说明书组织蛋白酶半胱氨酸蛋白酶抑制剂
背景技术
人类和其它哺乳动物中的多种疾病都涉及或者与异常的骨吸收相关。这些疾病包括但不限于骨质疏松症、肾上腺糖皮质激素诱发的骨质疏松症、Paget’s病、异常升高的骨更新、牙周病、牙齿损害、骨折、风湿性关节炎、骨关节炎、假体周围溶骨症、骨脆症病、恶性肿瘤的高钙血症或者多发性骨髓瘤。这些疾病中最常见的一种疾病是骨质疏松症，它在绝经后的女性中发生最为频繁。骨质疏松症是一种系统骨骼疾病，其特征在于低骨重量和骨组织微结构退化，同时随之而来的使得骨骼脆性和易遭受骨折的性能增加。骨质疏松骨折是导致老年人群发病和致死的主要原因。多达50％的女性和三分之一的男性会遭受骨质疏松骨折。大部分老年人群已经具有低骨骼密度并且具有高骨折风险。显著需要预防和治疗骨质疏松症以及其它与骨吸收相关的症状。因为骨质疏松症以及其它与骨骼损害相关的疾病通常都是慢性症状，因此，人们确信适当的疗法一般将需要慢性处理。
组织蛋白酶属于半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶总科。这些蛋白酶在正常生理学的结缔组织退化以及病理的结缔组织退化中起作用。组织蛋白酶在细胞内蛋白质降解、代谢回转和改造中起着举足轻重的作用。迄今为止，多种组织蛋白酶已经在多种来源中得到了鉴定和排序。这些组织蛋白酶天然地存在于多种组织中。例如，组织蛋白酶B、C、F、H、L、K、O、S、V、W和Z已经得到了克隆。组织蛋白酶L与正常的溶菌酶蛋白质水解以及若干病态相牵连，包括但不限于黑素瘤转移。组织蛋白酶S与阿尔茨海默氏病、动脉粥样硬化症、慢性阻塞性肺病和某些自身免疫疾病相牵连，包括但不限于青少年发作糖尿病、多发性硬化、慢性天疱疮、Graves’疾病、重症肌无力、系统红斑狼疮、类风湿性关节炎和桥本氏甲状腺炎；与变应性紊乱相牵连，包括但不限于哮喘；以及与外源性免疫反应相牵连，包括但不限于器官移植排斥或者组织移植排斥。升高的组织蛋白酶B水平和酶的重新分配在肿瘤中得到了发现，这表示它在肿瘤发病和转移中起作用。此外，异常的组织蛋白酶B活性与某类疾病状态相牵连，如类风湿性关节炎、骨关节炎、肺孢子虫肺炎、急性胰炎、炎性的气道疾病和骨与关节病症。
哺乳动物组织蛋白酶与引起疾病的寄生虫表达的类木瓜蛋白酶半胱氨酸蛋白酶相关，所述寄生虫包括原生动物、扁蠕虫、植物线虫和节肢动物家族的寄生虫。这些半胱氨酸蛋白酶在这些有机体的生命周期中起着主要作用。
人类I型胶原，骨中的主要胶原，是组织蛋白酶K的优良基质。参见Kafienah，W.等人，1988，Biochem J，331：727-732，其全部内容在此引入作为参考。对组织蛋白酶K使用反义寡核苷酸的体外试验已经显示了降低的体外骨吸收，这可能是由于组织蛋白酶K信使RNA翻译的减少。参见Inui，T.等人，1997，J Biol Chem，272：8109-8112，其全部内容在此引入作为参考。组织蛋白酶K的晶体结构已经得到了解析。参见McGrath，M.E.等人，1997，Nat Struct Biol，4：105-109；Zhao，B.等人，1997，Nat Struct Biol，4：109-11，其全部内容在此引入作为参考。同样，对基于组织蛋白酶K抑制剂的选择性缩氨酸已经进行了研究。参见Bromme，D.等人，1996，Biochem J，315：85-89；Thompson，S.K.等人，1997，Proc Natl Acad Sci USA，94：14249-14254，其全部内容在此引入作为参考。因此，组织蛋白酶K抑制剂可以降低骨吸收。这些抑制剂对治疗涉及骨吸收的病症将会有用，涉及骨吸收的病症例如骨质疏松症。
发明概述
本发明涉及能够在需要其的哺乳动物中治疗和预防组织蛋白酶依赖症状或者疾病状态的化合物。本发明的一种实施方案通过式I化合物和其药学上可接受的盐、立体异构体和N-氧化物衍生物进行说明：
发明详述
本发明涉及以下化学式的化合物：
其中R1和R2与它们连接的碳原子合起来形成C3-4环烷基，其任选被C1-3烷基取代；
R3为C1-6烷基，其任选被1～4个氟或者1～4个氯取代；
R4是被1～5个卤素原子取代的C1-6烷基；
R5为氢或者C1-6烷基，其任选被1～5个卤素原子取代；
D各自独立地为芳基或者杂芳基；
R6为氢或者C1-6烷基，其任选被1～2个羟基或者2～6个卤素原子取代；
R7为C1-6烷基，其任选被2～5个卤素原子取代；
n为2；
或者其药学上可接受的盐、立体异构体或者N-氧化物衍生物。
在本发明的一种实施方案中，R1和R2与它们连接的碳原子合起来形成环丙基。
在本发明的一种实施方案中，D为苯基。
在本发明的一种实施方案中，R4为CF3。
在本发明的一种实施方案中，R5为氢。
在本发明的一种实施方案中，R7是被两个或者三个氟取代的C1-3烷基。
除非另有说明，如上所述的优选实施方案意指包括所有具体和优选基团的组合。
本发明的具体实施方案包括但不限于：
N1-(1-氰基环丙基)-N2-(1-{4′-[2，2-二氟-1-羟基乙基]联苯基-4-基}-2，2，2-三氟乙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺；
N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-{2，2，2-三氟-1-[4′-(2，2，2-三氟-1-羟基乙基)联苯基-4-基]乙基}-L-亮氨酸酰胺；
N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-(2，2，2-三氟-1-{4′-[3，3，3-三氟-1-羟基-1-甲基丙基]联苯基-4-基}乙基)-L-亮氨酸酰胺；
N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-(2，2，2-三氟-1-{4′-[2，2，2-三氟-1-羟基-1-(三氟甲基)乙基]联苯基-4-基}乙基)-L-亮氨酸酰胺；
N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-{2，2，2-三氟-1-[4′-(2，2，2-三氟-1-羟基-1-甲基乙基)联苯基-4-基]乙基}-L-亮氨酸酰胺；
N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-(2，2，2-三氟-1-{4′-[1-羟基-1-(三氟甲基)丙基]联苯基-4-基}乙基)-L-亮氨酸酰胺；
N1-(1-氰基环丙基)-N2-(1-{4′-[2，2-二氟-1-羟基-1-甲基乙基]联苯基-4-基}-2，2，2-三氟乙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺；
N1-(1-氰基环丙基)-N2-(1-{4′-[2，2-二氟-1-羟基-1-(羟甲基)乙基]联苯基-4-基}-2，2，2-三氟乙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺；
N2-[1-(4-溴苯基)-2，2，2-三氟乙基]-N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺；
N1-(1-氰基环丙基)-N2-((1S)-1-{4′-[(1R)-2，2-二氟-1-羟基乙基]联苯基-4-基}-2，2，2-三氟乙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺；
N1-(1-氰基环丙基)-N2-((1S)-1-{4′-[(1S)-2，2-二氟-1-羟基乙基]联苯基-4-基}-2，2，2-三氟乙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺；
N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-{(1S)-2，2，2-三氟-1-[4′-(2，2，2-三氟-1-羟基乙基)联苯基-4-基]乙基}-L-亮氨酸酰胺；
N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-((1S)-2，2，2-三氟-1-{4′-[(1S)-3，3，3-三氟-1-羟基-1-甲基丙基]联苯基-4-基}乙基)-L-亮氨酸酰胺；
N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-((1S)-2，2，2-三氟-1-{4′-[(1R)-3，3，3-三氟-1-羟基-1-甲基丙基]联苯基-4-基}乙基)-L-亮氨酸酰胺；
N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-{(1S)-2，2，2-三氟-1-[4′-(R)-(2，2，2-三氟-1-羟基乙基)联苯基-4-基]乙基}-L-亮氨酸酰胺；
N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-((1S)-2，2，2-三氟-1-{4′-[2，2，2-三氟-1-羟基-1-(三氟甲基)乙基]联苯基-4-基}乙基)-L-亮氨酸酰胺；
N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-{(1 S)-2，2，2-三氟-1-[4′-(2，2，2-三氟-1-羟基-1-甲基乙基)联苯基-4-基]乙基}-L-亮氨酸酰胺；
N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-((1S)-2，2，2-三氟-1-{4′-[1-羟基-1-(三氟甲基)丙基]联苯基-4-基}乙基)-L-亮氨酸酰胺；
N1-(1-氰基环丙基)-N2-((1S)-1-{4′-[(1R)-2，2-二氟-1-羟基-1-甲基乙基]联苯基-4-基}-2，2，2-三氟乙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺；
N1-(1-氰基环丙基)-N2-((1S)-1-{4′-[(1S)-2，2-二氟-1-羟基-1-甲基乙基]联苯基-4-基}-2，2，2-三氟乙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺；
N1-(1-氰基环丙基)-N2-((1S)-1-{4′-[(1S)-2，2-二氟-1-羟基-1-(羟甲基)乙基]联苯基-4-基}-2，2，2-三氟乙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺；
N1-(1-氰基环丙基)-N2-((1S)-1-{4′-[(1R)-2，2-二氟-1-羟基-1-(羟甲基)乙基]联苯基-4-基}-2，2，2-三氟乙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺；
N2-[(1S)-1-(4-溴苯基)-2，2，2-三氟乙基]-N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺；
及其药学上可接受的盐、立体异构体和N-氧化物衍生物。
在本发明范围内还包括含有如上所述的式I化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明还预期包括含有药学上可接受的载体和任何在本申请中明确公开的化合物的药物组合物。
本发明的另一实施方案涉及含有式I化合物或者其药学上可接受的盐、立体异构体或者N-氧化物衍生物的口服药物组合物，其适于按照剂量间隔为每周一次、每两周一次、每半月一次或者每月一次的连续制度抑制骨吸收。
根据在本文中包含的教导，本发明的这些和其它方面将是显而易见的。
应用
本发明化合物为组织蛋白酶抑制剂，并且因此可以用于治疗或者预防哺乳动物组织蛋白酶依赖疾病或者症状，优选人类。特别地，本发明化合物为组织蛋白酶K抑制剂，并且因此可以用于治疗或者预防哺乳动物组织蛋白酶K依赖性疾病或者症状，优选人类。
与现有技术中已知的结构类似化合物相比，本发明化合物的优点在于它们具有显著的改良药物动力学分布。明确而言，本发明化合物具有优良的生物利用度，例如但不限于，在0.5-1％甲基纤维素(methocel)中，剂量为10毫克/千克雄性Sprague Dawley大鼠。另外，本发明化合物提供了比本领域已知的结构类似化合物更长的药物系统曝置期。
“组织蛋白酶依赖疾病或者症状”是指依赖一种或多种组织蛋白酶活性的病理情况。“组织蛋白酶K依赖疾病或者症状”是指依赖一种或多种组织蛋白酶K活性的病理情况。与组织蛋白酶K活性相关的疾病包括骨质疏松症、肾上腺糖皮质激素诱发的骨质疏松症、Paget’s病、异常疾病、牙齿损害、骨折、风湿性关节炎、骨关节炎、假体周围溶骨症、骨脆症、动脉粥样硬化症、肥胖病、青光眼、慢性阻塞性肺病和癌症(包括转移性骨骼疾病、恶性肿瘤的高钙血症和多发性骨髓瘤)。在用本发明要求的化合物治疗这些症状中，需要的治疗剂量将根据具体疾病而不同，并且本领域熟练技术人员可以轻易确定该剂量。虽然治疗和预防都预期在本发明范围内，但是这些症状的治疗是优选的用途。
本发明的一种实施方案是在需要其的哺乳动物中抑制组织蛋白酶活性的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。
本发明的一类实施方案是方法，其中组织蛋白酶活性是组织蛋白酶K活性。
本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗或者预防组织蛋白酶依赖症状的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。
本发明的一类实施方案是方法，其中组织蛋白酶活性是组织蛋白酶K活性。
本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中抑制骨损害的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中降低骨损害的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗异常升高的骨更新和骨折的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。组织蛋白酶K抑制剂在抑制骨吸收中的应用在文献中是已知的，参见Stroup，G.B.，Lark，M.W.，Veber，DF.，Bhattacharrya，A.，Blake，S.，Dare，L.C.，Erhard，K.F.，Hoffman，S.J.，James，I.E.，Marquis，R.w.，Ru，Y.，Vasko-Moser，J.A.，Smith，B.R.，Tomaszek，T.和Gowen，M.Potent and selective inhibition of human cathepsin K leads toinhibition of bone resorption in vivo in a nonhuman primate.J.BoneMiner.Res.，16：1739-1746；2001；和Votta，B.J.，Levy，M.A.，Badger，A.，Dodds，R.A.，James，I.E.，Thompson，S.，Bossard，M.J.，Carr，T.，Connor，J.R.，Tomaszek，T.A.，Szewczuk，L.，Drake，F.H.，Veber，D.和Gowen，M.Peptide aldehyde inhibitors of cathepsin Kinhibit bone resorption both in vivo and in vitro.J.Bone Miner.Res.12：1396-1406；1997。
本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗或者预防骨质疏松症的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何上述药物组合物。组织蛋白酶K抑制剂在治疗或者预防骨质疏松症(包括肾上腺糖皮质激素诱发的骨质疏松症)中的应用在文献中是已知的，参见Saftig，P.，Hunziker，E.，Wehmeyer，O.，Jones，S.，Boyde，A.，Rommerskirch，W.，Moritz，J.D.，Schu，P.和Vonfigura，K.Impaired osteoclast bone resorption leads toosteopetrosis in cathepsin K-deficient mice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：13453-13458；1998。
本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗或者预防牙周病或者牙齿损害的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何上述药物组合物。组织蛋白酶K抑制剂在治疗或者预防牙周病或者牙齿损害中的应用已经在文献中进行了论述，参见Sasaki，T.，“Differentiation and functions of osteoclasts andosontoclasts in mineralized tissue resorption，”Microsc Res Tech.2003Aug 15；61(6)：483-95。
本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗或者预防风湿性关节炎或者风湿性关节症状的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。在文献中，已知关节周的骨的渐进破坏是风湿性关节炎(RA)病人中关节机能障碍和关节无力的主要原因，参见Goldring SR，“Pathogenesis of boneerosions in rheumatoid arthritis”.Curr.Opin.Rheumatol.2002；14：406-10。患有RA患者的关节组织分析已经提供证据，组织蛋白酶K阳性破骨细胞是介导与风湿性滑液损害有关的病灶骨吸收的细胞类型，参见Hou，W-S，Li，W，Keyszer，G，Weber，E，Levy，R，Klein，MJ，Gravallese，EM，Goldring，SR，Bromme，D，“Comparisonof Cathepsin K and S expression within the Rheumatoid andOsteoarthritic Synovium”，Arthritis Rheumatism 2002；46：663-74。此外，全身性骨损害是导致与严重RA有关的病状的主要原因。在患有慢性RA的患者中，殿部和脊柱的骨折几率得到了显著增加，参见GouldA，Sambrook，P，Devlin J et al，“Osteoclastic activation is the principalmechanism leading to secondary osteoporosis in rheumatoid arthritis”.J.Rheumatol.1998；25：1282-9。组织蛋白酶K抑制剂在关节下骨吸除和全身性骨损害的治疗或者预防中的应用表明了在风湿性关节炎增进上药理学介入的合理方法。
本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗或者预防骨关节炎加重的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。在文献中，已知骨关节炎(OA)伴随有明确的关节变化，包括关节软骨表面侵蚀、周围关节软骨内骨化/骨赘增生和软骨下骨硬化和孢囊形成，参见Oettmeier，R &Abendroth，K，“Osteoarthritis and bone：osteologic types ofosteoarthritis of the hip”，Skeletal Radiol.1989；18：165-74。最近，已经提出了软骨下骨硬化可能具有促使OA开始和加重的作用。当关节响应重复的冲动负载时，变硬的软骨下骨只能较差的减弱和分散通过关节的压力，使得该压力通过关节软骨表面成为更大的机械应力。这反过来也促进了软骨磨损和纤化，参见Radin，EL和Rose RM，“Roleof subchondral bone in the initiation and progression of cartilagedamage”，Clin.Orthop.1986；213：34-40.通过抗吸收试剂(例如组织蛋白酶K抑制剂)抑制过多的关节下骨吸收，将导致软骨下骨更新受到抑制，由此可能会对进行性OA产生有利的影响。
除上述假设之外，采自OA病人滑膜和关节软骨样品的滑液成纤维细胞、巨噬细胞相似细胞和软骨细胞中的组织蛋白酶K蛋白质表达最近得到了鉴定，参见Hou，W-S，Li，W，Keyszer，G，Weber，E，Levy，R，Klein，MJ，Gravallese，EM，Goldring，SR，Bromme，D，“Comparison of Cathepsin K and S expression within the Rheumatoidand Osteoarthritic Synovium”，Arthritis Rheumatism 2002；46：663-74；和Dodd，RA，Connor，JR，Drake，FH，Gowen，M，“Expression ofCathepsin K messenger RNA in giant cells and their precursors inhuman osteoarthritic synovial tissues”.Arthritis Rheumatism 1999；42：1588-93；和Konttinen，YT，Mandelin，J，Li，T-F，Salo，J，Lassus，J等人“Acidic cysteine endoproteinase cathepsin K in thedegeneration of the superficial articular hyaline cartilage inosteoarthritis”，Arthritis Rheumatism 2002；46：953-60。由此，这些近期研究涉及组织蛋白酶K在破坏与骨关节炎进行相关的关节软骨II型胶原中的作用。由此，如本发明所述的组织蛋白酶K抑制剂在骨关节炎治疗或者预防中的应用包括两种不同的机制，一种机制是抑制破骨细胞驱动的软骨下骨更新，和第二种机制是直接抑制患有OA的患者的滑膜和软骨中的II型胶原变性。
本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗假体周围溶骨症的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。组织蛋白酶K抑制剂在治疗或者预防假体周围溶骨症中的应用已经在文献中进行了论述，参见，Mandelin，J.，等人，“Interface tissue fibroblasts from loose total hip replacementprosthesis produce receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand，osteoprotegerin and cathepsin K，”J Rheumatol.2005 Apr；32(4)：713-20。
本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗骨骼疾病(比如Paget’s疾病、骨脆症和由多发性骨髓瘤导致的骨骼病变)的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。组织蛋白酶K抑制剂用于治疗Paget’s疾病、骨脆症和由多发性骨髓瘤导致的骨骼病变的应用已经在文献中进行了论述，参见，Lipton，A.，“New therapeutic agents for the treatment of bonediseases，”Expert Opin Biol Ther.2005 Jun；5(6)：817-32。
本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗癌症的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。在文献中已知组织蛋白酶K在人类乳腺癌、前列腺癌和脊索癌中表达并且其具有基体分解能力，参见Littlewood-EvansAJ，Bilbe G，Bowler WB，Farley D，Wlodarski B，Kokubo T，InaokaT，Sloane J，Evans DB，Gallagher JA，“The osteoclast-associatedprotease cathepsin K is expressed in human breast carcinoma，”CancerRes 1997 Dec 1；57(23)：5386-90.Brubaker KD，Vessella RL，True LD，Thomas R，Corey E，“Cathepsin K mRNA and protein expression inprostate cancer progression，”J Bone Miner Res 2003 18，222-30.Haeckel C，Krueger S，Kuester D，Ostertag H，Samii M，Buehling F，Broemme D，Czerniak B，Roessner A，“Expression of cathepsin K inchordoma，”Hum Pathol 2000 Jul；31(7)：834-40。
本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗动脉粥样硬化症的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。下文献中已知组织蛋白酶K在人类动脉粥样化中表达并且具有显著的弹性蛋白酶活性，参见Sukhova GK，ShiGP，Simon DI，Chapman HA，Libby P，“Expression of the elastolyticcathepsins S and K in human atheroma and regulation of theirproduction in smooth muscle cells，”J Clin Invest 1998 Aug 102，576-83。
本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗肥胖病的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。在文献中已知组织蛋白酶K mRNA在数种肥胖病鼠模型中的脂肪组织中和肥胖人类男性的脂肪组织中升高，参见ChielliniC，Costa M，Novelli SE，Amri EZ，Benzi L，Bertacca A，Cohen P，Del Prato S，Friedman JM，Maffei M，“Identification of cathepsin K asa novel marker of adiposity in white adipose tissue，”J Cell Physiol2003，195，309-21。
本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗青光眼的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。组织蛋白酶K在虹膜、睫状体和视网膜色素上皮细胞中高度表达并且由此可以用于治疗青光眼，参见Ortega，J.，et al.，“Gene Expression of Proteases and Protease Inhibitors in the HumanCiliary Epithelium and ODM-2 cells，”Exp.Eye Res(1997)65，289-299；国际公开申请WO 2004/058238(Alcon，Inc.)。
本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗慢性阻塞性肺病的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。在文献中已知组织蛋白酶K在肺部纤维化中起作用，参见Buhling，F.等人，“Pivotal role of cathepsin K in lungfibrosis，”Am J Pathol.2004 Jun；164(6)：2203-16。
本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗寄生虫感染的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。在文献中已知哺乳动物组织蛋白酶与在这些寄生虫的生命周期中起着重要作用的类木瓜蛋白酶半胱氨酸蛋白酶相关。所述寄生虫涉及疟疾、美洲锥虫病、刚果锥虫病、利什曼病、贾第虫病、滴虫病、变形虫病、血吸虫病、片吸虫病、肺吸虫病和肠蛔虫疾病，参见Lecaille F，Kaleta J，Bromme D.，Human and parasiticpapain-like cysteine proteases：their role in physiology and pathologyand recent developments in inhibitor design.Chem Rev 2002 102，4459-88。
本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗严重急性呼吸性综合症(SARS)的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。
本发明的另一实施方案是在需要其的哺乳动物中治疗转移性骨骼疾病的方法，包括给药所述哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何药物组合物。在文献中已知，破骨细胞引起骨吸收并且由转移性肿瘤诱发的骨组织破坏和高钙血症通过破骨细胞进行。据此，对破骨细胞的抑制可以预防骨组织破坏和骨骼转移，参见Miyamoto，T.和Suda，T.，“Differentiation and function ofosteoclasts，”Keio J Med 2003 Mar；52(1)：1-7。
本发明的另一实施方案是给药哺乳动物治疗有效量的如上所述的任何化合物或者任何组合物，以治疗与组织蛋白酶S相关的哺乳动物疾病，包括阿兹海默病、动脉粥样硬化症、慢性阻塞性肺病、癌症和某些自身免疫疾病，包括但不限于青少年发作糖尿病、多发性硬化、慢性天疱疮、Graves’疾病、重症肌无力、系统红斑狼疮、类风湿性关节炎和桥本氏甲状腺炎；变应性疾病，包括但不限于哮喘；和外源性免疫反应，包括但不限于器官移植排斥或者组织移植排斥。在文献中已知组织蛋白酶S活性与上述疾病状态相关，参见
Munger J S，Haass C，Lemere CA，Shi GP，Wong WS，Teplow DB，Selkoe DJ，Chapman HA，“Lysosomal processing of amyloid precursorprotein to A beta peptides：a distinct role for cathepsin S，”Biochem J 1995 311，299-305.Sukhova GK，Zhang Y，Pan JH，Wada Y，Yamamoto T，Naito M，Kodama T，Tsimikas S，Witztum JL，Lu ML，SakaraY，Chin MT，Libby P，Shi GP，“Deficiency of cathepsin S reduces atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice，”J Clin Invest 2003 111，897-906.Zheng T，Zhu Z，Wang Z，Homer RJ，Ma B，Riese RJJr，Chapman HA Jr，Shapiro SD，Elias JA“Inducible targeting of IL-13 to the adult lung causes matrixmetalloproteinase-and cathepsin-dependent emphysema，”J Clin Invest 2000 106，1081-93.Shi GP，Sukhova GK，Kuzuya M，Ye Q，Du J，Zhang Y，Pan JH，Lu ML，Cheng XW，Iguchi A，Perrey S，LeeAM，Chapman HA，Libby P，“Deficiency of the cysteine protease cathepsin S impairs microvesselgrowth，”Circ Res 2003 92，493-500.Nakagawa TY，Brissette WH，Lira PD，Griffiths RJ，Petrushova N，Stock J，McNeish JD，Eastman SE，Howard ED，Clarke SR，Rosloniec EF，Elliott EA，Rudensky AY，“Impaired invariant chain degradation and antigen presentation and diminished collagen-induced arthritisin cathepsin S null mice，”Immunity 1999 10，207-17.
本发明的例证是任何如上所述化合物在制备用于在需要其的哺乳动物中治疗和/或预防骨质疏松症的药物中的用途。本发明更进一步的例证是任何如上所述化合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防：骨损害、骨吸收、骨折、转移性骨疾病和/或与组织蛋白酶功能相关的病症。
本发明的其它例证是本发明的组织蛋白酶K抑制剂或者其药学上可接受的盐、立体异构体或者N-氧化物衍生物的用于制造药物的用途，所述药物是在需要其的哺乳动物中按照每周一次、每两周一次、每月两次或者每月一次的剂量间隔的连续给药方案治疗选自以下的疾病的口服单元剂型：骨质疏松症、肾上腺糖皮质激素诱发的骨质疏松症、Paget’s病、异常升高的骨更新、牙周病、牙齿损害、骨折、风湿性关节炎、骨关节炎、假体周围溶骨症、骨脆症、动脉粥样硬化症、肥胖病、青光眼、慢性阻塞性肺病、转移性骨骼疾病、恶性肿瘤的高钙血症或者多发性骨髓瘤。本发明的例证还是通过将本发明组织蛋白酶K抑制剂按照每周一次、每两周一次、每月两次、每月一次的连续给药方案给药至需要其的哺乳动物从而治疗选自以下的疾病：骨质疏松症、肾上腺糖皮质激素诱发的骨质疏松症、Paget’s疾病、异常升高的骨更新、牙周病、牙齿损害、骨折、风湿性关节炎、骨关节炎、假体周围溶骨症、骨脆症、动脉粥样硬化症、肥胖病、青光眼、慢性阻塞性肺病、转移性骨骼疾病、恶性肿瘤的高钙血症或者多发性骨髓瘤。
本发明化合物可以单独给药或者优选协同药学上可接受的载体或者稀释剂联合给药至哺乳动物，优选人类，在药物组合物中，根据标准药物实践，任选与已知的辅剂联合，辅剂例如明矾。所述化合物可以口服给药或者胃肠外给药，包括静脉内的、肌内的、腹膜内的、皮下的、直肠的和局部的给药途径。
在用于口服使用的片剂的情况下，通常加入常规使用的载体，包括乳糖和玉米淀粉，和润滑剂，例如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服给药，有益的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。对于根据本发明的治疗化合物的口服应用，选择的化合物可以通过以下方式给药，例如以片剂或者胶囊形式，或者以水溶液或者悬浮液形式给药。对于片剂或者胶囊形式的口服给药，药物活性成分可以与口服的、无毒的、药学上可接受的惰性载体联合使用，惰性载体例如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸氢钙、硫酸钙、甘露醇和山梨糖醇等等；对于液态形式的口服给药，口服的药物组分可以与任何口服的、无毒的、药学上可接受的惰性载体联合使用，惰性载体例如乙醇、甘油和水等等。此外，当期望或者需要时，也可以将合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂结合入混合物中。适当的结合剂包括淀粉、明胶、天然糖类(例如葡萄糖或者β-乳糖)、玉米甜味剂、天然树胶和合成树胶(例如阿拉伯胶、西黄蓍胶或者海藻酸钠)、羧甲基纤维素、聚乙二醇和石蜡等等。用于这些剂型中的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠和氯化钠等等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、皂土和黄原胶等等。当含水混悬剂需要口服应用时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂联合使用。如果需要，可以将某些甜味剂和/或增香剂加入其中。对于肌内、腹膜内、皮下和静脉内应用，通常制备活性成分的无菌液，并且应当对溶液的pH值进行适当地调节和缓冲。对于静脉内使用，应该对溶质的总浓度进行控制，以便使得制剂等渗。
本发明化合物还可以以微脂粒输送系统的形式进行给药，微脂粒输送系统例如小单层囊、大单层囊和多层囊。脂质体可以由多种磷脂形成，例如胆固醇、十八胺或者卵磷脂。
本发明化合物也可以通过利用单克隆抗体作为个体载体进行递送，所述化合物分子连接到单克隆抗体上。本发明化合物也可以与作为目标药物载体的可溶性聚合物结合。上述聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、多羟丙基甲基丙烯酰胺-苯酚、多羟基-乙基天冬酰胺-苯酚或者棕榈酰基取代的聚氧化乙烯-聚赖氨酸。此外，可以将本发明化合物结合到一类用于实现药物控释的可生物降解的聚合物上，可生物降解的聚合物例如聚丙醇酸、聚乙醇酸、聚丙醇酸和聚乙醇酸的共聚物、聚ε-己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和交联的或者亲水疏水两重性的水凝胶嵌段共聚物。
本发明化合物还可以用于与已知可以用于治疗或者预防以下疾病的试剂联合使用，所述疾病为骨质疏松症、肾上腺糖皮质激素诱发的骨质疏松症、Paget’s病、异常升高的骨更新、牙周病、牙齿损害、骨折、风湿性关节炎、骨关节炎、假体周围溶骨症、骨脆症、转移性骨骼疾病、恶性肿瘤的高钙血症和多发性骨髓瘤。本发明公开的化合物与其它对治疗或者预防骨质疏松症或者其它骨病症有用的试剂的联合同样包括在本发明范围内。基于药物的特性以及所涉及的疾病，本领域普通技术人员将可以辨别哪些试剂的联合有效。所述试剂包括以下：有机双膦酸酯；雌激素受体调节剂；雄激素受体调节剂；破骨细胞质子ATP酶抑制剂；HMG-CoA还原酶抑制剂；整联蛋白受体拮抗剂；维生素D；合成维生素D类似物；合成代谢试剂，比如PTH；非甾族抗炎药物；选择性环加氧酶-2抑制剂；白细胞间介素-1β抑制剂；LOX/COX抑制剂；RANKL抑制剂；及其药学上可接受的盐和混合物。优选的联合为本发明化合物和有机双膦酸酯的联合。另一优选的组合为本发明化合物和雌激素受体调节剂的组合。另一优选的组合为本发明化合物和雄激素受体调节剂的组合。另一优选的组合为本发明化合物和成骨细胞合成代谢剂的组合。
“有机双膦酸酯”包括但不限于下面化学式的化合物：
其中n为0～7的整数，和其中A和X独立地选自H、OH、卤素、NH2、SH、苯基、C1-C30烷基、C3-C30支链或者环烷基、具有两个或者三个N的二环结构、C1-C30取代的烷基、C1-C10烷基取代的NH2、C3-C10支链或者环烷基取代的NH2、C1-C10二烷基取代的NH2、C1-C10烷氧基、C1-C10烷基取代的硫基、苯硫基、卤代苯硫基、C1-C10烷基取代的苯基、吡啶基、呋喃基、吡咯烷基、咪唑基、咪唑并吡啶基和苄基，从而使得当n为0时A和X都不选自H或者OH；或者A和X与它们连接的碳原子合起来形成C3-C10环。
在上述化学式中，所述烷基可以是直链、支链或者环状的烷基，条件是对化学式选择充足的原子。C1-C30取代烷基可以包含多种取代基，取代基的非限制性实例包含选自以下的取代基：苯基、吡啶基、呋喃基、吡咯烷基、咪唑基、NH2、C1-C10烷基或者二烷基取代的NH2、OH、SH和C1-C10烷氧基。
就A和/或X取代基来说，上述化学式还意图包含复杂碳环结构、芳香结构和杂原子结构，这些结构的非限制性实例包括萘基、喹啉基、异喹啉基、金刚烷基和氯代苯硫基。
在此还可以使用双膦酸酯的药学上可接受的盐和衍生物。这些盐的非限制性实例包含选自以下的盐：碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和单-、二-、三-或者四-C1-C30烷基取代的铵盐。优选的盐选自钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铵盐。更优选钠盐。所述衍生物的非限制性实例包含选自以下的衍生物：酯、水合物和酰胺。
应当指出，在此使用的涉及本发明治疗剂的术语“双膦酸酯”的含义还包括二膦酸酯、双膦酸和二膦酸，以及这些物质的盐和衍生物。除非明确说明，在关于双膦酸酯中使用的具体命名法并不意味着对本发明范围的限制。因为当前本领域普通技术人员使用混合命名法，因此除非在本文中另有说明，在本发明中涉及双膦酸酯化合物的具体重量或者百分比基于酸活性重量。例如，短语“对于阿仑膦酸活性重量基位，约5mg选自阿仑膦酸酯、其药学上可接受的盐及其混合物的骨吸收抑制双膦酸酯”是指选择的双膦酸酯化合物的量以5mg阿仑膦酸为基准进行计算。
在此有效的双膦酸酯的非限制性实例包括以下：
阿仑膦酸酯(又名阿仑膦酸)、4-氨基-1-羟基亚丁基-1，1-二膦酸、阿仑膦酸钠或者阿仑膦酸钠三水合物、4-氨基-1-羟基亚丁基-1，1-二膦酸单钠三水合物。
阿仑膦酸酯描述于美国专利4,922,007中，Kieczykowski等人，公开于1999年5月1日；5,019,651，Kieczykowski等人，公开于1991年5月28日；5,510,517，Dauer等人，公开于1996年4月23日；5,648,491，Dauer等人，公开于1997年7月15日，它们的全部内容在此引入作为参考。
环庚基氨基甲撑-1，1-二膦酸，YM 175，Yamanouchi(英卡磷酸酯，以前称为cimadronate)，如Isomura等人的公开于1990年11月13日的美国专利4,970,335所述，其全部内容在此引入作为参考。
1，1-二氯甲撑-1，1-二磷酸(氯膦酸)和二钠盐(氯膦酸盐，Procter和Gamble)，描述于比利时专利672,205(1966)和J.Org.Chem，32，4111(1967)中，它们的全部内容都在此引入作为参考。
1-羟基-3-(1-吡咯烷基)-亚丙基-1，1-二膦酸(EB-1053)。
1-羟基乙烷-1，1-二膦酸(依替膦酸)。
1-羟基-3-(N-甲基-N-戊基氨基)亚丙基-1，1-二膦酸，又名BM-210955，Boehringer-Mannheim(埃本膦酸盐)，描述于1990年5月22日公开的美国专利No.4,927,814中，其全部内容在此引入作为参考。
1-羟基-2-咪唑并(1，2-a)吡啶-3-基乙叉(米诺膦酸酯)。
6-氨基-1-羟基亚己基-1，1-二膦酸(奈立膦酸酯)。
3-(二甲基氨基)-1-羟基亚丙基-1，1-二膦酸(奥帕膦酸酯)。
3-氨基-1-羟基亚丙基-1，1-二膦酸(帕米膦酸酯)。
[2-(2-吡啶基)亚乙基]-1，1-二膦酸(piridronate)，描述于美国专利编号4,761,406中，其全部内容在此引入作为参考。
1-羟基-2-(3-吡啶基)-亚乙基-1，1-二膦酸(利塞膦酸酯)。
(4-氯苯基)硫甲烷-1，1-二膦酸(替鲁膦酸酯)，如美国专利4,876,248，Breliere等人，1989年10月24日中所述，其全部内容在此引入作为参考。
1-羟基-2-(1H-咪唑-1-基)-亚乙基-1，1-二膦酸(唑来磷酸酯)。
双膦酸酯的非限制性实例包含阿仑膦酸酯、英卡膦酸酯、氯屈膦酸酯、依替膦酸酯、埃本膦酸酯、英卡磷酸酯、米诺膦酸酯、奈立膦酸酯、奥帕膦酸酯、帕米膦酸酯、piridronate、利塞膦酸酯、替鲁膦酸酯和唑来磷酸酯，及其药学上可接受的盐和酯。特别优选的双膦酸酯是阿仑膦酸盐，特别是阿仑膦酸的钠、钾、钙、镁或者铵盐。优选的双膦酸盐的例证是阿仑膦酸钠盐，特别是水合阿仑膦酸钠盐。所述盐可以与整摩尔数的水或者非整摩尔数的水进行水合。优选的双膦酸盐的其它例证是水合阿仑膦酸钠盐，特别是当水合盐是阿仑膦酸钠三水合物时。
应当认可，可以使用两种或更多种双膦酸酯活性物质的混合物。
有机双膦酸酯的精确剂量将随着剂量方案、选择的具体双膦酸酯、哺乳动物或者人类的年龄、大小、性别和状态、要进行治疗的病症的性质和严重程度以及其它相关的医疗和物理因素而变化。因此，精确的药学有效量不能预先规定，可以由护理者或者临床医生即时确定。适宜的量可以通过动物模型和人类临床研究的常规试验进行确定。通常，对双膦酸酯的适宜量进行选择以获得骨吸收抑制作用，即给药骨吸收抑制量的双膦酸酯。对于人类，双膦酸酯的有效口服剂量一般为约1.5～约6000μg/kg体重，并且优选约10～约2000μg/kg体重。对于阿仑膦酸单钠三水合物，一般人类给药剂量通常为约2毫克/天～约40毫克/天，优选为约5毫克/天～约40毫克/天。对于阿仑膦酸单钠三水合物，美国目前批准的用于预防骨质疏松症的剂量是5毫克/天，用于治疗骨质疏松症的剂量是10毫克/天，用于治疗Paget’s疾病的剂量是40毫克/天。
在另一种给药方案中，双膦酸酯可以每隔一段时间给药而不是按天给药，例如每周一次给药、每周两次给药、每两周一次给药和每月两次给药。在每周一次的给药方案中，阿仑膦酸单钠三水合物将按35毫克/周或者70毫克/周的剂量给药。
“选择性雌激素受体调节剂”是指干扰或者抑制雌激素结合至受体的化合物，与机制无关。雌激素受体调节剂的实例包含但不限于雌激素、孕激素、雌二醇、屈洛昔芬、雷洛昔芬、拉索昔芬、TSE-424、他莫昔芬、伊多昔芬、LY353381、LY117081、托瑞米芬、氟维司群、4-[7-(2，2-二甲基-1-氧代丙氧基-4-甲基-2-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-2H-1-苯并吡喃-3-基]-苯基-2，2-二甲基丙酸酯、4，4′-二羟基二苯甲酮-2，4-二硝基苯基-腙和SH646。
“雌激素受体β调节剂”是一种选择性激动或者拮抗雌激素受体β的化合物(ERβ激动ERβ经ERβ介导作用促进色氨酸羟化酶基因的转录(TPH，5-羟色胺合成中的关键酶))。雌激素受体β激动剂的实例可以PCT国际公开WO 01/82923(公开于2001年11月8日)和WO02/41835(公开于2002年5月20日)中发现，它们的全部内容都在此引入作为参考。
“雄激素受体调节剂”是指干扰或者抑制雄激素结合至受体的化合物，与机制无关。雄激素受体调节剂的实例包含非那甾胺以及其它5α-还原酶抑制剂、尼鲁米特、氟他米特、必卡他胺、利阿唑和阿比特龙醋酸盐。
“破骨细胞质子三磷酸腺苷酶抑制剂”是指质子三磷酸腺苷酶的抑制剂，发现于破骨细胞的顶膜上，并且据报道，其在骨吸收过程中起着显著的作用。此质子泵代表着设计可能可以用于治疗和预防骨质疏松症和相关代谢疾病的骨吸收抑制剂的诱人目标。参见C.Farina等人，“Selective inhibitors of the osteoclast vacuolar proton ATPase asnovel bone antiresorptive agents”，DDT，4：163-172(1999)，其全部内容在此引入作为参考。
“HMG-CoA还原酶抑制剂”是指3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶的抑制剂。对HMG-CoA还原酶具有抑制活性的化合物可以通过使用现有技术中众所周知的验定法轻易得到鉴定。例如，参见美国专利4,231,938第6栏和WO 84/02131第30～33页中描述或者引用的测定法。当在此使用时，术语“HMG-CoA还原酶抑制剂”和“HMG-CoA还原酶的抑制剂”具有相同的含义。
可以使用的HMG-CoA还原酶抑制剂的实例包括但不限于洛伐他汀MEVACOR；参见美国专利Nos.4,231,938，4,294,926和4,319,039)、辛伐他汀(ZOCOR；参见美国专利Nos.4,444,784、4,820,850和4,916,239)、普伐他汀(PRAVACHOL；参见美国专利Nos.4,346,227、4,537,859、4,410,629，5,030,447和5,180,589)、氟伐他汀(LESCOL；参见美国专利Nos.5,354,772、4,911,165、4,929,437、5,189,164、5,118,853、5,290,946和5,356,896)、阿伐他汀(LIPITOR；参见美国专利Nos.5,273,995、4,681,893、5,489,691和5,342,952)和西立伐他汀(还称为西伐他汀和BAYCHOL；参见美国专利No.5,177,080)。这些和另外可以用于本发明方法中的HMG-CoA还原酶抑制剂的结构式描述于M.Yalpani的“Cholesterol Lowering Drugs”，85～89页的第87页(1996年2月5日)中和美国专利Nos.4,782,084以及4,885,314中。在此使用的术语“HMG-CoA还原酶抑制剂”包含所有药学上可接受的内酯和开放酸形式(即，其中内酯环开放从而形成游离酸)，以及具有HMG-CoA还原酶抑制活性的化合物的盐和酯形式，并且因此上述盐、酯、开放酸和内酯形式的用途都包括在本发明范围内。内酯部分的实例及其相应的开放酸形式如下结构I和II所示。
内酯 开放酸
I II
在其中可以存在开放酸形式的HMG-CoA还原酶抑制剂中，盐形式和酯形式优选可以由开放酸形成，并且所有这些形式都包含在在此使用的术语“HMG-CoA还原酶抑制剂”的含义内。优选HMG-CoA还原酶抑制剂选自洛伐他汀和辛伐他汀，并且最优选辛伐他汀。在此，关于HMG-CoA还原酶抑制剂的术语“药学上可接受的盐”将意指用于本发明中的化合物的无毒盐，它们通常通过游离酸与适当的有机或者无机碱进行反应制备，尤其是那些由阳离子形成的盐，阳离子例如钠、钾、铝、钙、锂、镁、锌和四甲铵，以及由胺形成的盐，胺例如氨、乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、1-对氯苄基-2-四氢吡咯-1′-基-甲基苯并咪唑、二乙胺、哌嗪和三羟甲基氨基甲烷。HMG-CoA还原酶抑制剂的盐形式的其它实例可以包含但不限于，醋酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、洒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、乙二胺四乙酸钙盐、右旋樟脑磺酸、碳酸盐、氯化物、克拉维酸盐、柠檬酸盐、二盐酸化物、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、依托红霉素、esylate、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酰基阿散酸盐、己基间苯二酸盐、哈胺、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、异硫代硫酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、硫酸二甲酯、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、油酸盐、乙二酸盐、pamaote、棕榈酸盐、泛酸盐、磷酸酯/磷酸氢盐、多聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式醋酸盐、琥珀酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、8-氯茶碱盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘化物和戊酸盐。
所述HMG-CoA还原酶抑制剂化合物的酯类衍生物可以作为前药，当将其吸收到恒温动物血液中去时，酯类衍生物可以以一定方式裂开以释放药物形式和使得药物提供改善的治疗效能。
以上所应用的“整联蛋白受体对抗剂”是指选择性对抗、抑制或者抵消生理配体结合至αvβ3整联蛋白的化合物，指选择性对抗、抑制或者抵消生理配体结合至αvβ5整联蛋白的化合物，指选择性对抗、抑制或者抵消生理配体结合至αvβ3整联蛋白和αvβ5整联蛋白的化合物，和指对抗、抑制或者抵消表达于毛细血管内皮细胞上的特定整联蛋白的化合物。该术语还指αvβ6、αvβ8、α1β1、α2β1、α5β1、α6β1和α6β4整联蛋白拮抗剂。该术语还指αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α1β1、α2β1、α5β1、α6β1和α6β4整联蛋白任何组合的拮抗剂。H.N.Lode等人，PNAS USA，96：1591-1596，1999年，在自发肿瘤转移的根除中，已经观察到血管原性αv整联蛋白对抗剂和肿瘤特异性抗体细胞因子(白细胞介素-2)融合蛋白之间的协同作用。他们的结果表明这种联用对于癌症和转移性肿瘤增加的治疗可能有用。αvβ3整联蛋白受体对抗剂通过与所有现有药物不同的新机理抑制骨吸收。整联蛋白是介导细胞-细胞和细胞-基质相互作用的异源二聚的横跨膜粘着受体。α和β整联蛋白亚单位非共价相互作用，并且以二阶阳离子依赖方式结合细胞外基质配体。破骨细胞上最大量的整联蛋白是αvβ3(＞107/破骨细胞)，它们看来似乎在对细胞迁移和极化至关重要的细胞骨架组织中起着限速的作用。αvβ3的拮抗作用选自骨吸收抑制作用、再狭窄抑制作用、黄斑变性抑制作用、关节炎抑制作用和癌症以及转移性生长抑制作用。
“成骨细胞合成代谢剂”是指构造骨的制剂，例如PTH。已经表明，甲状旁腺激素(PTH)或者它的氨基末端片段及其类似物的间歇给药在动物和人类中预防、阻止、部分逆转骨损害和刺激骨生成。关于其论述，参考D.W.Dempster等人，“Anabolic actions of parathyroidhormone on bone”，Endocr Rev，14：690-709(1993)。研究已经表明了甲状旁腺激素在刺激骨生成并且从而提高骨质量和强度中的临床益处。结果报道于RM Neer等的New Eng J Med，344：1434-1441(2001)中。
此外，甲状旁腺激素相关蛋白质片段或者其类似物，例如PTHrP-(1-36)已经表明具有有效的抗钙尿作用[参见M.A.Syed等人，“Parathyroid hormone-related protein-(1-36)stimulates renal tubularcalcium reabsorption in normal human volunteers：implications for thepathogenesis of humoral hypercalcemia of malignancy”，JCEM，86：1525-1531(2001)]，并且还可以具有成为治疗骨质疏松症的合成代谢剂的可能性。
“维生素D”包括但不限于维生素D3(胆钙化醇)和维生素D2(麦角钙化醇)，它们是天然存在的维生素D(1α-羟基维生素D；25-羟基维生素D和1α，25-二羟基维生素D)的羟基化生物学活性代谢产物的生物学惰性前体。维生素D2和维生素D3在人类中具有相同的生物学效力。当维生素D2或者D3进入循环系统时，它通过细胞色素P450-维生素D-25-羟化酶进行羟基化，从而得到25-羟基维生素D。所述25-羟基维生素D代谢产物是生物学惰性的，并且它在肾中通过细胞色素P450-单加氧酶25(OH)D-1α-羟化酶得到进一步羟基化，从而给出1，25-二羟基维生素D。当血清钙降低时，甲状旁腺激素(PTH)的形成增加，它通过将25-羟基维生素D转化成1，25-二羟基维生素D调节钙的体内平衡和提高血浆钙水平。
认为1，25-二羟基维生素D是维生素D对钙和骨骼代谢产生作用的物质。所述1，25-二羟基代谢产物是保持钙吸收和骨骼完整性所需的活性激素。通过将单核细胞干细胞诱化异化成破骨细胞和将钙保持在正常范围内，钙的体内平衡通过1，25-二羟基维生素D得到保持，这通过将钙羟磷灰石沉积在骨骼表面上导致骨盐沉积，参见Holick，MF，“Vitamin D photobiology，metabolism，and clinical applications，”Endocrinology，第三版，990-1013(1995)，DeGroot L等人编辑。然而，升高的1α25-二羟基维生素D3的水平会导致血液中钙浓度升高和由骨骼代谢对钙浓度的异常调节，导致高钙血症。1α，25-二羟基维生素D3还间接调节骨骼代谢中的破骨活性，并且可以预期其升高的水平可以增强骨质疏松症中的过度骨吸收。
在本发明实施方案中，对维生素D化合物的适当量进行选择，从而在剂量给药间隔期间提供不会与组织蛋白酶K抑制剂的能力相抵触的适当的维生素D营养，从而获得骨吸收抑制作用。对于包括组织蛋白酶K抑制剂和维生素D化合物的本发明口服组合物，维生素D化合物的量为约100IU～约60,000IU。在本发明实施方案中，维生素D化合物的口服量的非限制性实例包括但不限于2,800IU、5,600IU、7,000IU、8,400IU、11,200IU、14,000IU、16,800IU或者19,600IU的剂量。对于每周剂量给药，维生素D的口服量的非限制性实例为2,800IU、5,600IU、7,000IU、8,400IU和11,200IU。对于每月剂量给药，维生素D的口服量的非限制性实例为11,200IU、14,000IU、15,400IU、16,800IU和19,600IU。
“合成维生素D类似物”包括与维生素作用相同的非天然存在的化合物。
“非甾族抗炎药物”或者NSAIDs经环加氧酶(COX)-1和COX-2抑制花生四烯酸向促炎性前列腺素的代谢。NSAIDs的非限制性实例包括：阿斯匹林、布洛芬、萘普生、双氯芬酸、依托度酸、fenoporfen、氟比洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、美洛昔康、萘丁美酮、奥沙普秦、吡罗昔康、舒林酸、托美汀、二氟苯水杨酸、甲氯胺苯酸盐和苯丁唑酮。
“选择性环加氧酶-2抑制剂”或者COX-2抑制剂是指抑制COX-2辅酶的非甾族抗炎药物(NSAID)，其有助于缓解体内疼痛和炎症。COX-2抑制剂的非限制性实例包括：西利考昔、艾托考昔、帕瑞考昔、罗非考昔、伐地考昔和鲁米昔布。
“白细胞间介素-1β抑制剂”或者IL-1β是指IL-1的抑制剂，它是由活化T-胸腺依赖性细胞和加强它们对促细胞分裂剂或者抗原的响应的单核细胞、巨噬细胞和其它细胞形成的可溶性因子。IL-1β抑制剂的非限制性实例包括双醋瑞因和莱菌。
“LOX/COX抑制剂”是指所有涉及花生四烯酸途径的三种主要酶(即，5-LOX、COX-1和COX-2)的抑制剂。LOX/COX抑制剂的非限制性实例为利克飞龙。
“RANKL抑制剂”是指受体活化剂NF-kB配体(RANKL)的抑制剂，它以前被称为破骨细胞分化因子(ODF)、骨保护素配体(OPGL)和TNF-相关的活化诱发细胞因子(TRANCE)。RANKL是破骨细胞形成和成熟的关键刺激物。RANKL抑制剂的非限制性实例为AMG-162。
如果配制成固定剂量，那么所述组合物产品使用如下所述剂量范围的本发明化合物和在其批准剂量范围内的其它药学活性剂。当组合制剂不适宜时，本发明化合物可以另外与已知的药学上可接受的试剂一起顺序使用。
与本发明化合物相关的术语“给药”及其变形(例如，“用药”化合物)，意指将化合物或者化合物的前体药物引入到需要治疗的动物系统中。当本发明化合物或者其前药与一种或多种其它活性剂(例如细胞毒素剂等等)组合提供时，应当将“给药”及其变形理解为包含所述化合物或者其前药和其它试剂同时和顺序引入。本发明包括本发明化合物的前药。通常，所述前药将是可以在体内轻易转换成所需要的化合物的本发明化合物的功能性衍生物。本发明设想的前药的非限制性实例包括可以水解以提供本发明的醇的酯；可以在体内得到还原从而提供本发明的醇的酮。应当理解，在一些情形中，酮的还原可能存在立体专一性，从而提供占优势的单一非对映体的醇。适宜的前药的其它实例以及选择和制备所述衍生物的常规方法描述于，例如“Designof Prodrugs”ed.H.Bundgaard，Elsevier，1985中，其全部内容在此引入作为参考。因此，在本发明治疗方法中，术语“给药”应该包含使用明确公开的化合物或者使用可以不必明确公开但是在给药患者后体内转化成指定化合物的化合物进行的多种所述症状的治疗。这些化合物的代谢产物包含当将本发明化合物引入生物环境时所产生的活性中心。
在本文中使用的术语“组合物”意图包括含有指定量的指定成分的产品，以及任何由指定量的指定成分的组合物直接或者间接得到的产品。
在此使用的术语“治疗有效量”是指能够在组织、系统、动物或者人类中引起生物反应或者药物反应的活性物质或者药物制剂的量，该量由研究人员、兽医、医疗医生或者其他临床医生进行探索。
在此使用的术语疾病的“治疗”包括：预防疾病，即导致疾病的临床症状不在哺乳动物中发展，所述哺乳动物可能暴露于疾病或者易感染所述疾病，但是又没有经历或者显示疾病症状；抑制疾病，即阻止或者降低疾病或者其临床症状的发展；或者减轻疾病，即导致疾病或者其临床症状消退。
在此使用的术语“骨吸收”是指一个过程，经该过程破骨细胞降解骨。
在此使用的术语“每周一次”和“每周一次剂量给药”是指单元剂量，例如组织蛋白酶K抑制剂的单元剂量，每周进行一次给药，即，在七天时间内给药一次，优选在每周的同一天给药。在每周一次的剂量给药方案中，通常约每七天给药一次单元剂量。每周一次剂量给药方案的非限制性实例是每个星期日给药单元剂量的组织蛋白酶K抑制剂。通常建议不在连续两天内给药每周一次给药的一个单元剂量，但是每周一次剂量给药方案可以包括其中多个单元剂量在属于两个不同周的连续两天内进行给药的剂量给药方案。
“两周”剂量是指组织蛋白酶K抑制剂的单元剂量在两周时间内给药一次，即，在十四天时间内给药一次，优选在每两周的同一天。在每两周一次的剂量给药方案中，各个剂量单元通常约每十四天给药一次。每两周一次剂量给药方案的非限制性性实例是每隔一个星期日给药单元剂量的组织蛋白酶K抑制剂。优选不在连续两天内给药，但是每两周一次剂量给药方案可以包括其中单元剂量在属于两个不同两周周期的连续两天内进行给药的剂量给药方案。
“每月两次”是指在一个月时间内将组织蛋白酶K抑制剂单元剂量给药两次。在每月两次的方案中，优选所述剂量在每月的相同两天时给药。在每月两次的剂量给药方案中，各个剂量单元通常约每十四至十六天给药一次。每月两次剂量给药方案的非限制性实例是在每月的第一天前后和每月的第十五天(中间点)前后剂量给药。优选所述单元剂量不在同一天或者连续两天内给药，但是每月两次剂量给药的方案可以包括其中单元剂量在属于一个月周期或者不同月周期内的连续两天内进行给药的剂量给药方案。在此定义的每月两次方案不同于并且不包括每两周一次的方案，因为两种方案具有不同的周期性，并且导致长期时间内给药不同数量的剂量。例如，在一年时间中，根据每月两次的方案将总共给药约二十四个剂量(因为一年有十二个月)，而根据每两周一次的剂量给药方案将总共给药约二十六个剂量(因为一年大约有五十二周)。
术语“每月一次”根据公认的含义使用，为约四周、大约30天或者一年的1/12的时间量度。
本发明还包含用于治疗骨质疏松症或者其它骨骼病症的药物组合物，包括给药治疗有效量的本发明化合物，含有或者不含有药学上可接受的载体或者稀释剂。本发明适宜的组合物包括含有本发明化合物和药理学上可接受的载体(例如盐水，pH值水平为例如7.4)的水溶液。所述溶液可以通过局部弹丸注射引入到患者血液中。
当将根据本发明的化合物给药入人类对象时，每日剂量通常由开药医师确定，同时剂量通常依据个体患者的年龄、体重和反应以及患者症状的严重程度而不同。
在一个示范性应用中，将适宜量的化合物给药到对组织蛋白酶依赖状态进行治疗的哺乳动物。当用来产生所需要的效果时，本发明的口服剂量为约0.01毫克/千克体重/天(mg/kg/day)～约100mg/kg/day，优选0.01～10mg/kg/day，并且最优选0.1～5.0mg/kg/day。对于口服给药，组合物优选以片剂形式提供，其中含有0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、3.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、35.0、40.0、50.0、80.0、100、200和500毫克的活性成分以便根据进行治疗的患者的症状调整给药剂量。所述药物一般含有约0.01mg～约500mg活性成分，优选约1mg～约100mg活性成分。对于静脉内给药，在恒速输液期间，最优选的剂量为约0.1～约10mg/kg/min。有利地，本发明化合物可以以单一日剂量给药，或者每日总剂量可以分为每日两次、三次或者四次剂量给药。并且，本发明化合物还可以根据剂量间隔为每周一次、每两周一次、每月两次或者每月一次的连续方案进行给药。此外，本发明的优选化合物可以以鼻内形式经局部使用合适的鼻内载体进行给药，或者经透过皮肤路线，利用那些本领域普通技术人员熟知的皮肤表层贴片形式进行给药。为了以透皮分配系统的形式进行给药，剂量给药当然将持续整个给药方案期间而非间歇性的给药。
本发明化合物可以与其它用于治疗组织蛋白酶介导症状的试剂组合使用。上述组合的单个组分可以在治疗期间的不同时间给药，或者以分开或者单一组合的形式同时给药。因此，应当将本发明理解为包含所有上述联合治疗或者轮流治疗的方案，并且术语“给药”应当据此进行理解。应当理解，本发明化合物与其它可用于治疗组织蛋白酶介导状态的试剂的组合范围原则上包含任何与可用于治疗与雌激素功能相关病症的药物组合物的组合。
因此，本发明的范围包含本发明要求的化合物协同第二试剂的应用，所述第二试剂选自：有机双膦酸酯；雌激素受体调节剂；雄激素受体调节剂；破骨细胞质子三磷酸腺苷酶抑制剂；HMG-CoA还原酶抑制剂；整联蛋白受体对抗剂；成骨细胞合成代谢剂，例如PTH；维生素D；合成维生素D类似物；非甾族抗炎药物；选择性环加氧酶-2抑制剂；白细胞间介素-1β抑制剂；LOX/COX抑制剂；RANKL抑制剂；和其药学上可接受的盐及其混合物。
根据包含于本文中的教导，本发明的这些和其它方面将是显而易见的。
定义
本发明化合物可以具有不对称中心、手性轴和手性面(如E.L.Eliel和S.H.Wilen，Stereochemistry of Carbon Compounds，John Wiley &Sons，New York，1994，pages 1119-1190中所述)，并且可以作为外消旋物、外消旋混合物和单一非对映异构体存在，所有可能的异构体及其混合物(包括旋光异构体)都包括在本发明范围内。此外，在此公开的化合物可以以互变异构体形式存在，两种互变异构形式都意图包括在本发明范围内，即便仅仅表明了一种互变结构。例如，以下化合物A的任何权利要求都应当理解为包括互变结构B，并且反之亦然，及其混合物。
当任何组成部分中的任何变量(例如R1、R2、R3等等)出现多于一次时，其各次出现时的定义独立于其再次出现时的定义。并且，只有当组合能够产生稳定的化合物时，取代基和/或变量的组合才是允许的。从取代基画入环系统中的线表示所示键可以连接在任何可取代环碳原子上。如果所述环为多环，那么该键仅仅连接在最接近的环上的任何适宜碳原子上。
应当理解，可以由本领域普通技术人员对本发明化合物上的取代基和取代形式进行选择，从而提供化学性质稳定并且可以通过本领域已知的方法以及以下所述方法由易于得到的原料轻易合成的化合物。如果取代基自身被多于一个基团取代，那么应当理解所述多个基团可以在相同碳原子上或者在不同碳原子上，只要得到稳定结构即可。短语“任选被一个或者多个取代基取代”应当理解为等价于短语“任选被至少一个取代基取代”，在所述情形中，优选实施方案将具有0～3个取代基。
除非另作说明，在此使用的“烷基”意图包括具有1～10个碳原子的支链和直链的饱和脂族烃基。例如，在“C1～C10烷基”中的C1～C10定义为包括在直链、支链或者环状结构中具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10个碳原子的基团。例如，“C1～C10烷基”特别包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基和癸基等等。
除非另有说明，术语“环烷基”或者“碳环”将意指碳原子总数为3～8个或者此范围内任何数目的环状烷烃环(即环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或者环辛基)。
在某些情况下，取代基可以定义为具有包括零的数目范围的碳原子，比如(C0-C6)亚烷基-芳基。如果芳基为苯基，上述定义将包括苯基本身以及-CH2Ph、-CH2CH2Ph、CH(CH3)CH2CH(CH3)Ph等等。
在此使用的“芳基”是指任何稳定的在各环中具有高达12个原子的单环或者二环碳环，其中至少一个环是芳香环。上述芳基单元的实例包括苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、联苯基、菲基、蒽基或者苊基。在芳基取代基是二环并且一个环是非芳香环的情况中，可以理解，所述连接是通过芳环进行的。
在此使用的术语“杂芳基”表示各环中具有高达10个原子的稳定的单环、二环或者三环，其中至少一个环是芳香环并且含有1～4个选自O、N、和S的杂原子。在此定义范围内的杂芳基包括但不限于：苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并呋咱基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、苯并唑基、咔唑基、咔啉基、噌啉基、呋喃基、二氢吲哚基、吲哚基、中氮茚基(indolazinyl)、吲唑基、异苯并呋喃基、异氮杂茚基、异喹啉基、异噻唑基、异唑基、萘吡啶基、二唑基、唑基、唑啉、异唑啉、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并吡啶基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、四唑基、四唑并吡啶基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、三唑基、二氢苯并咪唑基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并唑基、二氢吲哚基、二氢喹啉基、亚甲二氧基苯、苯并噻唑基、苯噻吩基、喹啉基、异喹啉基、唑基和四氢喹啉。在其中杂芳基取代基是二环取代基并且一个环是非芳香环或者不包含杂原子的情况下，可以理解，所述连接分别通过芳环或者通过含杂原子的环进行。如果杂芳基含有氮原子，可以理解，其相应的N-氧化物也包含在该定义中。
如熟练的技术人员所理解，在此使用的“卤”或者“卤素”意指包括氯、氟、溴和碘。术语“酮”意指羰基(C＝O)。
本发明还包括式I化合物的N-氧化物衍生物和受保护的衍生物。例如，当式I化合物含有可氧化的氮原子时，可以通过本领域熟知的方法将氮原子转化成N-氧化物。并且，当式I化合物含有比如羟基、羧基、硫醇或者任何含有氮原子的基团时，可以用适当的保护基对这些基团进行保护。适当保护基的综合目录可以在T.W.Greene，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，John Wiley & Sons，Inc.，1981中发现，其全部内容在此引入作为参考。式I化合物的受保护衍生物可以通过本领域熟知的方法进行制备。
本发明化合物的药学上可接受的盐包括无机或者有机酸形式的本发明化合物的常规无毒盐。例如，常规的无毒盐包括由无机酸得到的盐，所述无机酸比如氢氯酸、氢溴酸、硫酸、胺磺酸、磷酸和硝酸等等，以及由有机酸制备的盐，所述有机酸比如醋酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、扑酸、马来酸、羟基马来酸、苯基马来酸、谷氨酸、安息香酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基-安息香酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙基二磺酸、草酸、羟乙磺酸和三氟乙酸等等。如上所述药学上可接受的盐以及其它一般药学上可接受的盐的制备由Berg等人，“PharmaceuticalSalts”，J.Pharm.Sci.，1977，66：1-19进行了更全面的描述，其全文在此引入作为参考。本发明化合物药学上可接受的盐，可以由含有碱性或者酸性部分的本发明化合物通过常规化学方法进行合成。通常，碱性化合物的盐或者通过离子交换色谱法进行制备，或者通过在适当溶剂或者多种溶剂组合中，使游离碱与化学计算量或者与过量的形成期望盐的无机酸或有机酸反应进行制备。类似地，酸性化合物的盐通过与适宜的无机或者有机碱反应而得到形成。
对于本说明书，以下缩略语具有所示含义：
i-BuCOCl＝氯甲酸异丁酯
t-BuMe2SiCl＝叔丁基二甲基氯硅烷
BuLi＝丁基锂
CH2Cl2＝二氯甲烷
CH3CN＝乙腈
CrO3＝铬酸盐
DAST＝二乙基氨三氟化硫
DMF＝N，N-二甲基甲酰胺
DMSO＝二甲亚砜
DTT＝二硫苏糖醇
EDTA＝乙二胺四乙酸
EtOH＝乙醇
KOH＝氢氧化钾
HATU＝2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐
HCl＝氢氯酸
H5IO6＝高碘酸
MeMgBr＝甲基溴化镁
MgSO4＝硫酸镁
Na2CO3＝碳酸钠
NaCl＝氯化钠
NH4Cl＝氯化铵
Na2BH4＝硼氢化钠
PdCl2(dppf)＝[1，1′-二(二苯膦基)二茂铁]二氯化钯(II)
PG＝保护基
rt＝室温
sat.aq.＝饱和水溶液
SiO2＝二氧化硅
TBAF＝四丁基氟化铵
THF＝四氢呋喃
tlc＝薄层色谱法
(Ts)2O＝对甲苯磺酸酸酐
Me＝甲基
Et＝乙基
本发明的新颖化合物可以利用适当原料根据以下一般方法进行制备，并且进一步通过以下具体实施例进行例证说明。然而，不应当将实施例中例证说明的化合物认为是本发明的唯一物质形式。以下实施例进一步说明了制备本发明化合物的细节。本领域熟练技术人员可以轻易理解，以下制备方法和条件的已知变体都可以用于制备这些化合物。除非另作说明，所有的温度都是摄氏温度。
如实施例12和方案1所述，由市售N-t-Boc-天冬氨酸β苄基酯开始，经过(硼氢化钠还原)的混合酸酐方法(参见，Chen，F.M.F.；Lee，Y；Steinauer，R.，Benoiton，N.L.，Can.J.Chem.1987，65，613-618)对游离酸进行活化。将醇转化为离去基团并且通过加热使其原位环化，从而形成氨基甲酸酯。用过量格氏试剂对酯进行处理，从而形成水溶性叔醇。用DAST对后者进行处理，从而获得氟化产品。对环状氨基甲酸酯进行水解并且对所得醇进行甲硅烷基化，从而得到伯胺。通过共沸除去挥发物，亚胺得到形成。对1，4-二溴苯进行单锂化作用，从而得到适于与亚胺反应的亲核试剂，它们进行反应从而得到仲胺。对上述醇进行去保护和氧化，从而得到酸。使其进行标准酰胺化反应，从而得到通用的溴中间体。
方案1
在如方案2所示的钯-介导反应条件下，可以将方案1中获得的溴化物转化为硼酸酯。随后，通过在钯-介导条件下与溴化物偶联，可以将上述所得硼酸酯轻易转化为二芳基产品。
方案2
另外，在方案3中表明，在钯催化下可以将芳基溴化物转化为硼酸酯。在钯-介导的反应条件下，该硼酸酯可以与方案1中所述的溴化物偶联，从而得到二芳基化合物。
方案3
实施例1
N1-(1-氰基环丙基)-N2-((1S)-1-{4′-[(1R)-2，2-二氟-1-羟基乙基]联苯基-4-基}-2，2，2-三氟乙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺的合成
步骤1：1-(4-溴苯基)-2，2-二氟乙酮的制备
向1，4-二溴苯(86.4g，366mmol)的四氢呋喃(800mL)冷却(-78℃)搅拌溶液中加入正丁基锂(228mL，1.6M己烷溶液，366mmol)。在-78℃下将上述混合物搅拌30分钟，并且在2分钟时间内向此浆液中加入二氟乙酸乙酯(50g，402mmol)。在-78℃下将上述浆液搅拌1小时。用1N氢氯酸(250mL)将反应猝灭并且使其升温至室温。用甲基叔丁基醚(250mL)对上述介质进行稀释并且将各层分离。所得有机层用盐水(100mL)洗涤、进行干燥(MgSO4)并且在减压下进行浓缩。。在真空下对所得残余物进行蒸馏，从而得到为白色玻璃状固体的二氟酮。
步骤2：(1R)-1-(4-溴苯基)-2，2-二氟乙醇的制备(类似于：Ramachandran，P.V.等人，Tet.Asym.1994，Vol.5，No.6，pp.1075-86)
在室温下将实施例1步骤1制备的酮(2.35g，10mmole)和市售R-Alpine Borane(3.1g，12mmol)混合在一起并且将其搅拌四天，有一些气体逸出。四天之后，对试样进行1H NMR分析，表明酮的总消耗量。将反应冷却至0℃以加入乙醛(168uL，3mmol)。将冷却浴除去并且在室温下将其继续搅拌30分钟。将乙醚(20mL)加入其中，随后将乙醇胺(725uL，12mmol)加入其中。在室温下将上述反应混合物搅拌一小时。通过过滤将沉淀除去并且用戊烷对其进行洗涤。在减压下对所得滤液进行浓缩并且通过快速色谱法(90％己烷；10％乙酸乙酯～70％己烷；30％乙酸乙酯)对其进行纯化，从而得到为无色油的期望物质。此时未检测其光学纯度。
步骤3：N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-{(1S)-2，2，2-三氟-1-[4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂戊硼烷-2-基)苯基]乙基}-L-亮氨酸酰胺的制备
在二氧六环(240mL)中对得自于实施例12步骤9的N2-[(1S)-1-(4-溴苯基)-2，2，2-三氟乙基]-N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺(24g，53mmol)、二(pinacolato)二硼(15.24g，60mmol)和乙酸钾(16.2g，165mmol)进行搅拌，然后通过滴管用氮气鼓泡15分钟。[将与二氯甲烷1∶1配合的[1，1-二(二苯膦)二茂铁]二氯化钯(II)(PdCl2dppf.CH2Cl2，2.4g，3mmol)加入其中，并且在氮气气氛下将上述反应混合物浸入80℃的油浴中105分钟。四天之后，对试样进行1H NMR分析，表明溴化物的全部消耗量。使上述反应冷却至室温并且在减压下将大部分溶剂除去。将所得残余物溶于少量二氯甲烷中并且将其过滤在硅藻土垫片上。对两种组分进行收集并且在减压下对其进行浓缩，从而得到固体。在室温下在90％己烷和10％二乙醚混合物中将极性最小的组分搅拌过夜，并且在0℃下在己烷中将极性较大的组分搅拌过夜。二者都得到为灰白色固体的纯物质。
步骤4：N1-(1-氰基环丙基)-N2-((1S)-1-{4′-[(1R)-2，2-二氟-1-羟基乙基]联苯基-4-基}-2，2，2-三氟乙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺的制备
将实施例1步骤3的硼酸酯(20g，40mmol)和实施例1步骤2的芳基溴化物(11.4g，48mmol)溶于二甲基甲酰胺(400mL)中，随后将其溶于碳酸氢钠水溶液(60mL，120mmol)中。然后，通过滴管鼓泡氮气15分钟。[将与二氯甲烷1∶1配合的[1，1-二(二苯膦)二茂铁]二氯化钯(II)(PdCl2dppf.CH2Cl2，2.4g，3mmol)加入其中，并且在氮气气氛下将上述反应混合物浸入80℃的油浴中16小时。在低压下(45℃，大约1-5mmHg)将大部分二甲基甲酰胺除去。将所得残余物溶于少量乙酸乙酯(400mL)中并且将其过滤在硅藻土垫片上。在减压下对所得滤液进行浓缩。将所得残余物吸收在大约10mL二氯甲烷中并且通过快速色谱法对其进行分离。在0℃下，在己烷(100mL)中将最纯的组分挥发三次并且再次对其进行快速色谱法分离(90％己烷；10％乙酸乙酯～45％己烷；55％乙酸乙酯)。在减压下对挥发物进行蒸发之后，在己烷中将所得固体搅拌2天。所得产品中仍然含有4％频哪醇，因此将该批次分成两份。在缓缓加热下，将部分A溶于少量异丙醇中。将己烷加入其中，直至溶液有点浑浊为止，并且使其冷却下来。出现白色晶体，进一步将该反应冷却至0℃15分钟。通过过滤对固体进行收集，从而获得未被频哪醇污染的产品。在室温下，在20％乙醚；1％乙酸乙酯；79％己烷(100mL)中将部分B搅拌3小时。通过1H NMR检测，通过过滤收集的固体仅仅被大约1％的频哪醇污染。通过手性AD-RH，利用等浓度的32％乙腈；68％水；0.1％甲酸对光学异构余量进行检测(对映异构体为24分，期望分子为27分钟)。(MH)+ESI＝528.0.
实施例2
N1-(1-氰基环丙基)-N2-((1S)-1-{4′-[(1S)-2，2-二氟-1-羟基乙基]联苯基-4-基}-2，2，2-三氟乙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺的合成
步骤1：(1S)-1-(4-溴苯基)-2，2-二氟乙醇的制备
在室温下将实施例1步骤1制备的酮(2.35g，10mmole)和市售S-Alpine Borane(3.1g，12mmol)混合在一起并且将其搅拌四天，有一些气体逸出。四天之后，试样的1H NMR表明了原料的存在。进一步将S-Alpine Borane(1mL)加入其中并且将其继续搅拌2天。对试样进行1H NMR分析，表明酮的全部消耗量。将反应冷却至0℃以加入乙醛(393uL，7mmol)。将冷却浴除去并且在室温下将其继续搅拌30分钟。将乙醚(20mL)加入其中，随后将乙醇胺(966uL，16mmol)加入其中。在室温下将上述反应混合物搅拌一小时。通过过滤将沉淀除去并且用戊烷对其进行洗涤。在减压下对所得滤液进行浓缩并且通过快速色谱法(90％己烷；10％乙酸乙酯～70％己烷；30％乙酸乙酯)对其进行纯化，从而得到为无色油的期望物质。
步骤2：N1-(1-氰基环丙基)-N2-((1S)-1-{4′-[(1S)-2，2-二氟-1-羟基乙基]联苯基-4-基}-2，2，2-三氟乙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺的制备
如实施例1步骤4所述，对实施例1步骤3的硼酸酯(200mg，0.40mmol)和实施例2步骤1的芳基溴化物(114mg，0.48mmol)进行处理，从而得到白色固体。(MH)+ESI＝528.0
实施例3
N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-{(1S)-2，2，2-三氟-1-[4′-(2，2，2-三氟-1-羟基乙基)联苯基-4-基]乙基}-L-亮氨酸酰胺的合成
步骤1：1-(4-溴苯基)-2，2，2-二氟乙醇的制备
向室温的市售4’-溴-2，2，2-三氟苯乙酮(100mg)的1.9mL甲醇溶液中加入硼氢化钠(15mg)。在室温下将上述混合物搅拌过夜。将水加入其中、用甲基叔丁基醚(3×20mL)对其进行提取，并且用水和盐水对其进行洗涤。用硫酸镁对其进行干燥并且在减压下将溶剂除去，从而得到标题化合物，照此将其用于下一步骤。
标题化合物的1H NMR(CDCl3)δ(ppm)：7.55(2H，d)，7.35(2H，d)，4.92-5.05(1H，m)，3.20(1H，s).
步骤2：N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-{(1S)-2，2，2-三氟-1-[4′-(2，2，2-三氟-1-羟基乙基)联苯基-4-基]乙基}-L-亮氨酸酰胺的制备
使氮气流通过DMF(4mL)、实施例1步骤3中所述的N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-{(1S)-2，2，2-三氟-1-[4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂戊硼烷-2-基)苯基]乙基}-L-亮氨酸酰胺(150mg)、得自于实施例3步骤1的1-(4-溴苯基)-2，2，2-三氟乙醇(92mg)和2M Na2CO3(750μL)15分钟，随后向其中加入[1，1’-二(二苯膦基)-二茂铁]二氯化钯(II)与二氯甲烷的配合物(1∶1)(12mg)。在氮气下，在80℃下将上述混合物加热3小时。将上述混合物冷却至室温，倾倒入冰(20g)和饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)中，并且用50％乙酸乙酯的乙醚溶液(3×50mL)对其进行提取。合并的提取物用盐水洗涤并且用硫酸镁干燥。除去溶剂得到残余物，使用乙酸乙酯和己烷(20～50％)作为洗脱液，在SiO2上通过色谱法对所得残余物进行纯化，然后通过使用乙醚和己烷进行研磨，得到标题化合物。
1H NMR(CD3COCD3)δ(ppm)：8.18(1H，s)，7.60-7.70(4H，m)，7.50-7.55(1H，m)，7.33(1H，d)，7.28(1H，d)，6.40(1H，bs)，4.38-4.48(1H，m)，3.56(1H，t)，2.67-2.69(1H，m)，1.92-2.01(2H，m)，1.45-1.46(10H，m)，1.05-1.11(3H，m)，0.92-0.99(1H，m)，0.56-0.60(2H，m)，0.36-0.38(2H，m).
实施例4
N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-((1S)-2，2，2-三氟-1-{4′-[(1S)-3，3，3-三氟-1-羟基-1-甲基丙基]联苯基-4-基}乙基)-L-亮氨酸酰胺和N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-((1S)-2，2，2-三氟-1-{4′-[(1R)-3，3，3-三氟-1-羟基-1-甲基丙基]联苯基-4-基}乙基)-L-亮氨酸酰胺的合成
步骤1：2-(4-溴苯基)-4，4，4-三氟丁-2-醇的制备
向-78℃的1，4-二溴苯(2.5g，10.6mmol)的THF(50mL)溶液中加入n-BuLi(6.5mL，10.4mmol；1.6M己烷溶液)，并且在-78℃下将所得混合物搅拌15分钟。然后，将4，4，4-三氟-2-丁酮(1.3g，10.3mmol)加入其中。此后，进一步将其搅拌15分钟。用NH4Cl水溶液将所得反应混合物猝灭并且用乙酸乙酯对其进行提取。通过联合快速色谱法(40g柱；用己烷-乙酸乙酯(10％-20％)洗脱20分钟；流速：35mL/min并且收集18mL/馏分)进行纯化，从而得到为浅褐色液体的标题化合物。
1H NMR(CD3COCD3)δ(ppm)：7.5(4H，m)，4.64(1H，s)，1.64(3H，s).
步骤2：N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-((1S)-2，2，2-三氟-1-{4′-[(1S)-3，3，3-三氟-1-羟基-1-甲基丙基]联苯基-4-基}乙基)-L-亮氨酸酰胺和N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-((1S)-2，2，2-三氟-1-{4′-[(1R)-3，3，3-三氟-1-羟基-1-甲基丙基]联苯基-4-基}乙基)-L-亮氨酸酰胺的制备
使氮气流通过DMF(5mL)、实施例1步骤3中所述的N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-{(1S)-2，2，2-三氟-1-[4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂戊硼烷-2-基)苯基]乙基}-L-亮氨酸酰胺(150mg)、得自于实施例4步骤1的2-(4-溴苯基)-4，4，4-三氟丁-2-醇(100mg)和2M Na2CO3(360μL)15分钟，随后向其中加入[1，1’-二(二苯膦基)-二茂铁]二氯化钯(II)与二氯甲烷的配合物(1∶1)(5mg)。在氮气下，在80℃下将上述混合物加热3小时。将上述混合物冷却至室温，倾倒入冰(20g)和饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)中，并且用50％乙酸乙酯的乙醚溶液(3×50mL)对其进行提取。合并的提取物用盐水洗涤并且用硫酸镁干燥。除去溶剂，留下残余物，利用自动梯度泵系统CombiFlash(乙酸乙酯/己烷，20∶80～50∶50进行25分钟)在硅胶上通过色谱法对所得残余物进行纯化，随后用乙醚和己烷对其进行研磨，从而得到两种非对映异构体的混合物。
为了进行分离，利用己烷作为溶剂，将200μL N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-{(1S)-2，2，2-三氟-1-[4′-(3，3，3-三氟-1-羟基-1-甲基丙基)联苯基-4-基]乙基}-L-亮氨酸酰胺的两种非对映异构体的混合物溶液(在33％2-丙醇和67％己烷中浓度为50μg/μL)注射在Chiralcel OD，250×20mm(OD00C-CK004)上，流速为6mL/min，并且在260nm对其进行检测。数次注射之后，N1-(1-氰基环丙基)-N2-((1S)-1-{4′-[(1R)-2，2-二氟-1-羟基-1-甲基乙基]联苯基-4-基}-2，2，2-三氟乙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺从第一洗脱馏分中得到分离和N1-(1-氰基环丙基)-N2-((1S)-1-{4′-[(1S)-2，2-二氟-1-羟基-1-甲基乙基]联苯基-4-基}-2，2，2-三氟乙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺从第二洗脱馏分中得到分离。
第一洗脱非对映异构体：1H NMR(CD3COCD3)δ(ppm)：8.19(1H，s)，7.74-7.68(6H，m)，7.57(2H，d)，4.60(1H，s)，4.42-4.36(1H，m)，3.57-3.53(1H，m)，2.78-2.88(2H，m)，1.94-2.00(2H，m)，1.73(3H，s)，1.49-1.31(8H，m)，1.07-1.13(1H，m)，1.00-0.90(1H，m)，三氟乙胺的NH未观察到。(MH)+APCI＝573.9.立体化学是临时规定的。
第二洗脱非对映异构体：1H NMR(CD3COCD3)δ(ppm)：8.19(1H，s)，7.74-7.68(6H，m)，7.57(2H，d)，4.60(1H，s)，4.42-4.36(1H，m)，3.57-3.53(1H，m)，2.78-2.88(2H，m)，1.94-2.00(2H，m)，1.73(3H，s)，1.49-1.31(8H，m)，1.07-1.13(1H，m)，1.00-0.90(1H，m)，三氟乙胺的NH未观察到。(MH)+APCI＝574.0.立体化学是临时规定的。
实施例5
N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-{(1S)-2，2，2-三氟-1-[4′-(R)-(2，2，2-三氟-1-羟基乙基)联苯基-4-基]乙基}-L-亮氨酸酰胺的合成
步骤1：(R)-2，2，2-三氟-1-[4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂戊硼烷-2-基)苯基]乙醇的制备
用氮气鼓泡(R)-1-(4-溴苯基)-2，2，2-三氟乙醇(2.26g，8.86mmol)、二(pinacolato)二硼(2.9g，11mmol)和乙酸钾(3g，30mmol)的DMF(80mL)悬浮液15分钟，将[1，1-二(二苯膦)二茂铁]二氯化钯(II)与二氯甲烷的1∶1配合物(362mg，0.44mmol)加入其中并且再次用氮气鼓泡10分钟。在85℃下将上述反应混合物搅拌2小时、将其倾倒在冰水上并且用乙酸乙酯对其进行提取(2×80mL)。合并的有机层用饱和NaCl溶液洗涤、进行干燥(MgSO4)并且在真空下进行浓缩。在硅胶上通过色谱法(乙酸乙酯/己烷，5∶95～20∶80进行25分钟，然后20∶80进行5分钟)对所得残余物进行纯化，从而得到标题产品。
1H NMR(CD3COCD3)δ(ppm)：7.8(2H，d)，7.55(2H，d)，5.9(1H，OH)，5.2-5.3(1H，m)，1.3(12H，s).
步骤2：N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-{(1S)-2，2，2-三氟-1-[4′-(R)-(2，2，2-三氟-1-羟基乙基)联苯基-4-基]乙基}-L-亮氨酸酰胺的制备
如实施例1步骤4所述，使实施例5步骤1的硼酸酯(250mg，0.83mmol)和得自于实施例12步骤9的N2-[(1S)-1-(4-溴苯基)-2，2，2-三氟乙基]-N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺(374mg，0.83mmol)进行偶联，从而得到为灰白色粉末的标题化合物。
1H NMR(CD3COCD3)δ(ppm)：8.1-8.2(1H，bs)，7.75-7.8(4H，m)，7.7(2H，m)，7.6(2H，m)，5.9(1H，m)，5.25-5.35(1H，m)，4.35(1H，m)，3.5-3.6(1H，m)，1.9-2.1(2.H，m)，1.2-1.6(8H，m)，0.9-1.1(2H，m)；NH not observed.(MH)+ESI＝545.8.
实施例6
N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-((1S)-2，2，2-三氟-1-{4′-[2，2，2-三氟-1-羟基-1-(三氟甲基)乙基]联苯基-4-基}乙基)-L-亮氨酸酰胺的合成
步骤1：2-(4-溴苯基)-1，1，1，3，3，3-六氟丙-2-醇的制备
向-78℃的二溴苯(4.7g)的四氢呋喃(100mL)溶液中加入正丁基锂(8mL；2.5M己烷溶液)并且将所得混合物搅拌15分钟。然后，使温和的六氟丙酮流通过该悬浮液约15分钟。然后，使上述混合物反应1小时。将其倾倒入冰中、用氯化铵稀释并且用乙酸乙酯对其进行提取。用硫酸镁对所得有机层进行干燥并且利用微微加热，在减压下将溶剂除去。使所得残余物通过SiO2短床，使用10％乙酸乙酯/90％己烷作为洗脱液，从而得到叔醇。
1H NMR(CD3COCD3)δ(ppm)：7.75-7.8(4H，s)，7.65(1H，OH).
步骤2：N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-((1S)-2，2，2-三氟-1-{4′-[2，2，2-三氟-1-羟基-1-(三氟甲基)乙基]联苯基-4-基}乙基)-L-亮氨酸酰胺的制备
使实施例1步骤3所述的N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-{(1S)-2，2，2-三氟-1-[4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂戊硼烷-2-基)苯基]乙基}-L-亮氨酸酰胺(220mg，0.44mmol)和得自于实施例6步骤1的溴化物(323mg，1mmol)如实施例1步骤4中所述进行偶联，从而得到为泡沫的标题化合物。
1H NMR(CD3COCD3)δ(ppm)：8.2(1H，bs)，7.85-7.95(4H，m)，7.75-7.8(2H，d)，7.6(2H，d)，7.55(1H，OH)，4.4(1H，m)，3.55(1H，m)，2.8-2.9(1H，m)，1.9-2.1(2H，m)，1.4-1.5(6H，m)，1.3-1.4(2H，m)，1.1(1H，m)，0.95(1H，m).(MH)+ESI＝614.1.
实施例7
N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-{(1S)-2，2，2-三氟-1-[4′-(2，2，2-三氟-1-羟基-1-甲基乙基)联苯基-4-基]乙基}-L-亮氨酸酰胺的合成
步骤1：2-(4-溴苯基)-1，1，1-三氟丙-2-醇的制备
将市售1-(4-溴苯基)-2，2，2-三氟乙酮(1g，4mmol)在乙醚(8mL)中冷却至-78℃，从而向其中加入市售甲基溴化镁(2.65mL，7.9mmol，3M乙醚溶液)。使上述浑浊的反应介质升温至室温并且将其搅拌过夜。将所得反应混合物转移入含有1.2M氢氯酸(20mL)的分液漏斗中。用乙酸乙酯(30mL)将所得水层提取3次。合并的有机层用盐水洗涤、用硫酸镁干燥并且在减压下进行浓缩。所得澄清油的纯度足以进行使用，不需要进一步纯化。
步骤2：N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-{(1S)-2，2，2-三氟-1-[4′-(2，2，2-三氟-1-羟基-1-甲基乙基)联苯基-4-基]乙基}-L-亮氨酸酰胺的制备
如实施例1步骤4所述，使实施例1步骤3的硼酸酯(250mg)和得自于实施例7步骤1的溴化物(150mg)进行偶联，从而得到为白色粉末的标题化合物。
(MH)+ESI＝560
实施例8
N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-((1S)-2，2，2-三氟-1-{4′-[1-羟基-1-(三氟甲基)丙基]联苯基-4-基}乙基)-L-亮氨酸酰胺的合成
步骤1：2-(4-溴苯基)-1，1，1-三氟丁-2-醇的制备
向-78℃的1，4-二溴苯(2.5g，10.6mmol)的THF(50mL)溶液中加入n-BuLi(6.5mL，10mmol；1.6M己烷溶液)，并且在-78℃下将所得混合物搅拌15分钟。然后，将1，1，1-三氟-2-丁酮(1.3g，10mmol)加入其中。此后，进一步将其搅拌15分钟。用NH4Cl水溶液将所得反应混合物猝灭并且用乙酸乙酯对其进行提取。通过combi-快速色谱法(40g柱；用己烷-乙酸乙酯(10％-20％)洗脱20分钟；流速：35mL/min并且收集18mL/馏分)进行纯化，从而得到为无色液体的标题化合物。
1H NMR(CD3COCD3)δ(ppm)：7.58(m，5H)，5.52(s，1H)，2.28(m，1H)，2.10(m，1H).
步骤2：N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-N2-((1S)-2，2，2-三氟-1-{4′-[1-羟基-1-(三氟甲基)丙基]联苯基-4-基}乙基)-L-亮氨酸酰胺的制备
如实施例1步骤4所述，使实施例1步骤3的硼酸酯(150mg)和得自于实施例8步骤1的溴化物(100mg)进行偶联，从而得到为白色粉末的标题化合物。
(MH)+ESI＝574
实施例9
N1-(1-氰基环丙基)-N2-((1S)-1-{4′-[(1R)-2，2-二氟-1-羟基-1-甲基乙基]联苯基-4-基}-2，2，2-三氟乙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺和N1-(1-氰基环丙基)-N2-((1S)-1-{4′-[(1S)-2，2-二氟-1-羟基-1-甲基乙基]联苯基-4-基}-2，2，2-三氟乙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺的合成
步骤1：2-(4-溴苯基)-1，1-二氟丙-2-醇的制备
在0℃下，在10分钟时间内，向1-(4-溴苯基)-2，2-二氟乙酮(2.5g，10.6mmol)的THF(60mL)溶液中加入甲基氯化镁(10mL，30mmol；3M THF溶液)，并且在0℃下将所得混合物搅拌1小时。微量后处理表明仍然剩余原料，进一步将甲基氯化镁(5mL，15mmol，3M THF溶液)加入其中。此后，进一步将其搅拌15分钟。上述混合物用H2O猝灭、小心地用1M HCl(100mL)进行酸化并且用乙酸乙酯进行提取。通过combi-快速色谱法(120g柱；用己烷-乙酸乙酯(5％-25％)洗脱20分钟；流速：70mL/min并且收集25mL/馏分)进行纯化，从而得到为无色液体的标题化合物。
1H NMR(CD3COCD3)δ(ppm)：7.54(m，4H)，5.86(t，1H)，5.10(s，1H)，1.64(s，3H).
步骤2：N1-(1-氰基环丙基)-N2-{(1S)-1-[4′-(2，2-二氟-1-羟基-1-甲基乙基)联苯基-4-基]-2，2，2-三氟乙基}-4-氟-L-亮氨酸酰胺的制备
如实施例1步骤4所述，使实施例1步骤3的硼酸酯(2.5g)和得自于实施例9步骤1的溴化物(1.6mg)进行偶联，从而得到为白色粉末的非对映异构体混合物。
步骤3：非对映异构体的分离
将得自于实施例9步骤2的1∶1非对映体混合物(80mg)溶于乙醇(2mL)中。利用Chiralcel OD半制备柱(2cm I.D.×25cm)，用32.5％2-丙醇的己烷溶液洗脱并且流速为6mL/min，通过～10次注射(10×200μL)对上述化合物的混合物进行拆分。对在21-23min得到洗脱的快馏分进行收集和浓缩，从而得到为白色粉末的N1-(1-氰基环丙基)-N2-((1S)-1-{4’-[(1R)-2，2-二氟-1-羟基-1-甲基乙基]联苯基-4-基}-2，2，2-三氟乙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺(98％d.e.)。立体化学是临时规定的。
(MH)+ESI＝542
对在～25min得到洗脱的慢馏分进行收集和浓缩，从而得到为白色粉末的N1-(1-氰基环丙基)-N2-((1S)-1-{4’-[(1S)-2，2-二氟-1-羟基-1-甲基乙基]联苯基-4-基}-2，2，2-三氟乙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺(98％d.e.)。立体化学是临时规定的。
(MH)+ESI＝542
实施例10
N1-(1-氰基环丙基)-N2-((1S)-1-{4′-[(1S)-2，2-二氟-1-羟基-1-(羟甲基)乙基]联苯基-4-基}-2，2，2-三氟乙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺的合成
步骤1：1-溴-4-[1-(二氟甲基)乙烯基]苯的制备
向1L烧瓶中的活化锌粉(13.3g，0.2mol)中加入THF(200mL)。在～10min时间内，将二碘甲烷(8.9mL，110mmol)滴加加入其中。在室温下将所得混合物搅拌30分钟。在冰-丙酮浴中对上述混合物进行冷却，在～15min时间内将氯化锡(iv)的1M CH2Cl2溶液(22.1mL，22.1mmol)加入其中(针尖通入混合物中)。将此混合物搅拌15min并且将冷却浴除去。在室温下将所得混合物搅拌30分钟。重新用冰-丙酮浴冷却之后，在～10min时间内，将1-(4-溴苯基)-2，2-二氟乙酮(5.2g，22.12mmol)的THF(30mL)溶液滴加加入其中。将冷却浴除去并且在室温下将所得混合物搅拌30分钟。然后，在0℃下将上述混合物分份倾倒入碳酸氢钠(300mL，300mmol)和己烷(300mL)的混合物中。搅拌15分钟之后，将混合物滤过硅藻土。对有机层进行分离、用盐水洗涤、干燥(Na2SO4)并进行浓缩。在硅胶上进行色谱分离并且用己烷∶乙酸乙酯(20∶1)洗脱，从而得到为浅黄色液体的标题化合物。
1H NMR(CD3COCD3)δ(ppm)：7.60(d，2H)，7.50(d，2H)，6.70(t，1H)，5.92(s，1H)，5.80(s，1H).
步骤2：(2S)-2-(4-溴苯基)-3，3-二氟丙-1，2-二醇的制备
向装有市售AD-mix-alpha(7g)的250mL烧瓶中加入叔丁醇(25mL)和H2O(25mL)。在室温下对上述混合物进行搅拌，从而得到透明的两相，下相呈现出橙黄色。冷却至0℃之后，立即将1-溴-4-[1-(二氟甲基)乙烯基]苯(1.1g，4.7mmol)加入其中，并且在大约4℃下将混合物搅拌过夜。由此得到亮黄色混合物。将混合物保持在0℃下并且将固体亚硫酸钠(8g，64mmol)加入其中。将反应混合物升温至室温和将其搅拌30分钟。将乙酸乙酯(50mL)加入其中并且将有机层分离。所得水层用乙酸乙酯(2×10mL)进行提取。对合并的乙酸乙酯提取物进行干燥(Na2SO4)和浓缩。通过combi-快速色谱法(40g柱；用己烷-乙酸乙酯(20％-60％)洗脱25分钟；流速：35mL/min并且收集18mL/馏分)进行纯化，从而得到为无色油的标题化合物。
1H NMR(CD3COCD3)δ(ppm)：7.56(s，4H)，6.14(t，1H)，5.00(s，1H)，4.40(t，1H)，4.00(m，1H)，3.80(m，1H).
步骤3：N1-(1-氰基环丙基)-N2-((1S)-1-{4′-[(1S)-2，2-二氟-1-羟基-1-(羟甲基)乙基]联苯基-4-基}-2，2，2-三氟乙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺的制备
如实施例1步骤4所述，使实施例1步骤3的硼酸酯(900mg)和得自于实施例10步骤2的溴化物(450mg)进行偶联，从而得到为白色粉末的标题化合物。
对单膦酸酯衍生物(Yves Leblanc等人，Tetrahedron Asymmetry2001，12，3063-3066)进行制备，从而测定其光学纯度(94％d.e.；Chiralpak AD，40％2-丙醇的己烷溶液，流速1mL/min；保留时间7.4min)。
1H NMR(CD3COCD3)δ(ppm)：8.15(s，1H)，7.70(m，6H)，7.55(d，2H)，6.20(t，1H)，4.92(s，1H)，4.35(m，2H)，4.08(m，1H)，3.85(m，1H)，3.52(m，1H)，1.98(m，2H)，1.50-1.28(m，8H)，1.05(m，1H)，0.90(m，1H).
实施例11
N1-(1-氰基环丙基)-N2-((1S)-1-{4′-[(1R)-2，2-二氟-1-羟基-1-(羟甲基)乙基]联苯基-4-基}-2，2，2-三氟乙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺的合成
步骤1：(2R)-2-(4-溴苯基)-3，3-二氟丙-1，2-二醇的制备
向装有市售AD-mix-beta(7g)的250mL烧瓶中加入叔丁醇(25mL)和H2O(25mL)。在室温下对上述混合物进行搅拌，从而得到透明的两相，下相呈现出橙黄色。冷却至0℃之后，立即将1-溴-4-[1-(二氟甲基)乙烯基]苯(1.1g，4.7mmol)加入其中，并且在大约4℃下将混合物搅拌过夜。由此得到亮黄色混合物。将混合物保持在0℃下并且将固体亚硫酸钠(8g，64mmol)加入其中。将反应混合物升温至室温和将其搅拌30分钟。将乙酸乙酯(50mL)加入其中并且将有机层分离。所得水层用乙酸乙酯(2×10mL)进行提取。对合并的乙酸乙酯提取物进行干燥(Na2SO4)和浓缩。通过联用快速色谱法(40g柱；用己烷-乙酸乙酯(20％-60％)洗脱25分钟；流速：35mL/min并且收集18mL/馏分)进行纯化，从而得到为无色油的标题化合物。
1H NMR(CD3COCD3)δ(ppm)：7.56(s，4H)，6.14(t，1H)，5.00(s，1H)，4.40(t，1H)，4.00(m，1H)，3.80(m，1H).
步骤2：N1-(1-氰基环丙基)-N2-((1S)-1-{4′-[(1R)-2，2-二氟-1-羟基-1-(羟甲基)乙基]联苯基-4-基}-2，2，2-三氟乙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺的制备
如实施例1步骤4所述，使实施例1步骤3的硼酸酯(1.5g)和得自于实施例11步骤1的溴化物(740mg)进行偶联，从而得到为白色粉末的标题化合物。
对单膦酸酯衍生物(Yves Leblanc等人，Tetrahedron Asymmetry2001，12，3063-3066)进行制备，从而测定其光学纯度(94％d.e.；Chiralpak AD，40％2-丙醇的己烷溶液，流速1mL/min；保留时间11.1min)。
1H NMR(CD3COCD3)δ(ppm)：8.15(s，1H)，7.70(m，6H)，7.55(d，2H)，6.20(t，1H)，4.92(s，1H)，4.35(m，2H)，4.08(m，1H)，3.85(m，1H)，3.52(m，1H)，1.98(m，2H)，1.50-1.28(m，8H)，1.05(m，1H)，0.90(m，1H).
实施例12
N2-[(1S)-1-(4-溴苯基)-2，2，2-三氟乙基]-N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺的合成
步骤1：(3S)-3-[(叔丁氧羰基)氨基]-4-羟基丁酸苄酯的制备
将N-(叔丁氧羰基)-L-天冬氨酸4-苄酯(30g)溶于乙二醇二甲醚(90mL)中，和将所得溶液冷却至-5℃。将N-甲基吗啉(10.32mL)加入其中，随后将氯甲酸异丁酯(12.66mL)缓慢加入其中，使得反应温度保持低于-10℃。将混合物保持0.5小时。将固体迅速过滤并且用乙二醇二甲醚(90mL)对其进行洗涤。将所得滤液冷却至-50℃并且将硼氢化钠(4.4g)的水(45mL)溶液缓慢加入其中，使得反应温度保持在-30～-15℃之间。然后，将水(500mL)加入其中，使得反应温度保持低于-15℃。将所得悬浮液过滤，所得固体用水(400mL)洗涤并且进行干燥，从而得到(3S)-3-[(叔丁氧羰基)氨基]-4-羟基丁酸苄酯。
1H NMR(CD3COCD3)δ7.3-7.45(5H，m)，5.85-5.95(1H，NH)，5.15(2H，s)，3.95-4.1(2H，m)，3.5-3.7(2H，m)，2.55-2.75(2H，m)，1.4(9H，s).
步骤2：[(4S)-2-氧代-1，3-唑烷-4-基]乙酸苄酯的制备
向得自于步骤1的醇(95.7g)的二氯乙烷(925mL)溶液中加入吡啶(625mL)，并且将所得混合物冷却至0-5℃。将无水对甲苯磺酸酐(105.7g)加入其中，并且将所得混合物升温至室温并且搅拌1小时，然后在90℃下将其加热2小时。将所得混合物进行冷却，用二氯甲烷(1000mL)对其进行稀释并且用1N HCl(3×600mL)进行洗涤。所得有机层用盐水洗涤、用硫酸钠干燥并且在真空下将溶剂除去。所得残余物使用比例为1∶1的乙酸乙酯和己烷，然后使用乙酸乙酯，通过色谱法在SiO2进行纯化，从而得到[(4S)-2-氧代-1，3-唑烷-4-基]乙酸苄酯。
1H NMR(CD3SOCD3)δ7.8(1H，NH)，7.3-7.45(5H，m)，5.05-5.15(2H，m)，4.4-4.5(1H，m)，4.1-4.2(1H，m)，4.0-4.05(1H，m)，3.6-3.8(2H，m).
步骤3：(4S)-4-(2-羟基-2-甲基丙基)-1，3-唑烷-2-酮的制备
在-20℃下，将甲基溴化镁(227mL的3M乙醚溶液)加入到甲苯(340mL)和THF(340mL)的混合物中。然后，将得自于步骤2的酯(40g)的温THF溶液(170mL)滴加加入其中，保持温度低于-10℃。将所得混合物放置2小时，然后将其缓慢加入到水(1000mL)和乙酸(200mL)的混合物中，并且在室温下将所得混合物搅拌2小时。将水层分离，并且用水(2×200mL)对所得有机层进行提取。使用二氯甲烷和连续提取器将产物从合并的水层中提取出来。使用庚烷作为共溶剂共沸乙酸，将二氯甲烷提取物蒸干。所得残余物使用乙醇和二氯甲烷(1∶30)，通过色谱法在SiO2进行纯化，从而得到(4S)-4-(2-羟基-2-甲基丙基)-1，3-唑烷-2-酮。
1H NMR(CD3COCD3)δ6.1-6.4(1H，NH)，4.45-4.55(1H，m)，4.1-4.2(1H，m)，3.95-4.05(1H，m)，3.7(1H，s)，1.65-1.85(2H，m)，1.25(6H，m).
步骤4：(4S)-4-(2-氟-2-甲基丙基)-1，3-唑烷-2-酮的制备
将得自于步骤3的醇(47.8g)的二氯甲烷溶液(100mL)加入到-70℃下的(二乙基氨基)三氟化硫(48.5g)的二氯甲烷(500mL)溶液中。将所得混合物升温至室温并且将其搅拌1小时。然后将上述混合物小心地加入到0℃的饱和NaHCO3水溶液(800mL)的混合物中。将有机层分离并且用饱和NaHCO3水溶液对其进行洗涤。所得水层进一步用二氯甲烷(100mL)提取，并且对合并的二氯甲烷层进行干燥和浓缩。所得残余物使用乙酸乙酯和己烷(1∶5)和随后使用乙酸乙酯，在SiO2上通过色谱法进行纯化，从而得到(4S)-4-(2-氟-2-甲基丙基)-1，3-唑烷-2-酮。
1H NMR(CD3SOCD3)δ7.6(1H，NH)，4.4-4.5(1H，m)，3.95-4.05(1H，m)，3.9-3.95(1H，m)，1.8-1.95(2H，m)，1.25-1.4(6H，2s).
步骤5：(2S)-2-氨基-4-氟-4-甲基戊-1-醇的制备
向得自于步骤4的氟衍生物(21.0g)的90％乙醇水溶液(216mL)中加入氢氧化钾(21.9g)。将上述混合物回流加热4小时并且将其冷却至室温。然后对混合物进行浓缩和用甲苯(3×300mL)对其进行共蒸发。将所得残余物溶于二氯甲烷(500mL)中并将其搅拌0.5小时。将所得悬浮液滤过硅藻土和用二氯甲烷(3×100mL)对硅藻土进行洗涤。将所得滤液浓缩至干燥，从而得到(2S)-2-氨基-4-氟-4-甲基戊-1-醇。
1H NMR(CD3OD)δ3.4-3.5(1H，m)，3.2-3.3(1H，m)，3.0-3.1(1H，m)，1.5-1.7(2H，m)，1.35(3H，s)，1.3(3H，s).
步骤6：(2S)-1-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4-氟-4-甲基戊-2-胺的制备
将得自于步骤5的氨基醇(21.0g)溶于二氯甲烷(300mL)中，并且将该溶液冷却至0℃。将4-(二甲基氨基)吡啶(0.051g)和叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物(21g)加入其中，然后将三乙胺(25mL)加入其中。在室温下将上述混合物搅拌过夜。将上述反应混合物缓缓倒入0℃的饱和氯化铵水溶液中，并且用二氯甲烷(3×300mL)对其进行萃取。所得有机层用盐水洗涤、用硫酸钠干燥并且在真空下除去溶剂，从而得到(2S)-1-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4-氟-4-甲基戊-2-胺。
1H NMR(CD3OD)δ3.6-3.65(1H，m)，3.4-3.5(1H，m)，3.1-3.2(1H，m)，1.6-1.8(2H，m)，1.35-1.45(6H，m)，0.93(9H，s)，0.1(6H，s).
步骤7：(2S)-1-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4-氟-4-甲基-N-[(1E)-2，2，2三氟亚乙基]戊-2-胺的制备
向得自于步骤6的胺(31.5g)的苯(126mL)溶液中加入三氟乙醛甲基半缩醛(21.6mL)。将上述溶液在回流下加热过夜，使用Dean-Stark阱收集水。将所得反应混合物冷却至室温并且将其浓缩至干燥。残余物使用4％的乙酸乙酯的己烷溶液在SiO2上进行纯化，从而得到(2S)-1-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-4-氟-4-甲基戊-2-胺。
1H NMR(CD3COCD3)δ7.9-7.95(1H，m)，3.75-3.85(1H，m)，3.7-3.75(1H，m)，3.53-3.6(1H，m)，1.9-2.0(2H，m)，1.3-1.4(6H，m)，0.9(9H，s)，0.1(3H，s)，0.05(3H，s).
步骤8：(2S)-2-{[(1S)-1-(4-溴苯基)-2，2，2-三氟乙基]氨基}-4-氟-4-甲基戊-1-醇的制备
向-75℃的1，4-二溴苯(0.26g)的THF(4mL)溶液中加入n-BuLi(0.42mL的2.5M己烷溶液)并且将所得混合物放置20分钟。将得自于步骤7的亚胺(0.329g)的THF(2mL)溶液加入其中并且将该混合物放置2小时。然后将上述混合物加入到水(50mL)、NH4Cl(1g)和碎冰的混合物中。用乙酸乙酯(2×25mL)对其进行萃取，并且对合并的乙酸乙酯层进行干燥和蒸干。
以较大用量重复相同的步骤，但是使用1，4-二溴苯(1.2g)、n-BuLi(1.84mL)和亚胺(1.38g.)，并且如上所述对反应混合物进行处理。将根据两种制备方法得到的合并残余物溶于THF(10mL)中，并且将其冷却至0℃。将正四丁基氟化铵(6mL的1M THF溶液)加入其中并且在+5℃下将所得混合物搅拌16小时。将上述混合物倾倒入水(50mL)、氯化铵(1g)和碎冰的混合物中，并且将所得有机层分离。所得水层进一步用乙酸乙酯(2×15mL)进行提取，并且对合并的有机层进行干燥和浓缩。所得残余物使用乙酸乙酯和己烷(1∶5)在SiO2上进行纯化，从而得到(2S)-2-{[(1S)-1-(4-溴苯基)-2，2，2-三氟乙基]氨基}-4-氟-4-甲基戊-1-醇。
1H NMR(CD3COCD3)δ7.65(2H，m)，7.5(2H，m)，4.5-4.6(1H，m)，3.8(1H，m)，3.6(1H，m)，3.3-3.4(1H，m)，2.85-2.0(1H，m)，2.55(1H，m)，1.7-1.9(2H，s)，1.3-1.4(6H，m).
步骤9：N2-[(1S)-1-(4-溴苯基)-2，2，2-三氟乙基]-N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺的制备
将H5IO6/CrO3悬浮液(66mL的0.44M CH3CN；注释)冷却至0℃，并且将得自于步骤8的醇(1.55g)的CH3CN(5mL)溶液滴加加入其中。在0～5℃下将所得混合物搅拌3.5小时。在剧烈搅拌下将其倾倒入pH值为4的Na2HPO4(200mL)中，并且用乙醚(3×50mL)对所得混合物进行萃取。合并的乙醚提取物用水与盐水(1∶1)洗涤，然后用NaHSO3稀溶液和盐水洗涤。所得混合物用硫酸镁进行干燥、进行过滤并且将溶剂蒸干，从而得到N-[(1S)-1-(4-溴苯基)-2，2，2-三氟乙基]-4-氟-L-亮氨酸，其照此用于下一步骤。
注释：氧化剂(H5IO6/CrO3)如Tetrahedron Letters39(1998)5323-5326所述进行制备，但是使用HPLC级CH3CN(含有0.5％水)；不加入水。
将二异丙基乙胺(4.2mL)加入到0℃的得自于上述步骤的酸(1.5g)、1-氨基-1-环丙烷腈盐酸盐(1.18g)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(1.94g)和二甲基甲酰胺(5mL)的悬浮液中，并且在室温下使上述混合物反应48小时。然后将其倾倒在冰和稀氯化铵水溶液中。所得混合物用乙酸乙酯和乙醚(1∶1)提取，并且用pH值为3的稀Na2HPO4和盐水对合并的有机层进行洗涤。将溶剂蒸干，和所得残余物通过使用乙酸乙酯和己烷(1∶2)的色谱法在SiO2上进行纯化，从而得到N2-[(1S)-1-(4-溴苯基)-2，2，2-三氟乙基]-N1-(1-氰基环丙基)-4-氟-L-亮氨酸酰胺，其具有用于下一步反应的充分纯度。
1H NMR(CD3COCD3)δ8.15(1H，NH)，7.6(2H，m)，7.45(2H，m)，4.35-4.45(1H，m)，3.45-3.55(1H，m)，1.9-2.1(2H，m)，1.75-1.85(1H，NH)，1.35-1.55(8H，m)，1.1-1.15(1H，m)，0.95-1.05(1H，m).
药物组合物
作为本发明的具体实施方案，将100mg(1R，2R)-N-(氰甲基)-5，5-二氟-2-[4′-(甲硫基)-1，1′-联苯基-2-基]环己烷羧酰胺与充分细碎的乳糖一起进行配制，从而得到总量为580～590mg的混合物，将其装填在0号的硬胶囊中。
在本申请中公开的化合物在以下测定中显示出了活性。此外，公开于本申请中的化合物相对于先前公开的化合物具有增强的药理学测验图。
组织蛋白酶K测定
在二甲亚砜(DMSO)中，对试验化合物浓度为500μM～0.0085μM的系列稀释物(1/3)进行制备。然后将2μL取自各稀释物的DMSO加入到在测定缓冲液溶液中的50μL测定缓冲液(MES，50mM(pH值5.5)；EDTA，2.5mM；DTT，2.5mM和10％DMSO)和25μL人类组织蛋白酶K(0.4nM)中。在摇动板上将上述测定溶液混合5～10秒钟并且在室温下将其培养15分钟。将在25μL测定缓冲液中的Z-Leu-Arg-AMC(8μM)加入到上述测定溶液中。通过分光荧光测定法(Exλ＝355nm；Emλ＝460nm)，对香豆素离去基团(AMC)的水解跟踪10分钟。通过将实验值拟合至剂量反应曲线的标准数学模型，对抑制作用百分比进行计算。
组织蛋白酶L测定
在二甲亚砜(DMSO)中，对浓度为500μM～0.0085μM的试验化合物的系列稀释物(1/3)进行制备。然后将2μL取自各稀释物的DMSO加入到50μL测定缓冲液(MES，50mM(pH值5.5)；EDTA，2.5mM；DTT，2.5mM和10％DMSO)和25μL人类组织蛋白酶L(0.5nM)的测定缓冲液溶液中。在摇动板上将上述测定溶液混合5～10秒钟并且在室温下将其培养15分钟。将在25μL测定缓冲液中的Z-Leu-Arg-AMC(8μM)加入到上述测定溶液中。通过分光荧光测定法(Exλ＝355nm；Emλ＝460nm)，对香豆素离去基团(AMC)的水解跟踪10分钟。通过将实验值拟合至剂量反应曲线的标准数学模型，对抑制作用百分比进行计算。
组织蛋白酶B测定
在二甲亚砜(DMSO)中，对浓度为500μM～0.0085μM的试验化合物的系列稀释物(1/3)进行制备。然后将2μL取自各稀释物的DMSO加入到50μL测定缓冲液(MES，50mM(pH值5.5)；EDTA，2.5mM；DTT，2.5mM和10％DMSO)和25μL人类组织蛋白酶B(4.0nM)的测定缓冲液溶液中。在摇动板上将上述测定溶液混合5～10秒钟并且在室温下将其培养15分钟。将在25μL测定缓冲液中的Z-Leu-Arg-AMC(8μM)加入到上述测定溶液中。通过分光荧光测定法(Exλ＝355nm；Emλ＝460nm)，对香豆素离去基团(AMC)的水解跟踪10分钟。通过将实验值拟合至剂量反应曲线的标准数学模型，对抑制作用百分比进行计算。
组织蛋白酶S测定
在二甲亚砜(DMSO)中，对浓度为500μM～0.0085μM的试验化合物的系列稀释物(1/3)进行制备。然后将2μL取自各稀释物的DMSO加入到50μL测定缓冲液(MES，50mM(pH值5.5)；EDTA，2.5mM；DTT，2.5mM和10％DMSO)和25μL人类组织蛋白酶S(20nM)的测定缓冲液溶液中。在摇动板上将上述测定溶液混合5～10秒钟并且在室温下将其培养15分钟。将在25μL测定缓冲液中的Z-Leu-Arg-AMC(8μM)加入到上述测定溶液中。通过分光荧光测定法(Exλ＝355nm；Emλ＝460nm)，对香豆素离去基团(AMC)的水解跟踪10分钟。通过将实验值拟合至剂量反应曲线的标准数学模型，对抑制作用百分比进行计算。
在大鼠中的药物动力学
在大鼠中的口服(PO)药物动力学
方法：
根据加拿大议会关于动物饲养的准则对动物进行圈养、进食和照顾。
在各次PO血液水平研究之前，将雄性Sprague Dawley大鼠(250-400g)禁食过夜。
一次将大鼠置于制动器中一只并且将箱体牢牢固定。通过从尾部顶端划破一小片(1mm或者更小)伤口，获得零血样。然后通过稳定但是平缓的从顶部到底部进行挤压，从而将血液挤出。将大约0.5mL血液收集入肝素化的真空采血管中。
根据需要，将化合物制备成10mL/kg的标准剂量体积，并且分为16种规格进行口服给药，3″灌食针入食道内。
随后按照与零血样相同的方式进行血液收集，但是不再需要划破尾部。用一片纱布将尾部擦净并且如上所述挤入/冲击入适当标记的管中。
在取样之后，立即对血液进行离心、分离，将血浆置入清楚标记的管形瓶中并且将其贮存入冷冻机中，直至进行分析为止。
在PO剂量给药之后，测定大鼠血液的一般时点为：
0、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、24h
在放血4小时时点之后，将食物任意提供给大鼠。在研究期间一直提供水。
赋形剂：
可以将以下赋形剂(相应的剂量体积)用于PO大鼠血液水平测定中：
PEG 200/300/400(在水中为0-60％)：等于或者小于10mL/kg
甲基纤维素(在水中为0.5％-1.0％)：等于或者小于10mL/kg
Tween 80(在水中为1-10％)：等于或者小于10mL/kg
用于PO血液水平研究的化合物可以为混悬剂形式。为了获得更好的均一性，可以将上述混悬剂置入超声波发生器中大约5分钟。
为了进行分析，用1.2～1.5倍体积的任选含有内标的乙腈对试样进行分析并且对其进行离心，从而除去蛋白沉淀物。将上清液直接注射入带有质谱(MS)或者紫外线吸光度(UV)或者荧光(Fluo)检测的C-18 HPLC柱中。相对于在任选含有内标的乙腈中利用已知量药物示踪的澄清血样得到的标准曲线，进行定量。将另外任选含有内标的乙腈加入1.2～1.5倍体积的相应于样品情形中的量的初始血液中。通过比较i.v.对p.o曲线(AUC)下的面积，对生物利用度(F)进行评价。
F = AUCpo AUCiv × DOSEiv DOSEpo × 100 % ]]>
和
AUC＝(C1+C2)*(T2-T1)/2
其中C是在给定时间T时通过MS或者UV或者Fluo测定的浓度
大鼠中的静脉内药物动力学
方法：
根据加拿大议会关于动物饲养的准则对动物进行圈养、进食和照顾。
在这些研究中使用雄性Sprague Dawley(325-375g)非禁食大鼠。
根据需要，将化合物制备为1mL/kg的标准剂量体积。
利用25规格的针，经颈静脉静脉内给药有意识的大鼠所述剂量。这构成零时点。
通过划破尾部顶端(1-2mm)，在5分钟时进行放血。然后通过稳定但是平缓的从顶部到底部进行挤压，从而将血液从尾部挤出。将大约0.5mL血液收集入肝素化收集管形瓶中。随后按照相同的方式进行放血，但是不再需要划破尾部。用一片纱布将尾部擦净并且如上所述采血入适当标记的管中。
在I.V.剂量给药之后，测定大鼠血液的一般时点为以下任意时点：
0、5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h
或者0、5min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、24h
赋形剂：
可以将以下赋形剂用于IV大鼠血液水平测定中：
葡萄糖：1mL/kg
Moleculosol 25％：1mL/kg
DMSO(二甲亚砜)：限制为10％的剂量体积至高达0.1mL/千克动物
PEG 200：不多于80％的PEG 200与20％无菌水混合至-1mL/kg
如果溶液浑浊，可以将葡萄糖或者碳酸氢钠加入其中。
为了进行分析，用1.2～1.5倍体积的任选含有内标的乙腈对试样进行稀释并且对试样进行离心，从而除去蛋白沉淀物。将上清液直接注射入带有质谱(MS)或者紫外线吸光度(UV)或者荧光(Fluo)检测的C-18 HPLC柱中。相对于在任选含有内标的乙腈中利用已知量药物示踪的澄清血样得到的标准曲线，进行定量。将另外任选含有内标的乙腈加入1.2～1.5倍体积的相应于样品情形中的量的初始血液中。通过比较i.v.对p.o曲线(AUC)下的面积，对生物利用度(F)进行评价。
F = AUCpo AUCiv × DOSEiv DOSEpo × 100 % ]]>
和
AUC＝(C1+C2)*(T2-T1)/2
其中C是在给定时间T时通过MS或者UV或者Fluo测定的浓度。