口服灭活疫苗及其提供方法.pdf

本发明描述了选择用于针对微生物引起的黏膜表面异常微生物建群的口服灭活疫苗的微生物分离群的方法。该方法包括评估微生物的多种不同分离群活化抗原呈递细胞的能力，以提供每个分离群的活化数据，并评估分离群降低微生物引起的黏膜表面感染的效力，以提供每个微生物分离群的清除数据。接着选择与其他分离群中任一个相比，活化数据和清除数据相关，并且对于产生针对微生物的黏膜免疫而言是最佳的分离群，或者分别选择与其他分离群中任一个相比活化数据最佳的分离群和清除数据最佳的其他分离群，以用于疫苗。本发明还描述了提供针对黏膜表面异常微生物建群的口服灭活疫苗的方法，所述方法包括评估微生物的多种不同分离群诱导抗原应答细胞中IL－10和IL－12表达的能力。选择与其他分离群中任一个相比，诱导IL－12相对于IL－10最佳表达的至少一种分离群用于备疫苗。

权利要求书
1.  选择用于针对黏膜表面异常微生物建群的口服灭活疫苗的微生物分离群的方法，所述方法包括：
评估单细胞微生物的多种不同分离群活化抗原应答细胞的能力，以提供每个微生物分离群的活化数据；
评估分离群降低所述微生物引起的黏膜表面感染的效力，以提供每个微生物分离群的清除数据；和
从所述微生物分离群中选择分离群，与其他分离群中任一个相比，所述分离群的活化数据和清除数据相关，并且对于产生针对所述微生物的黏膜免疫而言是最佳的，或者分别选择与其他分离群中任一个相比活化数据最佳的分离群和清除数据最佳的其他分离群，以用于制备疫苗。

2.  根据权利要求1的方法，其中所述微生物分离群为灭活微生物分离群。

3.  根据权利要求1或2的方法，其中选择活化数据和清除数据与其他分离群中任一个相比均为最佳的分离群。

4.  根据权利要求1或2的方法，其中选择与其他分离群中任一个相比活化数据最佳的分离群以及清除数据最佳的其他分离群。

5.  根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述黏膜免疫主要包括细胞免疫应答。

6.  根据权利要求1-5中任一项的方法，其中所述抗原应答细胞包括选自抗原呈递细胞和T淋巴细胞中的一种或多种细胞类型。

7.  根据权利要求6的方法，其中所述抗原应答细胞包括抗原呈递细胞和T淋巴细胞两者。

8.  根据权利要求6或7的方法，其中所述抗原呈递细胞包括巨噬细胞。

9.  根据权利要求7或8的方法，其中所述T淋巴细胞为Th1淋巴细胞或定向Th1的T淋巴细胞。

10.  根据权利要求1-9中任一项的方法，其包括测量与抗原呈递细胞活化相关的一种或多种参数，以提供活化数据。

11.  根据权利要求10的方法，其中一种或多种参数选自细胞增殖、细胞表面抗原表达、细胞效应子功能和细胞因子产生。

12.  根据权利要求1-5中任一项的方法，其中所述活化数据包括指示活化抗原呈递细胞能力的抗原呈递细胞数据和指示活化T淋巴细胞能力的其他数据，并且其中抗原呈递细胞数据和其他数据相关。

13.  根据权利要求12的方法，其中所述抗原呈递细胞数据包括指示诱导抗原呈递细胞表达IL-12的能力的数据。

14.  根据权利要求13的方法，其中所述抗原呈递细胞数据包括指示抗原应答细胞IL-12表达相对与IL-10表达的数据。

15.  根据权利要求14的方法，其中选择分离群用于疫苗，所述分离群的活化数据指示引发细胞因子应答的能力，所述引发细胞因子应答的能力特征为IL-10∶IL-12比值约为30或更低。

16.  根据权利要求12-15中任一项的方法，其中所述其他数据包括指示诱导抗原应答细胞表达IFN-γ的能力的数据。

17.  根据权利要求1-16中任一项的方法，其中通过测定分离群体内降低黏膜表面感染的能力来评估所述分离群降低黏膜表面感染的效力。

18.  根据权利要求1-17中任一项的方法，其中所述微生物选择细菌、酵母或真菌。

19.  根据权利要求18的方法，其中所述微生物选自以下微生物物种：衣原体属物种、嗜血菌属物种、非典型性嗜血菌属物种、假单胞菌属物种、链球菌属物种、葡萄球菌属物种、大肠杆菌物种、枝原体属物种、螺杆菌属、假丝酵母属物种和酵母属物种。

20.  根据权利要求19的方法，其中所述微生物选自非典型性流感嗜血菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和肺炎链球菌。

21.  提供针对黏膜表面异常微生物建群的口服灭活疫苗的方法，所述方法包括：
评估单细胞微生物的多种不同分离群活化抗原应答细胞的能力，以提供每个微生物分离群的活化数据；
评估分离群降低所述微生物引起的黏膜表面感染的效力，以提供每个微生物分离群的清除数据；
从所述多种微生物分离群中选择分离群，与其他分离群中任一个相比，所述分离群的活化数据和清除数据相关，并且对于产生针对所述微生物的黏膜免疫而言是最佳的，或者分别选择与其他分离群中任一个相比活化数据最佳的分离群和清除数据最佳的其他分离群，以用于制备疫苗；和
使用选择的一个或多个分离群制备疫苗。

22.  根据权利要求21的方法，其中所述微生物分离群为灭活微生物分离群。

23.  根据权利要求21或22的方法，其中选择活化数据和清除数据与其他分离群中任一个相比均为最佳的分离群。

24.  根据权利要求21或22的方法，其中选择与其他分离群中任一个相比活化数据最佳的分离群和清除数据最佳的其他分离群。

25.  根据权利要求21-24中任一项的方法，其中所述黏膜免疫主要包括细胞免疫应答。

26.  根据权利要求21-25中任一项的方法，其中所述抗原应答细胞包括选自抗原呈递细胞和T淋巴细胞中的一种或多种细胞类型。

27.  根据权利要求26的方法，其中所述抗原应答细胞包括抗原呈递细胞和T淋巴细胞两者。

28.  根据权利要求27的方法，其中所述抗原呈递细胞包括巨噬细胞。

29.  根据权利要求27或28的方法，其中所述T淋巴细胞为Th1淋巴细胞或定向Th1的T淋巴细胞。

30.  根据权利要求21-29中任一项的方法，其包括测量与抗原呈递细胞活化相关的一种或多种参数，以提供活化数据。

31.  根据权利要求30的方法，其中一种或多种参数选自细胞增殖、细胞表面抗原表达、细胞效应子功能和细胞因子产生。

32.  根据权利要求21-25中任一项的方法，其中所述活化数据包括指示活化抗原呈递细胞能力的抗原呈递细胞数据和指示活化T淋巴细胞能力的其他数据，并且其中抗原呈递细胞数据和其他数据相关。

33.  根据权利要求32的方法，其中所述抗原呈递细胞数据包括指示诱导抗原呈递细胞表达IL-12的能力的数据。

34.  根据权利要求33的方法，其中所述抗原呈递细胞数据包括指示抗原应答细胞IL-12表达相对与IL-10表达的数据。

35.  根据权利要求34的方法，其中选择分离群用于疫苗，所述分离群的活化数据指示引发细胞因子应答的能力，所述引发细胞因子应答的能力特征为IL-10∶IL-12比值约为30或更低。

36.  根据权利要求32-35中任一项的方法，其中所述其他数据包括指示诱导抗原应答细胞表达IFN-γ的能力的数据。

37.  根据权利要求21-36中任一项的方法，其中通过测定分离群体内降低黏膜表面感染的能力来评估所述分离群降低黏膜表面感染的效力。

38.  根据权利要求21-37中任一项的方法，其中所述微生物选择细菌、酵母或真菌。

39.  根据权利要求38的方法，其中所述微生物选自以下微生物物种：衣原体属物种、嗜血菌属物种、非典型性嗜血菌属物种、假单胞菌属物种、链球菌属物种、葡萄球菌属物种、大肠杆菌物种、枝原体属物种、螺杆菌属、假丝酵母属物种和酵母属物种。

40.  根据权利要求19的方法，其中所述微生物选自非典型性流感嗜血菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和肺炎链球菌。

41.  提供针对黏膜表面异常微生物建群的口服灭活疫苗的方法，所述方法包括：
评估单细胞微生物的多种不同分离群诱导抗原应答细胞中IL-10和IL-12表达的能力；
从所述微生物分离群中选择至少一个分离群用于制备疫苗，与其他分离群中任一个相比，所述分离群诱导IL-12相对于IL-10的最佳表达；和
使用选择的分离群制备疫苗。

42.  根据权利要求41的方法，其中所述选择的分离群以约为30或更低的IL-10与IL-12的比值诱导IL-10和IL-12表达。

43.  根据权利要求42的方法，其中所述比值为约15或更低。

44.  根据权利要求41-43中任一项的方法，其中所述分离群进一步诱导抗原应答细胞表达IFN-γ。

45.  根据权利要求44的方法，其中分别与其他分离群中任一个相比，所述分离群的IFN-γ表达是最佳的。

46.  根据权利要求41-45中任一项的方法，其中所述抗原应答细胞包括外周血单核细胞。

47.  根据权利要求41-46中任一项的方法，其中所述抗原应答细胞包括抗原呈递细胞和T淋巴细胞。

48.  根据权利要求41-47中任一项的方法，其中所述微生物选自以下微生物物种：衣原体属物种、嗜血菌属物种、非典型性嗜血菌属物种、假单胞菌属物种、链球菌属物种、葡萄球菌属物种、大肠杆菌物种、枝原体属物种、螺杆菌属、假丝酵母属物种和酵母属物种。

49.  根据权利要求48的方法，其中所述微生物选自非典型性流感嗜血菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和肺炎链球菌。

50.  口服灭活疫苗，其通过权利要求21-40中任一项所定义的方法提供。

51.  口服灭活疫苗，其通过权利要求41-49中任一项所定义的方法提供。

说明书口服灭活疫苗及其提供方法
技术领域
本发明涉及选择用于口服灭活疫苗的单细胞微生物分离群的方法、诱导针对该微生物在黏膜表面异常建群的保护性黏膜免疫应答的方法。还提供了用于预防或治疗这种感染的口服灭活疫苗。
背景技术
抗菌疫苗为本领域已知，实例包括流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)B疫苗，其由与破伤风类毒素蛋白缀合的细菌多糖组成。已知用于预防或治疗肠道感染的灭活细菌疫苗已有一段时间，而用于伤寒的灭活细菌疫苗已经市售。这些疫苗主要(如果不是仅仅)通过注射施用并发挥“经典”疫苗的作用，因为它们的目的在于刺激全身性抗体应答以提供针对疾病的保护。
口服施用的抗原由肠道淋巴组织(GALT)(而不是全身性淋巴样组织)加工。从目的上讲，这可以从黏膜生理学来理解，其中需要排除环境“抗原”，但不以损伤黏膜的“炎症”为代价。因此存在有效的抑制机制，以使对这种抗原的潜在损伤性免疫应答最小化。这一概念最初称为“分裂耐受性”，其中全身性免疫应答(即抗体产生介导的)与检测黏膜抗体应答的失败(耐受)相关。口服施用灭活流感病毒的研究显示，在很窄范围的抗原剂量下刺激了抗体应答。这种免疫“带”的两侧是低和高耐受“带”。相同的概念也应用于细胞免疫，尽管可以刺激T淋巴细胞介导的应答的带似乎范围更宽地进行保护而没有抗体应答。抗原与GALT相互作用的结果是B和T淋巴细胞选择性地迁移到不同的黏膜感染位点，它们在这些位点介导保护。
本领域还已知针对非典型性流感嗜血菌(NTHi)感染的口服灭活细菌疫苗。NTHi是与慢性肺病患者中鼻和支气管建群最普遍相关的细菌，并与这些患者中支气管炎的急性发作相关。这些患者中急性支气管炎产生的重要因素是在对建群细菌的应答中，中性粒细胞不受控制且不正确地迁移到支气管腔。充满中性粒细胞的流体在支气管内的积累引起脓痰。已经显示口服NTHi灭活细菌疫苗对脓痰产生、高水平的呼吸道细菌建群和细菌的环境传播(通过旁观受试者受到的感染来评估)提供保护。NTHi疫苗在激活GALT后刺激普遍的黏膜系统，并且更特异地刺激肠中的淋巴集结。
国际专利申请号PCT/AU86/00071描述了包含灭活细菌的口服无佐剂单细菌疫苗，其特别用于为长期慢性肺病患者提供黏膜免疫。具体地，该申请表明了不含有佐剂产生的疫苗的免疫效力，在这些疫苗中通常包括佐剂以促进免疫应答。推论不存在佐剂时产生的免疫应答是由于灭活细菌引发的应答，其不足以触发评估的患者肺中主要的抑制T细胞种群。
发明概述
宽泛而言，本发明涉及提供用于针对异常微生物建群的口服灭活疫苗以及来自以下认识：在杂交种群中的口服灭活疫苗引发的这种感染的清除存在显著的变异，反映了种群中的遗传变异。相信与使用本领域的口服灭活细菌疫苗相关的黏膜免疫的变异是由于在疫苗中使用非最佳或随机选择的微生物分离群引起的，这是因为未能认识到微生物的不同分离群在活化抗原呈递细胞和T淋巴细胞的能力上的显著变异。给定观察到的变异性，分离群的选择对于优化杂种种群中不同个体的普通黏膜系统的活化程度是关键性的。本发明的一个或多个实施方案中提供的方法使得可以选择优化口服灭活疫苗的分离群。
更具体地，本发明一方面提供了选择用于针对黏膜表面异常微生物建群的口服灭活疫苗的微生物分离群的方法，所述方法包括：
评估单细胞微生物的多种不同分离群活化抗原应答细胞的能力，以提供每个微生物分离群的活化数据；
评估分离群降低该微生物引起的黏膜表面感染的效力，以提供每个微生物分离群的清除数据；和
从该微生物分离群中选择分离群，与其他分离群中任一个相比，所述分离群的活化数据和清除数据相关，并且对于产生针对该微生物的黏膜免疫而言是最佳的，或者分别选择与其他分离群中任一个相比活化数据最佳的分离群和清除数据最佳的其他分离群，以用于制备疫苗。
本发明另一方面提供了针对黏膜表面异常微生物建群的口服灭活疫苗的方法，所述方法包括：
评估单细胞微生物的多种不同分离群活化抗原应答细胞的能力，以提供每个微生物分离群的活化数据；
评估分离群降低该微生物引起的黏膜表面感染的效力，以提供每个微生物分离群的清除数据；
从该多种分离群中选择分离群，与其他分离群中任一个相比，所述分离群的活化数据和清除数据相关，并且对于产生针对该微生物的黏膜免疫而言是最佳的，或者分别选择与其他分离群中任一个相比活化数据最佳的分离群和清除数据最佳的其他分离群，以用于制备疫苗；和
使用选择的分离群制备疫苗。
一般选择与其他分离群中任一个相比活化数据和清除数据都最佳的分离群。
优选地，黏膜免疫主要包括细胞免疫应答。
优选地，用于提供活化和清除数据的分离群是微生物的灭活分离群。然而，本发明并不仅限于此，活化和清除数据可以获自活分离群，随后将选择的分离群灭活用于疫苗。
被所述分离群活化的抗原应答细胞通常包括抗原呈递细胞和T淋巴细胞之一或其两者，优选同时包括这两种类型的细胞。抗原呈递细胞一般包括巨噬细胞。最优选地，T淋巴细胞为Th1细胞。抗原应答细胞的活化应以其最广义理解，包括分离群的直接和/或间接活化。“直接”活化指分离群通过与细胞接触(例如微生物分离群与其结合或被其吞噬)来活化至少一些抗原应答细胞。“间接”活化指至少一些抗原应答细胞通过以下活化：通过与已经接触分离群的细胞(如巨噬细胞)相互作用活化或者例如通过由分离群引发或诱导释放的细胞因子或其他化学信使活化，或者通过如分离群分泌的毒素或抗原等物质活化，或者以上可能性的组合。
可以通过测量与细胞活化相关的一种或多种参数来评估抗原应答细胞的活化水平。优选地，对分离群活化抗原呈递细胞和T淋巴细胞的能力都进行评估。在特别优选的实施方案中，通过测量指示抗原呈递细胞活化水平的至少一种参数和指示T淋巴细胞活化水平的至少一种其他参数来评估通过每个分离群获得的抗原应答细胞的活化。最优选地，选择与其他测试分离群相比，其活化数据对于活化抗原呈递细胞和T淋巴细胞都最佳的分离群，以用于制备口服灭活疫苗。
优选地，选择其活化数据指示该分离群引发细胞因子应答的能力(特征为IL-10∶IL-12比值约为30或更低)的分离群用于制备口服灭活疫苗。
因此，本发明另一方面提供了选择用于针对黏膜表面异常微生物建群的口服灭活疫苗的微生物分离群的方法，所述方法包括：
评估单细胞微生物的多种不同分离群诱导抗原应答细胞中IL-10和IL-12表达的能力；和
从所述微生物分离群中选择至少一种分离群用于制备疫苗，与其他分离群中任一个相比，该分离群诱导IL-12相对于IL-10的最佳表达。
本发明另一方面提供了提供针对黏膜表面异常微生物建群的口服灭活疫苗的方法，所述方法包括：
评估单细胞微生物的多种不同分离群诱导抗原应答细胞中IL-10和IL-12表达的能力；
从所述微生物分离群中选择至少一种分离群用于制备疫苗，与其他分离群中任一个相比，该分离群诱导IL-12相对于IL-10的最佳表达；和
使用该分离群制备疫苗。
单细胞微生物可以是具有在哺乳动物黏膜表面建群能力的任何这类微生物，并可选自例如细菌、真菌和酵母。微生物一般为细菌，因此疫苗为口服灭活细菌疫苗。优选地，所选分离群以完整灭活生物用于本发明的疫苗中。然而，本发明不限于使用完整的灭活生物，可以提供包含来自所选择分离群细胞外膜的特定物质的疫苗。
另一方面，本发明涉及通过本发明方法提供的口服灭活疫苗。
本发明的疫苗可以针对任何黏膜位点的感染，包括慢性和急性的这类感染。感染可以由瞬时暴露于通常不在黏膜位点建群的微生物病原体引起，或者是例如由通常可见于该位点的微生物菌群引起的机会感染引发。
因此，另一方面，本发明提供了通过单细胞微生物预防或治疗哺乳动物黏膜表面感染的方法，所述方法包括：对哺乳动物施用有效量的本发明口服灭活疫苗，以产生针对该微生物的黏膜免疫。
哺乳动物可以是可用本发明口服灭活细菌疫苗治疗的任何哺乳动物。例如，哺乳动物可以是灵长类、啮齿科成员如大鼠或小鼠，或牛、猪、羊或马科成员。然而，优选哺乳动物为人类。
在本说明书全文中，词语“包含”应理解为意指包括所述元素、整体或步骤或者元素、整体或步骤组，但不排除任何其他元素、整体或步骤或者元素、整体或步骤组。
本说明书中提及的所有出版物都在本文中引为参考文献。本说明书中包括的任何文献、作用、材料、装置、文献等的讨论仅出于提供本发明内容的目的。在本申请中各项权利要求的优先权日之前，不应理解为承认任一或所有这些事物形成现有技术基础的部分，或者是澳大利亚或其他地方存在的本发明相关领域的一般普通知识。
以下对优选实施方案的描述可使本发明的特征和优点更为明显。

附图简述
图1显示通过口服施用细菌的不同完整细胞灭活分离群对BALB/c小鼠鼻中金黄色葡萄球菌(S.aureus)建群的降低。
图2显示通过口服施用细菌的不同完整细胞灭活分离群对BALB/c小鼠呼吸道中NTHi建群的降低。
优选实施方案详述
本发明疫苗可特别应用于预防或治疗肺及上呼吸道感染。然而，本发明不仅限于此，由普通黏膜系统活化引起的黏膜免疫可以提供针对身体其他黏膜位点的感染的保护或治疗，所述感染包括口、鼻、口咽、鼻咽、咽、消化、阴道、眼相关感染和泌尿黏膜表面感染。疫苗可以含有选自衣原体属物种(Chlamydia species)、嗜血菌属物种(Haemophilus species)、非典型性嗜血菌属物种(Non-typable Haemophilus species)、假单胞菌属物种(Pseudomonas species)、链球菌属物种(Streptococcus species)、葡萄球菌属物种(Staphylococcus species)、大肠杆菌物种(E.coli species)、枝原体属物种(Mycoplasma species)和螺杆菌属物种(Helicobacter species)等细菌，或者整合不同细菌或其他单细胞微生物物种的组合。本发明口服灭活疫苗中可以使用的除细菌以外的微生物包括假丝酵母属物种(Candidaspecies)如白假丝酵母(Candida albicans)和酵母物种如酵母属物种(Saccharomyces species)。特别优选的本发明口服灭活疫苗是通过选自非典型性流感嗜血菌(Non-typable H.influenzae)(NTHi)、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌(Ps.aeruginosa)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)及其组合的细菌预防或治疗黏膜感染的疫苗。
尽管本发明疫苗的主要应用是产生针对已提供疫苗并可发生于多种黏膜位点的特定细菌感染的黏膜免疫，但该疫苗也可用于治疗或预防由于感染而恶化的疾病或病症。
例如，铜绿假单胞菌不仅在呼吸道建群，还感染眼黏膜和耳腔。非典型性流感嗜血菌(NTHi)也与一系列传染病(包括中耳炎)相关，并与肺炎及慢性支气管炎的恶化相关。因此，可以施用含有一种或多种这种细菌的灭活NTHi分离群的疫苗以预防或治疗这些病症。类似的，包含灭活流感嗜血菌、肺炎链球菌或铜绿假单胞菌的本发明疫苗也可应用预防或治疗支气管炎或肺炎，以及囊性纤维化急性感染和慢性阻塞性呼吸道疾病、窦疾病、肺功能受损，以及其他肺及呼吸道疾病和病症。这些疫苗还可特别应用于流感病毒或其他病毒的感染之后相应细菌导致的重叠感染(特别是中老年)。
尽管优选在本发明疫苗中使用完整的灭活分离群，但还可以将包括表面抗原的细胞表面颗粒物与完整灭活生物一起使用或代替完整灭活生物。在特别优选的实施方案中，使用生物的细胞外膜级分。可以通过以超声处理或其他合适的技术(如果需要)破碎灭活或活的选定分离群、通过如离心、过滤和/或本领域已知的其他合适的技术将所需级分与其他细胞组分分开，以制备颗粒物。可以使用获得所需水平的细胞破碎的任何适当方法，包括超声处理或使用适当的表面活性剂并搅动来溶解。使用超声处理时，可以对分离群进行多个超声处理步骤，以获得所需程度的细胞破碎或产生所需大小的颗粒物质。可以通过比较抗原应答细胞对分离群不同级分的应答并选择使细胞免疫应答最大化的级分来选择使用的颗粒物质级分。
为了评估微生物分离群或其颗粒物质活化抗原应答细胞的能力，可以评估指示细胞活化水平的任何参数。具体地，优选参数包括细胞增殖、细胞表面抗原表达、测量细胞效应子功能和细胞因子产生中的一种或多种。
可以通过细胞计数、3H胸苷摄取和/或MTT测定来便利地评估细胞增殖(特别是T细胞增殖)。
细胞因子的表达可以通过捕捉或夹层酶联免疫吸附测定(ELISA)直接测量，或者通过目的细胞因子作为生长因子或抑制因子的细胞生长测定来间接测量。类似的，细胞因子的表达可以通过使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)测定编码细胞因子的mRNA的表达来评估，或者通过本领域已知的使用单个细胞和特定寡核苷酸探针的原位杂交方案来评估。
疫苗产生的保护性免疫应答通常主要由Th1 T淋巴细胞介导，Th1 T淋巴细胞在IL-12和IFN-γ存在下分化自增殖CD4+T细胞。IL-12由抗原呈递细胞在活化早期产生。Th1 T淋巴细胞通过分泌IFN-γ，以及ThI细胞表达的CD40配体与巨噬细胞表达的CD40受体的相互作用来刺激感染的巨噬细胞。更广泛地，Th1细胞刺激吞噬细胞(如中性粒细胞和巨噬细胞)的抗菌机制并释放将这些吞噬细胞吸引至感染位点的细胞因子。除了IFN-γ以外，Th1细胞一般还分泌IL-12和IFN-β。
尽管Th1和Th2细胞均分泌IL-3，但Th1和Th2细胞的GM-CSF和例如IFN-α、总体细胞因子谱是不同的。更具体地，Th2细胞的活化主要引起体液免疫应答，其特征为B淋巴细胞的活化和活化B细胞的抗体产生，而Th1细胞主要介导非抗体细胞免疫应答。驱动免疫应答的Th2细胞的细胞因子特征在于包括IL-4、IL-5、IL-10、IL-13和TGF-β。因此，检测特征在于活化抗原呈递细胞和定向Th1的CD4+T淋巴细胞的IL-12、IFN-γ或其他细胞因子中的一种或多种的分泌可用于评估给定的微生物分离群活化普通黏膜系统的能力。优选地，测量IL-12分泌水平以提供待评估微生物分离群活化抗原呈递细胞程度的指示。类似的，一般测量IFN-γ分泌水平以提供微生物分离群获得的T淋巴细胞活化水平的指示。
在特别优选的实施方案中，活化数据可以包括指示IL-10相对于IL-12的表达的比值。IL-10抑制巨噬细胞释放细胞因子(如IL-12)，从而抑制Th1细胞活化。因此该比值指示微生物分离群引发的Th1淋巴细胞应答的水平。因此，选择用于活化抗原呈递细胞的分离群需要引发细胞因子应答，其特征为低IL-10∶IL-12比值但高表达IFN-γ。优选地，该比值小于30，更优选小于20、15、10、5，甚至小于4。
疫苗一般包含数量在疫苗组合物的约5％至约80％(重量/重量)之间的所选择细菌分离群。应该理解，疫苗中每种分离群的数目应该是将有效剂量递送至哺乳动物以活化普通黏膜系统的数目，其中要考虑打算使用的递送模式和疫苗的性质(如粉剂、液体剂、气雾剂递送等)。施用的每种细菌分离群的剂量一般分别在约109至约1012cfu之间，更优选约1010至约1011cfu之间。可以通过以下步骤确定所选择细菌分离群的最佳剂量：对不同组的测试哺乳动物施用不同剂量的分离群，其后用相应的活细菌病原体感染各组动物并确定获得满意的病原体清除所需的剂量水平，这是本领域技术人员容易理解的。
疫苗本身可以是冷冻干燥或低压冻干的，其后用可生理使用的缓冲液或流体进行重建。疫苗还可以含有一种或多种抗结剂、等渗剂、防腐剂如柳硫汞、稳定剂如氨基酸和糖部分、甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精、pH修饰剂氢氧化钠、盐酸、磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠、可药用载体如生理盐水、适当的缓冲液、溶剂、分散剂和等渗制剂。这些成分和介质用作药物活性物质和疫苗的用途是本领域所熟知的。除了与细菌分离群不相容的任何常规介质或试剂以外，特别包括它们在本发明疫苗中的用途。需要时，疫苗中还可掺入补充活性剂如一种或多种细胞因子，以增强免疫应答，特别是特征为Th1应答的细胞因子，如IFN-γ、IL-12和TNF-β。
此外，本发明的疫苗还可包含一种或多种佐剂。可用于本发明疫苗组合物的合适的佐剂、可药用载体和成分的组合可见于例如本领域技术人员所熟知的手册和教科书，如“Remington”The Science and Practice ofPharmacy(Mack Publishing Co.，1995)，其内容完整引入本文作为参考。
可以以干粉或液体形式施用口服灭活细菌疫苗。可以通过气雾剂吸入、作为给药液体通过滴注或作为喷雾剂进行施用。便于递送口服疫苗的装置为本领域所熟知，包括计量吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)和喷雾器，所述喷雾器包括使用超声能或压缩空气或其他推进物实现雾化的装置。可在MDI中使用的推进物包括例如含氯氟烃(CFC)和二氯二氟烃(CFC-12)和氢化氟代烷(hydrofluoroalkane)。
为了更清楚地理解本发明的性质，参考以下非限制性实施例描述其优选形式。
实施例1：用灭活铜绿假单胞菌口服疫苗口服免疫后T淋巴细胞活化作用的改变
进行了研究以证明受体T细胞识别并应答于未选择灭活细菌分离群的能力的改变。对一组9位患支气管扩张的人受试者给予两个疗程的灭活口服铜绿假单胞菌(Ps.a)疫苗。每个疗程包括三天中每天施用两片片剂(每片含1011个灭活细菌)，第二个疗程开始于第28天。使用的铜绿假单胞菌分离群选自已在动物模型中显示能活化普通黏膜系统的分离群。
使用在菲可/Paque密度梯度上分离自肝素化血液的外周血单核细胞作为抗原引发的T细胞的来源。在4℃以200g离心20分钟以后，从血浆：菲可界面收集细胞，用pH 7.4的PBS洗涤两次，接着以2×206个细胞/mL重悬于含有青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)和2-巯基乙醇(5×10-5M)的AIM-V培养基中。在96孔平底微孔板中，含有或不含有Ps抗原(1μg/mL)或PHA-P(2μg/mL)，总体积200μL的AIM-V培养基中培养细胞。在CO2培养箱中以37℃孵育4天后，在最后8小时中用每孔0.5μCi 3H-胸苷脉冲处理培养物，接着使用细胞收获器在玻璃纤维滤器上收获细胞。干燥后，在闪烁计数器中计数滤器。结果表达为平均cpm±SE。
表1显示口服免疫后的平均计数(H3-胸苷摄取代表抗原诱导的增殖)和平均值的标准误(SE，代表单个应答的变化)。
表1：人中铜绿假单胞菌抗原诱导的T细胞增殖  天数  PHA  铜绿假单胞菌抗原(1μg/ml) CPM×00  SE(平均值％)  CPM×000  SE(平均值％)  0  28  56  84  82  80  13  12  12.5  3  4.4  9.5  16.5  65  42
结果显示在研究全过程中通过经典非特异性T细胞mitogent PHA诱导了一致的平均刺激，标准误一致且较小，反映了相对相似的增殖应答。在口服免疫前用铜绿假单胞菌抗原刺激时，标准误(SE)与PHA中所见为相同数量级。然而，口服免疫28和56天后，记录到了应答的显著变化(SE为64和42)。这些结果显示了体内T细胞应答性的可观变化，反映了未能选择与多数受者的T细胞受体结合的分离群。
作为对照，使用相同的铜绿假单胞菌分离群口服免疫DA大鼠(每组4只)。简言之，在2周中，每周5天每天给予大鼠PBS中的5×108个多聚甲醛灭活的铜绿假单胞菌。分离外周血细胞并如上述评估3H-胸苷摄取。结果示于表2。
表2：近交大鼠中铜绿假单胞菌抗原诱导的T细胞增殖  H3-胸苷CPM(×000) SE(×000)(平均值％)  未免疫  16  19  经免疫(片剂)  35  13
在近交DA大鼠中发现为13的低SE(反映低遗传变异性)。推断人应答中的高SE(即反映个体变异的程度)主要是由于未选择疫苗候选者与抗原呈递细胞T淋巴细胞单位结合的变异。这种变异与人类研究中观测到的个体之间保护水平的较大差异相关，所述差异反映为第31天测定的细菌建群降低(通过痰中的细菌数测量)和痰脓降低(通过白细胞总数测量)的高变异水平。具体地，细菌计数在3个受试者中降低(1、3.0、1.0log)，在5个受试者中保持不变，在1个受试者中提高(2log)。痰白细胞计数平均降低40％，SE降低50％。因此，T细胞的活化作用(负责将白细胞募集至支气管腔接着进行细菌清除，参阅如Dunkley等(1994)′A role forCD4+ T cells from orally immunized rats in enhanced clearance ofPs.aeruginosa from the lung.Immunol 83，362-369)也是可变的，表示使用的灭活细菌分离群不是在普通人种群中用作口服灭活细菌疫苗的最佳分离群。
实施例2：选择引发细胞因子释放的最佳分离群
通过磷酸缓冲盐水(PBS)中的2％多聚甲醛处理来灭活得自正常人类受试者的金黄色葡萄球菌和非典型性流感嗜血菌。在室温孵育1小时以后，在PBS中彻底洗涤经处理的细菌，接着通过在甘露糖醇盐琼脂或马血琼脂平板上培养来测试生存力。通过吸光度与CFU的标准回归曲线的内插法将灭活细菌调整至2×109cfu/mL。用于培养物刺激时，将来自每个分离群的细菌调整至终浓度为2×108CFU每毫升含有青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)和2-巯基乙醇(2-ME，5×10-5M)的无血清AIM-V培养基。
对于金黄色葡萄球菌分离群，在两周中每周隔天通过胃内给予雄性BALB/c小鼠(n＝5)5×109个灭活完整细菌细胞，其后用鼻内施用的活金黄色葡萄球菌细菌进行攻击。基于检测多种口服剂量的类似研究确定剂量。对照小鼠(n＝5)仅喂饲PBS。在攻击后24-48小时测定鼻中集落的降低。对于NTHi分离群，在两周中每周隔天通过胃内途径给予雄性BALB/c小鼠5×109个灭活完整细菌细胞，其后用活NTHi细菌鼻内攻击。对照小鼠仅喂PBS。在活体攻击后4小时，测定支气管肺泡冲洗物(BAL)和肺匀浆中NTHi建群的降低。
通过在菲可/Paque密度梯度下离心从肝素化血液中分离人外周血单核细胞(PBMNC)。通过离心洗涤后，在96孔平底微孔板的孔内，以总体积300μL，每孔2×105个细胞将PBMNC与2×106/ml或2×108/ml CFU灭活细菌一起培养。在37℃和5％CO2的空气中孵育3天后，收集培养物上清液并存储于-20℃至进行ELISA测定细胞因子。
使用抗原呈递细胞T细胞培养系统测试单个金黄色葡萄球菌和NTHi分离群刺激细胞因子产生的能力。简言之，在CO2培养箱中，96孔板的平底孔内用梯度剂量的灭活细菌刺激含有APC和T细胞的PBMNC(2×106/ml)3天。收集培养物上清液并通过ELISA测定IL-12和IFN-γ。
表3显示测试其刺激IL-12和IFN-γ产生能力的金黄色葡萄球菌分离群(A2、A3、A8、A15、A28、A19、A20)的结果。对结果进行中位数标准化并表达为对照的百分比。观察到了多种IL-12和IFN-γ刺激。分离群A2、A8、A28和A19是比分离群A15、A20和A3更强的IL-12和IFN-γ产生刺激剂。与其他分离群中任一个相比，用分离群A28引起4-10倍的IL-12和/或IFN-γ产生。
表3：用不同剂量的灭活完整细胞金黄色葡萄球菌分离群刺激的外周血单核细胞培养物中的IL-12和IFN-γ产生  分离物  IL-12pg/mL  IFN-γpg/mL *106细菌/l *108细菌/l  106细菌/l  108细菌/l  A2  A3  A8  A15  A28  A19  A20  147  ＜10  36.5  ＜10  1568  149.3  18.6  186.5  ＜10  119  ＜10  ＜10  267.8  26.7  2159  2242  1938  ＜10  8592  800.6  977.9  891.9  2009  1711  2476  9202  607.4  668.3
*每毫升的灭活细菌数
使用来自5个正常健康受试者的PBMNC在培养物中测试分离群A2、A8和A28时，仅有A2和A28能在所有受试者中刺激显著量的IL-12和IFN-γ(表4和表5)。这些结果表明分离群A2和A28是免疫调节细胞因子的有效刺激剂，因此适于作为可能在多数受试者中介导保护性黏膜免疫的免疫刺激剂候选者。
表4：来自正常健康受试者的人外周血单核细胞培养物中用灭活完整细胞金黄色葡萄球菌分离群刺激的IL-12产生  分离物  IL-12(pg/mL)  受试者1  受试者2  受试者3  受试者3  受试者5 *106 *108  106  108  106  108  106  108  106  108  A2  A8  A28  无  138.6  157  112  -  193.7  ＜10  214.2  ＜10  11.3  46  ＜10  -  147.5  10.6  137.2  ＜10  ＜10  27.6  nd  -  87.6  29.7  56.9  ＜10  nd  nd  nd  -  264.8  nd  328.2  ＜10  nd  nd  nd  -  271.8  nd  454.2  ＜10
*每mL的灭活细菌数
nd＝未测定
表5：来自正常健康受试者的人外周血单核细胞培养物中用灭活完整细胞金黄色葡萄球菌分离群刺激的IFN-γ产生  分离物                                IFN-γ(pg/mL)    受试者1    受试者2    受试者3    受试者3     受试者5*106*108 106 108 106 108 106 108  106 108  A2  A8  A28  无7453388724-550146285368＜10 3316 7458 8547 - 8689 7458 1032 ＜10 963 6479 646 - 8838 8258 8429 ＜10 nd nd nd - 12152 11770 13560 ＜10  nd  Nd  Nd  -  6232  nd  6544  ＜10
*每mL的灭活细菌数
nd＝未测定
发现所有测试的NTHi分离群(B3、B4、B6、B10和B14)都能刺激不同量的IL-12和IFN-γ产生，而与培养刺激中使用的细菌剂量无关(表6)。与其他NTHi分离群相比，分离群B3和B6刺激产生较大量的IL-12和IFN-γ。结果以对照的百分比进行中位数表示。
表6：外周血单核细胞(PBMNC)培养物中用灭活完整细胞非典型性流感嗜血菌分离群刺激的IL-12和IFN-γ产生  细菌分离物            IL-12(pg/mL)           IFN-γ(pg/mL)  *106细菌/ml   *108细菌/ml    106细菌/ml   108细菌/ml *PC *RC  PC  RC  PC  RC  PC  RC    B3    B4    B6    B10    B14    无  65.5  25  40.5  18.2  28.6  23  20  13.2  26.9  16.2  17.1  -  42.8  18.2  41.2  24.4  18.2  -  20.6  14.8  34.7  21.2  16.8  -  1740  956  1755  378  274  19    316    76    436    53    45    - 1723 1208 2063 1002 1341 -  786  420  1758  619  713  -
*来自正常健康受试者的PBMNC
实施例3：选择作为降低黏膜建群的免疫刺激剂的最佳细菌分离群
用活细菌攻击后，使用两种小鼠黏膜集落模型测定(1)鼻腔中建群的金黄色葡萄球菌的降低和(2)肺中非典型性流感嗜血菌建群的降低。
在模型1中，在两周中每周2天通过胃内途径给予8周龄雄性SPFBALB/c小鼠(n＝5)300μl PBS中的灭活完整细胞金黄色葡萄球菌细菌(每只小鼠5×109个)。对照小鼠仅接受PBS。分别测试了用多聚甲醛灭活的来自分离群A2、A28、A3、A15、A19和A20的细菌，该测试包括ATCC菌株作为对照(ATCC 49247)。最后给药后1天，通过在每个鼻孔施用10μl 5×109个细菌/ml的活金黄色葡萄球菌攻击小鼠。攻击24-48小时后，处死小鼠并剪下鼻组织。将该组织在PBS中匀浆，收集匀浆，然后通过将匀浆10倍连续稀释至甘露糖醇盐琼脂平板上来测定细菌浓度。37℃孵育24小时后测定CFU计数。
图1显示接受制备自分离群A19、A20、A28、A2、A3、A8和A15的灭活细菌的小鼠的集落与对照相比发生降低。保护水平取决于选择的分离群，效力为A28＞A2＞A8＞A3＞A15＞A20＞A19。此外，用A28、A2和A8分离群得到的高保护水平与其刺激人PBMNC培养物中高水平的IL-12和IFN-γ的能力相关(参见表2和3)。
在模型2中，在两周中每周隔天通过胃内途径给予小鼠(n＝5)300μlPBS中的灭活完整细胞NTHi(每只小鼠5×109个)，其后用通过鼻内途径施用的PBS中的10μl活细菌(每只小鼠5×109个)进行攻击。分别测试了由分离群B3、B14、B16和B10制备的多聚甲醛灭活的细菌。活菌攻击后4小时，在来自处理小鼠和对照小鼠的支气管-肺泡灌洗液(BAL)和肺匀浆中，以细菌清除的形式测定建群的降低。如图2所示，在测试的分离群中，B3、B16和B10给出与ATCC对照菌株和分离群B14相比的最佳清除率。当与体外刺激IL-12和IFN-γ产生相比时，B3和B6分离群给出与建群降低的最佳相关性(参见表4)。
实施例4：基于最佳体外细胞因子应答和体内保护，选择作为候选疫苗的最佳细菌分离群
通过在菲可/Paque密度溶液上离心，从来自正常健康受试者的外周血分离外周血单核细胞(PBMNC)。从血浆/菲可界面收集细胞并通过在40℃以200g离心15分钟在PBS中洗涤3次。培养前，以2×106个细胞/mL将细胞重悬于AIM-V无血清培养基中，通过台盼蓝排除实验测定生存力。在平底96孔微孔板中，将100μl细胞悬液等分试样一式二份加入等体积的含梯度浓度灭活细菌的AIM-V培养基中或仅加入培养基中。在含有5％CO2的空气的培养箱中将培养物在37℃培养3天。培养后，收集上清液，混合并保存于-20℃至测定。
使用单克隆抗体对，以重组蛋白作为标准品，通过ELISA测量培养物上清液中的IL-10、IL-12和IFN-γ。简言之，在40℃用捕捉抗体将平底微孔板的孔包被过夜。洗涤后，室温(RT)下用PBS中的2％BSA溶液将孔封闭60分钟，接着在PBS/Tween中洗涤。每个孔中加入100μl样品上清液。接着在RT孵育90分钟，洗涤孔，然后加入100μl生物素化的检测剂抗体。孵育90分钟后，加入缀合HRP的链霉抗生物素蛋白溶液30分钟。接着洗涤孔，其后加入TMB底物溶液20分钟。显色后，用硫酸溶液终止反应，其后在ELISA平板读数器上在450nm处读数。通过使用标准曲线的内插法来计算培养物上清液中分泌的细胞因子量，并将结果表示为pg/mL。
表7显示用金黄色葡萄球菌(分离群A28)或NTHi(分离群B6)刺激外周血单核细胞产生的高水平IFN-γ和IL-12与鼠建群模型中的高保护水平相关。相反，在刺激低水平细胞因子的分离群和高水平保护的分离群间(A3和B10)无相关性。反言之，在刺激高水平细胞因子的分离群和低水平保护的分离群(A19和B14)之间未观察到相关性。结果证明，最佳的细胞因子应答和体内保护是选择作为候选口服疫苗或免疫刺激剂，以增强黏膜免疫并降低呼吸道建群的最佳细菌分离群的标志。
表7体外细胞因子产生与体内细菌清除的相关性  分离物  IL-12(pg/mL) IFN-γ(pg/mL)  保护(％)  A28  A3  A19  B6  1568  ＜10  267.8  412  9202  ＜10  800.6  1063  91.3  74.7  28  100  B10  B14  ＜10  24  335  1341  72.2  24
实施例5：基于IL-10和IL-12的差异产生以及增强IFN-γ产生和体内保护的能力选择最佳分离群
不同分离群刺激培养物中PBMNC产生不同量的IL-10和IL-12，其比值与IFN-γ和体内保护水平相关。如表8所示，具有低IL-10/IL-12比值的NTHi分离群(B3、B6)是Th1应答的较好刺激剂，所述Th1应答特征为与对照相比，最大的IFN-γ产生和用灭活疫苗分离群口服免疫的小鼠呼吸道中细菌建群的降低。反言之，具有高IL-10/IL-12比值的分离群(B4、B10和B14)与IFN-γ的较低产生和较高水平的建群相关。对于金黄色葡萄球菌分离群也是如此，其中高水平的IFN-γ与低IL-10/IL-12比值和低建群率相关(表9)。总而言之，结果显示可以基于低IL-10/IL-12比值和高IFN-γ以及增强的体内保护选择最佳细菌分离群作为候选疫苗。因此，基于这些结果，对于测试的所有健康受试者(最少3个受试者)而言，最佳分离群将伴随着IL-10/IL-12比值的截止值(如＜15)和高IFN-γ产生(对于NTHi为786pg/ml，对于金黄色葡萄球菌为＞500pg/ml)。
表8：基于IL-10/IL-12比值和IFN-γ产生及体内保护选择非典型性流感嗜血菌分离群  NTHi  分离  物  受试者1  受试者2  受试者3  细菌  建群*  IL-10/IL  -12比值  IFN-γ  (pg/mL)  IL-10/IL  -12比值  IFN-γ  (pg/mL)  IL-10/IL  -12比值  IFN-γ  (pg/mL)  ％对  照  B3  B6  B4  B10  B14  对照  10.9  7  23.8  720  749  51  1010  1645  532  236  45  0  2.0  2.5  26.4  16.8  22  10  1740  2063  956  690  897  23  1.25  0.41  6.7  80  29.8  1.24  786  1758  76  53  45  19  37  55  100  100  76  100
*用灭活完整细胞细菌分离群口服免疫的小鼠(n＝10)或仅给予PBS的小鼠(对照)呼吸道中的建群率
表9：基于IL-10/IL-12比值和IFN-γ产生及体内保护选择金黄色葡萄球菌分离群  金黄  色葡  萄球  菌分  离物  受试者1  受试者2  受试者3  细菌  建群*  IL-10/IL  -12比值  IFN-γ  (pg/mL)  IL-10/I  L-12比  值  IFN-γ  (pg/mL)  IL-10/IL  -12比值  IFN-γ  (pg/mL)  ％对  照  A2  A8  A28  A19  A20  对照  0.99  3.75  1.6  24  18  2  5501  4623  5638  197  222  9.8  2.5  13.2  4.9  3.9  38.8  2  8639  7620  8547  607  668  198  5.9  10.3  14.3  20.9  125.3  2.3  8839  8250  8429  714  1075  230  9.7  26.2  8.7  72  62.5  100
*用灭活完整细胞细菌分离群口服免疫的小鼠(n＝10)或仅给予PBS的小鼠(对照)鼻中的建群率
实施例6：非典型性流感嗜血菌分离群NTHi164刺激外周血单核细胞
将完整的灭活NTHi 164与来自正常健康对照的PBMNC一起培养并测定IFN-γ的产生。结果示于表10。
表10：用完整的灭活NTHi 164刺激PBMNC的IFN-γ产生刺激  完整灭活细  胞NTHi 164  受试者  MD  PH  PC  RC  IFN-γ(pg/mL)  106细菌/ml  207  257  491  72  108细菌/ml  1738  1193  4533  514
与实施例2中的表6相比，NTHi164对RC表达相当水平的IFNγ，对PC表达比NTHi分离群B3或B6更高的水平。还制备了NTHi分离群的颗粒级分并评估了该级分刺激IFNγ产生的能力。结果示于表11。简言之，从-80℃保存中将NTHi164复苏到巧克力琼脂平板上，接着传代到巧克力琼脂上。收获细菌、沉淀、洗涤并在PBS中重悬至1010/ml。使用30秒开60秒关的10个循环以6μ的幅度超声处理悬液。以7000g离心悬液并收集上清液、无菌过滤并通过PierceBCA蛋白质测定来测定蛋白质含量。将等分试样保存于-20℃待用。
表11：完整灭活NTHi614分离群颗粒抗原刺激PBMNC的IFN-γ产生  NTHi  164抗原  受试者  1  2  3  4  5  6  7  IFN-γ(pg/mL)  1μg/mL  130  287  24  111  156  86  35  10μg/mL  368  128  101  169  356  565  334
表10和11显示完整的灭活NTHi164和提取自该分离群的颗粒抗原提取物都能刺激外周血单核细胞产生IFN-γ。IFN-γ产生依赖于IL-12。
本领域技术人员应该理解，如具体实施方案中所示，可以对本发明进行多种改变和/或修饰，而不背离广义叙述的本发明精神或范围。因此，在所有方面中，上述实施方案应认为是说明性，而非限制性。
参考文献
1.Dunldey等人，Immunol.(1994)83，362-369页
2.Remington.“The Science and Practice of Pharmacy.”(MackPublishing Co.，1995)