶亲和层析法)得到：
1.将10吨新鲜的男性尿液泵入搅拌池中，调节pH至4.5～5.5，加入300kg脱乙酰甲壳素吸附，用10％的硫铵溶液调节pH至7.0～9.0洗脱；洗脱液用硅藻土作过滤介质，进行抽滤，将盐析溶液全部抽干，抽干产品1kg为人尿激肽原酶粗制品；
2.将150kg人尿激肽原酶粗品倒入搅拌罐中，加入750L的0.15M EDTA溶液溶解，将pH调至9.0，搅拌至粗品完全溶解即可；3000转/分离心20分钟，取上清，过滤0.45μm的膜，超滤得到超滤液45L，从中取样品A(人尿激肽原酶粗品溶解掖)；
3.将超滤液调pH8.0，上扩张床强阴离子交换柱(Streamline Q XL，GEHealthcare公司)，用含0.15M NaCl及0.02mol/LTris缓冲液冲洗柱子至OD280<0.2；用含0.3M NaCl及0.02mol/LTris缓冲液洗脱柱子；收集洗脱溶液20L；
4.洗脱收集液加入1800g(NH4)2S04，用HCl调整pH7.0±0.1，上苯基交联琼脂糖快速流凝胶(phenyl Sepharose 6 Fast Flow，GE Healthcare公司)柱，用0.7M(NH4)2S04缓冲液冲洗柱子，用0.4M(NH4)2S04缓冲液进行洗脱柱子，收集洗脱液40L，用10000MWCO膜超滤至3L；
5.将超滤后加入90g柠檬酸钠，用HCl调pH值至7.0±0.2，然后60℃恒温加热10小时，得到加热后人尿激肽原酶溶液；
6.将加热后溶液调pH8.0±0.1，上苯扎嘧啶交联琼脂糖凝胶(Benzami dineSepharoseTM 6B，GE Healthcare公司)柱，用含0.1M NaCl及0.02mol/L Tris缓冲进行冲洗，用含0.4M NaCl及0.02mol/L Tris缓冲进行洗脱，收集洗脱峰；
7.将洗脱收集液调pH7.0，用10000MWCO膜超滤至体积溶液1L，从中取样品B(SDS-PAGE电泳单一条带的人尿激肽原酶，见附图1)。将样品液A、B进行活性检测，结果如下表1。
表1样品液A、B活性检测结果
检测项目样品A样品B总活性(PNA U)15000069000
样品B各项检测指标结果如下表2。
表2样品B(SDS-PAGE电泳单一条带的人尿激肽原酶)的检查结果
检查项目检查结果性状无色澄清液体酸碱度6.8纯度99％分子量43400比活力(PAN单位/毫克蛋白)10.0
实施例2人尿激肽原酶结构确定人尿激肽原酶的氨基酸组成分析：
1.仪器名称及型号：日立835-50型高速氨基酸分析仪
2.样品制备：
准确量取样品入水解管中，加入6mol/L盐酸，于110℃水解24小时，冷却定容，过滤，蒸发去掉过量的盐酸，用0.02mol/L定容，上机分析。
3.测定条件：
离子交换柱：2.6×150mm；树脂规格：No.2619；柱温：53℃；泵流速：0.225ml/min；泵压力：90kg/cm2，洗脱液IPH-1，2，3，4；分析时间：72min；进样体积：50μl。
4.测定结果：与理论推导值基本一致(表3)。
表3氨基酸组成分析结果
氨基酸名称理论值实测值(比例)
  数目  比例  Asx(Asp、Asn)  26  10.9  10.3  Thr  14  5.9  5.4  Ser  16  6.7  6.2  Glx(Glu、Gln)  29/28  12.2  11.5  Pro  13  5.5  6.2  Gly  19  13.8  12.2  Ala  12  5.0  6.5  Cys  10  4.2  3.8  Val  21  8.8  8.4  Met  4  1.7  1.8  Ile  8  3.4  3.5  Leu  22  9.2  8.4  Tyr  5  2.1  1.8  Phe  9  3.8  4.2  Lys  7  2.9  3.5  His  11  4.6  4.8  Arg  5  2.1  2.7  Trp  7  2.9  2.2
对一级结构的研究证明，人尿激肽原酶的初级结构为含有238个氨基酸残基的单链，分别在Cys7-Cys150、Cys26-Cys42、Cys129-Cys196、Cys161-Cys175和Cys186-Cys211有五对二硫键，在Asn78、Asn84及Asn141处存在糖基化，糖组成为甘露糖3％、半乳糖1.7％、岩藻糖0.8％、N-乙酰葡萄糖胺5.0％，另外还检出少量唾液酸(0.4％)，人尿激肽原酶的总糖含量约为14.4％。
用TSK-GEL G3000SW凝胶测定本品分子量约54，000Da，呈单峰(如附图2)，电泳测定主要组分分子量约43,000Da，为单一条带(如附图1)。
实施例3  人尿激肽原酶酶学性质研究
取小试管(2×20cm)2支，各加入人尿激肽原酶溶液0.2ml，分别加入0.2mol/L Tris缓冲液(pH8.0)4.0ml，混匀，置37℃保温5分钟，于第1管中加入50％醋酸溶液0.4ml，第2管中加入底物溶液(S-2266(HD-Val-Leu-Arg-PnA·2HCl)，1.5mM)0.4ml，混匀，于37±0.5℃水浴中反应15分钟，然后在第1管中加入底物溶液0.4ml，第2管中加入50％醋酸溶液0.4ml，在405nm波长处测定，以第1管为空白，测定吸收值A，A值应控制在0.1～0.2之间。将A值代入下式计算：
PNA U/ml＝173.6×A×T/1000(T为稀释倍数)
lPNA U(p-nitroani line单位)：相当于37℃，pH8.0条件下以H-D-Val-Leu-Arg-p-nitroni lide为底物，1分钟水解产生1μmolp-nitroaniline时的人尿激肽原酶的酶量。
结果显示，上述人尿激肽原酶制品其比活大于8PNA U/mg蛋白。
实施例4人尿激肽原酶对血压的影响
试验药品：
1.人尿激肽原酶样品1(由实施例1的方法制备，即苯扎嘧啶亲和层析法制备，43KD组分大于99％)
2.人尿激肽原酶样品2(由慈菇蛋白酶抑制剂方法制备，43KD组分约60％，39KD组分约40％)
3.氯化钠注射液。
人尿激肽原酶样品2制备方法(慈菇蛋白酶抑制剂方法制备)如下：
人尿激肽原酶粗制品的提取：将新鲜尿泵入搅拌池中，调节pH至4.5～5.5，加入3％甲壳素吸附，用10％的硫铵溶液调节pH至7.0～9.0洗脱。洗脱液用硅藻土作过滤介质，进行抽滤，将盐析溶液全部抽干。抽干产品为人尿激肽原酶粗制品。
粗制品的溶解：取1kg人尿激肽原酶粗品。加入1∶3的0.15mol/L EDTA溶液溶解，3000转/分离心20分钟，取上清。
溶解液上清每升加5mol/L ZnCl2溶液30ml，调节pH至5～7，用95％预冷酒精：处理好的溶解液上清为1∶1.2的比例，加95％预冷酒精沉淀。
阴离子交换层析：酒精沉淀用0.15mol/L EDTA-0.2mol/L NaOH溶液溶解，超滤调pH8.0，超滤液上扩张床强阴离子交换柱(Streamline Q XL，GE Healthcare公司)，用含0.15mol/L NaCl及0.02mol/LTris缓冲冲洗柱子至0D280<0.2；用含0.3mol/L NaCl及0.02mol/L Tris缓冲洗脱柱子；收集洗脱溶液蛋白峰。
疏水层析：洗脱收集液加入(NH4)2S04使其终浓度为1.3mol/L，用HCl调整pH 7.0±0.1，上苯基交联琼脂糖快速流凝胶(phenyl Sepharose 6 Fast Flow，GE Healthcare公司)柱。用0.7mol/L(NH4)2S04缓冲液冲洗柱子。用0.4 mol/L(NH4)2S04缓冲液进行洗脱柱子，收集洗脱蛋白峰。用10000MWCO膜超滤至3L。
将超滤后加入90g柠檬酸钠，用HCl调pH值至7.0±0.2，然后60℃恒温加热10小时。得到加热后人尿激肽原酶溶液。
慈菇蛋白酶抑制剂为配体的亲和层析：用溴化氰法将300mg慈菇蛋白酶抑制剂与50gSepharos CL-4B填料偶联，装柱。将超滤液调整pH8.0上已平衡的亲和柱，用含0.05mol/L磷酸缓冲液及0.5mol/LNaCl进行平衡冲洗。再用0.05mol/L磷酸缓冲液及20％乙醇及0.4mol/L盐酸胍进行洗脱。收集洗脱蛋白峰。
凝胶过滤：用Superdex200填料装柱，用含0.05mol/L磷酸缓冲液及0.15mol/L NaCl，pH7.0±0.1的溶液进行平衡冲洗，收集蛋白峰。
将洗脱蛋白峰调pH7.0，用10000MWCO膜超滤浓缩。得到纯化的人尿激肽原酶。
试验动物：
新西兰大白兔，体重1.8～2.5kg。在光照充足、通风和空调设备良好动物室饲养，室温控制在20-25℃，湿度为40-65％。
将新西兰大白兔随机分为4组，每组6只兔子(雌雄各半)。
用乌拉坦(1000mg/kg)静脉注射麻醉后，切开气管，插入气管套管。一侧颈动脉插管并与压力换能器相连，经AP-601G放大器测量股动脉血压。
在血压指标稳定后记录5分钟作初始对照，然后静脉注射给药(2ml/kg)，对照组给予等体积氯化钠注射液，静脉注射给药用定时匀速推注器在20分钟注完。分别记录给药前及给药后在5、15、30、45、60min时间点的平均动脉压。
注射前将样品1-3按照每Kg试验动物一次注射量为2ml，一次注射人尿激肽原酶剂量0.0065PNA/Kg，用氯化钠注射液注射液进行稀释。对照组按照每Kg试验动物一次注射氯化钠注射液为2ml。
结果：
各组不同时间点平均动脉压值如下表4，其中0组为氯化钠注射液对照组，1组为人尿激肽原酶样品1组，2组为人尿激肽原酶样品2组。数据显示：0组和1组，从注射开始到注射结束的整个观察时间内，平均动脉压较稳定，未出现明显波动，而组2则在给药5分钟即出现血压明显下降，给药结束后40分钟恢复注射前的平均动脉压。
表4不同人尿激肽原酶制品对平均动脉压(Kpa)的影响(n＝6)
  初始值  静脉给药  5min  静脉给药  15min  静脉给药  30min  静脉给药  45min  静脉给药  60min  0  14.6±1.2  14.8±1.7  14.9±1.7  14.6±1.6  14.8±1.5  14.6±1.8  1  14.2±1.3  14.3±1.8  14.3±1.7  14.2±1.6  14.3±1.6  14.3±1.8  2  14.9±1.6  12.1±1.5**  12.4±2.0*  12.3±1.4**  13.0±1.7**  14.5±1.8
注：*和**分别表示各组内各时间点压力与初始压力比较，P<0.05和P<0.01
上述结果显示：人尿激肽原酶样品1组和样品2组之间对血压的影响有明显差异，样品1组在上述给药条件下对血压没有明显影响，而样品2组则表现出短期的对血压的下降作用。