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本发明提供了一种包含病毒体膜的病毒体，所述病毒体膜包含一种包膜病毒的至少一种脂质和包膜蛋白，并且所述包膜病毒的核壳体颗粒位于所述病毒体的里面和外面并且附着于所述包膜蛋白。另外，本发明提供了一种包含本发明的病毒体的疫苗以及一种生产本发明的病毒体的方法。进一步地，本发明提供了本发明的病毒体在制备例如用于预防或缓解与HBV感染有关的疾病的疫苗中的应用，以及对对象进行免疫接种的方法。

权利要求书
1.  一种病毒体，其包含：
(a)包含流感病毒和乙型肝炎病毒(HBV)的至少一种脂质和包膜蛋白的病毒体膜；和
(b)包含位于所述病毒体的里面和外面并且附着于所述包膜蛋白的所述HBV的HBc蛋白的核壳体颗粒。

2.  权利要求1的病毒体，其中所述至少一种脂质包括至少一种磷脂。

3.  权利要求2的病毒体，其中所述磷脂包括磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺。

4.  权利要求1-3任一项的病毒体，其中所述流感病毒的包膜蛋白是血凝素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)。

5.  权利要求1-4任一项的病毒体，其中所述HBV的包膜蛋白是HBs蛋白。

6.  一种疫苗，其包含权利要求1-5任一项的病毒体及任选地一种药物学可接受的载体或稀释剂和/或佐剂。

7.  权利要求6的疫苗，其中所述佐剂是RC529(Corixa)。

8.  一种产生病毒体的方法，包括下列步骤：
(a)在存在脂质的情况下，在去污剂溶液中溶解包膜病毒流感病毒和HBV的包膜蛋白；
(b)降低去污剂在溶液中的浓度；
(c)将包含HBc蛋白的HBV的核壳体颗粒加入至步骤(b)中所获得的溶液中；以及
(d)除去去污剂从而产生病毒体。

9.  权利要求8的方法，其中所述脂质包括至少一种磷脂。

10.  权利要求9的方法，其中所述磷脂包括磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺。

11.  权利要求8-10任一项的方法，其中所述流感病毒的包膜蛋白是血凝素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)。

12.  权利要求8-11任一项的方法，其中所述HBV的包膜蛋白是HBs蛋白。

13.  权利要求8-12任一项的方法，进一步包括在步骤(b)之后进行的步骤(b’)：
(b’)对步骤(b)中获得的稀释液进行无菌过滤。

14.  权利要求8-13任一项的方法，进一步包括步骤(e)：
(e)对步骤(d)中获得的稀释液进行无菌过滤。

15.  权利要求8-14任一项的方法，其中所述去污剂是非离子去污剂。

16.  权利要求15的方法，其中所述非离子去污剂是八聚乙二醇单(N-正十二烷基)醚(OEG)。

17.  权利要求15或16的方法，其中所述非离子去污剂在步骤(b)中调整到浓度为20mM-100mM。

18.  权利要求8-17任一项的方法，其中脂质∶蛋白质比例在1∶1和10∶1之间。

19.  权利要求18的方法，其中所述脂质∶蛋白质比例是大约5∶1。

20.  权利要求10-19任一项的方法，其中磷脂酰胆碱部分在病毒体内是22％。

21.  权利要求11-20任一项的方法，其中HA∶病毒包膜蛋白∶病毒衣壳蛋白比例是1∶1∶1。

22.  权利要求8-20任一项的方法，进一步包括在步骤(d)中产生病毒体之前加入佐剂。

23.  权利要求1-5任一项的病毒体或通过权利要求8-22任一项的方法获得的病毒体在制备疫苗中的应用。

24.  权利要求1-5任一项的病毒体或通过权利要求8-22任一项的方法获得的病毒体在制备用于预防、缓解、或治疗HBV感染的疫苗中的应用。

25.  一种对对象进行免疫接种的方法，包括步骤：给予权利要求1-5任一项的病毒体或通过权利要求8-22任一项的方法获得的病毒体。

26.  一种对对象进行免疫接种以预防、缓解或治疗HBV感染的方法，包括步骤：给予权利要求1-5任一项的病毒体或通过权利要求8-22任一项的方法获得的病毒体，任选地与药物学可接受的载体或稀释剂和/或佐剂组合给予。

说明书包含来自流感病毒和乙型肝炎病毒的抗原的病毒体颗粒
本发明涉及一种包含病毒体膜的病毒体(virosome)，所述病毒体膜包含一种包膜病毒的至少一种脂质和包膜蛋白，并且所述包膜病毒的核壳体颗粒位于所述病毒体的里面和外面并且附着于所述包膜蛋白。另外，本发明涉及一种包含本发明的病毒体的疫苗以及一种生产本发明的病毒体的方法。进一步地，本发明提供了本发明的病毒体在制备例如用于预防或缓解与HBV感染有关的疾病的疫苗中的应用，以及对对象进行免疫接种的方法。
本说明书引用了一些文献。本文通过引用将所引用的每一篇文献公开的内容(包括任何生产商的说明书、指导等等)并入本文。
新的并且更加安全的疫苗的开发通常使用其特征已经被研究清楚的抗原，特别是高度纯化的重组蛋白质或合成的肽。尽管有一些成功，但是这种方法被这些抗原通常在单独给予时是较差的免疫原这一事实所阻碍。这个事实使得开发能够增强给定抗原的免疫原性的合适的佐剂及载体系统成为必要。一种可能的方法是将抗原整合进更高级的结构，例如病毒样颗粒中。全部疫苗成分在单一颗粒中的物理关联(physical association)保证了它们同时与单一的免疫细胞作用，并因此使协同作用的潜力最大化。这在免疫刺激或免疫调节成分(佐剂)被包含在配制物(formulation)中时是特别有用的。另外，颗粒结构本身可以具有免疫刺激作用，并且可以增加各个成分的稳定性和免疫原性。
因此寻找一种将相关抗原组合在工业适用的产生有效预防和/或治疗应用的配制物中的合适的方法是一个问题。
在病毒在宿主细胞中复制的过程中，利用细胞基础结构(infrastructure)产生该病毒基因组的拷贝，并且在组装为成熟病毒粒体(virion)之前表达并加工病毒蛋白。通常的基本事实是病毒复制和子代组装需要活的宿主细胞的环境以及导致大分子病毒粒体结构的分离和组装的一系列有序的病毒核酸、病毒和宿主细胞蛋白、以及脂膜之间的特异性相互作用。所需要的大量不同分子和另外涉及到的细胞结构表明任何病毒粒体组装的高度复杂性。在不同病毒类别之间，特别是在包膜病毒和无包膜病毒之间存在重要差异。所有包膜病毒的共同之处是由一层具有整合的病毒蛋白的脂膜组成的病毒外壳(outershell)，以及由此产生的膜关联病毒蛋白和可溶性病毒蛋白或基于蛋白的结构例如核壳体之间的为了组装成熟包膜病毒所必需的相互作用。无包膜病毒缺乏基于脂质的膜，其仅组装自蛋白质和核酸分子。
在文献中已经描述了多种体外和体内重建(reconstitute)病毒颗粒的方法，可以分为不同几类：
(a)病毒包膜的体外重建
衍生自病毒的或重组的包膜蛋白可以纯化并与或不与另外的脂质配制为脂蛋白体(proteoliposome)。这种完全体外方法产生包膜病毒的外壳，即包膜，但是并不包含病毒核心(core)，即核壳体(nucleocapsid)。有嵌合病毒体结构的实例，其整合来自不同病毒的包膜蛋白。尚未将重建的病毒包膜成功的用于基因转移(DNA或RNA)，但是这些方法不依赖于对功能性的基于蛋白的核壳体进行包装，而是将核酸直接与重建的包膜相关联。
(b)一或多个病毒蛋白的异源表达
分离的重组病毒蛋白可以自组装为病毒样结构(virus-like structure，VLP)：HPV(酵母，杆状病毒)，HCV(杆状病毒)，HBs抗原(酵母，CHO)，HBc(大肠杆菌(E.coli))。所有这些方法的共同之处在于所述自组装发生在异源细胞表达系统中，并且所述病毒样颗粒接下来被纯化。因此，所述组装在体外不能进行，而是要依赖于细胞系统。已经将VLP用作疫苗和疫苗载体。(Pumpens，P.；Grens，E.(2001)Intervirology 44(2-3)；98-114；Noad R，Roy P.(2003)TrendsMicrobiol.11(9)：438-44)
(c)无包膜(二十面体)病毒或病毒样颗粒的体外重建
这种方法基于被分别纯化的成分。由于缺少基于脂膜的包膜，无包膜病毒在结构上比较简单，并且如果所有必要成分以正确化学计量(stoechiometry)存在，其能够在一定的条件下进行体外自组装。相似的，包膜病毒的内核无脂质的核壳体或其亚单位已经在体外由纯化的重组成分重建，例如流感病毒(Martin-Benito J.et al.(2001)EMBO Rep.2(4)：313-7)。
(d)病毒核壳体的纯化
已经由许多不同的病毒类型提取并纯化了核壳体，以鉴定其组成。这些制备物也可用于转染易感细胞以拯救病毒。成功的病毒拯救提示分离了功能性的核壳体并将其送递至宿主细胞的细胞质。然而，这不意味着功能性包膜病毒的成功重建，因为依赖于功能性包膜的感染的自然途径通过使用介导核壳体直接送递至宿主细胞的细胞质的转染子而被绕开。
(e)细胞培养系统中的包膜病毒和病毒载体的假型包装(pseudotyping)
这种体内方法已经在实验室水平上广泛并且成功地用于产生嵌合病毒或载体(例如反转录病毒、慢病毒和AAV)。生产假型包装的病毒的关键因素是共表达整合进病毒粒体的所有蛋白并介导所述病毒粒体组装的辅助细胞。相反，包膜病毒的体外组装基于已阐明的、分别生产并纯化的成分，并且所述物理关联在体外在受控条件下进行(Sandrin V.et al.(2003)Curr Top Microbiol Immunol.；281：137-78)。
作为病毒样颗粒的特殊形式，病毒体是一种被临床证实的疫苗载体/佐剂系统，其在人体中具有优异的安全性和耐受性特征。病毒载体通过外源和内源途径都可以介导抗原加工的能力使得这个系统成为治疗性疫苗的很好的候选者。
病毒体的基本概念包括在体外重建空病毒包膜，或更一般地，重建整合进球形脂双层的病毒包膜蛋白。病毒体已经由多种病毒产生(YKaneda.(2000)Adv.Drug Delivery Rev.43，197-205；Drummond DC.etal.(2000)Prog Lipid Res.39(5)：409-60)。已经证实了产生包含来自两种不同病毒的包膜蛋白的嵌合病毒体的可能性(Bagai S，Sarkar DP.(1994)FEBS Lett.353(3)：332-6)。
在所有情况中，感兴趣的病毒蛋白是跨膜或锚定于膜的结构，这是自发整合的前提条件。
不与病毒体脂膜直接相互作用的分子的病毒体配制要困难得多。尽管早先已经提出了将分子连接至病毒体结构的想法(WO 95/32706，INEX)，但是实现稳定及有效的配制的技术障碍可能是非常多的，这依赖于感兴趣的分子的生物化学性质。核酸可以通过使用带正电的脂质而与病毒体结构相关联(WO 98/52603，Berna)。对于其功能缺乏二级和三级结构的小分子(肽、药物)可以被生物化学修饰以进行关联、整合或包囊作用。已经描述了用于病毒体配制、特别是小分子(Wlti etal，(2002)Canc.Res)或合成颗粒(Jana et al.(2002)FEBS Lett.；515(1-3：184-188)的包囊作用的一些方法。这些方法仅在影响大蛋白质或更多的影响多聚蛋白质复合物如病毒核壳体(例如HBc抗原颗粒)的真正构象的化学条件下进行。迄今为止描述的用于将缺乏暴露的亲脂结构域的一或多个蛋白质与病毒体膜相关联的方法需要对所述蛋白质进行生物化学修饰，例如共价连接至脂分子(Hunziker IP.et al.(2002)IntImmunol.14(6)：615-26)以将所述蛋白质锚定在脂膜中。这种方法也已经证明对于将病毒体通过交联抗体重靶定至特定细胞类型是有效的(Mastrobattista E.et al.(2001)FEBS Lett.509(1)：71-6.，Wlti et al，Canc.Res.2002)。然而，生物化学修饰需要很可能解离非共价连接的多聚结构(例如病毒核壳体)的条件(例如用于活化反应性侧链基团的氧化性条件)。另外，这些条件也可能改变研究中的蛋白质分子的构象，并由此导致影响其免疫原性，并最终影响疫苗的效力。进一步地，交联过程增加了配制所需的步骤数目并损失抗原。只有一个实例是多聚蛋白质结构成功地与病毒体关联而没有进行生物化学修饰，即甲型肝炎疫苗Epaxal(Glück R.，1995，J.of Liposome Research 1995，5(3)，467-479)。然而，由于病毒体膜与病毒粒体之间的静电作用，在这个疫苗中在配制流感病毒病毒体后抗原仅与外表面关联。因此，在病毒体液相内部没有抗原，而这里是治疗性疫苗所需的进行有效的细胞质送递并诱导基于CD8的细胞应答的优选的位置。(Bungener L.et al.(2002)J Liposome Res.12(1-2)：155-63；Bungener L.et al.(2002)Vaccine.20(17-18)：2287-95.)
本文下面以HBV为例讨论了预防和治疗感染性疾病的方法的潜力和限制。HBV感染是世界范围内的重大健康问题，特别是因为其威胁生命的晚期复杂化。世界卫生组织(WTO)估计目前有大约4亿人是慢性HBV携带者。患有慢性HBV感染的患者显示各种程度的症状，从临床不明显到严重慢性肝病，而对所有慢性HBV携带者来说肝病的长期威胁(慢性肝炎、硬化和肝癌)急剧增加(感染后20至30年内发生率为25％)。所有慢性患者的共同之处还在于对导致疾病的因素HBV，特别是HBV核心蛋白(HBc)的弱免疫应答，尽管在整个慢性感染期间有大量抗原循环。相反，急性乙型肝炎的解决方案和慢性乙型肝炎的自发的或治疗诱导的解决方案与针对HBV抗原的广泛而有力的免疫应答的发生是严格相关的。传统治疗方法如使用干扰素或抗病毒药物控制慢性肝炎的治疗方案仅仅获得部分成功，而其是非常昂贵的，并且具有显著的副作用。因此患有HBV相关慢性肝炎的患者将会从可以控制这种持久性病毒感染的治疗性疫苗中受益。
根据对HBV发病机理和免疫学的现有了解，成功的治疗性疫苗的关键是克服慢性携带者的HBV特异性免疫不应答。为此目的，相关抗原(HBc和HBs)必须以将存在的低效率Th2型(体液)免疫改变为有力的并且持续性的Th1型(细胞)应答的方式呈递至患者的免疫系统，并且同时增强Th2型应答。
针对相关抗原的免疫应答应当是广泛的并同时针对许多不同表位以预防该病毒的逃避免疫的突变体。已经示出这些突变体在针对单一表位的选择压力下进化。另外，使用全长蛋白质作为疫苗的抗原要考虑患者对于抗原加工和MHC基因型依赖性表位选择的遗传多样性。
在过去已经付出了巨大的努力以开发治疗性HBV疫苗，参见M.Hilleman(Vaccine 21(2003)：4626-4649)的综述。在一些临床实验中，已经在慢性HBV患者中使用了传统的基于HBs的预防性疫苗，但是仍未观察到持续的阳性效果。基于肽的疫苗希望将重点集中在对几个相关表位的免疫应答上(参见Engler et al.，Mol Immunol.2001Dec；38(6)：457-65的综述)。这种方法在临床前的研究中获得了有希望的结果，但是在人体中没有。最近，在将两种相关HBV抗原组合在一种疫苗中的尝试中，产生了在表面上携带HBs的单一表位的重组HBc颗粒(Chen et al，Vaccine.2004 Jan 2；22(3-4)：439-46)。
这些方法的主要方向是免疫系统的体液应答。更先进的方法来自于针对HBV的细胞应答(Th1型)是成功的治疗性免疫的关键因素这一概念。
诱导针对HBV抗原，特别是针对HBc的Th1型免疫应答是治疗性HBV疫苗的最终目标。尽管HBs独自即可在一定程度上诱导Th1应答，但是单独的HBc不可以。因此，独自使用这些抗原不能诱导治疗效果所需的足够的免疫应答。只能通过将HBV抗原与支持Th1的佐剂或载体系统组合起来才能够实现。相反，在目前人类疫苗中最广泛应用的佐剂铝盐已知彻底破坏Th1应答，而有利于Th2应答。铝盐的这一性质使得其对于主要目的在于诱导高滴度的保护性抗体的预防性疫苗是一种非常有吸引力的佐剂。在治疗性方案中，持续性的Th1应答具有关键作用，因为Th1效应细胞介导病毒复制的控制和病毒感染的细胞的清除。
已经尝试使用已知主要促进细胞应答的DNA疫苗(编码HBV核心或S基因的质粒DNA)。尽管DNA疫苗在小鼠模型中效果良好，但是大量临床尝试都未能提供证据表明其在人体中的规律，而这不仅是在HBV领域如此。类似地，主要目的在于增强细胞应答的对表达HBV抗原的病毒载体(例如痘苗病毒)的使用也未能在人体中诱导显著的和持续性的应答。
尽管对于治疗性HBV疫苗已经测试了各种方法，但是没有一种方法可以产生充分的治疗性疫苗。
两种主要的HBV结构蛋白质HBs和HBc可以在几种异源系统中独立表达，所述异源系统如：大肠杆菌、酵母、以及哺乳动物细胞系。两种抗原都形成典型的明显不同于感染性的、有包膜的、并且包含核壳体的HBV病毒粒体的病毒样颗粒结构(分别为HBs颗粒和HBc颗粒)。
可以在基于细菌或酵母的表达系统中产生重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)，因为这种蛋白是非糖基化的。HBV核心单体自组装为病毒样颗粒，其直径为大约30nm，并且可以从生产细胞中以此形式纯化。与真正的HBV核壳体非常相似，HBc颗粒由180或240个自组装进颗粒结构的单体核心分子组成。HBc颗粒不含有脂质。HBV核心单体由183至185氨基酸(aa)残基组成(长度依赖于分离株)。C末端的30aa形成一个核酸结合结构域，这导致在HBc颗粒的纯化的制备物中存在大量的核酸(主要是在不存在HBV基因组的情况下衍生自表达细胞的RNA)，这是不需要的杂质。可以在C末端截短HBc至144aa长，这减少了99％的核酸含量，但是保留颗粒结构。短于144aa的构建体不能形成颗粒。
在许多变体中已经描述了重组HBc颗粒的产生。已经将HBc的工程化变体用作异源抗原的载体系统(Pumpens，P.；Grens，E.(2001)Intervirology 44(2-3)；98-114)。在这个方法中，外源aa序列插入到在多聚体颗粒中暴露于外表面的蛋白质链的区域aa70-90中。然而，由于单体必须保持其自组装为颗粒的能力，所以通过遗传学手段插入的外源抗原序列的大小是非常有限的。当用作动物模型中的疫苗时，HBc颗粒单独即可诱导显著的体液应答，但是缺乏诱导被认为对于治疗作用是必需的的HBc特异性CD8型细胞应答的能力。
WO 00/32625(Biogen)描述了包含乙型肝炎病毒核心颗粒的免疫原，表位潜在地来自多价乙型肝炎病毒核心颗粒。
一种已经进入临床试验的方法是构建含有恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的多个表位的修饰的乙型肝炎病毒核心颗粒用于预防疟疾(Birkett A.，et al，Infection and Immunity 2002，p686-6870)。
真正的HBV包膜蛋白(HBs)以三种形式存在：L(大)、M(中等)、S(小)，它们从三个交错排列的翻译起始位点表达。所有三种HBs以多聚体形式存在于HBV病毒粒体的包膜中。C末端前S1(L)和前S2(M)结构域在感染过程中参与HBV与细胞的结合，并且针对前S1结构域的抗体能够中和HBV。当在酵母或哺乳动物细胞中作为重组蛋白质表达时，HBs以微团(micelle)颗粒结构的形式分泌，直径为35-45nm，其还包含大量(60％w/w)细胞膜脂(Satoh O.et al.(2000)JBiochem；127(4)：543-50)。根据表达构建，所述重组颗粒包含单独的S或包括C末端前S1和/或前S2结构域。
现有的针对HBV的所有预防性疫苗均基于与铝盐一起配制的重组HBV包膜(HBs)蛋白。多数产物基于酵母表达。称为第3代HBV疫苗的最近的产物衍生自哺乳动物细胞。这些疫苗包含前S结构域以及另外的真正哺乳动物糖基化模式和哺乳动物脂质组成，这二者都被认为有利于免疫应答。
WO 99/39736(Yissum)要求保护HBs颗粒作为疫苗载体的应用，但是该系统仅限于单体抗原，从而排除了具有HBc颗粒或其他核壳体型结构的共配制物。另外，所述系统没有预见到所述载体颗粒的体外解体和重组装过程。
一篇最近的公开文献(Ponsel and Bruss，(2003)JV 77416-422)描述了包含HBs和HBc的HBV颗粒从用两种抗原的表达质粒共转染的哺乳动物细胞中的形成和分泌。然而，没有关于包含HBs和HBc抗原的包膜颗粒的体外重建的报道。
US 6,020,167(Medeva)要求保护通过给予包含来自前S1或HBV核心的一或多个T细胞活化表位和能够呈递所述多肽的载体的组合物而治疗乙型肝炎的方法。根据该发明的载体可以是HBsAg颗粒。
作为病毒样颗粒的特殊形式，病毒体是一种被临床证实的疫苗载体/佐剂系统，其在人体中具有优异的安全性和耐受性特征。病毒载体通过外源和内源途径都可以介导抗原加工的能力使得这个系统成为治疗性疫苗的很好的候选者。
病毒体的基本概念包括在体外重建空病毒包膜，或更一般地，重建整合进球形脂双层的病毒包膜蛋白。病毒体已经由多种病毒产生(YKaneda.(2000)Adv.Drug Delivery Rev.43，197-205；Drummond DC.etal.(2000)Prog Lipid Res.39(5)：409-60)。已经证实了产生包含来自两种不同病毒的包膜蛋白的嵌合病毒体的可能性(Bagai S，Sarkar DP.(1994)FEBS Lett.353(3)：332-6)。
在所有情况中，感兴趣的病毒蛋白是跨膜或锚定于膜的结构，这是自发整合的前提条件。
不与病毒体脂膜直接相互作用的分子的病毒体配制要困难得多。尽管早先已经提出了将分子连接至病毒体结构的想法(WO 95/32706，INEX)，但是实现稳定及有效的配制的技术障碍可能是非常多的，这依赖于感兴趣的分子的生物化学性质。核酸可以通过使用带正电的脂质而与病毒体结构相关联(WO 98/52603，Berna)。对于其功能缺乏二级和三级结构的小分子(肽、药物)可以被生物化学修饰以进行关联、整合或包囊作用。已经描述了用于病毒体配制、特别是小分子(Wlti etal，(2002)Canc.Res)或合成颗粒(Jana et al.(2002)FEBS Lett.；515(1-3：184-188)的包囊作用的一些方法。这些方法仅在影响大蛋白质或更多的影响多聚蛋白质复合物如病毒核壳体(例如HBc抗原颗粒)的真正构象的化学条件下进行。迄今为止描述的用于将缺乏暴露的亲脂结构域的一或多个蛋白质与病毒体膜相关联的方法需要对所述蛋白质进行生物化学修饰，例如共价连接至脂分子(Hunziker IP.et al.(2002)IntImmunol.14(6)：615-26)以将所述蛋白质锚定在脂膜中。这种方法也已经证明对于将病毒体通过交联抗体重靶定至特定细胞类型是有效的(Mastrobattista E.et al.(2001)FEBS Lett.509(1)：71-6.，Wlti et al，Canc.Res.2002)。然而，生物化学修饰需要很可能解离非共价连接的多聚结构(例如病毒核壳体)的条件(例如用于活化反应性侧链基团的氧化性条件)。另外，这些条件也可能改变研究中的蛋白质分子的构象，并由此导致影响其免疫原性，并最终影响疫苗的效力。进一步地，交联过程增加了配制所需的步骤数目并损失抗原。只有一个实例是多聚蛋白质结构成功地与病毒体关联而没有进行生物化学修饰，即甲型肝炎疫苗Epaxal(Glück R.，1995，J.of Liposome Research 1995，5(3)，467-479)。然而，由于病毒体膜与病毒粒体之间的静电作用，在这个疫苗中在配制流感病毒病毒体后抗原仅与外表面关联。因此，在病毒体液相内部没有抗原，而这里是治疗性疫苗所需的进行有效的细胞质送递并诱导基于CD8的细胞应答的优选的位置。(Bungener L.et al.(2002)J Liposome Res.12(1-2)：155-63；Bungener L.et al.(2002)Vaccine.20(17-18)：2287-95.)
已经有一些关于流感病毒病毒体(WO 92/19267 WO 98/52603，Berna)和衍生自其他包膜病毒(例如仙台病毒)的病毒体样结构的专利提出申请/得到授权。这些方法包括病毒包膜的溶解、包含病毒基因组的核壳体的清除、以及之后“空”病毒包膜的重建。进一步地，其他抗原被附着于已经制备的病毒体(Epaxal)或交联至脂分子，以将其锚定在病毒体膜中。
基于上述针对病毒感染的免疫接种的限制，本发明针对的技术问题是提供用于对对象进行预防、缓解或治疗病毒感染的免疫接种的改良的方式和方法。
解决所述技术问题的技术方案通过提供权利要求中限定的实施方案而实现。
因此，本发明提供一种病毒体，其包含：
(a)包含一种包膜病毒的至少一种脂质和包膜蛋白的病毒体膜；和
(b)位于所述病毒体的里面和外面并且附着于所述包膜蛋白的所述包膜病毒的核壳体颗粒。
术语“病毒体”是指一种特殊形式的病毒样颗粒(VLP)。病毒体是衍生自病毒颗粒的半合成复合物，并且通过体外方法产生。它们是基本上重建的病毒外被(coat)，而病毒核壳体被选择的化合物置换。病毒体保留其融合活性，因此将掺入的化合物(抗原、药物、基因)送递至靶细胞内部。它们可用作疫苗、药物送递或基因转移。
VLP是在大小和形状上都类似于其亲代病毒，甚至与其亲代病毒彼此难以分辨的颗粒结构，但是其缺乏感染和在宿主细胞中复制的能力。VLP是由病毒蛋白(真正的或其修饰的变体)组成的多聚体结构。另外，VLP可以或不可以包含核酸、脂质，并包含或不包含脂膜结构。衍生自单一病毒(HBV)的VLP的两个典型的但是非常不同的实例是HBs和HBc颗粒。
术语“病毒体膜”在本发明的内容中是指一种在体外重建的由具有整合的病毒包膜蛋白的脂双层组成的球形膜结构。
术语“包膜蛋白”在本发明的内容中是指由包膜病毒编码的蛋白质，其天然形式与病毒脂膜直接作用。
根据本发明，多种脂质可以包含在所述病毒体膜中。这组脂质包括中性和带电荷的磷脂、衍生自类固醇的脂质、中性和带电荷的合成脂质。除了加入到配制物中的纯化的脂质外，病毒成分中包含的脂质也包括在最终配制物中，例如在配制物(例如HBs颗粒)中包含的衍生自流感病毒或其他任何包膜病毒的脂质或衍生自含有脂质的VLP的脂质。这些衍生自病毒的脂质是异源的，并且反映了所述病毒的生产细胞或重组表达细胞的脂质组成。优选的配制物仅基于磷脂，以使配制物的复杂度最小化。在所附的实施例中描述的用于HB病毒体的磷脂通常是GMP级的，并且优选地与用于已注册的疫苗Inflexal和Epaxal的材料相同。
术语“包膜病毒”在本发明的内容中是指在成熟病毒粒体结构中包含衍生自宿主细胞的脂膜的病毒。包膜病毒的种类列于表1。
术语“核壳体颗粒”在本发明的内容中是指由病毒衣壳蛋白组成的颗粒结构。这种颗粒结构可以是VLP(由一或多个重组病毒衣壳蛋白组成)，或者是由亲代病毒纯化的核壳体复合物。所述核壳体颗粒是否含有核酸与该颗粒的形成没有关系。
本发明的病毒体(嵌合病毒样颗粒)包含在一个单一颗粒中物理关联的上述鉴定的分子。本发明的病毒体中的包膜蛋白质可以以天然方向整合进病毒体的表面中，与相应核壳体颗粒的反应面朝向病毒体里面，也可以以人工方向整合进病毒体的表面中，与相应核壳体颗粒的反应面朝向病毒体外面。图1示出了这种病毒体的一个实例。这类新的病毒体的结构与上面描述的各个成分的微粒结构或与原始病毒不同。这类颗粒在自然界中不存在，并且在现有体外产生的结构中既没有被描述过也没有被提示过。因此，所述颗粒结构是第一种从分离的成分完全体外重组装的包膜病毒样颗粒。
本领域已知的和上面所描述的病毒体在基于细胞的系统中产生。在这种基于细胞的系统中，全部成分都必须在同一细胞中同时产生，这严重限制了表达系统的选择，并损害了产量和可测量性。不易控制的生物表达系统和代谢过程限定了所产生的病毒样颗粒的组成，例如限定了成分之间的比例。进一步地，在细胞系统中产生的病毒样颗粒之后必须被提取和纯化而不影响颗粒结构或组成，以获得有用的制备物。
与之相反并如下文所述，本发明的病毒体的体外配制物的组成可以通过加入的材料和所选择的生物化学参数控制。该方法的简单性保证了其是强有力的方法。得到的配制物不需要进一步纯化。各个成分可以预先在独立的基于细胞的系统(例如大肠杆菌、哺乳动物细胞、以及酵母)中产生，并且对于每一种成分，可以针对产量、可测量性和纯度选择最适系统。
本发明的病毒体的配制方法利用了很容易整合进病毒体型结构中的病毒蛋白质(膜关联蛋白、包膜蛋白)和自身不与膜关联的蛋白质之间的作用。尽管这种作用在大多数包膜病毒在宿主细胞内的天然复制过程中的组装都是必需和有效的，但是这一性质在药物产品的体外配制方法中的应用是新的。令人惊讶地，所述细胞内病毒组装过程确实可以在体外模拟，尽管是在完全不同的条件下。
优选地，所述病毒体是一种病毒体，其中所述至少一种脂质包括至少一种磷脂。更优选地，所述磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸。
在一个进一步优选的实施方案中，本发明还设想了这种病毒体，其中所述包膜蛋白是第一种和第二种包膜病毒的包膜蛋白，并且所述核壳体颗粒是所述第二种包膜病毒的核壳体颗粒。
所述第一种包膜病毒可以选自任何包膜病毒。本发明特别优选流感病毒。
在本发明一个更优选的实施方案中，所述第一种包膜病毒的包膜蛋白是血凝素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)。
本发明的病毒体的流感病毒成分血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)可以纯化自灭活的流感病毒(例如A/Singapore病毒株)，类似于已确立及授予专利权的流感病毒体的配制物(EpaxalWO 92/19267，WO92/19268，Glück R.，1995，Journal of Liposome Research 5(3)，467-479)。衍生自流感病毒的蛋白质/所述第一种包膜病毒的蛋白质可基于功能性而非结构性/机械性原因而被包括，因为本发明的病毒体还可在缺乏流感病毒蛋白质/所述第一种包膜病毒的蛋白质的情况下配制。可包括流感病毒成分以强化本发明的病毒体的病毒体样载体的免疫学性质。
同样根据本发明，所述第二种包膜病毒优选地选自由乙型肝炎病毒(HBV)(优选的病毒)、丙型肝炎病毒(HCV)或任何其他黄病毒、和人类免疫缺陷病毒(HIV)组成的一组包膜病毒。
在本发明进一步优选的实施方案中，所述核壳体颗粒包含HBc蛋白。
HBc颗粒可以在大肠杆菌中产生，包括全长氨基酸序列或截短的形式。全长和截短的144氨基酸构建体都成功地配制进HB病毒体中。或者，也包括将较短的(非特殊的)HBV核心掺入HB病毒体中。本领域已知相应的技术，并且描述于所附的实施例中。
也优选所述第二种包膜病毒的包膜蛋白是HBs蛋白。
HBs颗粒可以仅包含S或前S和S的组合。本领域已知产生所述颗粒的方法。所述颗粒可以例如在酵母或哺乳动物细胞中产生。在包含本发明的病毒体的疫苗中存在前S结构域可能有助于更广泛及更有效的免疫应答，但是对于配制过程没有影响。HB病毒体可以从任何来源的HBs产生。甚至来自不同来源或不同血清型的不同HBs类型的组合配制进单一HB病毒体也已经使用本文描述的方法得到证实。本发明将上述优选的实施方案归入流感病毒体一类。然而，掺入接下来用于将相同病毒的核壳体蛋白(HBc)连接至病毒体结构的完全无关的病毒(HBV)的包膜蛋白(HBsAg)是全新的。
本发明另一个实施方案涉及包含本发明的病毒体的疫苗。
术语“疫苗”在本发明的内容中是指预防性组合物，其在预防一种病毒疾病时被给予对象。可替代地或附加地，该术语也指药物组合物，其在缓解或治疗病毒疾病时被给予对象。
根据本发明，术语“预防性组合物”和“药物组合物”是指用于给予患者，优选人类患者的组合物。在一个优选的实施方案中，所述组合物包括用于非胃肠道给予、经皮给予、腔内给予(intraluminal)、动脉内给予、鞘内给予或通过直接注射进组织而给予的组合物。特别设想所述组合物通过灌注或注射被给予患者。给予适当的组合物可以通过不同途径实现，例如通过静脉内、腹膜内、皮下、肌内、局部或皮内给予。本发明的疫苗/组合物可以进一步包括药物学可接受的赋形剂。根据本发明使用的赋形剂包括载体、添加剂和稀释剂例如胶囊、载体(vehicle)、保存剂(conservant)、着色剂、崩解剂、粘合剂、乳化剂、增溶剂、润湿剂、溶剂、缓冲剂、胶凝剂、增稠剂、成膜剂、润滑剂、助流剂、分型剂(form-separating agen)、调流剂(flow-regulatingagent)、吸附剂和添加剂例如抗氧化剂、矫味剂(taste-correcting agent)及矫嗅剂(smell-correcting agent)。合适的药物学载体为本领域所熟知，包括磷酸缓冲盐水溶液、水、乳剂例如油/水乳剂、各种类型的润湿剂、无菌溶液等等。包含这些组合物的载体可以通过熟知的常规方法配制。这些组合物可以以适当的剂量给予患者。给药方案由主治医生和临床因素确定。如医药领域所熟知的，用于任何一名患者的剂量依赖于许多因素，包括患者的体重、体表面积、年龄、给予的特定化合物、性别、给予时间和途径、一般健康状况和其他共给予的药物。用于给予的一个优选剂量可能在每次1ng-1mg范围内变化。
本发明的疫苗/组合物可以局部或全身给予。优选地非胃肠道给予，例如通过推注送递至内部或外部靶位点。用于非胃肠道给予的制备物包括无菌水或非水溶液、悬浮液、以及乳剂。水相载体包括水、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。非胃肠道的载体包括氯化钠溶液、Ringer’s葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、或乳酸化的Ringer’s。静脉内载体包括体液和养料补充物、电解质补充物(例如基于Ringer’s葡萄糖的那些)等等。防腐剂和其他添加剂也可以存在，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等等。也设想本发明的疫苗/组合物可以除了本发明的病毒体之外基于所述组合物的用途进一步包含生物活性剂。这些物质可以是佐剂。佐剂是一种添加到疫苗配制物中以增强或调节针对所述疫苗中包含的抗原的免疫应答的物质。各种不同的佐剂为本领域所熟知，包括脂质、蛋白质、碳水化合物、去污剂、盐、或它们的组合。
如所附实施例中所描述的，已知病毒体配制物确实改善了针对抗原的细胞应答。这特别由在用HB病毒体免疫小鼠后检测到针对HBc的细胞应答这一事实证明。持续诱导针对病毒核心抗原例如HBc的细胞应答特别是CD8/Th1型应答是有益的，并且是用本发明的疫苗对对象进行免疫的特别优选的结果。
任选地，本发明的疫苗可以进一步包括药物学可接受的载体或稀释剂和/或佐剂。
药物学可接受的载体或稀释剂在下文描述。称为佐剂的免疫刺激物质可以加入到本发明的疫苗的配制物中以进一步增强或调节针对所述疫苗中包含的抗原的免疫应答。本领域已知大量具有佐剂性质的化合物。这些化合物包括蛋白质、脂质、碳水化合物、核酸及其组合。所述化合物可以是合成的或生物学产生的。佐剂可以加入至预先配制的病毒体中，或共配制并整合进病毒体结构中。后者是可能的，如果该佐剂的生物化学性质允许与任何一种病毒体成分相互作用的话。特别优选地，所述佐剂是RC529(Corixa)。
如本文前面所述，本发明优选的HB病毒体是稳定的同源病毒体共配制物，其中流感病毒和HBV抗原在单一颗粒中物理关联。抗原与病毒体载体的关联是已经清楚记载的对于全面探查病毒体抗原载体/佐剂系统的免疫刺激作用的前提要求(参见综述Moser C et al.(2003)Expert Rev Vaccines，2(2)：189-96)。
·抗原的HA介导的MHC-I呈递和针对抗原的Th1免疫应答
·以重复性的病毒样结构进行的抗原呈递
·抗原呈递细胞的靶向
·防止细胞外降解
对于治疗性HBV疫苗来说，病毒体(HA)介导的MHC-I呈递和树突状细胞的靶向是病毒体疫苗载体的最重要的相关特性。因此，优选地HBc抗原的至少一部分应当被包囊进病毒体中，以送递至抗原呈递细胞的细胞质中，实现抗原特异性CD8T细胞的诱导(Bungener Let al.(2002)J Liposome Res.12(1-2)155-63)。更新的研究已经证实了病毒体通过CD4T细胞的激活增强I类MHC限制的CTL(Schumacheret.al，Vaccine 22(2004)：714-723)。未修饰的HBs和HBc抗原分别的物理整合和掺入代表了在实验原型配制物水平，甚至在工业cGMP水平上的主要技术障碍。所述障碍通过本发明得以克服。配制物中使用的HBV和流感病毒抗原在不同的重组表达系统(哺乳动物细胞、酵母或大肠杆菌)中分别产生和纯化，并且这些纯化的抗原通过其自身形成有其特点的颗粒。
在另一实施方案中，本发明提供一种产生病毒体的方法，包括下列步骤：
(a)在存在脂质的情况下，在去污剂溶液中溶解包膜病毒的包膜蛋白；
(b)降低去污剂在溶液中的浓度；
(c)将所述包膜病毒的核壳体颗粒加入至步骤(b)中所获得的溶液中；以及
(d)除去去污剂或卵磷脂从而产生病毒体。
术语“降低浓度”在本发明的内容中包括加入不含有所述去污剂的溶液或加入与在步骤(a)中获得的溶液相比含有较低浓度的所述去污剂的溶液。
术语“除去去污剂”在本发明的内容中包括例如透析、渗滤、或层析等方法。当去污剂通过吸附至一种基质(例如珠、树脂)而除去时，优选后者，即层析。
本发明的病毒体的配制方法可调整为用于GMP生产的方法而没有进一步困扰。如针对HB病毒体的实例所描述的，对于生物化学和化学计量条件的修饰是必需的，以获得包含HBc蛋白的新的多成分颗粒结构的同源和有效的配制物(图2)并且可以基于本说明书的教导而无需不必要的负担即可实现。
本发明的方法的基本概念是通过利用病毒包膜蛋白与相应的核壳体或核壳体样颗粒之间的特异性相互作用而进行病毒体的完全体外组装，其在病毒复制过程中的细胞内病毒组装期间发生。在实施例中，HBs和HBc分别代表了典型的和优选的包膜蛋白和核壳体复合物，但是应理解本发明并非限于此，而是可以应用于任何包膜病毒。作为一般性的原则，在体外配制期间，所选择的生物化学条件应当允许包膜蛋白(env)与核壳体(nc)成分之间的相互作用。配制中的关键生化参数包括去污剂浓度、pH值、摩尔渗透压浓度(osmolarity)、以及存在的螯合剂、特异的盐、缓冲分子。
必须存在一种去污剂以溶解起始材料(病毒粒体或VLP的包膜)和脂质成分。去污剂类型和浓度的变化在下文描述。
pH和摩尔渗透压浓度优选地在技术上可能的情况下尽可能地保持与生理条件(pH 7.4，150mEq)接近，以降低与其他成分的较弱相互作用或非特异性相互作用的风险。对于其他包膜病毒，优选pH范围在5-10，摩尔渗透压浓度在10-400mEq。
盐、螯合剂和缓冲液也影响蛋白质之间的相互作用，并因此影响env/nc配制物的效力。在所附的实施例中描述的一种方案中，使用包含NaCl和生理缓冲系统磷酸盐的模拟生理条件盐组成的磷酸缓冲盐水溶液(PBS)。然而，对于配制其他包膜病毒，可能需要修饰的缓冲系统(例如基于Tris的缓冲液或基于碳酸盐的缓冲液)与NaCl、MgCl、KCl和CaCl盐组合使用。在本发明一个优选的实施方案中，可以设想包括螯合剂(例如EDTA、EGTA)以使不需要的酶活性失活。
最成功的配制物是病毒样颗粒的单一的、同源的群体，其大小、成分、或生物化学性质与各种起始材料(纯化的病毒或VLP)都不同。大小的差异可以通过光子相关光谱(photon correlation spectroscopy，PCS)分析很容易地检测，如在图4中示出的HB病毒体的分析。该分析方法描述于实施例4(第31页)。
对于本方法的原理来说，核壳体是否由单一重组蛋白亚基组成(这是HBc的情况)或是包含与核酸相关联的几种不同的病毒蛋白是没有关系的。病毒包膜蛋白成分例如HBs起到在重建的病毒体膜和核壳体颗粒(例如HBc)之间的接头的作用，而其自身不能与膜结构有效地作用或关联。尽管基本上不同，但是体外配制过程必须在一定程度上模拟HBV感染的细胞内部的条件，以使得HBs和HBc之间进行有效的相互作用。在本发明的体外方法中，在不存在任何大分子细胞结构的情况下，在除去去污剂的过程中发生组装。相反，在HBV复制过程中，HBs分子被锚定在细胞膜中与HBV核壳体反应。尽管存在令人惊讶的基本上不同的条件，病毒组装——将核壳体颗粒包装进病毒包膜中——在我们的配制过程中以高效发生。需要两个过程同时发生以将两种抗原与病毒体结构连接起来：
(i)跨膜蛋白、流感病毒包膜(HA和NA)和HBs(HBV包膜)需要整合进病毒体膜中，以及
(ii)HBc颗粒需要与锚定在膜中的HBs有效地关联。
因此，有效的HB病毒体组装仅可以在最优化的生物化学条件和各种成分的正确化学计量下发生。对于包含来自流感病毒和HBV之外的其他病毒的蛋白质的病毒体组装也是如此。复合物核壳体结构的完整性被认为是其与膜锚定的包膜蛋白进行相互作用的前提要求。
在本发明的实施例中，来自独立来源的三种独特的生物学颗粒结构被体外转变为一种新型合成病毒样颗粒，其明显有别于任何起始结构，并且其是天然不存在的。
优选地，本发明的方法的上述实施方案中的脂质至少包含一种磷脂。更优选地，所述磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸。
本发明的方法中还优选所述包膜蛋白是第一种和第二种包膜病毒的包膜蛋白，并且所述核壳体颗粒是所述第二种包膜病毒的核壳体颗粒。
在本发明的方法的进一步优选的实施方案中，所述第一种包膜病毒是流感病毒。更优选地，所述包膜蛋白是血凝素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)。
本发明的方法中进一步优选所述第二种包膜病毒是乙型肝炎病毒(HBV)。更优选地，所述核壳体颗粒包含HBc蛋白。同样优选地，所述包膜蛋白是HBs蛋白。
根据本发明的方法，优选地在步骤(a)中的溶解步骤之前对包膜蛋白的稀释液进行离心，并将所获得的沉淀在存在脂质的情况下在去污剂或卵磷脂溶液中溶解。
可以在本发明的方法中应用的脂质已经在前面更详细地限定。
进一步优选地，步骤(a)进一步包括在离心之前对稀释液进行超声处理。
更优选地，所述离心在100,000g和4℃至少进行2小时，和/或所述超声处理在37℃水浴中进行至少2分钟。
在本发明的方法的一个可替代的方案中，所述方法可进一步包括在步骤(b)之后进行的步骤(b’)：
(b’)对步骤(b)中获得的稀释液进行无菌过滤。
对溶液进行无菌过滤的方式和方法是本领域所熟知的。所述无菌过滤例如可包括将步骤(b)中获得的稀释液通过0.22μm滤器进行过滤，如所附实施例中所描述的。
本发明上述方法的步骤(d)中的除去去污剂可通过下述步骤实现：
(i)加入Bio-Beads SM-2并将稀释液在旋转的情况下进行温育；和
(ii)从稀释液中除去Bio-Beads SM-2。
优选地所述步骤(i)和(ii)使用新鲜Bio-Beads SM-2重复进行至少一次，优选地重复至少两次。
同样优选地，所述步骤(i)和(ii)在室温进行。
进一步地，同样也是优选地，步骤(i)中的温育至少持续30分钟。
还设想了本发明的方法可包括步骤(e)：
(e)对步骤(d)中获得的稀释液进行无菌过滤。
优选地，上面描述的去污剂是非离子去污剂。根据本发明的非离子去污剂的实例包括去污剂例如八聚乙二醇单(N-正十二烷基)醚(octaethylene glycol mono(N-dodecyl)ether，OEG)、Triton X-100、TritonX-114、NP 40、Tween 20/80和卵磷脂。去污剂可以优选地在浓度范围0.1-15％(v/v)使用。由于去污剂的性质，优选的浓度通常以(v/v)形式给出。然而，OEG以粉末形式获得，因此其浓度优选地以mM单位给出。例如浓度为100mM OEG相应于大约5.5％(v/v)OEG。
特别优选的是所述非离子去污剂是八聚乙二醇单(N-正十二烷基)醚(OEG)。
本发明的方法还优选OEG在步骤(b)中调整到浓度为20mM-100mM。最优选地所述浓度是50mM(相应于大约2.75％OEG(v/v))。
在本发明的方法的优选的实施方案中，调整的脂质∶蛋白质比例在1∶10和20∶1之间。更优选地，所述脂质∶蛋白质比例是大约5∶1。
本发明的方法优选磷脂酰胆碱部分在病毒体内是22％。
在本发明的方法中还优选HA∶病毒包膜蛋白∶病毒衣壳蛋白比例是1∶1∶1。
另外，优选地本发明的方法包括在步骤(d)中产生病毒体之前加入佐剂。
本发明的进一步可替代的实施方案涉及本发明的病毒体或通过本发明的方法生产的病毒体在制备疫苗中的应用。
本发明的进一步可替代的实施方案涉及本发明的病毒体或通过本发明的方法生产的病毒体在制备用于预防、缓解、或治疗HBV感染的疫苗中的应用。
本发明还涉及一种对对象进行免疫接种的方法，包括步骤：将本发明的病毒体或通过本发明的方法生产的病毒体给予需要其的患者。所述病毒体可以如前面所描述的一般用于药物组合物的方法给予。
本发明的另一个实施方案涉及用于对对象进行免疫接种以预防、缓解或治疗HBV感染的方法，包括步骤：将本发明的病毒体或通过本发明的方法生产的病毒体给予需要其的患者。任选地所述病毒体可以与药物学可接受的载体或稀释剂和/或佐剂组合给予。
特别优选地，上述对象是人。
                     表1：包膜病毒列表
(来源：http://www.virology.net/Big_Virology/BVHostList.html) 病毒科 人类病原体实例 沙粒病毒科(Arenaviridae) 布尼亚病毒科(Bunyaviridae) 冠状病毒科(Coronaviridae) 丝状病毒科(Filoviridae) 黄病毒科(Flaviviridae)  嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae) 疱疹病毒科(Herpesviridae) 正粘病毒科(Orthomyxoviridae) 副粘病毒科(Paramyxoviridae) 痘病毒科(Poxviridae) 逆转录病毒科(Retroviridae) 弹状病毒科(Rhabdoviridae) 披膜病毒科(Togaviridae) 淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV) 汉滩病毒 SARS病毒 埃博拉病毒 丙型肝炎病毒(HCV)，黄热病毒，登革病毒，森林 脑炎病毒，西尼罗河病毒 乙型肝炎病毒(HBV) 人类疱疹病毒1-5 流感病毒A，B，C 呼吸道合胞病毒(RSV)，人副流感病毒(hPIV) 天花病毒 人免疫缺陷病毒(HIV) 狂犬病病毒 风疹病毒
附图显示了：
图1：
图1示出了各个成分的结构和得到的HB病毒体的示意图。分析数据与这个设想的结构相符。
图2：
图2示出了配制过程的流程图。HB病毒体的详细配制方案在所附的实施例中提供。
图3：
图3示出了HB病毒体的SDS-PAGE分析结果。HB病毒体和起始材料(流感病毒、HBs和HBc)的蛋白质组成在图3中示于SDS-PAGE分析。
HB病毒体的预期的物理结构被接下来的分析结果所证实(图4-7)。
图4：
图4示出了HB病毒体与其各个成分的大小相比较的大小分析的结果。HB病毒体由一个与各个成分截然不同的单一类型的颗粒组成，在分子相关光谱中的颗粒大小分布中显示为一个单一窄峰。
图5：
图5示出了HB病毒体的梯度分级分离分析的结果。HB病毒体在蔗糖梯度上超速离心后所有抗原在同一梯度级分中发现，提示了它们的物理关联。
图6：
图6示出了HB病毒体的SDS-PAGE/Western印迹分析的结果。使用抗HA或抗HBs抗体进行的HB病毒体的免疫沉淀在两种情况下都产生了所有抗原(HBs、HBc和HA)的共沉淀。如果在免疫沉淀之前通过加入去污剂破坏HB病毒体结构，则只有被抗体直接识别的抗原被沉淀(分别是HA或HBs)。这个发现证实了所有抗原在一个单一结构中相关联。
图7：
图7示出了HB病毒体的SDS-PAGE/Western印迹分析的结果。当对HB病毒体进行胰蛋白酶消化时，HBV的两种抗原都被部分保护(50％，根据Western印迹)。如果在胰蛋白酶温育前通过加入去污剂而破坏病毒体结构，则HBV抗原在短时间内被完全降解。
图8：
图8示出了在免疫小鼠后对HB病毒体的抗体免疫应答的测试结果。对于HB病毒体的免疫原性目前只有初步数据。在小鼠中使用HB病毒体而没有另外的佐剂进行实验。小鼠通过肌内注射不同量的HB病毒体进行免疫，检测到针对所有三种抗原的高抗体滴度。
图9：
图9示出了在免疫小鼠后对HB病毒体的细胞免疫应答的测试结果。在第三次加强后，从被免疫的动物中纯化脾细胞，并且在用相应抗原体外再刺激后，通过针对γ干扰素进行的ELISPOT确定细胞应答。应当注意这种方法不能区分CD4和CD8型应答。
图10：
总结表显示了在用HB病毒体免疫后迄今为止获得的免疫数据。在被免疫的动物中检测到针对HBs和HBc的体液和细胞应答。
本发明现在通过参考下面的实施例进行描述，这些实施例仅仅是示例性的，而不应将其解释为对本发明的范围的限制。
实施例1：HBsAg在酵母中的表达和纯化
Schaefer S.et al.，in Hansenula polymorpha：Biology andApplications，WILEY-VCH Verlag，Weinheim，2002，Recombinanthepatitis B vaccines-disease characterization and vaccine production(p187-p193)
该方法包括下述步骤：构建表达盒和载体；转化酵母多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、选择并研究菌株特征、发酵、收获细胞、破坏细胞、澄清、吸附、离子交换色谱、超滤、超速离心、凝胶过滤色谱、最终液体的无菌过滤。
最终物质的质量(quality)由各种生物化学测试确定，如Lowry、SDS/PAGE、Western印迹分析、或AUSZYME。
实施例2：HBc在大肠杆菌中的表达
Zheng et al，Journal of Biological Chemistry 1992，13：9422-9429The structure of Hepadnaviral core antigens
Preikschat et al.，Journal of General Virology 1999，80：1777-1788Expression，assembly competence and antigenic properties of hepatitis Bvirus core gene deletion variants from infected liver cells.
该方法包括下述步骤：构建表达盒和载体；转化细菌大肠杆菌(Escherichia coli)、选择并研究菌株特征、发酵、收获细胞、破坏细胞、澄清、吸附、色谱、凝胶过滤、最终液体的无菌过滤。
最终物质的质量(quality)由各种生物化学测试确定，如Lowry、SDS/PAGE、Western印迹分析。
实施例3：流感病毒病毒体的重建
Glück R，1995，Journal of Liposome Research 1995，5(3)，467-479：Liposomal Hepatitis A Vaccine and Liposomal multiantigen combinationvaccines
流感病毒病毒体由磷脂和生长在鸡胚中或细胞培养物中的流感病毒产生。通过一或多个离心步骤收获、纯化并浓缩病毒，接下来通过用β-丙内酯(BPL)处理灭活。
灭活病毒通过超速离心沉淀，并在去污剂(含有100mM OEG的PBS)中重悬以溶解病毒的外壳，即病毒包膜，而病毒的内侧部分即核壳体保留蛋白质复合物和残余核酸。同样地，脂质(卵磷脂及其他)在相同的去污剂(含有100mM OEG的PBS)中溶解。接下来混合脂质和溶解的流感病毒，并且任选地，用超声脉冲处理以完成解离。接下来，进行第二次超速离心以沉淀并除去混和物中所有不能溶解的物质。这种不能溶解的物质主要包括病毒核壳体复合物。超速离心后的上清含有未来的病毒体的处于溶液中的全部成分：病毒包膜蛋白和脂质，以及分别加入的磷脂。在最后一步中，从上清中通过使用SM-2Bio-Beads的批处理色谱除去去污剂。顺序除去去污剂导致自发形成病毒体囊泡(vesicle)的同源群体，其平均直径为100至200nm，取决于精确组成和脂∶蛋白质比例。
实施例4：HB病毒体的配制和分析
为了实现HBs和HBc成分定量整合进HB病毒体，已确立的用于流感病毒病毒体的配制方法被较大程度修饰并针对一些变量进行优化。使用标准流感病毒病毒体的方案，已经证明HBV抗原的掺入率和该方法的重现性不能令人满意。
4.1图3-11示出了用于HB病毒体的详细的基本配制方案。
混和包含2mg HA和2mg纯化的重组HBs抗原(二者均处于磷酸缓冲盐水(PBS)中)的灭活的流感病毒(A/Singapore病毒株)，并在100000g，4℃离心2小时。将得到的沉淀在含有100mM PBS-OEG的1ml PBS中溶解。
将粉末形式的衍生自鸡卵的磷脂(16.5-mg磷脂酰胆碱和4.5mg磷脂酰乙醇胺)溶解在1ml 100mM PBS-OEG中。
接下来将磷脂和HA-HBs抗原溶液进行混和并在37℃水浴中超声处理2分钟以完全溶解。不能溶解的物质通过在100000g，4℃离心2小时而除去。收集得到的上清(2ml)并用PBS稀释至终体积3.5ml。
将HBc抗原在PBS中稀释至4mg/ml，并且将0.5ml该稀释液加入至含有处于PBS-OEG中的HA、HBs抗原和磷脂的溶液中，得到OEG终浓度为50mM。
配制物混和物通过0.22微米滤器(Millipore)进行过滤并且进入去污剂清除程序。所述混和物加入到1.2g(干重)Bio-Beads SM-2(BioRad)中并且在室温下转动温育30分钟。接下来，将悬浮液转移至0.8g新鲜Bio-Beads并在相同条件下温育30分钟，之后在相同条件下与0.8g新鲜Bio-Beads进行第三次温育。得到的HB病毒体接下来进行无菌过滤(0.22微米)并在4℃玻璃安瓿中贮存直至使用。
4.2HB病毒体的组成的可能的修饰
以相似的方式制备包含来自不同来源(CHO衍生的HBs、酵母衍生的HBs)、亚型(ayw和adw HBV核心颗粒)或变体(全长和截短的HBV核心)的HBV抗原的HB病毒体。上述重建的HB病毒体的制备得自为了鉴别颗粒大小和抗原掺入率的关键参数而进行的，并且在与最终无菌过滤相容的均一大小的颗粒中允许好的抗原掺入的一系列配制。具有不同磷脂组成(磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱比例不同)的配制物显示了颗粒大小和磷脂酰乙醇胺含量之间的反比关系。脂质与蛋白质比例(2.5，5，6，7.5)对于大小和抗原掺入的影响已经在一系列配制中进行研究。已经显示不同抗原的相对量影响掺入，在配制中增加HA的浓度(不含有HBc抗原)引起HBs抗原掺入的增加，对于1∶1比例达到80％。测试了下列参数并系统地使其优化：
脂质∶蛋白质比例
我们手中最佳脂质∶蛋白质比例是5∶1，但是如果使用磷脂，则对于最大抗原掺入，20∶1至1∶10之间的范围也是可能的。如果使用其他脂质(合成的脂质、类固醇型脂质)或不同脂质的组合，则脂质∶蛋白质比例可以变化更大。
磷脂组成(PC、PE、其他脂质)
可以产生仅具有PC的HB病毒体，在我们手中，对于大小和同一性而言22％PE是最适的。同样，如果使用其他脂质，这些比例可以有很大变化。
抗原之间的比例(HA∶HBs∶HBc)
在我们手中1∶1∶1的比例被证明是最适的。然而，当使用修饰的脂质组成和脂质∶蛋白质比例时，对于最大抗原掺入的最适量很可能变化。另外，不含有任何HA的配制也得到了希望的颗粒结构。
去污剂
选择的去污剂是浓度为50mM的OEG。然而，当修饰组成和比例时，20-100mM之间的范围也可应用。也可以使用其他具有非离子、离子、或两性离子性质的去污剂代替OEG用于配制过程。
其他非离子去污剂候选者：
去污剂                   浓度范围
Triton X-100             0.1-15％(v/v)
Triton X-114             0.1-15％(v/v)
NP 40                    0.1-15％(v/v)
Tween 20/80              0.1-15％(v/v)
4.3病毒体配制物分析
HB病毒体的彻底的物理-化学分析对于配制过程的最适化和将来的产品的质量控制是一个极其重要的因素。因此，对于开发研究HB病毒体的成分和结构的测试投入了巨大努力。由于佐剂效果(MCH-1呈递)直接依赖于HB病毒体的物理结构，因此特别关注了将疫苗的HBV成分与病毒体载体物理关联在一起的单一颗粒类型的阐明。
成分的定量：
蛋白质(SDS-PAGE)
HBs(ELISA，Western印迹)
HBc(ELISA，Western印迹)
HA(SRD)
磷脂(酶学分析)
病毒体结构：
光子相关光谱
免疫共沉淀
密度梯度超速离心
胰蛋白酶消化
电子显微镜术(计划中的)
确定总蛋白质浓度
通过在260、280和320nM波长的UV光吸收测定蛋白质浓度，根据下述公式计算1.55×(A280-A320)-0.76×(A260-A320)。结果用每毫升毫克数表示。
HBs和HBc抗原定量
通过定量Elisa分析确定掺入HB病毒体的HBs和HBc抗原的量。为了最大程度地接触抗原，将抗原标准和HB病毒体样品在第一次稀释期间溶解于PBS-OEG中，而后续稀释在PBS中进行。使用可商购的HBs Elisa检测试剂盒(DADE Behring)进行HBs分析，在同一分析中测试的纯化的HBs抗原的系列稀释使得可以定量确定HB病毒体样品中的抗原。对于定量HBc ELISA，用针对HBc的单克隆抗体(mAb)(克隆7E6，Biogenesis，稀释度1∶1000)在Na2CO3，50mM，pH 9.6覆盖微量滴定平板。接下来用PBS中的BSA 1％、sucrose 5％、0.05％NaN3在室温下封闭所述平板至少1小时，并用含有0.05％(v/v)Tween20的PBS(漂洗缓冲液)漂洗。对样品(0.1ml)进行上样并在室温温育1小时。针对HBc的第二种生物素酰化的mAB(克隆4H5，Biogenesis)在含有0.05％Tween 20和BSA 0.1％的PBS(稀释缓冲液)中以1∶1000稀释，在室温加入(0.1ml/孔)并温育1小时。在漂洗4次后，将平板在存在链霉抗生物素蛋白(1∶5000，稀释缓冲液中)的情况下在室温温育1小时。在另外漂洗四次后，温育TMB(0.075ml/孔)30分钟并用1M H2SO4(75μl/孔)终止显色反应，在450nm测定光强度。
HA定量
使用标准径向扩散(radial diffusion，SRD)分析确定HB病毒体的HA含量。这个测试是分析病毒体疫苗的有效分析，由Berna BiotechLtd.QC部门依照Epaxal相关SOP进行。
凝胶电泳，Western印迹，银染
为了阐明HB病毒体中存在HA、HBs或HBc抗原，将来自配制物、梯度级分、蛋白酶消化、或免疫共沉淀的样品在NuPage Bis-TrisSDS-Page预制凝胶(Invitrogen)上用MES缓冲液分离，然后根据生产商的说明转移至硝酸纤维素膜上。膜用PBST(PBS中的1％Tween20)中的5％牛乳封闭，并与1∶1000稀释的抗原特异性抗体在室温温育1小时。漂洗膜后与1∶10,000稀释的过氧化物酶缀合的抗兔或抗绵羊免疫球蛋白温育1小时。蛋白质用ECL Plus底物试剂(AmershamPharmacia，Piscataway，N.J.)显色。
凝胶的银染根据供货商(Invitrogen)的说明进行。
确定颗粒大小：光子相关光谱
通过光子相关光谱或动态光散射(dynamic light scattering)确定起始物质和配制的HB病毒体的水力直径(hydrodynamic diameter)、多分散性指数(polydispersity index)、和统计学颗粒大小分布。这种方法基于布朗运动的大小依赖性速度，其作为相对于时间的光散射变量测定。Malvern Zetasizer 1000HS(Malvern Ltd，Malvern，UK)被用于此目的，包括用于从原始数据光强度变化计算参数的软件。样品在PBS中充分稀释，并在25℃标准条件下分析1ml稀释液。
蔗糖梯度
应用通过非连续蔗糖梯度进行的超速离心作为基于各个成分的不同密度评估HB病毒体结构中的抗原掺入的分析方法。PBS中的HB病毒体配制物的小份被置于PBS中的20-60％(w/v)非连续蔗糖梯度的顶部并在100,000g 4℃离心24小时。接下来分析收集到的级分的密度、蛋白质的量和通过western印迹分析不同抗原的存在。
胰蛋白酶消化
通过有限胰蛋白酶消化研究HB病毒体颗粒中抗原掺入和最终的包囊作用。接下来通过western印迹分析被加工的样品的蛋白酶解抗性片段或被保护的蛋白全长。HB病毒体在PBS缓冲液(完整颗粒＝天然条件)中稀释，或在PBS中的0.5％Na-去氧胆酸和1％Triton X100(被破坏的病毒体结构＝变性条件)中稀释。用胰蛋白酶5％(w/w蛋白质)在室温进行0、2、5和10小时蛋白酶消化。作为各个成分有效接触胰蛋白酶消化的对照，将不同抗原的混和物在相同浓度相同条件下也进行消化。通过加入4x SDS-PAGE样品缓冲液终止反应。在95℃变性10分钟后，对消化产物进行SDS-PAGE电泳并对HBs和HBc进行免疫印迹分析。
免疫共沉淀
HA、HBs和HBc抗原在HB病毒体结构中的物理关联通过每一种抗原在天然和变性条件下(如对胰蛋白酶消化所描述的)的分离的(独自的)免疫沉淀、以及接下来通过western印迹分析进行的免疫共沉淀的抗原的鉴别而阐明。在存在针对HA、HBc或HBs的特异性抗体的情况下，在平行分析中进行HB病毒体配制物的免疫沉淀。免疫复合物接下来与G蛋白-琼脂糖凝胶包被的珠(Promega)温育4小时并离心。得到的沉淀用PBS漂洗五次。通过在样品缓冲液中煮沸10分钟重悬免疫沉淀的蛋白质，并用SDS-PAGE和Western印迹分析。通过与相应的特异性抗体一起温育研究每一种抗原的存在。
病毒体配制：在小鼠模型中的免疫原性
对于HB病毒体的免疫原性目前只有初步数据。在小鼠中使用有或没有一种额外佐剂RC529(Corixa)的HB病毒体进行实验。小鼠通过肌内注射不同量的HB病毒体进行免疫，检测到针对所有三种抗原的高抗体滴度(图8)。在第三次加强后，从被免疫的动物中纯化脾细胞，并且在用相应抗原体外再刺激后，通过针对γ干扰素进行的ELISPOT确定细胞应答(图9)。应当注意这种方法不能区分CD4和CD8型应答。另外，通过FACS分析来自被免疫的动物的脾细胞(图10)。新鲜的脾细胞直接用与抗CD8抗体组合的HBc特异性五聚体染色。或者用CD8特异性肽或全蛋白刺激脾细胞，并接下来对与抗CD4或抗CD8抗体组合的细胞内γ干扰素染色。
实施例5：配制原则对其他病毒系统的应用
不同病毒蛋白质之间的相互作用对于病毒粒体组装是至关重要的，并且已发现这对于所有病毒来说是一个一般规律。包膜病毒粒体的组装依赖于细胞膜结构。核壳体(一种核酸和蛋白质的复合物)与膜结合的病毒蛋白相关联以形成成熟病毒结构。我们已经示出了对于乙型肝炎病毒这一过程可以在体外模拟，并且在缺乏细胞膜结构并使用来自不同重组来源的病毒蛋白的情况下进行。尽管对于数量和纯度来说病毒抗原的重组来源是优选的，但是病毒蛋白质也可以衍生自起始病毒，如本文中涉及的流感病毒HA所应用的。体外配制物的可变性使得可以包括来自不同来源的多个抗原。基于这一原则，包含来自几种病毒的蛋白质的多价配制物(如示出的关于HBV和流感病毒的情况)可以改良物理稳定性、免疫学性质、或者疫苗保护谱。
如果条件适合相应病原体并且必需的成分可以得到并且有充分的量，那么同样的原则应用于任何其他包膜病毒也是可能的。下面列出了一些候选者，对于它们可以应用体外配制原则，并且它们还代表了引人注目的和急迫的疫苗靶。然而，这些理论上的病毒样颗粒诱导的免疫应答是否将会具有预防性甚至治疗性效果还无法预测。
5.1丙型肝炎病毒
HCV作为丙型肝炎的病原物代表了一个全球健康问题。据估计全世界％的人口被这种病毒感染。目前没有针对HCV的疫苗，无论是用于预防还是用于治疗。已经阐明了病毒样颗粒在细胞系统中的组装(Baumert et al，Journal of Virology 1998，75：3827-3838；Hepatitis C virus structural proteins assemble into viruslike particlesin insect cells)。至于在HBV中，核心蛋白单体与与膜锚定的包膜蛋白(E1，E2)相互作用的二十面体核壳体相关联。
5.2其他黄病毒
除了HCV外，黄病毒科中还包括一些相关人类病原体：(西尼罗河病毒、库宁病毒(Kunjin virus)、流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)、登革病毒、黄热病毒、和森林脑炎病毒)。与HCV(和HBV)在结构水平上的相似性是很高的，因此体外重组装病毒样颗粒看上去是可能的。
5.3HIV
HIV是逆转录病毒科最重要的成员。同样，尽管有非常急切的医疗需要，但是还没有有效的疫苗。尽管这些病毒形成更复杂的核壳体，但是基于与HB病毒体相同的原则，体外配制多抗原疫苗看上去是可行的。