逆境鉴定筛选抗性作物的育种方法.pdf

本发明提供了一种棉花全程逆境鉴定筛选方法，用于对棉花育种后代及其亲本进行选择和纯化以加速育种进程，提高选择效率和准确率。本发明的核心技术是将待鉴定棉花品种分成两份，一份在非逆境条件下栽培，一份在逆境条件下栽培，通过相关性状的比较，鉴定和筛选出性状优良的品种。本发明方法可操作性强，准确高效，可在棉花抗枯萎病、黄萎病、棉铃虫、抗旱、耐盐碱等性状鉴定中广泛应用。

权利要求书
1、  逆境鉴定筛选抗性作物的育种方法，包括如下步骤：将待鉴定样品材料分成两份，分别在非逆境和逆境环境中栽培，并设置对照，同时栽培同样管理，考察其抗性性状及生产性能，筛选出优良的品种。

2、  如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过产量损失率和/或增产百分数来鉴定筛选样品材料，其中所述产量损失率的计算方法是：

所述增产百分数包括非逆境条件下的增产百分数以及逆境条件下的增产百分数，非逆境条件下计算方法是：

逆境条件下的计算方法是：


3、  如权利要求2所述的方法，其特征在于选择增产百分数＞0，产量损失率≤20％的样品材料。

4、  如权利要求1～3之任一项所述的方法，其特征在于，所述的样品材料为稳定遗传的子代。

5、  如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述稳定遗传的子代是通过如下方式获得：采用NPTII作为标记基因转化植株，通过喷施卡那霉素水溶液筛选阳性转化植株，直至获得遗传稳定的转基因植株。

6、  如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述卡那霉素水溶液的浓度为2000～4000mg·L-1。

7、  如权利要求1～3之任一项所述的方法，其特征在于，所述的作物为棉花。

8、  如权利要求1～3之任一项所述的方法，其特征在于，所述的抗性包括抗虫性、抗病性、抗旱性、抗盐碱性。

说明书逆境鉴定筛选抗性作物的育种方法
技术领域
本发明涉及植物育种领域，具体地说是通过作物逆境鉴定对作物育种后代进行选择和纯化，以加速育种进程，提高选择效率和准确性，本发明方法特别适用于棉花育种。
背景技术
作物新品种选育历时长，育种效率低。对抗性品种的选育准确率低，育成品种抗病性差，产量较低。
棉花是世界上最重要的经济作物，也是我国出口创汇的重要来源。早在20世纪40年代我国就开始棉花育种，但由于育种技术落后，当时主要通过系统育种改造从美国引进的岱字棉品种，进展缓慢。50年代后开展杂交育种，棉田病害轻，基本上根据产量表现选育品种。70年代后棉花枯萎病发生逐渐加重，开始了抗枯萎病育种，西北农业大学高永成等提出感病品种在病地鉴定选择抗病品种的理论，但育种技术基本上采用自然感病试验田进行抗病性鉴定，由于病原菌不足，田间发病不均匀，年份间差异大，育种亲本和杂交后代材料鉴定结果不准确，材料当选或淘汰盲目性较大。90年代后黄萎病发生渐趋严重，特别是落叶型黄萎病的发生，一般对产量影响20％-30％，迫切需要培育抗黄萎病品种，但抗病性鉴定仍采用与抗枯萎病类似的方法，育种效率低，后代材料选择不准确，育成品种抗病性差，且抗病品种产量较低。进入21世纪后，棉花生产快速发展，产量迅速增加，转基因育种技术迅速普及，要求品种产量、抗病性、抗虫性、抗干旱、盐碱性和纤维品质同步提高，因此建立棉花抗逆性鉴定技术成为棉花育种技术创新的重要内容和迫切要求。转育抗病、抗旱和抗盐碱基因育种的分子标记鉴定技术国内外未见报道，国内在转基因抗虫棉的抗虫性鉴定中，一般在棉花定苗后采用卡那霉素涂抹真叶1次的鉴定方法，不但工作效率和选择效率低，而且对试验田产量影响较大。
发明内容
本发明的目的在于针对上述不足提供一种逆境鉴定筛选抗性作物的育种方法，用于对作物育种后代进行选择和纯化以加速育种进程，提高选择效率和准确率，缩短育种周期，本发明方法特别适用于棉花育种。
本发明方法将待鉴定样品材料分成两份，分别在非逆境和逆境环境中栽培，并设置对照，同时栽培同样管理，考察其抗性性状及生产性能，筛选出优良的品种。
具体地说，本发明通过产量损失率和/或增产百分数来鉴定筛选样品材料，其中所述产量损失率的计算方法是：

所述增产百分数包括非逆境条件下的增产百分数以及逆境条件下的增产百分数，非逆境条件下计算方法是：

逆境条件下的计算方法是：

优选地入选样品材料判断指标是增产百分数＞0，产量损失率≤20％。
本发明方法特别适用于对转基因植株稳定遗传的子代进行筛选，目前国内外未见同类报道。
本发明还提供了鉴定和筛选上述转基因植株方法，其是采用NPTII作为标记基因转化植株，通过喷施卡那霉素水溶液鉴定并筛选阳性转化植株，直至获得遗传稳定的转基因植株，所述卡那霉素水溶液的浓度为2000～4000mg·L-1。
目前国内外转基因抗虫棉普遍采用NPTII，是目前作物育种领域中普遍采用的标记基因，特别是用于培育转基因抗虫棉，该基因对卡那霉素产生抗性反应，非转基因棉在叶片喷施卡那霉素1周后，叶片产生黄斑，据此鉴定转基因棉是否具有功能基因表达。国内外对NPTII标记基因的鉴定中，一般采用卡那霉素涂抹叶片，本发明采用适当浓度的卡那霉素喷雾法鉴定，鉴定效率提高50倍以上。其它如抗病、抗旱、抗盐碱等外源转基因作物均可采用此技术。鉴定时期选择苗期和花铃期，鉴定性状为有NPTII标记的转基因材料，包括转抗虫、抗病、抗旱、抗盐碱等基因均可采用此技术。鉴定方法：通过田间喷洒卡那霉素，非转基因植株叶片产生黄斑，而转基因植株无此反应。作物长出1片真叶时，用喷雾器喷洒卡那霉素水溶液1次，花铃期重复喷洒1次。
按照上述方法对转基因作物子代群体及其后代进行连续鉴定筛选，直至获得稳定遗传的抗性植株。然后通过产量损率和增产百分数筛选出利用价值高的材料。
本发明所述的对照，可以是具有相对抗性的品系，或者是育种的亲本。
通过本发明方法先后育成了中棉所30、31、32、41和中棉所57等转基因抗虫棉品种，育种周期比常规技术缩短3年左右，育成的品种抗棉铃虫性强而稳定，产量高，适应性广，经济效益显著。
具体实施方式
下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1  转基因棉花的培育以及逆境鉴定筛选方法
2003年以中棉所41(国审棉2002001，中棉种业科技有限责任公司)作为亲本，和常规棉品系957182(中棉种业科技有限责任公司)杂交，2003年冬杂交F1代在海南三亚进行南繁加代，不进行鉴定选择。2004年在河南安阳中棉所试验田种植F2代，田间播种出苗后棉花长出1片真叶时，用喷雾器喷洒2500ppm卡那霉素水溶液1次，花铃期重复喷洒1次。第1次喷洒7～10天后，彻底拔除有黄斑的非转基因阳性植株，不影响田间定苗和其它作业，可保证棉田足够的密度。第2次喷洒后，发现个别叶片有黄斑反应的非转基因植株，用塑料绳或塑料牌作出标记，收获期作为杂花收获，可不影响试验田产量，只选择无反应的转基因植株。重复上述方法对其后代进行连续筛选鉴定，及早淘汰不良组合和非转基因植株，直至其它主要性状遗传稳定，后代不再发生分离为止。经筛选得到6个遗传稳定的转基因株系，分别加以编号。
2005年发明人对获得的6个转基因品系进行产量损失比较法(根据产量损失率以及增产百分数)鉴定抗虫性及利用价值，试验设正常防治棉铃虫和不防治棉铃虫两个处理，试验结果如下：
                表1产量损失比较法皮棉产量鉴定结果(公斤/亩) 品系名称  非逆境  逆境  产量损失率  增产率(非逆境)   增产率(逆境) 501001 501002 501003 501004 501005 501006  98.5  86.4  77.5  99.2  85.3  69.4  87.5  53.2  68.5  90.2  81.4  58.7  11.16  38.42  11.61  9.07  4.57  15.41  11.04  -2.59  -12.62  11.83  -3.83  -21.75    8.56    -33.99    -15.01    11.91    0.99    -27.17 中棉所41  88.7  80.6  9.13
由上表可以看出，编号为501004的品系，其产量损失率低，增产显著，有好的经济利用价值。
实施例2
按照实施例1的筛选鉴定方法，发明人自1998年获得转基因抗虫棉材料R93-6(国审棉980002，中棉种业科技有限责任公司)以来，即对中低代育种材料抗棉铃虫性连续进行卡那霉素鉴定，每年在田间出苗后，用喷雾器喷洒2500ppm卡那霉素水溶液，1周后根据田间植株抗卡那霉素反应，于定苗前及时拨除产生黄斑的非抗虫植株，2代棉铃虫(一般为6月20日)发生时再喷施一次，鉴定和筛选方法同第一次，并同时通过产量损失率以及增产百分数筛选高产株系。利用该技术连续进行世代鉴定，先后育成了中棉所30、31、32、41和中棉所57等转基因抗虫棉品种(可从中棉种业科技有限责任公司购买，河南安阳)，育种周期比常规技术缩短3年左右，育成的品种抗棉铃虫性强而稳定，产量高，适应性广，推广面积大，经济效益显著，其中双价转基因抗虫棉中棉所41在河南、河北、山东、安徽、山西、陕西六省累计推广面积2300万亩，新增社会经济效益30亿元，2006年获得中国农业科学院科技成果一等奖和陕西省科技进步一等奖。