治疗血液癌症的方法和组合物.pdf

本发明涉及溶瘤微小RNA病毒、和治疗患有血液癌症的受试者的方法和组合物。其包括使用公开的微小RNA病毒，如柯萨奇病毒，治疗骨髓瘤的方法和组合物，以直接或间接给药的方法给予受试者，并在移植前在自体移植物中先体外后体内净化恶性细胞。

权利要求书
1.  一种治疗和/或预防受试者血液癌症的方法，所述方法包括：给予治疗有效量的微小RNA病毒或其改良形式，使得至少一些癌细胞发生病毒溶瘤。

2.  根据权利要求1所述的方法，其中所述的微小RNA病毒选自肠病毒的原型和临床分离株，所述肠病毒包括柯萨奇病毒、艾柯病毒、脊髓灰质炎病毒、未分类的肠道病毒、鼻病毒属、副肠孤病毒属、肝病毒属和心病毒属。

3.  根据权利要求1所述的方法，其中所述的微小RNA病毒是A组柯萨奇病毒，其选自CVA13、CVA15、CVA18、CVA20、CVA21、其改良形式及其组合。

4.  根据权利要求1所述的方法，其中所述的微小RNA病毒通过静脉内、瘤内、腹膜内、肌肉内给药，在自体干细胞移植之前先体外后体内净化自体移植物中的恶性细胞，或在移植之前先体外后体内净化自体移植物中的恶性细胞。

5.  根据权利要求4所述的方法，其中所述的自体移植物包括造血干细胞。

6.  根据权利要求1所述的方法，其中病毒用药剂量的范围是每个细胞大约0.01至大约1000个病毒感染单位。

7.  根据权利要求1所述的方法，其中所述的病毒与有效量的化疗药物联合给予受试者。

8.  根据权利要求1所述的方法，其中所述的病毒与有效量的益生菌剂联合给予受试者。

9.  根据权利要求1所述的方法，其中所述的血液癌症选自多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B幼淋巴细胞白血病和单核细胞白血病。

10.  根据权利要求1所述的方法，其中血液癌症细胞对病毒-细胞入胞受体分子细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和/或衰变加速因子(DAF)过度表达。

11.  根据权利要求1所述的方法，其中血液癌症细胞构成性地表达NF-κB。

12.  一种治疗和/或预防受试者血液癌症的方法，所述血液癌症选自多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B幼淋巴细胞白血病和单核细胞白血病，所述方法包括给予治疗有效量的选自CVA13、CVA15、CVA18和CVA21或其组合的微小RNA病毒，使得至少一些癌症细胞发生病毒溶瘤。

13.  一种治疗和/或预防受试者血液癌症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的来源于微小RNA病毒或其改良形式的核酸分子，使得至少一些癌症细胞被病毒杀死。

14.  根据权利要求13所述的方法，其中所述的微小RNA病毒是选自CVA13、CVA15、CVA18、CVA20、CVA21的A组柯萨奇病毒。

15.  根据权利要求1或13所述的方法，其中所述的受试者是人。

16.  一种用于治疗和/或预防受试者血液癌症的药学组合物，所述组合物包括有效量的能够溶解性地感染血液癌症的微小RNA病毒或其改良形式，以及药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

17.  一种用于治疗和/或预防受试者血液癌症的药学组合物，所述组合物包括有效量的能够溶解性地感染血液癌症的来源于微小RNA病毒或其改良形式的核酸分子，以及药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

18.  能够溶解性地感染血液癌症的微小RNA病毒或其改良形式在制备治疗和/或预防受试者血液癌症的药物中的应用。

19.  根据权利要求18所述的应用，其中所述的微小RNA病毒是选自CVA13、CVA15、CVA18、CVA20、CVA21的A组柯萨奇病毒。

20.  根据权利要求18所述的应用，其中所述的血液癌症是选自多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B幼淋巴细胞白血病和单核细胞白血病的癌症。

21.  能够溶解性地感染血液癌症的来源于微小RNA病毒或其改良形式的核酸分子在制备治疗和/预防受试者血液癌症的药物中的应用。

22.  一种诱发受试者对血液肿瘤或癌细胞发生免疫反应的方法，所述方法包括用治疗有效量的微小RNA病毒或其改良形式感染受试者的所述细胞，使得至少一些癌症细胞发生病毒溶瘤。

说明书治疗血液癌症的方法和组合物
技术领域
本发明涉及溶瘤微小RNA病毒和治疗患有血液癌症的受试者的方法和组合物。
背景技术
血液癌症是“血液系统”的癌症。这些癌症通常影响白细胞(疾病和感染对抗细胞)而不是红细胞(携氧细胞)。这些癌症中的一些发生在制造所有血细胞的骨髓中。一些发生在白细胞流过的淋巴结和其他淋巴组织中。白细胞的常见癌症是白血病、何杰金淋巴瘤、其他淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
多发性骨髓瘤(MM)是一种B细胞恶性肿瘤，在所有类型的人类癌症中的发生率约为1％，比髓细胞白血病或何杰金氏病更常见。
多发性骨髓瘤可引起贫血、严重的骨骼疼痛，一些情况下引起病理性骨折、感染的机率增加、高钙血症和肾衰。尽管化疗是有症状的MM的优选初步治疗方法，但该病对化疗药物是高度耐药的，对这种治疗开始有反应的大多数患者最终会复发。
控制癌症进展的一种新方法是通过使用溶瘤病毒。溶瘤病毒是能够选择性地破坏或“溶解”恶性细胞，同时保持正常宿主细胞完整的病毒。许多人实体肿瘤对大量病毒的溶瘤活性易感，每种病毒都具有独特的生物学特性以介导选择性溶瘤作用。呼肠孤病毒(Alain T等人，Blood.2002；100：4146-4153；Thirukkumaran CM等人，Blood.2003；102：377-387)、麻疹病毒(Grote D等人，Blood.2001；97：3746-3754)、和新城疫病毒(Schirrmacher V等人，Int J Oncol.2001；18：945-952)是其中三种已知的可有效对抗一些恶性肿瘤的溶瘤病毒。
最近证明一种普通感冒病毒，柯萨奇病毒A21(CVA21)能有效对抗免疫缺陷小鼠模型中的人黑素瘤异种移植物(Shafren DR等人，Clin Cancer Res.2004；10：53-60)。CVA21是一种已知能选择性地利用细胞表面分子细胞间粘附分子1(ICAM-1)和衰变加速因子(DAF)介导感染细胞的肠道病毒。尽管CVA21可与DAF结合，但ICAM-1是CVA21细胞感染的关键受体——细胞表面上没有ICAM-1表达时，正常条件下CVA21不能获得细胞入口并感染宿主细胞。
本申请人以前开发了使用识别ICAM-1的溶瘤病毒治疗实体恶性肿瘤的新方法(PCT/AU00/01461(WO 01/37866)，题目为：“治疗受试者恶性肿瘤的方法及其使用的药学组合物(A Method of Treating aMalignancy in a Subject and a Pharmaceutical Composition For Use inSame)”)。通过在大量实体肿瘤细胞类型上使用各种A品系柯萨奇病毒株获得了很好的治疗结果。本申请人也开发了使用识别用于细胞感染的整联蛋白α2β1的病毒，如艾柯病毒，治疗哺乳动物异常细胞(如癌细胞)的新方法(PCT/AU2003/001688(WO2004/054613)，题目为“通过微小RNA病毒直接介导的溶瘤作用治疗受试者恶性肿瘤的方法(A method of treating a malignancy in a subject via directPicornaviral-mediated oncolysis)”)。为了扩大可能的癌症治疗方法，甚至提供更有效的治疗方法，本发明者惊喜地发现微小RNA病毒分离物也可适合用作血液癌症的溶瘤剂。
发明内容
在第一个方面，本发明提供了治疗和/或预防受试者血液癌症的方法，该方法包括施予治疗有效量的微小RNA病毒或其改良形式，使得至少一些癌细胞发生病毒溶瘤。
在第二个方面，本发明提供了治疗和/或预防受试者血液癌症的方法，所述癌症选自多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、B幼淋巴细胞白血病和单核细胞白血病，该方法包括施予治疗有效量的微小RNA病毒或其改良形式，使得至少一些癌症细胞发生病毒溶瘤。
在本发明的优选实施方式中，受试者是人。
微小RNA病毒可以是任何微小RNA病毒，包括已知的和分类的微小RNA病毒、以及有待分类的微小RNA病毒。优选地，微小RNA病毒选自原型和临床分离株。在一个优选的方法中，微小RNA病毒是肠道病毒，包括柯萨奇病毒、艾柯病毒、脊髓灰质炎病毒和未分类的肠道病毒，或其他微小RNA病毒属，包括鼻病毒属、副肠孤病毒属(Paraechovirus)、肝病毒属、心病毒属、口蹄病毒属、马鼻病毒属(Erbovirus)、嵴病毒属(Kobovirus)、和捷申病毒属(Teschovirus)。
在一个优选的实施方式中，微小RNA病毒是柯萨奇病毒。优选地，A组柯萨奇病毒选自CVA13、CVA15、CVA18、CVA20、CVA21、其改良形式及其组合。更优选地，A组柯萨奇病毒选自CVA13、CVA15、CVA18、CVA20或CVA21。
在一个优选的实施方式中，A组柯萨奇病毒是CVA15或CVA21。优选地，A组柯萨奇病毒是CVA15。更优选地，CVA15是G-9。
在另一个优选的实施方式中，A组柯萨奇病毒是CVA21。更优选地，CVA21是Kuykendall株。
在此所使用的术语“血液癌症”包括非实体肿瘤，如白血病、多发性骨髓瘤、何杰金氏病、非何杰金氏病、脊髓发育不良、和淋巴瘤，如B细胞淋巴瘤。白血病的实例包括但不限于慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性和淋巴细胞白血病(CLL)、B幼淋巴细胞白血病和单核细胞白血病。在优选的实施方式中，血液癌症是多发性骨髓瘤。
在优选的实施方式中，血液癌症是，或包括对一种或多种化疗药物耐药的细胞。
在优选的实施方式中，微小RNA病毒以任何合适的方式施予人类受试者。例如，病毒可经静脉内、瘤内、腹膜内、肌肉内、眼内、皮下、口服、局部给药，或在自体干细胞移植之前，先体外后体内净化自体移植物内的恶性细胞。在一种实施方式中，该方法包括预防性治疗，例如用于MGUS。在一种实施方式中，该方法包括用于血液癌症，例如多发性骨髓瘤的全身抗肿瘤药物。在一种实施方式中，该方法包括在移植之前，先体外后体内净化自体移植物内的恶性细胞。优选地，自体移植物包括造血干细胞。
在优选的实施方式中，病毒用量的范围可在每个细胞大约0.01至大约1000感染病毒单位。
在一个优选的实施方式中，病毒可与有效量的化疗药物联合给予受试者。
在另一个优选的实施方式中，病毒可与有效量的益生菌剂联合给予受试者。
血液癌症的细胞可过度表达病毒-细胞入胞受体分子细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和/或衰变加速因子(DAF)。
血液癌症细胞可构成性地表达NF-κB。
在第三个方面，本发明提供了治疗和/或预防受试者血液癌症的方法，该方法包括施予治疗有效量的来源于微小RNA病毒或其改良形式的核酸分子，使得至少一些癌症细胞被病毒杀死。
核酸分子可以是来自病毒的单链RNA或互补DNA。
在优选的实施方式中，微小RNA病毒是柯萨奇病毒。优选地，柯萨奇病毒是A型，更优选是柯萨奇病毒A21(CVA21)。优选地，CVA21是Kuykendall株。
在第四个方面，本发明提供了用于治疗和/或预防受试者血液癌症的药学组合物，该组合物包括有效量的能够溶解性地感染血液癌症的微小RNA病毒或其改良形式，以及药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体是本领域技术人员所公知的，包括但不限于能够被用作治疗药物给药载体的任何无活性物质。在优选的实施方式中，药学可接受的载体可以是脂质体。
在第五个方面，本发明提供了用于治疗和/或预防受试者血液癌症的药学组合物，该组合物包括有效量的能够溶解性地感染血液癌症的来源于微小RNA病毒或其改良形式的核酸分子，以及药学可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
在优选的实施方式中，药学组合物进一步包括脂质体(该脂质体也可包含与特异肿瘤标志物结合的单克隆抗体)，允许靶向核酸-脂质体复合体。
在第六个方面，本发明提供了治疗和/或预防受试者血液癌症的方法，该方法包括施予治疗有效量的根据本发明第三或第四个方面的药学组合物，使得至少一些癌细胞发生病毒溶瘤。
在第七个方面，本发明提供了能溶解性地感染血液癌症的微小RNA病毒或其改良形式，以及药学可接受的赋形剂或稀释剂，在治疗和/或预防受试者血液癌症的方法中的应用。
在第八个方面，本发明提供了来源于能溶解性地感染血液癌症的微小RNA病毒或其改良形式的核酸分子，以及药学可接受的赋形剂或稀释剂，在治疗和/或预防受试者血液癌症的方法中的应用。
在第九个方面，本发明提供了能溶解性地感染血液癌症的微小RNA病毒或其改良形式，在制备治疗和/或预防受试者血液癌症的药物中的应用。
在第十个方面，本发明提供了来源于能溶解性地感染血液癌症的微小RNA病毒或其改良形式的核酸分子，在制备治疗和/或预防受试者血液癌症的药物中的应用。
在第十一个方面，本发明提供了诱发哺乳动物对血液肿瘤或癌细胞发生免疫反应的方法，该方法包括用治疗有效量的微小RNA病毒或其改良形式感染哺乳动物的所述细胞，使得至少一些癌症细胞发生病毒溶瘤。
在本说明书中，除非上下文另外需要，词语“包括(comprise)”或其变化形式如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”要被理解为暗示包含所述的要素、整体或步骤，或要素、整体或步骤的组，但不排除任何其他要素、整体或步骤，或要素、整体或步骤的组。
在本说明书中包括的对文件、法规、物质、装置、文章或类似物的任何讨论仅是为了提供本发明的上下文。不能认为是承认任何或所有这些内容，形成现有技术基础的一部分，或是在本申请的优先权日之前在澳大利亚或其他地方与本发明相关的领域中的公知常识。
为了更清晰地理解本发明，参考下面的附图和实施例描述优选的实施方式。
缩写
在此缩写“MM”用于表示多发性骨髓瘤。
在此缩写“CVA”用于表示A组柯萨奇病毒，例如CVA21是柯萨奇病毒A21的缩写。本领域中的文献使用不同的缩写“CAV”和“CVA”来表示A组柯萨奇病毒，为了本申请的目的能够理解，这些缩写是指同一生物体，因此是可以互换的。
在此缩写“MOI”用于表示感染多样性。
在此缩写“MGUS”用于表示意义不明的单克隆丙种球蛋白病。
在此缩写“BM”用于表示骨髓。
在此缩写“CFU-GM”用于表示粒细胞/巨噬细胞集落形成单位。
在此缩写“MTT测定”用于表示微量培养四氮唑盐测定，该测定使用化合物3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑。
在此缩写“PI”用于表示碘化丙啶。
在此缩写“PBMC”用于表示外周血单核细胞。
在此缩写“BMSC”用于表示骨髓基质细胞。
在此缩写“mAb”用于表示单克隆抗体。
在此缩写“TCID50”用于表示组织培养50％感染剂量。
在此缩写“PFU”用于表示噬菌斑形成单位。
在此缩写“CPE”用于表示细胞病变效应。
在此缩写“ICAM-1”用于表示细胞间粘附分子1。
在此缩写“DAF”用于表示衰变加速因子。
在此缩写“kb”用于表示千碱基对。
在此缩写“DNA”用于表示脱氧核糖核酸。
在此缩写“RNA”用于表示核糖核酸。
在此缩写“ELISA”用于表示酶联免疫吸附测定。
附图说明
图1.多发性骨髓瘤细胞系上ICAM-1和DAF的流式细胞分析。
多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226、U266和NCI-H929细胞和正常的PBMC用抗-ICAM-1和抗-DAF mAb进行双重染色。抗-ICAM-1 mAb直接与FITC交联，抗-DAF mAb经与PE连接的二级交联物(secondaryconjugate)进行间接染色。
图2.CVA21对多发性骨髓瘤细胞系的细胞病变效应。为了测定CVA21对多发性骨髓瘤细胞系和正常PBMC的细胞病变效应，RPMI-8226、U266、NCI-H929和PBMC的培养物在6-孔板中与或不与CVA21在37℃培养48h(MOI～1)。小心地从每个孔中吸出细胞上清液，细胞用0.01％台盼蓝溶液染色。被CVA感染破坏的无活力细胞用台盼蓝染色呈阳性，而有活力的细胞能够排除染料。以×100放大倍数进行显微照相。
图3.使用MMT测定检测CVA21对MM细胞系和正常PBMC的溶瘤作用。
MM细胞系RPMI-8226、U266和NCI-H929以及正常PBMC证明对CVA21 48h的连续接触有差别的敏感度。误差棒表示四个孔/组的标准误差的均数。
图4.在感染多发性骨髓瘤细胞系后CVA21的产量。
MM细胞系NCI-H929、U266和RPMI-8226在用CVA21感染24h和48h后产生感染性病毒颗粒的能力。在用～1MOI的CVA21感染后，在每个多发性骨髓瘤细胞系中都能检测到病毒的增加，与正常PBMC相反。
图5.多发性骨髓瘤细胞中CVA21的病毒生长曲线。在同步感染(感染多样性大约为1)和以指定的时间间隔收集病毒子代后测定的CVA21在U266(●)、NCI-H929(○)和RPMI-8226()细胞系中的病毒生长曲线。样品的滴定进行三次，对每个时间点的平均病毒产量作图。
图6.用CVA21感染的RPMI-8226、NCI-H929和U266细胞中DNA断裂分析。
RPMI-8226、NCI-H929和U266细胞用CVA21(MOI～10 TCID50/细胞)感染24h。从感染的和未感染的细胞中提取总DNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测碎片。显示了来自骨髓瘤细胞系RPMI-8226(泳道1和2)、NCI-H929(泳道3和4)和U266(泳道5和6)的DNA样品。泳道“M”含有1-kb DNA梯型(ladder)。从在培养基中单独培养的MM细胞系提取的DNA显示在泳道1、3和5中，而泳道2、4和6含有从用CVA21处理的细胞系提取的细胞DNA。
图7.从与PBMC的混合物中先体外后体内净化多发性骨髓瘤细胞。
正常PBMC和多发性骨髓瘤细胞RPMI-8226和U266的混合物在一起培养，用CVA21感染3天，测定多发性骨髓瘤净化的效果。通过流式细胞仪分析有活力的骨髓瘤细胞(CD138+/PI-)和PBMC(CD138-/PI-)。显示了RPMI-8226和U266细胞系净化(“CVA21”)和未净化(“无病毒”)样品的流式细胞图。
图8.临床多发性骨髓瘤样品上ICAM-1表达和CVA21生长抑制作用的分析。
(A)从多发性骨髓瘤患者获得患者的骨髓抽吸物(临床样品#001)，并加工获得单细胞悬液。细胞用抗-CD138和抗-ICAM-1抗体双重染色。在点阵图的右上象限出现了ICAM-1表达阳性的骨髓瘤细胞(CD138+/ICAM-1+)。在原发肿瘤样品中大约37％的细胞由CD138+浆细胞组成。
(B)然后来自患者的临床骨髓细胞用CVA21以多种浓度进行感染，通过MTT测定检测癌细胞的生长抑制。图表显示了样品#001在不同的病毒输入量下细胞存活的百分比。
图9.CVA21从临床骨髓样品净化多发性骨髓瘤浆细胞的能力。
(A)在流式细胞仪分析前，来自患者#001的骨髓样品与无病毒、～2.75 TCID50/细胞、～5.5 TCID50/细胞或～11 TCID50/细胞的病毒培养72h，以检测仍然存活的骨髓瘤细胞的百分比。细胞用碘化丙啶、和抗CD138-FITC抗体双重染色。在每个点阵图的右下象限(CD138+/PI-)可见到在用不同浓度的病毒净化后仍然存活的骨髓瘤细胞。
(B)用0、～2.75和～5.5 TCID50/细胞感染48h的CVA21感染的原发肿瘤样品的显微照片。与无病毒对照相比，在病毒处理的样品中均可见到细胞聚集(×40倍放大)。
(C)在用不同浓度的病毒激发后，从上面的流式细胞仪数据计算有活力的骨髓瘤细胞的百分比。
图10.CVA21选择性地从MM和MGUS BM中净化浆细胞。
(A)CD138+细胞上的ICAM-1表达。在用抗-CD138和抗-ICAM-1染色后，患者#005的代表性点阵图。
(B)(i)来自患有复发性MM(#001、#002和#008)、部分缓解MM(#003)、意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)(#004、#006)和诊断MM(#007)的患者的BM样品的体外感染和杀伤。来自7名患者的BM样品用感染多样性(MOI)为0(假)、3或10 TCID50/细胞的CVA21体外感染。感染后48小时收集样品，CD138染色后通过流式细胞仪进行分析。每个样品记录10,000个结果(event)；显示CD138阳性的有活力细胞的百分比。
(B)(ii).在本文表1中所示的条件范围内总共19个临床样品的综合结果。
(C)BM祖细胞对CVA有抗性。用CVA21以0(假)、3或10 TCID50/细胞的MOI感染48小时的三个BM样品中的残余细胞(大约10,000个细胞)，在3ml MethoCult GF4434完全甲基纤维素培养基(Stem CellTechnologies，Vancouver，Canada)中培养。在6孔板的孔中进行CFU-GM培养，在37℃、5％CO2下培养14天。对CFU-GM使用倒置显微镜记录由20个或更多个细胞的粒细胞和/或巨噬细胞组成的集落。显示了在用每种浓度的CVA21感染后集落的平均数目。误差棒表示三个样品的均数的标准误差。显示的集落数目是每1×104接种细胞。CFU-GM：粒细胞/巨噬细胞集落形成单位。
(D)通过流式细胞仪检测，在CVA21净化后，PBMC(CD138-)群仍然存活。在上面B(i)中所述的7名患者BM样品感染后，也对CD138-细胞进行定量。该群体在CVA21感染后保持相对无变化。
(E)来自图10B(ii)中所述患者的BM样品的体外感染和杀伤，结果表示为CD138+细胞减少的百分比。
图11(A和B).对B细胞淋巴瘤、B幼淋巴细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病(APML)、单核细胞白血病和多发性骨髓瘤细胞系上的ICAM-1和DAF的流式细胞分析。
(A)B细胞淋巴瘤细胞系SCOTT、B幼淋巴细胞白血病细胞系JVM13、急性早幼粒细胞白血病(APML)细胞系NB4和(B)HL-60、单核细胞白血病细胞系U937和多发性骨髓瘤细胞系H929，用抗-ICAM-1和抗-DAF mAb双重染色。抗-ICAM-1 mAb直接与FITC交联，抗-DAF mAb通过与PE连接的二级交联物间接染色。
图12.使用MTT测定检测CVA21、CVA18、CVA15和CVA13对所选择的血液性癌细胞系的溶瘤作用。
(A)MM细胞系RPMI-8226、(B)单核细胞白血病细胞系U937和(C)急性早幼粒细胞白血病(APML)细胞系HL-60证明对所述病毒48h的连续接触有差别的敏感度。
图13.所选择的血液性癌细胞系感染后CVA21的产量。
在用CVA21感染24和48 h后，(◇)MM细胞系RPMI-8226、(□)单核细胞白血病细胞系U937和(△)急性早幼粒细胞白血病(APML)细胞系HL-60产生感染性的病毒颗粒的能力。在用～10 TCID50/细胞的CVA21感染后，仅在MM细胞系RPMI-8226中检测到病毒的增加。
具体实施方式
尽管已知一些天然存在的微小RNA病毒和其他病毒，如呼肠孤病毒，适合用于治疗有限类型的癌症，但仍然需要开发改良的治疗方法。
如在此所述，本发明者已经发现微小RNA病毒可用来溶解性地感染血液肿瘤或癌症。“易感的”细胞是那些证明能诱发细胞病变效应、病毒蛋白合成和/或病毒产生的细胞。
基于这些发现，本发明者已经开发了治疗和/或预防哺乳动物血液癌症的方法和组合物。哺乳动物可以是根据本发明需要治疗的任何哺乳动物。哺乳动物可以是人或任何有社会、经济或研究重要性的物种的个体，包括但不限于小鼠、狗、猫、绵羊、山羊、牛、马、猪、非人灵长类、和人。在优选的实施方式中，哺乳动物是人。
细胞的死亡一般是由于病毒感染细胞引起的，并且可能是由以下方式引起的：由于病毒的细胞内复制引起的细胞溶解，或很可能是活化细胞胱填蛋白酶的结果而触发凋亡的感染。一旦被溶解，感染细胞的细胞溶质内容物可从破裂的胞膜中溢出，并可释放出能激发对异常细胞免疫反应的包括细胞表面抗原的抗原。因此，根据本发明的方法治疗哺乳动物血液肿瘤或癌细胞可以为哺乳动物对这些细胞的免疫反应提供助力。
微小RNA病毒可以是任何微小RNA病毒，包括已知的和已分类的微小RNA病毒、以及有待分类的微小RNA病毒。微小RNA病毒可选自原型和临床分离株。人微小RNA病毒的代表类型包括肠道病毒、柯萨奇病毒、艾柯病毒、脊髓灰质炎病毒，和未分类的肠道病毒、鼻病毒属、副肠孤病毒属、肝病毒属和心病毒属。在一个优选的方法中，微小RNA病毒是肠道病毒，包括柯萨奇病毒、艾柯病毒、脊髓灰质炎病毒和未分类的肠道病毒，或来自其他属的微小RNA病毒，其可包括鼻病毒属、副肠孤病毒属、肝病毒属、心病毒属、口蹄病毒属、马鼻病毒属、嵴病毒属、和捷申病毒属。在优选的实施方式中，微小RNA病毒是柯萨奇病毒。优选地，柯萨奇病毒是A型，更优选柯萨奇病毒A21。
理想地，病毒可选自A组柯萨奇病毒。优选CVA21，特别是CVA21(Kuykendall)(Sickles G.M.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.102：742；ShafrenD.等人，J.Virol 1997，71：4736；Hughes等人，J.Gen Virol.1989，70：2943；Schmidt，NJ.等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，1961，107：63。CVA21(Kuykendall)可从American Type Culture Collection(ATCC)10801University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，United States ofAmerica获得，登记号为No.VR-850。其他优选的A组柯萨奇病毒也可从ATCC获得，包括CVA13(登记号No.VR-171)、CVA15尤其是G-9(登记号No.VR-1021)、和CVA18(登记号No.VR-1024和VR-176)。
微小RNA病毒可以是天然存在的或修饰的。当微小RNA病毒从天然来源中分离，并且没有被人类在实验室中人为修饰的时候，它是“天然来源的”。例如，微小RNA病毒可从“场源(field source)”获得：即，来源于人类患者。
微小RNA病毒可以是修饰的，但仍能够溶解性地感染血液肿瘤或癌症。
优选地，用于在此所述的方法或组合物中的微小RNA病毒在接受者中将几乎不引起或仅引起轻微的病毒感染临床症状。
微小RNA病毒可以是来自两种或更多种类型的具有不同致病表型的微小RNA病毒的重组微小RNA病毒，这样它含有不同的抗原决定簇，从而减小或避免了以前曾接触微小RNA病毒亚型的哺乳动物所产生的免疫反应。
在本发明的方法中，微小RNA病毒可给予单个受试者的血液肿瘤或癌症。可使用不同血清型和/或不同株和/或不同种和/或不同属的微小RNA病毒，如来源于不同动物种属的柯萨奇病毒。如果需要，在施予肿瘤之前，微小RNA病毒可以被化学或生物化学预处理(例如，用蛋白酶处理，如糜蛋白酶或胰蛋白酶)。这些预处理能去除病毒的被膜，从而可产生更好的病毒感染性。
微小RNA病毒可与其他的治疗药物联合给药或使用。例如，微小RNA病毒可与一种或多种不同的病毒株或血清型或种或属的微小RNA病毒一起给药。其他株或血清型或种或属的微小RNA病毒对于细胞感染可以具有与本发明的微小RNA病毒相同或不同的受体要求。
作为进一步的实例，微小RNA病毒或其组合，可与一种或多种能够调节或抑制被治疗个体的免疫反应的药物联合给药。以此方式，个体对病毒感染的天然免疫反应可被改变，从而优选地获得更有效的病毒感染和/或溶瘤和/或治疗结果。能够改变免疫反应的药物典型地是能够抑制免疫反应的药物。能调节或抑制如人类个体之类的个体免疫反应的药物，在例如The Merck Index，第十三版，Merck & Co.Inc，Whitehouse Station，NJ，USA.中说明，其内容在此引入作为参考。
微小RNA病毒或其组合，可与一种或多种化疗药物(也称为抗肿瘤药物)联合使用。例如，抗肿瘤药物在The Merck Index，第十三版，Merck & Co.Inc，Whitehouse Station，NJ，USA.中描述。例如，微小RNA病毒可与化疗药物一起给药，所述化疗药物如：阿霉素、紫杉醇、氟尿嘧啶、美法仑、顺铂、α干扰素、COMP(环磷酰胺、长春新碱、甲氨蝶呤和强的松)、依托泊甙(etoposide)、mBACOD(甲氨蝶呤、博来霉素、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱和地塞米松)、PROMACE/MOPP(强的松、甲氨蝶呤(w/四氢叶酸解救(leucovin rescue))、阿霉素、环磷酰胺、紫杉醇、依托泊甙/氮芥、长春新碱、强的松和甲基苄肼)、长春新碱、长春碱、血管抑制素(angioinhibin)、TNP-470、多硫酸戊聚糖、血小板因子4、血管生成抑素(angiostatin)、LM-609、SU-101、CM-101、Techgalan、沙立度胺、SP-PG和类似物。其他的化疗药物包括烷基化剂，如氮芥类，包括双氯乙基甲胺、美法兰(melphan)、苯丁酸氮芥、环磷酰胺和异环磷酰胺；亚硝基脲类，包括卡氮芥、环己亚硝脲、甲基环己亚硝脲和链脲霉素；烷基磺酸盐类，包括白消安；三嗪类，包括氮烯唑胺；乙撑亚胺类(ethyenimines)，包括噻替派和六甲密胺；叶酸类似物，包括甲氨蝶呤；嘧啶类似物，包括5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷；嘌呤类似物，包括6-巯基嘌呤和6-硫鸟嘌呤；抗肿瘤抗生素，包括放线菌素D；蒽环类抗生素，包括阿霉素、博来霉素、丝裂霉素C和光辉霉素(methramycin)；激素类和激素拮抗剂，包括它莫西芬和皮质类固醇，和杂类药物，包括顺铂和布喹那(brequinar)。微小RNA病毒可与博来霉素、去乙酰长春酰胺、长春新碱、dactamycin、甲基苄肼、环己亚硝脲或氮烯唑胺的一种或多种联合用于，例如治疗黑色素瘤。微小RNA病毒可与顺铂和卡铂的一种或多种联合用于，例如治疗卵巢癌。与微小RNA病毒联合用于，例如治疗乳腺癌的化疗药物的进一步实例包括，环磷酰胺(Cytoxan)、甲氨蝶呤(Amethopterin，Mexate，Folex)和氟尿嘧啶(Fluorouracil、5-FU、Adrucil)[缩写为CMF]；环磷酰胺、阿霉素(Adriamycin)、和氟尿嘧啶[缩写为CAF]；阿霉素(Adriamycin)和环磷酰胺[缩写为AC]；阿霉素(Adriamycin)和环磷酰胺与紫杉醇(Taxol)；阿霉素(Adriamycin)，然后是CMF；环磷酰胺、表柔比星(Ellence)和氟尿嘧啶。用于治疗患乳癌女性的其他化疗药物，例如包括多烯紫杉醇(Taxotere)、长春瑞滨(Navelbine)、吉西他滨(Gemzar)和卡培他滨(Xeloda)。
要理解的是，微小RNA病毒或其组合可与治疗血液癌症的公知治疗方法联合使用，如用肽胺哌啶酮、蛋白酶体(proteasome)抑制剂和三氧化二砷治疗骨髓瘤。
要理解的是微小RNA病毒与一种或多种附加的药物，如一种或多种其他的微小RNA病毒、一种或多种能调节或刺激免疫反应的药物、或一种或多种抗肿瘤药物的“联合”使用或给药，是指任何方式的使用或给药，其中微小RNA病毒和附加的药物具有治疗作用，如暂时的重叠效应。联合给药的成员可同时给药或以任何达到所需疗效的顺序单独给药。当考虑进行联合治疗时，微小RNA病毒和附加的药物可以是其物理混合物或单独提供，如以试剂盒的形式，有或没有给药说明书。根据本发明的试剂盒也可包括必需或实施本发明的方法所需的其他组分，如缓冲液和/或稀释剂。在本发明的方法中，试剂盒典型地包括存放多种组分的容器和使用试剂盒组分的说明书。
要理解的是本发明的药学组合物包括微小RNA病毒与一种或多种其他治疗药物的物理混合物形式的组合物，以及包括微小RNA病毒作为唯一治疗活性剂的组合物。
微小RNA病毒可与有效量的益生菌剂联合给药。益生菌剂可包括但不限于嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)、L.gasseri、L.confusus、嗜热链球菌属(Streptococcus thermophilus)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)和B.longum。
血液癌症—如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤—是从骨髓细胞或淋巴组织发生的癌症。血液癌症可生长为实体肿瘤或单个细胞，在此情况下它们出现在血液中成为白血病。
通常，至少一些血液癌症细胞表达ICAM-1和/或DAF。与非恶性细胞相比，通常至少一些血液癌症细胞过度表达ICAM-1和/或DAF。对本发明的方法的治疗特别易感的血液肿瘤或癌症包括白血病、多发性骨髓瘤、何杰金氏病、非何杰金氏病、脊髓发育不良和淋巴瘤。白血病的实例包括但不限于慢性骨髓性白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)。
微小RNA病毒典型地在生理学可接受的载体或载剂，如磷酸缓冲盐水中，施药给血液癌症。“施药给血液癌症”表示微小RNA病毒的给药方式是它与血液癌症细胞接触。微小RNA病毒给药的途径、以及剂型、载体或载剂，取决于肿瘤的部位和类型。可采用许多种给药途径。例如，对于能接触到的实体肿瘤，微小RNA病毒可通过向肿瘤直接注射进行给药。例如，对于造血肿瘤，微小RNA病毒典型地可静脉内或血管内给药。例如，静脉内的递送可经单次或多次剂量推注或经缓慢输注入静脉系统中，例如使用滴注器械来给药。对于在体内不容易接触到的肿瘤，如转移灶或脑肿瘤，微小RNA病毒给药的方式可以是通过哺乳动物的机体全身输送，从而到达肿瘤(例如，鞘内、静脉内或肌肉内)。或者，微小RNA病毒可直接向单个实体肿瘤给药，然后从该处通过身体经全身被带到转移灶。微小RNA病毒也可皮下、腹膜内、局部、经口、经直肠、经阴道、经鼻、或通过喷雾吸入给药。
通常，根据本领域普通技术人员所公知的方法可制备合适的组合物，因此可包括药学可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。
组合物可通过标准的途径给药。通常，组合物可通过胃肠外(例如，静脉内、椎管内、皮下或肌肉内)、经口或局部途径给药。更优选通过胃肠外途径给药。
就与组合物的其他成分相容而言，载体、稀释剂和佐剂必须是“可接受的”，并对其接受者无害。
药学可接受的载体或稀释剂的实例是软化水或蒸馏水；盐水溶液；植物油类，如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油，麻油类，如花生油(peanut oil)、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、麻油、花生油(arachis oil)或椰子油；硅油类，包括聚硅氧烷类，如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；挥发性硅酮类；矿物油类，如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物，如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级烷醇类，例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇类(aralkanols)；低级聚烷撑二醇类或低级烷撑二醇类，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯类，如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；黄耆树胶或阿拉伯胶和凡士林。一般载体或多种载体形成组合物的10wt％至99.9wt％。
组合物可以是适合注射给药的剂型、适合口服摄取的剂型(如胶囊、片剂、囊片、酏剂)、适合局部给药的油膏、乳膏或洗剂形式、适合用作滴眼剂的递送剂型、适合通过吸入给药的气雾剂形式(如通过鼻内吸入或口吸入)、适合胃肠外给药的剂型，即皮下、肌肉内或静脉内注射。
对于可注射溶液或悬液的给药，无毒的胃肠外可接受的稀释剂或载体可包括林格氏溶液、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇和1，2丙二醇。
用于口服的合适载体、稀释剂、赋形剂和佐剂的一些实例包括花生油、液体石蜡、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、海藻酸钠、阿拉伯胶、黄耆树胶、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、明胶和卵磷脂。另外，这些口服剂型可含有合适的调味剂和着色剂。当以胶囊剂型使用时，胶囊可用能延缓崩解的化合物包被，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
佐剂典型地包括润滑剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、杀菌剂和缓冲剂。
口服给药的固体剂型可包含在人和兽医药学实践中可接受的粘合剂、增甜剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、包衣剂、防腐剂、润滑剂和/或延时剂(time delay agent)。合适的粘合剂包括阿拉伯胶、明胶、玉米淀粉、黄耆树胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的增甜剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴特或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、黄原胶、膨润土、藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖、山梨醇、甘露醇、右旋糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。合适的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、柑橘或树莓调味剂。合适的包衣剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它们的酯类的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米蛋白、虫胶或麸质。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。合适的延时剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
用于口服给药的液体剂型除了上述药物以外，还可包含液体载体。合适的液体载体包括水、油类如橄榄油、花生油(peanut oil)、麻油、向日葵油、红花油、花生油(arachis oil)、椰子油、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯或其混合物。
用于口服给药的悬液可进一步包括分散剂和/或悬浮剂。合适的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙稀吡咯烷酮、海藻酸钠或乙酰乙醇。合适的分散剂包括卵磷脂、如硬脂酸之类的脂肪酸的聚氧乙烯酯类、聚氧乙烯山梨醇单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯和类似物。
用于口服给药的乳剂可进一步包括一种或多种乳化剂。合适的乳化剂包括上面所例举的分散剂或天然树胶，如瓜尔胶、阿拉伯胶或黄耆树胶。
制备胃肠外给药组合物的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的，更多的细节在例如Remington′s Pharmaceutical Science，第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.中说明，在此引入作为参考。
本发明的局部给药剂型包括活性成分以及一种或多种可接受的载体，并任选任何其他的治疗成分。适合局部给药的剂型包括适合通过皮肤渗透至需要治疗的部位的液体或半液体制剂，如搽剂、洗剂、乳膏、油膏或糊剂，和适合眼、耳或鼻给药的滴剂。
根据本发明的滴剂可包括无菌水溶液或油性溶液或悬液。这些剂型可通过将活性成分溶解在水溶液中而进行制备，所述水溶液是杀菌和/或杀真菌剂和/或任何其他合适的防腐剂的水溶液，并任选地包括表面活性剂。然后得到的溶液可通过过滤澄清，转移至合适的容器中并灭菌。可通过下列方法进行灭菌：高压灭菌或在90℃-100℃保持半小时，或通过过滤，然后通过无菌技术转移至容器中。适合包括在滴剂中的杀菌剂和杀真菌剂的实例是硝酸苯汞或醋酸苯汞(0.002％)、苯扎氯铵(0.01％)和醋酸洗必泰(0.01％)。制备油性溶液的合适溶剂包括甘油、稀乙醇和丙二醇。
根据本发明的洗剂包括适合应用于皮肤或眼的剂型。眼用洗剂可包括无菌水溶液，任选地包含杀菌剂，并可通过与上述制备滴剂有关的类似方法制备。用于皮肤的洗剂或搽剂也可包括促进皮肤干燥和使皮肤清凉的试剂，如乙醇或丙酮、和/或湿润剂如甘油、或油如蓖麻油或花生油。
根据本发明的乳膏、油膏或糊剂是外用活性成分的半固体剂型。它们可通过将细粒状或粉末形式的活性成分，单独或在溶液或水性液体或非水性液体的悬液中，与油基或非油基混合进行制备。该基质可包括烃类，如硬、软或液体石蜡、甘油、蜂蜡、金属皂；粘胶；天然来源的油，如杏仁、玉米、花生、蓖麻或橄榄油；羊毛脂或其衍生物、或如硬脂酸或油酸之类的脂肪酸，以及丙二醇或聚乙二醇之类的醇。
组合物可掺入任何合适的表面活性剂，如阴离子、阳离子或非离子型表面活性剂，如脱水山梨糖醇酯或其聚氧乙烯衍生物。也可包括悬浮剂如天然树胶、纤维素衍生物或如硅质(silicaceous)二氧化硅之类的无机物质、和其他成分如羊毛脂。
当需要多次给予微小RNA病毒时，每次可给予不同的病毒以避免或尽量减小对以前施用的病毒所发生的任何免疫反应，疗程可延长至一周至两周或更长时间，如一至两个月或更长时间，可由主治医生来确定。更优选地，由标准技术可确定，可给予哺乳动物以前没有接触过的病毒或哺乳动物对其产生相对小的免疫反应的病毒。
可采用很多种给药途径。例如，对于血液癌症，给药途径可以是静脉内、瘤内、腹膜内、肌肉内、眼内、皮下、经口、局部、或在自体干细胞移植之前在自体移植物内先体外后体内净化恶性细胞。
微小RNA病毒以足以治疗血液癌症的量给药(例如，“有效量”)。当微小RNA病毒给予癌细胞引起至少一些癌细胞溶解，使癌症一定程度缩减，或优选癌症完全消失时，则血液癌症“被治疗”。癌症一定程度的缩减，或优选癌症的消失，通常是由微小RNA病毒所导致的血液癌症细胞溶解(“溶瘤作用”)引起的。
有效量取决于个体，也可部分考虑微小RNA病毒的类型：个体大小、年龄、性别；和血液癌症的类型、程度和其他特征。例如，对于人类的治疗，可使用大约102至大约1010噬斑形成单位(PFU)的微小RNA病毒，其取决于特定的情况，如所存在的癌症的类型、大小和程度。例如，接种物可含有大约105PFU以上，例如大约105至大约106PFU之间或大约106至大约107PFU之间或大约107至大约108PFU之间。作为进一步的实例，病毒用药量的范围可以在大约0.01至大约1000感染病毒单位/细胞，例如大约0.01至大约0.1感染病毒单位/细胞，或大约0.1至大约1感染病毒单位/细胞，或大约1至大约10感染病毒单位/细胞，或大约10至大约100感染病毒单位/细胞，或大约100至大约1000感染病毒单位/细胞。
微小RNA病毒可以单次剂量或多次剂量(即，超过一次剂量)给药。多次剂量可同时或连续给药(例如，在几天或几周的周期内)。在治疗应用中，治疗持续的时间一般为疾病状况的持续时间，例如至少至通过常规手段不再检测到血液癌症。也能预料到可能需要在癌症可检测到存在的周期之外继续治疗，例如治疗医生怀疑可能存在未检测到的肿瘤时。微小RNA病毒也可给予相同个体内的一个以上的血液癌症。
也要理解的是，微小RNA病毒可间接给药，通过使用RNA基因组或基因组的互补DNA拷贝或其足够的部分，使病毒感染的癌细胞中产生溶解反应。当给药时，微小RNA病毒仍然能够在细胞中进行复制，并引起所需的溶解性感染和杀伤作用。
一般患者用初始剂量的病毒治疗，然后在决定进一步向患者施用病毒之前监测一段合适的时间，要考虑的因素如患者对病毒初始给药的反应和初始治疗引起的病毒感染和恶性细胞死亡的程度。
理想地，个体用病毒以预定的时间间隔在一定的周期内进行治疗。时间间隔可以是每天或从24小时至72小时或更大，如每周或每月，可根据每种情况适当地决定。每次可给予相同或不同的病毒，例如以避免或尽量减小对以前曾给药或曾接触过的病毒的任何免疫反应效应，疗程可以延伸至一至两周或更长时间，可由主治医生来确定。最优选地，给予个体以前没有接触过的病毒、或采用标准技术可确定出个体对其产生相对较小的免疫反应的病毒。另外可选地且有时理想地，病毒给药可以与免疫调节剂(例如希望减少受体对所施用病毒的免疫反应时)联合使用。
虽然可获得的公知病毒可适用于本发明的方法中，也可使用采用常规技术修饰或工程改造的病毒。例如，病毒可被修饰以采用其他的细胞粘附分子作为细胞受体。例如，柯萨奇病毒A21可使用定点诱变来进行修饰，这样肽基序“RGD”在病毒衣壳表面上表达，如柯萨奇病毒A9(CVA-9)的情形。RGD基序由所有αv整合素异二聚体识别，例如，这种衣壳修饰可使病毒与整合素αvβ3结合，该整合素是一种细胞粘附分子，其已经显示在恶性黑色素瘤病变的表面上与ICAM-1一起上调，通过与整合素分子的相互作用或随后与ICAM-1的相互作用引起对病毒的摄取增强。或者，病毒可被修饰以识别如E-选择素之类的选择素，或靶向NF-κB信号通路。
病毒可被修饰或选择以识别进入细胞的可选分子。这些修饰和选择的方法描述在申请人的共同未决申请PCT/AU2005/000048中说明，其题目为“修饰的溶瘤病毒(Modified oncolytic viruses)”，其内容在此引入作为参考。例如，PCT/AU2005/000048公开了分离和选择的微小RNA病毒，其能在基本上缺少细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的细胞中，例如通过细胞上的衰变加速因子(DAF)，溶解性地感染细胞或诱导细胞凋亡。
                       实施例
本发明现在参考具体实施例进行详细地描述，但不应以此来限制本发明的范围。
材料和方法
细胞和病毒
从Dr M.Kennett，Enterorespiratory Laboratory，Fairfield Hospital，Melbourne，Victoria，Australia处获得A组柯萨奇病毒CVA21的原型株(Kuykendall株)。CVA21被双重空斑纯化，并在表达ICAM-1的骨髓瘤细胞(SK-Mel-28)中生长。病毒是CVA21、CVA18、CVA15和CVA13的实验室保存株。这些A组柯萨奇病毒CVA13(Flores)、CVA15(G-9)、CVA18(G-13)和CVA21(Kuykendall)的原型株也从Dr M.Kennett处获得。开始，CVA13、CVA15和CVA18在HeLa-B细胞中繁殖，而CVA21 Kuykendall在RD-ICAM-1细胞中繁殖。然后在SK-Mel-28细胞中由这些保存株制备这些病毒的工作实验室株。
SK-Mel-28细胞由Dr P.Hersey，Oncology，Mater Hospital，Waratah，New South Wales，Australia惠赠。U266、RPMI-8226和NCI-H929多发性骨髓瘤细胞系从Dr L.Lincz，Hematology，Mater MisericordiaeHospital(Hunter Hematology Research Group)，Edith Street，Waratah，New South Wales，2298，Australia处获得。其他的细胞系，B细胞淋巴瘤细胞系SCOTT、B幼淋巴细胞白血病细胞系JVM13、急性早幼粒细胞白血病(APML)细胞系NB4和HL-60、和单核细胞白血病细胞系U937也从Dr L.Lincz处获得。SK-Mel-28细胞在含有10％胎牛血清(FCS)的DMEM中保持，而U266、RPMI-8226、NCI-H929、SCOTT、JVM13、NB4、HL-60和U937细胞在含有10％FCS的PRMI中培养。所有细胞系都在37℃，5％CO2的环境中保持。通过在Ficoll-Hypaque加4∶1比例的梯度上的全血样品分层，将来自健康供体的正常外周血单核细胞(PBMC)分离，然后400×g离心35min。收集中间层，重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，然后在PBS中冲洗两次备用。
原代肿瘤细胞
所有方法都经过the University of Newcastle Human Care and EthicsCommittee(Newcastle，NSW，Australia)以及the Hunter Area HealthService Human Care and Ethics Committee(Newcastle，NSW，Australia)的批准。从进行多发性骨髓瘤诊断接受常规骨髓检查的患者获得原代肿瘤细胞。如表1所示从19名患者中收集骨髓吸出物。
                        表1
患者ID样品日期性别年龄状态1 21/06/2004 M 55复发性2 30/06/2004 M 76复发性3 20/07/2004 F 44持续性4 28/07/2004 F 69 MGUS5 28/07/2004 M 80 MM诊断样品6 11/08/2004 M 85 MGUS7 10/09/2004 F 77诊断8 14/02/2005 M 44诊断9 16/02/2005 M 46移植前10 23/02/2005 F 75干抽11 28/02/2005 M 55 PR12 2/03/2005 M 70复发性13 13/04/2005 M 57 PR14 11/05/2005 F 80 MGUS15 1/06/2005 F 72瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症16 1/06/2005 F 60 MM诊断17 03/08/2005 F 67 MGUS18 10/08/2005 M 66浆细胞瘤19 10/08/2005 F 72 MGUS
“PR”部分缓解；“干抽”是指没有骨髓(骨颗粒)。所有患者签署知情同意书。通过将样品以2∶1的比例覆盖在淋巴细胞分离液(Lymphoprep)(Nycomed，Oslo，Norway)上，400×g离心30min，从骨髓样品中获得单细胞悬液。收集单核细胞层，在PBS中冲洗两次，在用于下一个试验之前重新悬浮在含有5％FCS的RPMI中。
抗体
市售的与异硫氰酸荧光素(FITC)交联的针对ICAM-1的N-末端功能域(Berendt AR等人，Cell.1992；68：71-81)的抗-CD54抗体(Immunotech Coulter，Marseilles，France)，用于染色表面表达的ICAM-1。从Dr B.Loveland，Austin Research Institute，Heidelberg，Victoria，Australia处获得抗-DAF IH4 mAb。抗-CD 138-FITC mAb(Serotec，Oxford，UK)对浆细胞抗原Syndecan-1是特异的。另一个市售的与藻红蛋白(PE)交联的抗-CD138抗体得自Miltenyi Biotec，CA，USA。
流式细胞检测
在多发性骨髓瘤细胞系和其他血液癌症细胞系B细胞淋巴瘤、B幼淋巴细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病(APML)和单核细胞白血病上ICAM-1和DAF的表面表达，通过双色流式细胞检测进行分析。简单来说，分散的细胞(1×106)在冰上直接用交联的抗-CD54-FITC mAb(在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释为5μg/ml)培养20min。然后细胞用PBS冲洗，以1000×g压丸(pelleted)5min，然后用抗-DAF IH4 mAb(5μg/ml PBS)在冰上双重标记20min。细胞用PBS冲洗，重新悬浮在100μl二抗溶液中；羊抗鼠免疫球蛋白的R-藻红蛋白-交联F(ab′)2片段，在PBS(DAKO A/S，Denmark)中稀释1∶100，并在冰上培养20min。对于每种细胞系，同时也使用适当的交联对照抗体进行染色。如上冲洗细胞和压丸，重新悬浮在PBS中，使用FACStar分析仪(BectonDickenson，Sydney，Australia)分析ICAM-1和DAF的表达。
病毒溶解性感染和细胞活力测定
多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226、U266和NCI-H929与CVA21或不与CVA21在6孔培养板中培养48h。从健康志愿者获得正常人外周血单核细胞作为对照。每种培养物的感染多样性(MOI)大约为5TCID50/细胞。在CVA21感染后48h使用台盼蓝活力染色评估细胞病变效应(CPE)。由于台盼蓝对多发性骨髓瘤细胞系分泌至培养上清液中的蛋白有亲和性，在染色之前首先通过钝的26号(gauge)针头缓慢抽吸去掉培养上清液。剩余的细胞用0.4％台盼蓝溶液染色5min。以×100的放大倍数照相。
体外生长抑制试验
改良的微量培养四氮唑盐测定(Alley MC等人，Cancer Res.1988；48：589-601)，用来研究CVA21浓度的增加对多发性骨髓瘤细胞系生长的作用。简单来说，从指数生长期(exponential-phase maintenance)的培养物中收获多发性骨髓瘤细胞，以100μl的体积分配在多块96孔培养板中(1×105细胞/孔)。100μl培养基，或含有病毒(2×10-5-20 TCID50/细胞)的培养基分配至合适的孔中。为了比较其他A组柯萨奇病毒(CVA13、CVA15和CVA18)与CVA21的生长抑制作用，使用从1×10-4-100 TCID50/细胞的范围10-倍连续稀释。不含细胞的孔用于单独培养基或单独病毒溶液的空白“本底”测定。
在加入MTT试剂(Sigma Chemicals，Sydney，New South Wales，Australia)之前，培养板在37℃培养2天。制备MTT母液(5mg MTT/mlPBS溶液)，用0.2μm过滤装置无菌过滤，并在4℃保存。为了测定生长抑制水平，在2天的培养后，向每个培养孔中加入20μl MTT母液，继续在37℃培养4h。
培养后，通过钝的26号针头缓慢抽吸从孔中去掉细胞上清液，替换以150μl DMSO。在室温(RT)下轻轻振摇完全溶解甲替(formazan)晶体，使用ELISA平板读数仪(Flow Laboratories，McLean，Virginia，USA)在540nm处测定每孔的吸光度。随后，细胞系生长抑制作用表示为，减去平均“本底”吸光度后，平均吸收单位占对照吸光度读数的百分比。
病毒产量和终点滴定
在三种骨髓瘤细胞系中测定CVA21 CPE后，进行试验测定在U266、RPMI-8226、NCI-H929细胞和PBMC感染过程中产生的感染性病毒颗粒的产量。每种细胞系大约3×106细胞用1 TCID50/细胞的MOI感染。接种CVA21的U266、RPMI-8226、NCI-H929细胞和PBMC用PBS冲洗两次，并重新悬浮在600μl RPMI中，之后每种细胞分成3等份，每份200μl(～1×106细胞/试管)。这些试管在37℃培养，每种细胞系收集1份，在0、12、24和48h的时刻通过三次连续的冷冻-解冻循环收获细胞。每种细胞溶解产物中的病毒产量在SK-Mel-28细胞中通过终点滴定试验进行测定。结果见图4。
简单来说，对于终点滴定试验，在96孔组织培养板中的SK-Mel-28汇合的单层细胞中接种10-倍连续病毒稀释液(100μl/孔，每种稀释度4份)，并在37℃下在5％CO2的环境中培养48h。通过与结晶紫/甲醇溶液(0.1％结晶紫、20％甲醇、4.0％甲醛/PBS)(100μl/孔)培养24h，然后用蒸馏水冲洗三次，对细胞的生存率进行定量，在multiscan酶联免疫吸收试验平板读数仪(Flow Laboratories，McLean，Virginia，USA)上在540nm处对每个孔的相对吸光度进行读数。使用SpearmanKarber法计算50％病毒终点滴定度；如果吸光度值小于对照无病毒孔的负三个标准差(SD)的均数，该孔记为阳性。
也在选择的血液癌症细胞系，即MM细胞系RPMI-8226、单核细胞白血病细胞系U937和急性早幼粒细胞白血病(APML)细胞系HL-60中，进行试验以测定感染过程中产生的感染性病毒颗粒(CVA21)的产量。该方法类似于上述方法，尽管细胞用CVA21以10 TCID50/细胞感染，但在冲洗前使病毒在37℃结合30min，然后置于新鲜培养基(RPMI 10％FCS)中。在感染后0、24和48h收获细胞和上清液，在SK-MEL-28细胞单层上通过终点滴定测定病毒量。结果见图13。
病毒生长速率
为了研究三种骨髓瘤细胞系中CVA21的复制动力学，含有1×106U266、RPMI-8226或NCI-H929细胞的试管用含有大约3×106 TCID50CVA21(MOI～3 TCID50/细胞)的100μl病毒试样感染。试管在室温下轻轻振荡30min，然后用5ml RPMI/次冲洗细胞5次，细胞重新悬浮在1ml含1％FCS的RPMI中。然后每管接种CVA21的细胞分成9等份100μl试样(～1×105细胞/试管)以便在适当的时间点收集。这些试管在试验期间在37℃培养。同步化的感染以0、2、4、6、8、10、12、24和48小时的时间间隔被中断，在每个时间点收集检测的每种细胞系的1个试样，通过三次连续的冷冻-解冻循环溶解细胞，室温下以10,000×g离心5min，然后在终点滴定试验中测定细胞溶解产物中的病毒产量。
DNA碎片检测
通过检测基因组DNA碎片，测定CVA21感染MM细胞诱发的凋亡。MM细胞系RPMI-8226、U266和NCI-H929在6孔板(5×105细胞/孔)中培养，分析前在37℃用CVA21(MOI～I0 TCID50/细胞)感染24h，或不感染，单独使用培养基培养24h。以800g离心5min使细胞压丸，然后向细胞团中加入500μl溶解缓冲液(5mM Tris-HCl、20mM EDTA，0.5％Triton X-100，pH 8.0)，并在冰上培养20min。溶解产物以12,000g离心20min，使用苯酚∶氯仿从上清液中提取DNA。DNA被乙醇沉淀，在70％乙醇中冲洗，并重新悬浮在含有RNase(50μg/ml)的30μl TAE中。DNA样品在37℃培养30min，然后通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。15微升提取的DNA与3μl加样缓冲液(0.25％OrangeG、40％甘油/TAE)混合，然后在含溴化乙啶的1.2％TAE琼脂糖凝胶上解析。凝胶在紫外线下显像，并使用Gel Doc系统(Bio-RAD，RegentsPark，New South Wales，Australia)数码采集图像。
CVA21对与正常外周血单核细胞共培养的骨髓瘤细胞系的选择性感染
每种U266和RPMI-8226骨髓瘤细胞都与PBMC在添加了10％FCS的RPMI培养基中混合，得到最终的浆细胞浓度为10％。细胞混合物用CVA21(1MOI/总细胞群)处理或不处理保持72h。在净化的第3天，在PBS中从每种细胞群混合物中收集样品，在首先用抗-CD138-FITC(10μl/ml)染色30min，然后用碘化丙啶(PI)(5μg/ml)染色10min后，使用流式细胞仪检测未被处理的癌细胞数目。细胞在5ml PBS中冲洗，以1000g离心压丸，然后在FACStar分析仪(BectonDickenson，Sydney，Australia)上分析。不再有活力或未处理的细胞用碘化丙啶(PI+)染色呈阳性，而抗-CD138-FITC的染色用来从正常PBMC(CD138-)中确定多发性骨髓瘤细胞(CD138+)。
先体外后体内净化具有CVA21的患者骨髓样品
从两名已经签署知情同意书的多发性骨髓瘤患者获得原发肿瘤样品，仅将常规诊断过程中收集的骨髓抽吸物的剩余细胞用于本研究。首先，通过用抗-CD138-PE(10μg/ml)和抗-ICAM-1-FITC抗体(5μg/ml)双重染色原代肿瘤细胞(1×105细胞)，基于上述的标准表面受体染色原始数据，测定每个临床样品的ICAM-1受体水平。然后在用CVA21感染的临床样品上进行三次生长抑制/MTT试验。然后将大约1×105细胞(在含5％FCS的RPMI中)接种在96孔板中，以0至16 TCID50/细胞的范围10-倍连续稀释，测定CVA21的溶瘤作用。这些细胞在37℃培养48h，然后使用MTT测定进行分析。
在生长抑制试验后，将来自临床骨髓样品的单细胞悬液(1×106细胞，在含有5％FCS的RPMI中)接种在6孔板的每个孔中，与0、2.75、5.5和11 TCID50/细胞浓度的CVA21培养48h。然后轻轻吸液收获细胞，并重新悬浮在4ml PBS中，在进行细胞活力分析之前冲洗一次。通过流式细胞仪，使用细胞活力染料碘化丙啶(5μg/ml)和抗-CD138-FITC(10μg/ml)抗体，测定CVA21介导的溶瘤作用对MM细胞的选择性。
如表1中所示的其他临床样品(总共19个)类似地进行测定。
结果
MM细胞表达ICAM-1和DAF
流式细胞检测用来检测几种MM细胞系表面上CVA21入胞受体ICAM-1和DAF的相对水平。在用抗-ICAM-1和抗-DAF抗体双重染色后，通过流式细胞检测分析U266、RPMI-8226和NCI-H929细胞。与交联物对照相比，在每个点阵图(图1)的右上象限中，染色的细胞非常明显，证明三种细胞系中每种的ICAM-1和DAF水平都升高。但在PBMC样品中并不是所有细胞都显示有ICAM-1的表而表达，大多数细胞ICAM-1的染色呈阴性。但PBMC的DAF表达是阳性的，可见与交联物对照相比，在双重染色的样品中PBMC的群体向上迁移。
ICAM-1和DAF存血液癌症细胞系中的表达
为了进一步研究血液癌症对微小RNA病毒感染和溶解的潜在易感性，在代表性细胞系的图上证明有入胞受体ICAM-1和DAF的表达。在用抗-ICAM-1和抗-DAF抗体双重染色后，使用流式细胞检测来测定CVA21入胞受体ICAM-1和DAF在B细胞淋巴瘤细胞系SCOT、B幼淋巴细胞白血病细胞系JVM13、急性早幼粒白血病(APML)细胞系NB4和HL-60、单核细胞白血病细胞系U937和多发性骨髓瘤细胞系H929表面上的相对水平。B细胞淋巴瘤细胞系SCOTT、B幼淋巴细胞白血病细胞系JVM 13和MM细胞系H929证明都表达ICAM-1和DAF，与交联物相比，在每个点阵图(图11A和B)的右上象限中染色细胞非常明显。单核细胞白血病细胞系U937虽然程度小一些，但也证明ICAM-1和DAF表达的水平的升高。而在急性早幼粒细胞白血病(APML)细胞系NB4和HL-60中，大多数细胞DAF表达是染色阳性的，ICAM-1是染色阴性的。
MM细胞对CVA21的溶解性感染是易感的
为了检测是否表达ICAM-1和DAF的多发性骨髓瘤细胞对CVA21的溶瘤作用易感，细胞用CVA21(MOI～5 TCID50/细胞)在37℃下感染48h。每种多发性骨髓瘤细胞系在24h时都显示有CVA21感染的初步征象。在感染后24-48h之间，在U266、RPMI-8226和NCI-H929细胞系中观察到最大的细胞病变效应，由细胞聚集成团并摄取台盼蓝可见(图2)。与三种多发性骨髓瘤细胞系相比，人外周血单核细胞的细胞病变效应最小。
CVA21的感染抑制MM细胞的生长
使用MTT细胞活力试验，更详细地检验CVA21对多种多发性骨髓瘤细胞系有差别的杀伤和生长抑制作用。接种的U266、RPMI-8226和NCI-H929细胞与浓度不断增加的CVA21接触48h。通过MTT生存率作为CVA21不断增加的剂量的函数，测定CVA21的溶瘤作用。图3表明在接触CVA21后生长抑制曲线和剂量依赖性曲线。发现测定的每种MM细胞系很敏感，RPMI-8226和U266细胞系对低浓度CVA21显示有明显的生长抑制反应。正常PBMC在与高浓度病毒接触后生长被抑制，但即使在20MOI时，有80％PBMC存活，相比MM细胞系，每种的生存率都低于10％。
MM细胞支持子代CVA21的繁殖
为了测定CVA21感染的MM细胞产生感染性子代以进一步发挥溶瘤作用的能力，测定CVA21感染U266、RPMI-8226、NCI-H929和PBMC后的病毒产量。感染后24和48h时，三种骨髓瘤细胞系的病毒产量显示与0h时间点相比病毒滴度大幅度增加(图4)。但PBMC显示CVA21产量没有增加，提供了CVA21不能自由地在正常人PBMC内复制的证据。CVA21在PBMC中增殖延续至6天而没有任何CVA21复制或病毒产量的增加(数据未显示)。
当在相似但不相同的条件下测定时，单核细胞白血病细胞系U937和急性早幼粒细胞白血病(APML)细胞系HL-60在感染后24或48h时没有显示CVA21产量增加，表明CVA21不能在U937或HL-60内自由地复制(图13)。
CVA21存MM细胞中具有快速的生长速率
恶性细胞的病毒治疗的一个优势是，产生感染性子代病毒的能力，可进一步靶向在此处或甚至较远部位的周围恶性细胞。在三种多发性骨髓瘤细胞系同步感染后，在指定的时间点收集全部细胞和上清液(图5)。发现CVA21在癌细胞系内的复制非常迅速，用CVA21病毒接种后4个小时就观察到被感染的多发性骨髓瘤细胞中病毒滴度增加。CVA21在U266、RPMI-8226和NCI-H929细胞中的一步生长曲线分析，证明感染后8和12h之间病毒有效地复制至最大的滴度。
在RPMI-8226和NCI-H929细胞中CVA21诱发的凋亡
为了确定CVA21是否在感染过程中诱发多发性骨髓瘤细胞发生凋亡，CVA21以大约为10 TCID50/细胞的MOI与RPMI-8226、NCI-H929或U266细胞一起培养，并在感染后24h通过DNA断裂试验测定凋亡。CVA21在感染的RPMI-8226和NCI-H929细胞(分别为泳道2和4)中诱发凋亡特征性的DNA梯型(图6)，但感染的U266细胞中没有(泳道6)。在用CVA21处理的U266细胞中没有观察到DNA片断化，表明在此细胞系中的CVA21溶瘤作用没有诱发凋亡。结果表明CVA21能在RPMI-8226和NCI-H929细胞中诱发凋亡，但在U266骨髓瘤细胞溶解过程中可能活化了抗凋亡信号通路。泳道1、3和5包含了从假性感染的对照细胞中提取的DNA。
含有恶性和非恶性细胞的骨髓瘤共培养物的先体外后体内净化
通过将多发性骨髓瘤细胞与正常人外周血单核细胞混合，产生大约10％的肿瘤负荷(tumor burden)，并用CVA21净化3天，从而研究CVA21对多发性骨髓瘤细胞而不是正常细胞的溶瘤作用的特异性。通过用抗-CD138-FITC和PI染色，可以区分正常PBMC和多发性骨髓瘤细胞的有活力和没有活力的群体。如图7中所见(“没有病毒”)，在用CVA21感染之前，在流式细胞仪点阵图的右下象限中可见到有活力的RPMI-8226或U266细胞(CD138+/PI-)。在用MOI为1 TCID50/细胞的CVA21净化RPMI-8226或U266共培养物3天后，有活力的骨髓瘤细胞分别剩余了不足0.26％和0.51％。CVA21能够从共培养物中净化大约98％的RPMI-8226和大约95.7％的U266细胞。在左下象限中显示有活力的淋巴细胞群，CD138和PI染色阴性。在用病毒感染后，即使与CVA21接触3天后这些群体仍然保持相对地没有变化。
从临床骨髓样品净化多发性骨髓瘤细胞
在证明体外对几种多发性骨髓瘤细胞系有有效的溶瘤作用后，确认从两种原发的多发性骨髓瘤骨髓样品中癌细胞的先体外后体内净化。将来自两名进行了常规诊断的患者的骨髓抽吸物，加工成为单细胞悬液。细胞首先用抗-CD138和抗-ICAM-1抗体染色以测定多发性骨髓瘤细胞上ICAM-1的表面表达。发现两个临床样品中骨髓瘤状态(CD138+)与ICAM-1表达之间有明显的相关性，其中一个临床样品的结果描绘在图8A中。在临床样品#001中，全部细胞中大约37％是多发性骨髓瘤浆细胞，且表达CD138标记物和ICAM-1。在第二个患者中也发现相似的骨髓瘤细胞比例，其大约41％的细胞用CD138和ICAM-1染色(数据未显示)。
对患者临床样品的MTT测定的结果证实，在与不同浓度病毒培养48h后，CVA21的治疗以剂量依赖的方式有效地抑制骨髓瘤细胞生长。在用不同浓度的CVA21激发原代肿瘤细胞(样品#001)后，随着病毒输入量的增加，增殖细胞的百分比稳定地下降(图8B)。因为原发肿瘤样品也含有一部分非恶性细胞，因此仍然需要确定CVA21特异性感染MM细胞的特异性。
为了检测CVA21是否选择性地介导多发性骨髓瘤细胞而不是正常细胞的特异性溶解，原发肿瘤样品用不同浓度的CVA21感染48h，然后用抗-CD138抗体和碘化丙啶染色进行分析。使用流式细胞检测，测定CD138+和CD138-细胞的活力(图9A)，在48h时，三种浓度的CVA感染观察到细胞病变效应(图9B)。来自临床样品#001的肿瘤细胞与0、2.75、5.5和11 TCID50/细胞浓度的CVA21培养48h，显示随着病毒输入量的增加，通过流式细胞仪计数，活骨髓瘤细胞(CD138+/PI-)的百分比下降(图9A)。用11 TCID50/细胞的CVA21感染的原代肿瘤细胞，检测到恶性骨髓瘤细胞的百分比下降了74％。在此原发肿瘤样品中，无活力的骨髓瘤细胞(CD138+/PI+)的数目稳定地增加，与有活力的骨髓瘤细胞(CD138+/PI-)的下降相对应。
这些结果在其他临床样品中也有所反映，在与CVA21培养更长时间后，有活力的肿瘤细胞最大达到了90％的减少(数据未显示)。即使没有病毒的处理，两个临床样品都有低水平的无活力细胞存在，更重要的是，检测的临床样品在病毒处理后，无活力的CD138-细胞的水平基本上没有增加。要考虑的另一个因素是这些细胞先体外后体内培养48h也可引起低水平的细胞死亡，如在无病毒对照中所观察到的。临床样品#001在用不同浓度的CVA21处理后，剩余的有活力的多发性骨髓瘤细胞的百分比，从流式细胞检测数据中概括出来，显示在图9C中。
为了进一步评价CVA21作为先体外后体内的净化剂的临床应用性，研究其他的BM抽吸物。5名MM患者和2名MGUS患者的BM抽吸物用大约3和10 MOI浓度的CVA21感染的结果，显示在图10B(i)中。总共19个不同病情(表1)的临床样品的综合结果，显示在图10B(ii)中。所有检测的临床样品中的CD138+细胞群都表达ICAM-1；显示了来自患者#006的代表性点阵图(图10A)。在用病毒单独处理后，在所有7个检测的临床样品中，CVA21都具有有效的溶瘤净化作用，其表现为：有活力的CD138+细胞实质上减少，在样品#008中MM细胞消除达到最大比例为97.2％(图10B(i)和10E)。有活力的CD138-正常细胞的水平在病毒处理后基本上没有下降(图10D)。更重要的是，在此馏分中的祖细胞仍然保留了支持造血作用的能力。图10C表明在用CVA21处理原发样品后，能够培养有活力的远祖干细胞；显示来自这三个患者样品的CFU-GM集落的平均数目。与假性感染对照样品相比，在病毒处理组中CFU-GM集落的数目低57-70％。
血液癌症细胞系对CVA13、CVA15和CVA18的易感性
使用ICAM-1感染和破坏细胞的其他A组柯萨奇病毒(如CVA13、CVA15和CVA18)也能够抑制多发性骨髓瘤细胞的生长。使用RPMI-8226细胞作为代表性的多发性骨髓瘤细胞系，CVA13、CVA15和CVA18处理这些细胞证明与0.1至100 TCID50/ml浓度的CVA21具有相似的抗肿瘤作用(图12A)。当在非多发性骨髓瘤癌细胞系U937和HL-60上检测时，CVA13、CVA15、CVA18和CVA21的作用不太一致(图12B和C)。尽管每种病毒对U937和HL-60细胞都观察到一些生长抑制作用，但对感染这些细胞后CVA21生长的产量的进一步研究表明，癌细胞系U937和HL-60不能支持病毒的复制，因此不能作为病毒治疗的理想候选物(图13)。
讨论
柯萨奇病毒A21是一种新的溶瘤剂，其开始显示是一种针对恶性黑色素瘤的有效抗肿瘤药物。CVA21是一种常见的与轻微的上呼吸道感染有关的微小RNA病毒，尚未发现能引起人类严重的疾病(RueckertRR.Picornaviridae：The Viruses and Their Replication(微小RNA病毒科：病毒及其复制)。In：Fields BN，Knipe DM，Howley PM eds.FieldsVIrology.Vol 1.Philadelphia：Lippincott-Raven；1996：609-645)。体外对几种MM细胞系的检测结果证明，CVA21是一种针对多发性骨髓瘤的有效溶瘤剂。通过CVA21在MM细胞系上所观察到的细胞病变效应(图2)，和经MTT测定证实的CVA21对MM细胞的明显生长抑制作用/细胞毒性(图3)支持该结论。
在此报道的数据也证明了其他微小RNA病毒(实例为CVA13、CVA15和CVA18)是针对MM细胞的有效溶瘤剂(图12)。
正如在此所证明的单核细胞白血病细胞系U937对CVA13、CVA15、CVA18和CVA21的反应性，这种作用不限于MM细胞，尽管其剂量依赖性明显高于MM细胞(图12B)。
使用流式细胞检测，证实多发性骨髓瘤细胞系U266、RPMI-8226和NCI-H929表达高水平的CVA21病毒入胞受体ICAM-1和DAF(图1)，这两种分子是CVA21的溶瘤选择性和功效的决定因素。
在此也证明了从其他血液癌症建立的细胞系中ICAM-1和DAF的表达，强调了使用微小RNA病毒治疗血液癌症的广泛潜在用途。如图11中所示，B细胞淋巴瘤细胞系SCOTT和B幼淋巴细胞白血病细胞系JVM13都证明有ICAM-1和DAF的表达。单核细胞白血病细胞系U937也证明尽管表达程度低一些，但ICAM-1和DAF的水平是升高的。与急性早幼粒细胞白血病(APML)细胞系HL-60对CVA21明显缺少可检测到的易感性相符合，大多数HL-60细胞的ICAM-1染色是阴性的。
B细胞淋巴瘤细胞系SCOTT和B幼淋巴细胞白血病细胞系JVM13在本文使用的培养条件下生长非常缓慢。因此，不可能像证明各种其他血液癌症细胞系那样直接证明CVA对任何这些细胞系的溶瘤性感染作用。但考虑到已证明在这些细胞系的每一种上都有ICAM-1和DAF的表达，本申请人相信B细胞淋巴瘤和B幼淋巴细胞白血病的每一种都对本发明的方法是易感的。
在文献中已经详细描述了MM细胞有高水平的ICAM-1表达，从而提出一些提议将抗-ICAM-1 mAb治疗作为MM的潜在治疗方法(van de Stolpe A，van der Saag PT.Journal of Molecular Medicine.1996；74：13-33；Huang YW等人，Cancer Res.1995；55：610-616)。在MM细胞中这种高水平ICAM-1表达的原因可解释为在MM细胞中转录因子NF-κB的构成性活化(Hideshima T等人，J Biol Chem.2002；277：16639-16647)。
NF-κB是与MM发病机理和药物耐受性有关的细胞存活因子，它是MM细胞中粘附分子表达的重要调节剂(Chauhan D等人，Blood.1996；87：1104-1112)。ICAM-1基因的5’启动子区含有几个κB增强子元件，并在ICAM-1表达的调节中代表最重要的转录调控元件之一。NF-κB在MM细胞中的活化和其引起的粘附分子(如ICAM-1)的上调，显示增加了MM细胞与骨髓基质细胞(BMSC)的结合(HideshimaT等人，Oncogene.2001；20：4519-4527)。已经证实MM细胞与BMSC的粘附诱发由BMSC对NF-κB依赖性IL-6(白介素-6)转录上调，BMSC在MM中是一种生长和抗凋亡因子(Chauhan D等人，Blood.1997；89：227-234)。
MTT/生长抑制试验表明，在初始的20 TCID50/细胞的CVA21输入量下观察到最高水平的细胞毒性/生长抑制作用(图3)。我们的结果表明，CVA21对所有检测的三种多发性骨髓瘤细胞系都具有有效的细胞毒性和杀细胞效应，对正常的人外周血单核细胞的细胞毒性较小(图3)，证实了在CVA21感染后观察到的细胞病变效应(图2)。
优选的溶瘤病毒的一种理想特性是其产生子代病毒的能力，这可播散至在此处或较远部位的周围的未感染肿瘤细胞，以引起进一步的溶瘤作用。结果显示CVA21能够有效地在每种多发性骨髓瘤细胞系中复制，支持其作为能复制的溶瘤剂的应用。在不同的骨髓瘤细胞系中，CVA21的复制使初始输入剂量扩增100至1000倍，而在相同条件下用CVA21感染的正常PBMC没有增殖性病毒(图4)。
优选的病毒溶瘤剂的另一个重要特性是复制效率的最佳水平。从一步病毒生长曲线分析中发现，CVA21在MM细胞内有效和迅速地复制，在感染后8和12h之间达到产生病毒的峰值水平(图5)。这种相对迅速的复制周期可促进子代病毒播散和控制MM疾病进展的能力。CVA21抑制MM细胞生长的复制能力和细胞毒性，是支持采用CVA21病毒治疗MM的进一步证据，如在体内治疗MM、和先体外后体内选择性地净化MM。
在此报告的结果证明了子代病毒的产生，同时优选为了允许播散至在此处或较远部位的周围的未感染肿瘤细胞以引起进一步的溶瘤作用，对于通过微小RNA病毒溶瘤性感染引起的血液癌症细胞死亡不是必需的。在此证明对CVA易感的单核细胞白血病细胞系U937(图12)还没有证明可观察到的支持CVA21生长的能力(图13)。多次给予微小RNA病毒可能对这些癌症的治疗有特别的益处。
虽然CVA21引起MM细胞死亡的确切机制仍然需要确定；但该过程高度依赖于细胞转化事件、以及在不同临床样品和MM细胞系中存在的基因突变。CVA21以及其他微小RNA病毒被认为通过中止宿主细胞蛋白合成、抑制细胞糖蛋白的转运、诱发凋亡和转录因子的蛋白水解消化的组合来介导细胞的死亡(Rueckert RR.Picornaviridae：TheViruses and Their Replication(微小RNA病毒科：病毒及其复制).In：Fields BN，Knipe DM，Howley PM，eds.Fields Virology.Vol.1.Philadelphia：Lippincott-Raven；1996：609-645)。根据在CVA21感染的RPMI-8226和NCI-H929细胞上进行的DNA断裂试验，CVA21能在这两种细胞系中诱发凋亡，但不能在U266细胞中诱发凋亡(图6)。U266细胞的生存和生长依赖于自分泌或旁分泌的IL-6刺激。联系到细胞因子介导的转录因子(如信号传导子和转录激活子(STAT)-3)的活化，IL-6信号通路可对CVA感染后U266细胞的抗凋亡反应有一些影响。
最近的一项研究(Bharti AC等人，Blood.2004；103：3175-3184)证实，在U266细胞的细胞核中显示有构成性活化的STAT3，而RPMI-8226细胞中构成性活化的STAT3是阴性的。但NF-κB的化学抑制剂已经显示能诱发U266和RPMI-8226细胞系发生凋亡，不管STAT3是否活化，表明STAT3似乎在由化学NF-κB抑制剂触发的凋亡中意义不大。但我们的结果显示，STAT3信号通路的活化事实上在CVA21感染的骨髓瘤细胞的溶瘤作用中具有抗凋亡的作用。
NF-κB家族转录因子的作用的确很复杂，有证据表明NF-κB可在凋亡前和抗凋亡信号传递中有一定的作用。治疗MM的新药物，如沙立度胺(Keifer JA等人，J Biol.Chem.2001；276：22382-22387)、蛋白酶体抑制剂PS-341(Hideshima T等人，Cancer Res.2001；61：3071-3076)、和三氧化二砷As2O3(Kapahi P等人，J.Biol.Chem.2000；275：36062-36066)已经显示能抑制NF-κB的活化，并帮助克服以前在临床前和早期临床试验中常见的MM的耐药性。
在本研究中从临床样品中收集的数据表明，观察到的CVA21和其他微小RNA病毒的溶瘤能力不限于多发性骨髓瘤细胞系，在其他血液癌症细胞系和先体外后体内感染的原发肿瘤样品中也有效。临床样品在骨髓中存在显著水平的CD138浆细胞，通过流式细胞仪检测时所有都表达ICAM-1(图8A)。在用增加剂量的CVA21感染时，在所有临床样品中都观察到生长基本上停止和肿瘤细胞的净化，在一个样品(#008)中最大达到了98％的抑制。为了更详细评价CVA21对正常和恶性细胞的作用，细胞用抗-CD138和PI染色，然后使用流式细胞仪进行分析。在17个可测定的临床样品的14个中，CVA21有效地将恶性细胞的百分比降低＞80％(图10E)。其他临床样品的分析(达到总共19个)证实这些观察结果的普遍性(图10)。病毒输入量的增加和CVA21感染的扩散可提高癌细胞净化的水平。在本研究中使用的临床样品证实CVA21对MM细胞的净化是有益的。
从患者样品中基本上清除骨髓瘤肿瘤细胞、以及远祖干细胞的持久活力，清楚地证明CVA21能特异地杀死骨髓瘤细胞，而对正常远祖细胞的影响相对最小。另外，CVA21的治疗对以前未治疗的以及难以预先治疗、对化学药物耐药的肿瘤细胞都有效，表明CVA21可能是MM的一种有用的治疗选择。有意义的还有CVA21在从诊断无症状的前期MM、MGUS的患者中清除癌前浆细胞的作用。这些患者中有30％持续发展为MM，但目前不可能预测每个人的预后，因此这种良性的恶液质通常不予治疗。在这部分患者中CVA21用于预防的潜在用途，说明病毒治疗在预防性治疗MM中的新作用。
CVA21除了对恶性细胞有直接细胞毒作用以外，在MM的治疗中可能还有其他作用。尽管大多数MM细胞开始对现有的药物治疗敏感，但在大多数病例中耐药性是MM的共同特征。CVA21作为化学药物致敏剂与例如长春新碱和阿霉素之类的药物的联合应用，可获得比药物单独使用更好的结果，这是研究CVA21治疗MM的进一步原因。
目前，治疗多发性骨髓瘤的途径有限，需要新的治疗方法。虽然多发性骨髓瘤患者的免疫缺陷状态是病毒治疗患此恶性肿瘤的患者真正要关心的问题，但在这些患者中，由于缺少抗病毒免疫，CVA21的病毒治疗获得的结果将是最成功的。另外，MM是以缓慢增殖的恶性浆细胞的积累为特征的疾病，因此提供了通过CVA21的溶瘤作用有效控制肿瘤负荷的理想机会。病毒治疗被预测在缓慢生长的恶性肿瘤中是最有效的，因为如果子代病毒的播散不起作用，迅速生长的肿瘤可逃避病毒的溶瘤作用。
CVA21应该对患者有不良的后果，通过抗病毒化合物如pleconaril(Rogers JM等人，Adv Exp Med Biol.1999；458：69-76)、或免疫血清球蛋白(Rotbart HA.Pediatr Infect Dis J.1999；18：632-633)可控制CVA21的感染。另一种选择包括使用CVA21先体外后体内净化MM和其他血液肿瘤细胞。最近，使用溶瘤性呼肠孤病毒作为自体干细胞移植的新净化策略在血液恶性肿瘤中被评估，但从aphaeresis产品的混合物中先体外后体内净化富集的多发性骨髓瘤细胞是不完全的(ThirukkumaranCM等人，Blood.2003；102：377-387)。CVA21是一种独特的溶瘤性病毒，对多发性骨髓瘤细胞的细胞毒性有选择性，也可具有作为先体外后体内净化剂的提高的潜力。
总结
我们的数据证明CVA21和其他微小RNA病毒(如CVA13、CVA15和CVA18)是对多发性骨髓瘤细胞系和其他血液癌细胞系的有效体外溶瘤剂，在体内MM和血液癌细胞的直接溶瘤作用和外周血干细胞的自体移植物的先体外后体内净化中也有潜在的应用性。
本发明已经如上进行了详细的描述，本领域专业技术人员应该理解，如具体实施方式中所示，在不背离广义描述的本发明的精神或范围的前提下，对本发明可进行各种变化和/或修改，包括各种形式上或细节上的省略、替换和/或改变。因此，从各种方面考虑，本发明的实施方式都要被认为是说明性的而非限制性的。
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