9－脂肪氨基取代小檗碱衍生物及其制备方法与作为抗癌药物的应用.pdf

本发明公开了一种9－脂肪氨基取代小檗碱衍生物及其制备方法与作为抗癌药物的应用。本发明根据一些与端粒DNA或c－myc DNA相互作用的小分子化合物的结构特征，在保留小檗碱母体骨架的情况下，在9－位引入一条脂肪氨基侧链，得到可与端粒DNA或原癌基因c－myc DNA相互作用很强的的9－脂肪氨基取代的小檗碱类衍生物。显示对癌细胞中的端粒/端粒酶具有很好的抑制活性，对原癌基因c－myc的表达有很强的抑制作用。实验证明，本发明的9－脂肪氨基取代小檗碱衍生物对多种癌细胞株具有显著的抑制作用，而对正常细胞毒性小，可用于制备抗肿瘤药物。

权利要求书
1.  9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物，其通式如式(I)：

其中，n选自1～5；
R1、R2可以相同，也可以不同，分别选自H、C1-6的烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、吡噁啉基。

2.  权利要求1所述9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：在高温和真空条件下，将小檗碱的9-甲氧基转变成9-羟基；再与Br-(CH2)n-Br进行烷基化反应；所得化合物再与R1-NH-R2反应，产物经离子树脂交换得到9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物。

3.  权利要求1所述9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物在制备抗癌药物中应用。

说明书9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物及其制备方法与作为抗癌药物的应用
技术领域
本发明涉及一种新药物化合物，具体的说，涉及一种9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物及其制备方法与作为抗癌药物的应用。
背景技术
癌症是威胁人类健康和生命安全的主要疾病。抗癌药物的研究与开发一直是化学家和药物学家关注的热点。寻找高效、高选择性、毒副作用小的抗癌药物是药物研究开发的重要方向之一。
以DNA为靶点设计合成抗癌药物，特别是针对具有重要生理意义的端粒DNA及原癌基因DNA的特殊高级结构设计合成小分子抑制剂，是发展新型抗癌药物的重要方法。与端粒DNA，以及原癌基因c-myc DNA相互作用的小分子化合物具有一些共同的结构特征：具有三个或者更多的近似平面芳环结构；一条或者几条在生理条件下带正电荷的侧链。它们的抗癌作用的机制主要是通过与端粒DNA或原癌基因c-myc DNA相互作用，抑制癌细胞的端粒酶活性，或c-myc基因的表达，从而抑制癌细胞的复制。
小檗碱是一种生物碱，是黄连等重要中药的主要有效成分。小檗碱具有良好的抗菌和抗炎作用，也有一定的抗癌活性。以小檗碱的母核为基础进行结构改造，是发现具有更好抗癌活性先导化合物的一条可行途径。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一类新的9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物。
本发明的另一个目的是提供上述9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物的制备方法。
本发明的进一步目的是提供上述9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物在制备抗癌药物中的应用。
本发明根据一些与端粒DNA或c-myc DNA相互作用的小分子化合物的结构特征，在保留小檗碱母体骨架的情况下，在9-位引入一条脂肪氨基侧链，得到可与端粒DNA或原癌基因c-myc DNA相互作用很强的的9-脂肪氨基取代的小檗碱类衍生物。而小檗碱本身与端粒DNA或原癌基因c-myc DNA相互作用很弱。
9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物，其通式如式(I)：

其中，n选自1～5；
R1、R2可以相同，也可以不同，分别选自H、C1-6的烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、吡噁啉基。
上述9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物的制备方法，包括如下步骤：在高温和真空条件下，将小檗碱1的9-甲氧基转变成9-羟基2；再与α，ω-二溴烷烃[Br-(CH2)n-Br]进行烷基化反应；所得化合物3再与取代胺化合物(R1-NH-R2)反应，产物经离子树脂交换得到9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物4。反应通式见式(II)。

发明人在长期的研究中发现，与小檗碱相比较，9-脂肪氨基取代的小檗碱衍生物与富含鸟嘌呤的端粒DNA以及原癌基因c-myc DNA具有很强的相互作用，显示对癌细胞中的端粒/端粒酶具有很好的抑制活性，对原癌基因c-myc的表达有很强的抑制作用。进一步实验证明，本发明涉及的9-脂肪氨基取代的小檗碱衍生物对多种癌细胞株具有显著的抑制作用，而对正常细胞毒性小，可用于制备抗肿瘤药物。
本发明的9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物可与药学上可接受的辅助剂混合，制备各种剂型，如片剂、丸剂、胶囊、注射剂、悬浮剂或乳剂等等。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物与富含鸟嘌呤的端粒DNA以及原癌基因c-mycDNA具有很强的相互作用，显示对癌细胞中的端粒/端粒酶具有很好的抑制活性，对原癌基因c-myc的表达有很强的抑制作用。实验证明，本发明的9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物对多种癌细胞株具有显著的抑制作用，而对正常细胞毒性小，可用于制备抗肿瘤药物。
具体实施方式
实施例1：化合物2的合成
将0.1mol干燥的盐酸小檗碱置于真空干燥箱中，升温至190℃，在10-15mmHg压力下反应15min，得暗红色粉末固体，粗品用氯仿/甲醇(V/V＝9∶1)柱层析洗脱，得鲜红色固体粉末2。
产率：78％；1H NMR(CD3OD/CDCl3，300MHz)：δ9.23(s，1H)，8.47(s，1H)，8.07(d，1H，J＝9.1)，7.90(d，1H，J＝9.1)，7.50(s，1H，)，6.93(s，1H)，6.06(s，2H)，4.37(t，2H，J＝6.5)，4.02(s，3H)，3.10(t，2H，J＝6.5)；FAB-MS m/z：321[M]+；元素分析C19H15NO4，理论值C，71.02；H，4.71；N，4.36.实测值C，71.38；H，4.95；N，4.57.

                         化合物2
实施例2：化合物3a的合成
将0.05mol化合物2溶于300ml乙腈中，加入0.12mol的1，3-二溴丙烷于70-80℃反应3小时，趁热抽滤，固体用乙腈洗涤2次，粗品用氯仿/甲醇(V/V＝9∶1)柱层析洗脱，得鲜黄色固体3a。
产率：62％；1H NMR(CD3OD/CDCl3，300MHz)：δ9.72(s，1H)，8.51(s，1H)，8.09(d，1H，J＝9.0)，7.92(d，1H，J＝9.0)，7.47(s，1H，)，6.88(s，1H)，6.01(s，2H)，4.85(t，2H，J＝5.5)，4.34(t，2H，J＝6.2)，4.05(s，3H)，3.32(t，2H，J＝6.7)，3.00(t，2H，J＝5.5)，2.25(m，2H)；FAB-MSm/z：442[M-Br]+；元素分析C22H21Br2NO4，理论值C，50.50；H，4.05；N，2.68.实测值C，50.24；H，4.33；N，2.41

                          化合物3a
实施例3：化合物3b的合成
方法同实施例2，所不同的是用1，2-二溴乙烷代替1，3-二溴丙烷，得鲜黄色固体3b。
产率：62％；1H NMR(CD3OD/CDCl3，300MHz)：δ9.69(s，1H)，8.57(s，1H)，8.03(d，1H，J＝9.1)，7.89(d，1H，J＝9.1)，7.45(s，1H，)，6.94(s，1H)，6.04(s，2H)，4.91(t，2H，J＝5.6)，4.46(t，2H，J＝6.0)，4.07(s，3H)，3.72(t，2H，J＝6.0)，3.02(t，2H，J＝5.6)；FAB-MS m/z：428[M-Br]+；元素分析C21H19Br2NO4，理论值C，49.53；H，3.76；N，2.75.实测值C，49.40；H，3.54；N，2.93

                          化合物3b
实施例4：化合物4a的合成
将0.01mol化合物3a溶于30ml乙腈中，加入0.02mol二甲胺盐酸盐，于80℃反应3小时，冷却，抽滤，粗品用氯仿/甲醇(V/V＝9∶1)柱层析洗脱后，固体经Dowex离子交换树脂交换，得到鲜黄色固体粉末4a。
产率：52％；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)：δ9.70(s，1H)，8.88(s，1H)，8.16(d，1H，J＝9.2)，8.01(d，1H，J＝9.2)，7.75(s，1H)，7.06(s，1H)，6.13(s，2H)，4.90(t，2H，J＝5.5)，4.31(t，2H，J＝5.7)，4.04(s，3H)，3.36(t，2H，J＝7.8)，3.20(t，2H，J＝5.7)，2.85(s，6H)，2.22(m，2H)；FAB-MS m/z：407[M-Cl]+；元素分析：C24H27ClN2O4，理论值C，65.08；H，6.14；N，6.32.实测值C，65.27；H，6.42；N，6.05.

                           化合物4a
实施例5：化合物4b的合成
方法同实施例4，所不同的是用二乙胺代替二甲胺盐酸盐，产物为鲜黄色固体粉末4b。
产率：58％；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)：δ9.73(s，1H)，8.90(s，1H)，8.20(d，1H，J＝9.1)，8.04(d，1H，J＝9.1)，7.78(s，1H)，7.09(s，1H)，6.16(s，2H)，4.92(t，2H，J＝5.6)，4.36(t，2H，J＝5.8)，4.07(s，3H)，3.38(t，2H，J＝7.5)，3.22(m，6H)，2.24(m，2H)，1.26(t，6H，J＝7.2)；FAB-MS m/z：435[M-Cl]+；元素分析：C26H31ClN2O4，理论值C，66.30；H，6.63；N，5.95.实测值C，66.61；H，6.37；N，6.21

                           化合物4b
实施例6：化合物4c的合成
方法同实施例4，所不同的是用哌嗪代替二甲胺盐酸盐，产物为鲜黄色固体粉末4c。
产率：29％；1H NMR(CD3OD/CDCl3，300MHz)：δ9.93(s，1H)，8.50(s，1H)，7.94(d，1H，J＝9.2)，7.88(d，1H，J＝9.1)，7.47(s，1H)，6.82(s，1H)，6.02(s，2H)，5.01(t，2H，J＝5.7)，4.46(t，2H，J＝5.5)，4.02(s，3H)，3.49(t，2H，J＝5.5)，3.24-3.16(m，8H)，2.94(t，2H，J＝7.6)，2.38(m，2H)；FAB-MS m/z：448[M-Cl]+；元素分析：C26H30ClN3O4，理论值C，64.52；H，6.25；N，8.68.实测值C，64.77；H，6.06；N，8.74.

                               化合物4c
实施例7：化合物4d的合成
方法同实施例4，所不同的是用哌啶代替二甲胺盐酸盐，产物为鲜黄色固体粉末4d。
产率：48％；1H NMR(CD3OD：CDCl3，300MHz)：δ9.69(s，1H)，8.55(s，1H)，7.97(d，1H，J＝9.3)，7.94(d，1H，J＝9.3)，7.52(s，1H)，6.88(s，1H)，6.09(s，2H)，4.93(t，2H，J＝6.2)，4.42(t，2H，J＝6.3)，4.08(s，3H)，3.24(t，2H，J＝6.3)，2.62(t，2H，J＝7.7)，.2.51(brs，4H)，2.12(m，2H)；1.64(m，4H)，1.51(m，2H)；FAB-MS m/z：447[M-Cl]+；元素分析：C27H31ClN2O4，理论值C，67.14；H，6.47；N，5.80.实测值：C，67.25；H，6.70；N，5.53.

                          化合物4d
实施例8：化合物4e的合成
方法同实施例4，所不同的是用吗啉代替二甲胺盐酸盐，产物为鲜黄色固体粉末4e。
产率：60％；1H NMR(CD3OD/CDCl3，300MHz)：δ9.65(s，1H)，8.48(s，1H)，7.92(d，1H，J＝9.1)，7.88(d，1H，J＝9.1)，7.46(s，1H)，6.80(s，1H)，6.01(s，2H)，4.90(t，2H，J＝6.3)，4.39(t，2H，J＝6.4)，4.01(s，3H)，3.67(t，4H，J＝4.4)，3.19(t，2H，J＝6.4)，2.62(t，2H，J＝7.4)，2.51(t，4H，J＝4.4)；2.09(m，2H)；FAB-MS m/z：449[M-Cl]+；元素分析C26H29ClN2O5，理论值C，64.39；H，6.03；N，5.78.实测值C，64.66；H，5.89；N，6.02.

                              化合物4e
实施例9：化合物4f的合成
方法同实施例4，所不同的是用化合物3b代替3a，用二乙胺代替二甲胺盐酸盐，产物为鲜黄色固体粉末4f。
产率：42％；1H NMR(DMSO-d6，300MHz)：δ9.81(s，1H)，9.00(s，1H)，8.19(d，1H，J＝9.2)，8.06(d，1H，J＝9.2)，7.76(s，1H)，7.07(s，1H)，6.14(s，2H)，4.89(t，2H，J＝5.5)，4.51(t，2H，J＝4.0)，4.07(s，3H)，3.68(t，2H，J＝4.0)，3.34(m，4H)，3.22(t，2H，J＝5.5)，1.29(t，6H，J＝7.0)；FAB-MS m/z：421[M-Cl]+；元素分析C25H29ClN2O4，理论值C，65.71；H，6.40；N，6.13.实测值C，65.45；H，6.65；N，6.28.

                                化合物4f
实施例10：化合物4g的合成
方法同实施例4，所不同的是用化合物3b代替3a，用二异丙胺代替二甲胺盐酸盐，产物为鲜黄色固体粉末4g。
产率：20％；1H NMR(CD3OD/CDCl3，300MHz)：δ9.86(s，1H)，8.58(s，1H)，8.02(d，1H，J＝9.0)，7.97(d，1H，J＝9.0)，7.56(s，1H，)，6.90(s，1H)，6.11(s，2H)，4.96(t，2H，J＝5.7)，4.39(t，2H，J＝6.7)，4.11(s，3H)，3.30(m，2H)，3.13(t，2H，J＝6.7)，3.02(t，2H，J＝5.7)，1.11(d，12H，J＝6.3)；FAB-MS m/z：449[M-Cl]+；元素分析C27H33ClN2O4，理论值C，66.86；H，6.86；N，5.78.实测值C，66.71；H，6.92；N，5.57.

                        化合物4g
实施例11：9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物对端粒酶的抑制作用
选择部分具有代表性的化合物，采用TRAP法进行无细胞体系端粒酶活性测定。从人乳腺癌细胞株MCF-7中提取总蛋白(内含端粒酶)，将一定量的总蛋白提取液与待测药物混合加入TRAP反应混合液中，PCR反应后利用荧光凝胶成像仪或荧光酶标仪进行检测，通过吸光值计算抑制端粒酶活性达50％时的化合物浓度，以IC50tel表示，结果如表1所示。结果表明，式(I)化合物在体外对端粒酶有明显抑制作用。因此本发明的9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物可用于制备以端粒酶为靶点的抗癌药物。
表1式(I)化合物对端粒酶活性的抑制作用(IC50tel/M)  化合物  小檗碱  4a  4b  4c  4d  4e  4f  4g  IC50tel(mol/L)  75  17.5  17.5  7.5  12.5  17.5  25  25
实施例12：9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物对c-myc DNA表达的抑制作用
选择部分具有代表性的化合物，采用RT-PCR法进行c-myc癌基因转录水平测定。处于对数生长期的淋巴瘤细胞株K562中加入不同浓度的9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物，作用96小时后，从细胞中提取总RNA，以c-myc特异引物进行RT-PCR，电泳后测定条带光密度值，计算抑制c-myc表达达50％时的化合物浓度，以IC50表示，结果如表2所示。结果表明式(I)化合物对细胞内癌基因c-myc的转录表达有明显抑制作用。因此本发明的9-脂肪氨基取代的小檗碱衍生物可用于制备以癌基因c-myc为靶点的抗癌药物。
表2式(I)化合物对c-myc基因表达的抑制作用(IC50/M)  化合物  小檗碱  4a  4b  4c  4d  4e  4f  4g  IC50(mol/L)  50  18  18  12.5  15  18  21  21
实施例13：9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物对肿瘤细胞生长的抑制作用
选择部分具有代表性的化合物，以四种肿瘤细胞株NCI-H460(人肺腺癌细胞株)、GLC-82(人肺腺癌细胞株)、MCF-7(人乳腺癌细胞株)，采用MTT法进行体外细胞毒测定。对数生长期细胞加入不同浓度的9-脂肪氨基取代的小檗碱衍生物，作用48小时后，测定其吸光度。分别计算抑制细胞生长达50％时的化合物浓度，以IC50值表示，结果如表3所示。结果表明式(I)化合物在体外对这三种肿瘤细胞株均具有较强的抑制作用。因此本发明的9-脂肪氨基取代的小檗碱衍生物可用于制备抗癌的药物。
表3式(I)化合物对肿瘤细胞株生长的抑制作用(IC50/M)  化合物  小檗碱  4a  4b  4c  4d  4e  4f  4g  NCI-H460  20  7.8  8.2  5.6  7.3  8.4  10.4  9.5  GLC-82  35  8.4  7.3  6.2  6.4  9.2  9.8  10.6  MCF-7  25  9.4  8.2  5.3  5.8  7.8  10.5  10.2
实施例14：9-脂肪氨基取代小檗碱衍生物急性毒性试验
选择部分具有代表性的化合物(如4c)，进行急性毒性试验。取18-22克小鼠随机分六组，每组10只小鼠，分别用生理盐水、DMSO2.5ml/kg、4c 500mg/kg、4c 200mg/kg、4c 100mg/kg、4c 50mg/kg处理，观察14天，结果可见500mg/kg组小鼠45％死亡，即4c对小鼠的急性毒性LD50值大约为500mg/kg。因此本发明的9-脂肪氨基取代的小檗碱衍生物的急性毒性较小，可用于制备抗癌药物。