血小板凝聚抑制剂及对抑制血小板凝聚有效的保健食品.pdf

本发明提供一种容易制成制剂、并可长期保存的血小板凝聚抑制剂及对抑制血小板凝聚有效的保健食品。其将利用纳豆激酶使血纤维蛋白反应得到的分解物作为有效成分；将利用纳豆激酶使血纤维蛋白反应得到的分解物的分子量为10000道尔顿以下的分解物作为有效成分；所述血纤维蛋白由血纤维蛋白原和凝血酶反应而得到。

权利要求书
1.  血小板凝聚抑制剂，其特征在于，将利用纳豆激酶使血纤维蛋白反应得到的分解物作为有效成分。

2.  血小板凝聚抑制剂，其特征在于，将利用纳豆激酶使血纤维蛋白反应得到的分解物的分子量为10000道尔顿以下的分解物作为有效成分。

3.  对抑制血小板凝聚有效的保健食品，其特征在于，将利用纳豆激酶使血纤维蛋白反应得到的分解物作为有效成分。

4.  对抑制血小板凝聚有效的保健食品，其特征在于，将利用纳豆激酶使血纤维蛋白反应得到的分解物的分子量为10000道尔顿以下的分解物作为有效成分。

5.  如权利要求1或2所述的血小板凝聚抑制剂，其特征在于，所述血纤维蛋白由血纤维蛋白原和凝血酶反应而得到。

6.  如权利要求1或2所述的对抑制血小板凝聚有效的保健食品，其特征在于，所述血纤维蛋白由血纤维蛋白原和凝血酶反应而得到。

说明书血小板凝聚抑制剂及对抑制血小板凝聚有效的保健食品
技术领域
本发明涉及一种血小板凝聚抑制剂、特别是将利用纳豆激酶(nattokinase)使血纤维蛋白反应而得到的血纤维蛋白分解物作为有效成分的血小板凝聚抑制剂及其保健食品。
背景技术
目前，已知纳豆激酶是与来自生物体的血纤维蛋白溶酶同样地直接分解血纤维蛋白(血栓)的血栓溶解酶(例如，参照非专利文献1)。
而且，纳豆激酶具有抑制血小板凝集的作用由本发明者中的森山及高岗发明，记载于已申请的特愿2003-111081中。
专利文献1：高岗晋作：ジャパンフ一ドサィェンス Vol.39，9月号2000年单行本
发明内容
如上所述已知纳豆激酶分解血纤维蛋白，但是，这种分解产生的分解物具有什么作用、效果还未可知。
另一方面，如上所述可以认为：如果纳豆激酶具有抑制血小板凝集的作用，那么纳豆激酶分解血纤维蛋白得到的分解物应该也具有抑制血小板凝集的作用。
对此，调研了现有技术，不存在记载着关于纳豆激酶分解血纤维蛋白得到的分解物是否具有抑制血小板凝聚的作用的现有技术文献。
该分解物为肽，由于其比作为酶的纳豆激酶稳定，因此容易制成制剂，并能长期保存。
因而，可以认为，如果该分解物具有抑制血小板凝集的作用，则血小板凝聚抑制剂及纳豆激酶，因为纳豆被食用了几百年，其安全性得到了证明，所以也可以得到保健食品(健康食品)，本发明者进行了专心研究，完成了本发明。
因而，本发明的目的在于，提供一种容易制成制剂、并可长期保存的血小板凝聚抑制剂及对抑制血小板凝聚有效的保健食品。
为了达到上述目的，本发明的内容涉及：
本发明的血小板凝聚抑制剂含有将利用纳豆激酶使血纤维蛋白反应得到的分解物作为有效成分；
而且，含有将利用纳豆激酶使血纤维蛋白反应得到的分解物的分子量为10000道尔顿以下的分解物作为有效成分。
另外，本发明的对抑制血小板凝集有效的保健食品含有将利用纳豆激酶使血纤维蛋白原反应得到的分解物作为有效成分；
而且，含有将利用纳豆激酶使血纤维蛋白反应得到的分解物的分子量为10000道尔顿以下的分解物作为有效成分。
优选上述血纤维蛋白由血纤维蛋白原和凝血酶反应而得到。
在本发明中，优选分子量作成10000道尔顿以下是因为适于做成制剂。即，是因为分子量变大时稳定性差而不适于做成制剂。
由于本发明具有以上的构成，所以可以提供一种容易制成制剂且可以长期保存的血小板凝聚抑制剂、及对抑制血小板凝聚有效的保健食品。
实施例
下面叙述制造方法、加工例、实施例。
(制造方法)
在100ml容量的三角烧瓶中量取生理盐水(0.85％NaCl)14ml和9.6mg/ml血纤维蛋白原(シグマ制、血纤维蛋白原级分I型I-S、来源于牛血清、产品编号F-8630)4ml，在37±0.3℃的恒温水槽中加温10分钟后，加入2U/ml凝血酶1ml，充分搅拌。将该溶液在37℃下放置20分钟后，加入纳豆激酶溶液1ml，充分搅拌，在37±0.3℃下放置。添加纳豆激酶溶液，在20、40、60、80、100分钟后充分搅拌，在120分钟后在沸水中煮沸10分钟，由此调制成血纤维蛋白分解产物溶液(简称FDP溶液)。将FDP溶液用ァドバンテック制超滤装置USY-5(级分分子量50000)进行超滤。将得到的透过液进一步用超滤装置USY-1(级分分子量10000)进行超滤，得到级分分子量10000以下的FDP溶液。而且，全部试剂用0.85％生理盐水调制。
(加工例)
上述血纤维蛋白分解物干燥粉末可以加工成胶囊、片剂、口服液、颗粒、糊剂等形式，以下为加工例。
对软胶囊而言，例如，将血纤维蛋白分解物干燥粉末36.7mg、大豆卵磷脂10mg、大豆油133.3mg、蜂蜡15mg、甘油脂肪酸酯15mg共计210mg混合乳化，将乳化后的液体作为内容液，填充在用明胶100mg、甘油30mg共计130mg构成的被膜中，做成总重量为340mg的软胶囊。
硬胶囊的情况，同样地，将血纤维蛋白分解物干燥粉末36.7mg、糊精209.8mg、蔗糖脂肪酸酯13.5mg共计260mg混合而成的物质作为内容物，填充在2号明胶硬胶囊(70mg)中，做成总重量为330mg的硬胶囊。
对肠溶胶囊(含耐酸性包衣)而言，例如，将血纤维蛋白分解物干燥粉末36.7mg、大豆卵磷脂10mg、大豆油133.3mg、蜂蜡15mg、甘油脂肪酸酯15mg共计210mg混合乳化，将乳化后的液体作为内容液，填充在用明胶100mg、甘油30mg共计130mg构成的被膜中，做成总重量为340mg的软胶囊。在其上包被玉米蛋白30mg，从而制作总重量为370mg的肠溶胶囊。
另外，可以应用于压片品、口服液、颗粒、糊剂等。
(实施例1)
实验方法：
将血纤维蛋白分解产物溶液冷冻干燥而成的物质用生理盐水稀释至100mg、50mg、10mg。
将健康人、男：1女：2作为对象进行采血，测定抑制血小板凝集能力。血液采样是全部使用加有3.8％柠檬酸钠的管、用21G针从上臂正中静脉进行的。将得到的血液检测样品进行180×g、10分钟的离心分离，将其上清液作为富血小板血浆(PRP)，将剩余的检测样品进行1600×g、15分钟的离心分离，作为贫血小板血浆(PPP)。将PRP用PPP稀释，调制成血小板数为25±3×104/μl，制成检测样品。凝聚诱导剂使用胶原(MC医药公司)，使最终浓度为2μg/ml。在检测样品300μl中，加入血纤维蛋白分解液24μl或生理盐水24μl(对照)，在37℃搅拌1分钟，培养后添加凝聚诱导剂36μl。
对于血小板凝聚测定，用使用有激光散射光的粒子计数测定型血小板凝聚能力测定装置(PA-20：兴和(株))。PA-20为应用直射光遇到细小粒子发生的散射光强度与粒径的平方成比例而增大的原理而开发的装置，还可以计算出除血小板凝聚率之外的血小板凝聚块的大小和其产生数。另外，在目前的吸光度法中，形成含有数千个血小板的凝聚块，吸光度才开始下降，但在该装置中，即使对含有数十个血小板的小凝聚块也可以进行测定，其检测灵敏度优良。需要说明的是，血小板凝聚块大小根据散射光强度分为3类：25mV＜(粒径9～25μm)＜200mV；200mV＜中凝聚块(粒径25～50μm)＜600mV；600mV＜大凝聚块(粒径50～70μm)＜2047mV。[Hoshi K.，Zhou X.，Terazono M.，Satou Y.，Yamazaki M.，Miyake F.，Jpn.J.Clin.Pharmacol.Ther.，32，223-230(2001)]。
使用下式计算血小板抑制率。
血小板抑制率(％)＝(1-X/Y)×100
X：添加血纤维蛋白分解物后添加了胶原的散射强度或OD(吸光度)
Y：添加血纤维蛋白分解物前添加了胶原的散射强度或OD
[Moriyama H.，Iizuka T.，Nagai M.，Hoshi K.，Biol.Pharm.Bull.，26，1361-1364(2003).]
实验结果
下述表1采用透过率(OD)来表示抑制率，显示利用高浓度血纤维蛋白分解物(6.70mg/ml)显著地抑制了由胶原引起的凝聚导致的血小板凝聚。而且判明抑制率依赖于血纤维蛋白分解物的浓度。
表1.利用血纤维蛋白分解物抑制血小板凝聚的作用

平均值±标准差(n＝3)
浓度全部为最终浓度。
而且，下述表2表示血小板凝聚块的大小分布，在添加了高浓度的血纤维蛋白分解物的样品中，大凝聚块的显现率低，相反地，小凝聚块的显现率高，表明血纤维蛋白分解物可以抑制大凝聚块的形成。该结果表明：血纤维蛋白分解物具有抑制血小板凝聚的作用。
表2.由抑制作用引起的血小板凝聚块的大小分布

平均值±标准差(n＝3)，*p＜0.05(根据Bonferroni多重比较的相对胶原的有意差检验)
浓度全部为最终浓度。
(实施例2)
实验方法：
将血纤维蛋白分解产物溶液减压干燥而成的物质用生理盐水稀释至100mg、50mg、10mg。
将健康人、男：1女：2作为对象进行采血，测定抑制血小板凝集的能力。血液采样是全部使用加有3.8％柠檬酸钠的管、用21G针从上臂正中静脉进行的。将得到的血液检测样品进行180×g、10分钟的离心分离，将其上清液作为多血小板血浆(PRP)，将剩余的检测样品进行1600×g、15分钟的离心分离，作为贫血小板血浆(PPP)。将PRP用PPP稀释，调制成血小板数为25±3×104/μl，制成检测样品。凝聚诱导剂使用ADP(MC医药公司)，使最终浓度为5μM。在检测样品300μl中，加入血纤维蛋白分解液24μl或生理盐水24μl(对照)，在37℃搅拌1分钟，培养后添加凝聚诱导剂36μl。
对于血小板凝聚测定，用使用有激光散射光的粒子计数测定型血小板凝聚能力测定装置(PA-20：兴和(株))。PA-20为应用直射光遇到细小粒子发生的散射光强度与粒径的平方成比例而增大的原理而开发的装置，还可以计算出除血小板凝聚率之外的血小板凝聚块的大小和其产生数。另外，在目前的吸光度法中，形成含有数千个血小板的凝聚块，吸光度才开始下降，但在该装置中，即使对含有数十个血小板的小凝聚块也可以进行测定，其检测灵敏度优良。需要说明的是，血小板凝聚块大小根据散射光强度分为3类：25mV＜(粒径9～25μm)＜200mV；200mV＜中凝聚块(粒径25～50μm)＜600mV；600mV＜大凝聚块(粒径50～70μm)＜2047mV。[Hoshi K.，Zhou X.，Terazono M.，Satou Y.，Yamazaki M.，Miyake F.，Jpn.J.Clin.Pharmacol.Ther.，32，223-230(2001)]。
使用下式计算血小板抑制率。
血小板抑制率(％)＝(1-X/Y)×100
X：添加血纤维蛋白分解物后添加了ADP的散射强度或OD(吸光度)
Y：添加血纤维蛋白分解物前添加了ADP的散射强度或OD
[Moriyama H.，Iizuka T.，Nagai M.，Hoshi K.，Biol.Pharm.Bull.，26，1361-1364(2003).]
实验结果
上述表1采用透过率(OD)来表示抑制率，显示利用高浓度血纤维蛋白分解物(6.70mg/ml)显著地抑制了由ADP引起的凝聚导致的血小板凝聚。而且判明抑制率依赖于血纤维蛋白分解物的浓度。
而且，下述表3表示血小板凝聚块的大小分布，在添加了高浓度的血纤维蛋白分解物的样品中，血小板的大凝聚块的显现率低，相反地，小凝聚块的显现率高，表明血纤维蛋白分解物可以抑制大凝聚块的形成。该结果表明：血纤维蛋白分解物具有抑制血小板凝聚的作用。
表3.由抑制作用引起的血小板凝聚块的大小分布

平均值±标准差(n＝3)，*p＜0.05(根据Bonferroni多重比较的相对ADP的有意差检验)
浓度全部为最终浓度。