中华蜜蜂MRJP1表达产物酶解制备抗高血压多肽的方法.pdf

本发明公开的中华蜜蜂MRJP1表达产物酶解制备抗高血压多肽的方法，利用Bac－to－Bac/BmNPV杆状病毒表达系统构建得到重组Bacmid－MRJP1并转染家蚕细胞，获得重组病毒后注射家蚕幼虫，感染96h后收集血淋巴，经亲和柱纯化后获得了高纯度重组MRJP1，将纯化后中华蜜蜂MRJP1真核表达产物经胰蛋白酶酶切，超滤膜离心过滤，用CaCl2去除磷酸盐，得到抗高血压多肽混合物。本发明方法制得的多肽具有降血压功能。

权利要求书
1.  中华蜜蜂MRJP1表达产物酶解制备抗高血压多肽的方法，其特征步骤如下：
1)MRJP1基因的克隆
a)以中华蜜蜂8日龄工蜂头部MRJP1 cDNA为模板，采用Primer Primier 5.0软件，设计上游引物F-Prime序列为5’-CCATGGACATGACAAGGTGGTTGTT-3’，下游引物R-Prime序列为3’TAAAGTTATGTAGACATTCGCCGGCG-5’，分别在上游引物F-Prime序列与下游引物R-Prime序列中引入酶切位点Nco I和Not I；
b)PCR反应体系共50μl，组成如下：5μl 10×PCR Buffer、6μl 25mM MgCl2、1μl 10mM dNTP Mix、2μl 10μM F-Prime、2μl 10μM R-Prime、5μl中华蜜蜂MRJP1cDNA模板、0.75μl 5U/l Taq DNA Polymerase，加ddH2O至终体积为50μl；
PCR反应条件如下：PCR反应体系先在94℃预热3min，然后94℃变性1min、54.6℃退火1min、72℃延伸1min、35个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物电泳分析后经UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收，克隆至TaKaRa公司的pMD18-T载体，经PCR和双酶切鉴定，并测定其序列；
2)重组Bacmid病毒的构建
a)将鉴定正确的pMD18-T-MRJP1质粒经Nco I和Not I酶切后与经相同限制性内切酶酶切的pFastBacHTb表达载体在16℃的条件下连接过夜，将连接产物转化入TG1感受态细胞，得到转移载体pFastBacHTb-MRJP1，经PCR和双酶切鉴定正确后转化入DH10Bac感受态细胞；
b)将上述DH10Bac感受态细胞涂布于含100μg/ml X-gal、40μg/ml IPTG、50μg/ml卡那霉素、10μg/ml四环素及7μg/ml庆大霉素的LB平板，挑取白色菌落，以M13通用引物进行PCR检测，获得含有中华蜜蜂MRJP1重组Bacmid病毒；
c)PCR检测反应条件如下：先94℃预热3min，然后94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸4min、35个循环，最后72℃延伸7min；
3)家蚕细胞的培养与转染
a)家蚕细胞BmN用含10％胎牛血清的HyQ SFX-INSECT昆虫细胞培养基在27℃条件下恒温培养；然后接种于50ml培养瓶中，培养至2×106/瓶，离心去除血清，备用；
b)将194μl无血清培养基与6μl FUGENE 6转染剂混匀，室温静置5min，再加入4μg重组Bacmid DNA，混匀，室温静置45min；将该混合液逐滴加入细胞培养瓶中，边加边摇，27℃温育7h后，弃共转染液，加入6ml含血清的完全培养基继续培养3-5天，取上清液，10000rpm，离心2min，上清液于4℃避光保存备用；将所获病毒上清液继续感染细胞，扩繁病毒，收集第三轮感染的病毒上清液，用于注射家蚕幼虫；
4)中华蜜蜂MRJP1在家蚕幼虫中的表达及纯化
将重组病毒及对照物ddH2O通过皮下注射导入家蚕五龄第一天幼虫，5μl/头，感染96h后收集其血淋巴，经超声波破碎，8000rpm，5min，4℃离心后，取上清液，用Ni-NTA亲和柱纯化，获得中华蜜蜂MRJP1真核表达产物。
5)中华蜜蜂MRJP1真核表达产物酶解制备抗高血压多肽
将纯化后中华蜜蜂MRJP1真核表达产物与胰蛋白酶于37℃共同孵育6h，100℃煮沸5min，使胰蛋白酶失活，经超滤膜离心过滤，得到分子量在10kDa以下的小肽混合物，用CaCl2去除磷酸盐，得到抗高血压多肽混合物。

说明书中华蜜蜂MRJP1表达产物酶解制备抗高血压多肽的方法
技术领域
本发明涉及中华蜜蜂MRJP1表达产物酶解制备抗高血压多肽的方法。
背景技术
血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽最早是Ferreira(1965)从美洲茅头腹蛇(Bothrops jararaca)蛇毒中发现的，Oshima等又从明胶的细菌胶原酶消化液中寻找到ACE抑制肽，而Cushman等则基于ACE键合部位假说模型开发出第一代ACEI抗高血压药Captopril，在临床治疗高血压中获得巨大成功。随后又开发出第二、三代化学合成的ACE抑制剂，如Lisinopril、Enalapril、Forsinopril等，这些降压药多数是短链肽的类似物。合成ACE抑制肽具有药效快而强的特点，但易损害肾功能，有一定副作用。因此，从天然食物蛋白中分离制备降血压多肽的研究得到国内外学者的高度重视，采用基因工程技术生产包含降血压多肽片段的蛋白，再经酶解制备降血压多肽是一条十分诱人的途径。
蜂王浆具有多种医疗保健和生物学功能。Takeshi(2001)研究报道王浆中的蛋白成分有强的抗氧化能力和清除活性氧的能力；Iwao(2003)报道王浆主蛋白之一——MRJP3在体内和体外具有潜在的调节免疫功能；Kamakura(2001)报道鲜王浆对小鼠有抗疲劳作用。Toshiro(2002)报道王浆蛋白胃肠酶酶解产物生物活性多肽及其在SHR中的抗高血压作用。Katsu(2004)报道经蛋白酶处理的王浆(ProRJ)和从中获得的多肽具有抑制血管紧张肽I-转化酶活性，给自发性高血压大鼠(SHR)口服ProRJ或多肽有抗高血压作用。蜜蜂MRJPs的基因克隆及其潜在功能研究越来越得到国内外学者的关注，已从西方蜜蜂中克隆出MRJP1、MRJP2、MRJP3s、MRJP4、MRJP5s、MRJP6、MRJP7、MRJP8等多个基因的cDNAs。
随着西方蜜蜂MRJPs研究的深入，蜂王浆主蛋白(MRJPs)的医疗保健功能被越来越多的试验结果所证实，最新研究认为王浆主蛋白因具有多种生物医药保健功能而重新命名为王浆活性蛋白(Apalbumins)，且对西方蜜蜂王浆活性蛋白1(Apalbumin1，原为MRJP1)的全长cDNA序列、4个亚克隆片段在大肠杆菌进行了表达，这5个表达产物的免疫调节功能研究结果表明，全长基因的表达产物和四个亚克隆表达产物与空白细胞对照组相比均具有显著的免疫调节效果，证实了王浆活性蛋白1具有免疫调节功能，且发现5’-端的第一个亚克隆表达产物的免疫调节功能比全长基因的表达产物更强，这是一个十分令人振奋的研究结果，为王浆活性蛋白基因表达的生物医药开发和产业化研究开拓新的研究领域和方向。
虽然东方、西方蜜蜂MRJPs家族的相当多基因已被克隆，部分基因在大肠杆菌中被表达，但对MRJPs各成员的确切的生物学功能尚未诠释。MRJP1、2、3、5是MRJPs基因家族的主要成员，已有研究表明MRJP1可能具有免疫调节、促进肝细胞生长和抗菌功能，王浆蛋白的酶解产物会产生丰富的抗高血压多肽。
利用先进的现代生物技术改造传统的食品工业和制造业已成为新的发展趋势。从新的生物资源中发现、开发对人类健康和疾病防治有重要作用的新基因，采用现代生物技术手段，把这些重要基因克隆、转移到其他经济生物中进行表达，从而达到利用这些新的基因资源为人类造福的目的。蜂王浆具有重要的医疗保健功能，其王浆蛋白被证明具有酶解产生多种降血压功能肽的作用，通过构建能酶解产生抗高血压多肽的高效表达基因，进而通过实现利用基因工程和发酵工程制备降血压功能肽，为高血压疾病的预防和治疗提供新的优质的医药资源和保健食品源；另一方面也可以把这些功能基因转移到食品工业微生物内，获得具有降血压功能的啤酒酵母或乳酸菌，在高科技食品工业上具有广阔的应用前景，将产生巨大的经济效益和社会效益。但至今还未见利用基因工程方法制备重组王浆蛋白酶解产生抗高血压的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种中华蜜蜂MRJP1表达产物酶解制备抗高血压多肽的方法。
本发明的中华蜜蜂MRJP1表达产物酶解制备抗高血压多肽的方法，步骤如下：
1)MRJP1基因的克隆
a)以中华蜜蜂8日龄工蜂头部MRJP1 cDNA为模板，采用Primer Primier 5.0软件，设计上游引物F-Prime序列为5’-CCATGGACATGACAAGGTGGTTGTT-3’，下游引物R-Prime序列为3’-TAAAGTTATGTAGACATTCGCCGGCG-5’，分别在上游引物F-Prime序列与下游引物R-Prime序列中引入酶切位点Nco I和NotI；
b)PCR反应体系共50μl，组成如下：5μl 10×PCR Buffer、6μl 25mM MgCl2、1μl 10mM dNTP Mix、2μl 10μM F-Prime、2μl 10μM R-Prime、5μl中华蜜蜂MRJP1cDNA模板、0.75μl 5U/μl Taq DNA Polymerase，加ddH2O至终体积为50μμl；
PCR反应条件如下：PCR反应体系先在94℃预热3min，然后94℃变性1min、54.6℃退火1min、72℃延伸1min、35个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物电泳分析后经UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收，克隆至TaKaRa公司的pMD18-T载体，经PCR和双酶切鉴定，并测定其序列；
2)重组Bacmid病毒的构建
a)将鉴定正确的pMD18-T-MRJP1质粒经Nco I和Not I酶切后与经相同限制性内切酶酶切的pFastBacHTb表达载体在16℃的条件下连接过夜，将连接产物转化入TG1感受态细胞，得到转移载体pFastBacHTb-MRJP1，经PCR和双酶切鉴定正确后转化入DH10Bac感受态细胞；
b)将上述DH10Bac感受态细胞涂布于含100μg/ml X-gal、40μg/ml IPTG、50μg/ml卡那霉素、10μg/ml四环素及7μg/ml庆大霉素的LB平板，挑取白色菌落，以M13通用引物进行PCR检测，获得含有中华蜜蜂MRJP1重组Bacmid病毒；
c)PCR检测反应条件如下：先94℃预热3min，然后94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸4min、35个循环，最后72℃延伸7min；
3)家蚕细胞的培养与转染
a)家蚕细胞BmN用含10％胎牛血清的HyQ SFX-INSECT昆虫细胞培养基在27℃条件下恒温培养；然后接种于50ml培养瓶中，培养至2×106/瓶，离心去除血清，备用；
b)将194μl无血清培养基与6μl FUGENE 6转染剂混匀，室温静置5min，再加入4μg重组Bacmid DNA，混匀，室温静置45min；将该混合液逐滴加入细胞培养瓶中，边加边摇，27℃温育7h后，弃共转染液，加入6ml含血清的完全培养基继续培养3-5天，取上清液，10000rpm，离心2min，上清液于4℃避光保存备用；将所获病毒上清液继续感染细胞，扩繁病毒，收集第三轮感染的病毒上清液，用于注射家蚕幼虫；
4)中华蜜蜂MRJP1在家蚕幼虫中的表达及纯化
将重组病毒及对照物ddH2O通过皮下注射导入家蚕五龄第一天幼虫，5μl/头，感染96h后收集其血淋巴，经超声波破碎，8000rpm，5min，4℃离心后，取上清液，用Ni-NTA亲和柱纯化，获得中华蜜蜂MRJP1真核表达产物。
5)中华蜜蜂MRJP1真核表达产物酶解制备抗高血压多肽
将纯化后中华蜜蜂MRJP1真核表达产物与胰蛋白酶于37℃共同孵育6h，100℃煮沸5min，使胰蛋白酶失活，经超滤膜离心过滤，得到分子量在10kDa以下的小肽混合物，用CaCl2去除磷酸盐，得到抗高血压多肽混合物。
本发明与现有技术相比，具有的有益的效果是：
a)采用中华蜜蜂MRJP1真核表达产物酶解制备的多肽具有抗高血压功能。
b)中华蜜蜂MRJP1在家蚕或酵母内表达，直接食用全蚕粉或酵母，在起到降血压作用的同时，还具有服用方便和保健功能。
附图说明
图1是中华蜜蜂MRJP1基因PCR扩增结果，M：DNA分子量标准；箭头所指为目的片段；
图2是重组Bacmid和未重组Bacmid的PCR检测结果，M为DNA分子量标准，1表示重组Bacmid的PCR产物；2表示未重组Bacmid的PCR产物；
图3表示受重组病毒Bacmid-MRJP1转染后家蚕细胞BmN的表型变化，其中图A为转染Bacmid-MRJP1 120h后家蚕细胞，直径增大，裂解并聚集成团；图B为对照的正常家蚕细胞；
图4是中华蜜蜂MRJP1表达产物的SDS-PAGE分析结果和利用His单抗进行的Western blotting印迹分析，图中M为蛋白质分子量标准：66.4kDa代表牛血清蛋白，44.3kDa代表卵清蛋白，29.0kDa代表碳酸苷酶，20.1kDa代表胰蛋白酶抑制剂，14.3kDa代表溶菌酶；泳道1为感染家蚕血淋巴上清液；泳道2为对照；泳道3为王浆水溶物；泳道4为纯化的中华蜜蜂MRJP1，泳道5为感染家蚕血淋巴上清液纯化产物的Western blotting分析；
图5是中华蜜蜂MRJP1表达产物酶切后获得的抗高血压多肽质谱检测结果。
具体实施方式
以下结合实施例进一步说明本发明。
实施例1
促进细胞生长的中华蜜蜂MRJP1真核表达产物的制备方法，其特征是步骤如下：
1)MRJP1基因的克隆
a)以中华蜜蜂8日龄工蜂头部MRJP1 cDNA为模板，采用Primer Primier 5.0软件，设计上游引物F-Prime序列为5’-CCATGGACATGACAAGGTGGTTGTT-3’，下游引物R-Prime序列为3’TAAAGTTATGTAGACATTCGCCGGCG-5’，分别在上游引物F-Prime序列与下游引物R-Prime序列中引入酶切位点Nco I和Not I，(见下划线部分)；
b)PCR反应体系共50μl，组成如下：5μl 10×PCR Buffer、6μl 25mM MgCl2、1μl 10mM dNTP Mix、2μl 10μM F-Prime、2μl 10μM R-Prime、5μl中华蜜蜂MRJP1cDNA模板、0.75μl 5U/μl Taq DNA Polymerase，加ddH2O至终体积为50μl；
PCR反应条件如下：PCR反应体系先在94℃预热3min，然后94℃变性1min、54.6℃退火1min、72℃延伸1min、35个循环，最后72℃延伸10min，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，获得大小为1300bp左右的特异性扩增片段，见图1，与预期的目的片段大小相符。将目的片段割胶，经UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收，割胶回收方法详见上海生工说明书。然后将回收获得的目的基因克隆至TaKaRa公司的pMD18-T载体，经PCR和双酶切鉴定，并送上海生工测序。
2)重组Bacmid病毒的构建
a)将鉴定正确的pMD18-T-MRJP1质粒经Nco I和Not I酶切后与经相同限制性内切酶酶切的pFastBacHTb表达载体在16℃的条件下连接过夜，将连接产物转化入TG1感受态细胞，得到转移载体pFastBacHTb-MRJP1，经PCR和双酶切鉴定正确后转化入DH10Bac感受态细胞；
b)将上述DH10Bac感受态细胞涂布于含100μg/ml X-gal、40μg/ml IPTG、50μg/ml卡那霉素、10μg/ml四环素及7μg/ml庆大霉素的LB平板培养48h后，挑取白色菌落，以M13通用引物进行PCR检测，PCR检测反应条件如下：先94℃预热3min，然后94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸4min、35个循环，最后72℃延伸7min；获得含有中华蜜蜂MRJP1重组Bacmid病毒。经PCR检测，未发生重组的Bacmid经PCR扩增得到273bp大小的特异性片段；重组后的Bacmid，PCR扩增得到转座子内侧片段2430bp加上克隆片段大小之和，即2430bp+1302bp＝3732bp，见图2。PCR结果与预期的片段大小一致，说明中华蜜蜂MRJP1基因已经成功地转座到Bacmid中，重组病毒命名为Bacmid-MRJP1。
3)家蚕细胞的培养与转染
a)家蚕细胞BmN用含10％胎牛血清的HyQ SFX-INSECT昆虫细胞培养基在27℃条件下恒温培养；然后接种于50ml培养瓶中，培养至2×106/瓶，离心去除血清，备用；
b)将194μl无血清培养基与6μl FUGENE 6转染剂混匀，室温静置5min，再加入4μg重组Bacmid DNA，混匀，室温静置45min；在转染剂FuGENE 6的介导下，将Bacmid-MRJP1转染家蚕细胞BmN，扩增得到大量重组病毒。将该混合液逐滴加入细胞培养瓶中，边加边摇，27℃温育7h后，弃共转染液，加入6ml含血清的完全培养基继续培养3-5天，细胞直径增大，生长停止，裂解并聚集成团(见图3)，取上清液，10000rpm，离心2min，上清液于4℃避光保存备用；将所获病毒上清液继续感染细胞，扩繁病毒，收集第三轮感染的病毒上清液，用于注射家蚕幼虫。
4)中华蜜蜂MRJP1在家蚕幼虫中的表达及纯化
将重组病毒及对照物ddH2O通过皮下注射导入家蚕五龄第一天幼虫，5μl/头，感染120h后，家蚕体色变黑，食欲下降，生长延滞，在感染96h时，收集其血淋巴，经超声波破碎，8000rpm，5min，4℃离心后，取上清液和沉淀物，用Ni-NTA亲和柱纯化，获得中华蜜蜂MRJP1真核表达产物。将感染家蚕血淋巴上清液和沉淀的纯化产物进行SDS-PAGE分析，结果表明表达产物主要在上清液中，即主要以溶解状态存在。图4为感染家蚕血淋巴上清液、对照家蚕血淋巴上清液(皮下注射ddH2O)、RJ水溶物、纯化的rAccMRJP1的SDS-PAGE分析和Western-blotting检测结果。图中可见一条约60kDa的明显条带，证明表达、纯化成功。
5)中华蜜蜂MRJP1真核表达产物酶解制备抗高血压多肽
将10mg纯化后的中华蜜蜂MRJP1真核表达产物与100μg胰蛋白酶于37℃共同孵育6h，100℃煮沸5min使胰蛋白酶失活(Kamakura et al.，2001)，经Ultracel YM-10超滤膜(Millipore)离心过滤(13000rpm，30min，4℃)得到分子量在10kDa以下的小肽混合物，用CaCl2去除磷酸盐后，即得到抗高血压多肽混合物。
将获得的多肽混合物送中科院上海有机化学研究所分析测试中心进行LC-MS液质联用分析。采用Agilent LC/MSD SL液质联用仪。样品经DIKMAc-18(4.6×250mm，5μm)色谱柱分离，柱温35℃，流速0.3ml/min，进样量8μl。流动相为：A相0.1％甲酸溶液，B相乙腈，梯度洗脱，色谱条件为：0-60min：B由15％～40％；60-70min：B由40％～80％。DAD检测波长为220nm。质谱采用电喷雾离子化(ESI)方式，正离子检测模式。重复实验一次，同时以未酶解的重组蛋白中华蜜蜂MRJP1真核表达产物作对照。结果发现酶解液中存在一个Matsui等人(Matsui et al.，2002)在西方蜜蜂全王浆水解产物中发现的降血压二肽Ile-Phe(IF，MW＝278kDa，图5)。IF会阻碍血管紧缩素I-转化酶(ACE)的活性，进而起到降血压作用。这证明中华蜜蜂MRJP1的胰蛋白酶水解物含有降血压成分，通过其在酵母或家蚕中的表达，可为人类所食用(酵母或全蚕粉)，经消化液酶解后即可产生抗高血压多肽，被人体吸收后达到治疗目的，造福人类健康。