细茎双蝴蝶的组织培养方法.pdf

本发明是细茎双蝴蝶的组织培养方法，是一种用于双蝴蝶属植物组织培养方法，涉及一种植物培养方法。该方法包括无菌苗获得和培养，增殖培养，生根培养，炼苗移栽等四个步骤。其中，上述培养条件，培养基均由L9(34)正交试验、方差分析选出。①萌发培养基：MS+ZT 1.0mg.L-1；②增殖培养基：MS+6BA 1.8mg.L-1；③生根培养基：1/2MS+IBA 0.8m.L-1以上培养基均添加3％蔗糖，1.1％卡拉胶，pH5.8，培养温度25±1℃，自控日光灯光源，光强2000LX，光照时间14h.d-1，增殖时每30d更换一次培养基。该方法可以提高新芽的诱导率，繁殖系数和移栽成活率，克服了该种药用植物种子繁难度大的问题。

权利要求书
1.  细茎双蝴蝶的组织培养方法，其特征在于采用下述步骤：
第一步，无菌苗获得和培养：取一年生植株的根茎，去除叶片和叶柄，剪成6cm长的茎段，先用自来水洗净后用饱和洗衣粉溶液漂洗1-5分钟，再用自来水流水冲洗1-2小时，然后用蒸馏水冲洗1-2次以后在无菌室内于超净工作台上，用75％的酒精浸20-30s，并不断地摇动，以便充分杀菌；倒掉酒精，加入0.1％的升汞溶液和一滴吐温80浸泡8-10分钟，以进一步消毒，倒掉升汞溶液后，再用无菌水冲洗3-6次，置于无菌培养皿中干燥的无菌滤纸上，吸干表面水分，用利刀切成长1.5cm左右，每段有一个节的带芽茎段，以下端插入萌发培养基中，节和腋芽露在萌发培养基外，接种于萌发培养基上，暗培养5天后转入光照培养，6天后萌发培养基上外植体陆续萌动，长出嫩芽；
第二步：增殖培养：接种后30-35d，芽长1-2cm时，选健康无杂菌感染的芽连同外植体一起移入增殖培养基上进行繁芽培养；接种40天后，苗高5cm左右，具3-4个节，繁殖系数5.1，以后每30-35d更换一次培养基；
第三步：生根培养：当不定芽长到2-3cm，具3-4片叶时，将其切下，转接入生根培养基上，进行根的诱导，培养30天；
第四步：炼苗移栽：当试管苗株高4cm左右，根长2-3cm时，选择生长健壮，根系发达的植株进行炼苗移栽，先将幼苗移出组培室，置于与日光下相比荫蔽度为70％的温室内闭瓶炼苗3d，进行光照适应性锻炼，再将培养瓶盖打开一半，半开瓶炼苗1天，再开瓶炼苗一天，然后将苗取出，洗净根部培养基，移栽于装有珍珠岩：红壤土：河砂比例为1∶2∶1的基质的塑料小花钵中，其基质应为0.1％高锰酸钾溶液或0.1％菌绝杀处理24小时，经每100kg水+少量MS培养液+1支链霉素喷雾洗净叶面和茎表面，待叶片表面无积水后，用透明塑料袋封好钵口，从第二天起，每天在封口塑料袋上刺一个筷子粗的孔，15天后去掉封口膜，进入正常生长，移栽至与原产地环境相似的油茶權木林下。

2.  根据权利要求1所述的细茎双蝴蝶的组织培养方法，其特征是：上述培养基均由L9(34)正交试验、方差分析选出，其中：
①萌发培养基：MS+ZT 1.0mg.L-1
②增殖培养基：MS+6BA 1.8mg.L-1
③生根培养基：1/2MS+IBA 0.8m.L-1
以上培养基均添加3％蔗糖，1.1％卡拉胶，PH5.8，培养温度25±1℃，自控日光灯光源，光强2000LX，光照时间14h.d-1.，增殖时每30d更换一次培养基。

说明书细茎双蝴蝶的组织培养方法
技术领域
本发明是细茎双蝴蝶的组织培养方法，涉及这种药用植物的有效快速繁殖，开发利用。
技术背景
对双蝴蝶属植物的研究，文献很少，国内主要是分类、发育方面的文章，国外和我国台湾省对该属植物的5个种进行了植物化学成分和药物功能活性成分方面的研究。细茎双蝴蝶植物，种子细小，休眠期长，发芽率极低，申请者经过三年实验，发现该植物种子繁殖时，其实生苗有一个没有实效的幼年期，发芽后6个月完成不了二叶期，故不仅发芽率极低，发芽后成苗率也极低，所以种子繁殖难度很大。
发明内容
本发明需解决的技术问题是：针对细茎双蝴蝶植物发芽率低、发芽后成苗率低、种子繁殖难度大的问题，而建立一种高效的细茎双蝴蝶的组培方法。
本发明的目的是这样实现的：
第一步，无菌苗获得和培养：取一年生植株的根茎(靠近地面10公分的地上茎，一般从酸性红壤土的茶林或油茶与马尾松、油桐、杉树的混交林下采集细茎双蝴蝶无病虫害的茎作为外植体。因为靠近地面的根茎比根茎上面的缠绕茎的生理年龄更年轻，生理年龄越年轻的外植体，其侧芽在芽诱导分化培养基上萌发出新芽的时间越早、出芽率越高，细茎双蝴蝶基本不形成愈伤组织，都是由休眠侧芽萌发出芽。)去除叶片和叶柄，剪成6cm长的茎段，先用自来水洗净后用饱和洗衣粉溶液漂洗1-5分钟，再用自来水流水冲洗1-2小时，然后用蒸馏水冲洗1-2次以后在无菌室内于超净工作台上，用75％的酒精浸30s，并不断地摇动，以便充分杀菌。倒掉酒精，加入0.1％的升汞溶液和一滴吐温80浸泡8-10分钟，以进一步消毒。倒掉升汞溶液后，再用无菌水冲洗6次，置于无菌培养皿中干燥的无菌滤纸上，吸干表面水分。用利刀切成长1.5cm左右，每段有一个节的带芽茎段，以下端插入培养基中，节和腋芽露在培养基外，接种于培养基上。暗培养5天后转入光照培养。6天后，萌发培养基上外植体陆续萌动，长出嫩芽。
第二步：增殖培养：接种后30-35d，芽长1-2cm时，选健康无杂菌感染的芽连同外植体一起移入增殖培养基上进行繁芽培养。接种40天后，苗高5cm左右，具3-4个节，繁殖系数5.1，以后每30-35d更换一次培养基。
第三步：生根培养：当不定芽长到2-3cm，具3-4片叶时，将其切下，转接入生根培养基上，进行根的诱导，培养30天左右，开始长出不定根。
第四步：炼苗移栽：当试管苗株高4cm左右，根长2-3cm时，选择生长健壮，根系发达的植株进行炼苗移栽。先将幼苗移出组培室，置于荫蔽度(与日光下相比)70％左右的温室内闭瓶炼苗3d，进行光照适应性锻炼，(经对该种植物原产地环境生态限制因子的研究，发现该植物喜分布于下午背光一面的山坡的油茶林下。经照度计和干湿计测定，在荫蔽度70％左右，云障雾罩的湾糟环境中生长良好，茎长可达一米以上，单株茎叶重达0.25kg左右。)再将培养瓶盖打开一半，半开瓶炼苗1天，再开瓶炼苗一天。然后将苗取出，洗净根部培养基，移栽于装有珍珠岩∶红壤土∶河砂比例为1∶2∶1基质的塑料小花钵中，(其基质应为0.1％高锰酸钾溶液或0.1％菌绝杀处理24小时)，经喷雾(每100kg水+少量MS培养液+1支链霉素)洗净叶面和茎表面，待叶片表面无积水后，用透明塑料袋封好钵口，从第二天起，每天在封口塑料袋上刺一个筷子粗的孔，15天后去掉封口膜，进入正常生长，移栽成活率95％以上。移栽至与原产地环境相似的油茶權木林下，一年缠绕茎长达50cm以上，两年内可开花结果，收获其植物体入药。
其中：上述培养条件，培养基均由L9(34)正交试验、方差分析选出。
①萌发培养基：MS+ZT 1.0mg.L-1
②增殖培养基：MS+6BA 1.8mg.L-1
③生根培养基：1/2MS+IBA 0.8m.L-1
以上培养基均添加3％蔗糖，1.1％卡拉胶，PH5.8，培养温度25±1℃，自控日光灯光源，光强2000LX，光照时间14h.d-1.，增殖时每30d更换一次培养基。
采用上述方法，具有下列优点：
1.芽诱分化培养基采用ZTmg/L(玉米素)作为生长刺激素代替6-BA1.5mg/L诱导休眠芽萌发成新芽的诱导率从15％提高到47％.
2.明确肯定不用缠绕茎作外植体，而用近地面10公分的粗壮根茎作为外植体，这样外植体不仅生理年龄年轻，而且营养丰富，使萌芽的时间提早1天以上，芽也粗壮，这也是繁殖系数提高的原因，根的条数增加0.4条/株。
3.增殖培养基中，6-BA份数由1.5mg/L增加到1.8mg/L，是繁殖系数提高的又一原因，每两个月可增殖4.6个芽。
4.在炼苗移栽时：①先在温室内进行三天光照适应性锻炼②培养瓶盖分两天，两步打开，后种入花钵后选用透明塑料薄膜袋封口保湿，防止自身抗生素物质的挥发，逐渐刺穿封口袋膜，使之受到湿度适应性锻炼，增加抗菌能力。③用高锰酸钾和菌绝杀彻底处理基质中的病菌，移栽后用链霉素稀溶液喷雾一次后封上透明薄膜，使组培苗炼苗时由于茎的皮层发达，胶状物质多，易于感染病菌导致死亡率高的突出矛盾得到较好解决，也使该植物因产于高寒山区林下草丛中，空气湿度大，茎运输水分能力差，适应干燥空气能力差的矛盾得以解决。④将基质配方中的腐殖土改为原产地3.5-5.5的红壤土，使土壤中腐败微生物减少，生境更接近原产地条件，加上在基质中加适量MS营养液，故使移栽成活率提高了6％，达到95％以上。
5.用成年材料作外植体经组培——营养繁殖产生的植株，不存在没有实效的幼年期。克服了该种植物种子繁难度大，制约该种药用植物广泛开发利用的巨大矛盾。
具体实施方式
下面结合实例对本发明作进一步说明：
第一步：获取无菌苗：取一年生植株的根茎，去除叶片和叶柄，剪成6cm长的茎段，先用自来水洗净后用饱和洗衣粉溶液漂洗5分钟，再用自来水流水冲洗两小时，然后用蒸馏水冲洗2次以后在无菌室内于超净工作台上，用75％的酒精浸泡30s，并不断地摇动，以便充分杀菌。倒掉酒精，加入0.1％的升汞溶液和一滴吐温-80浸泡10分钟，以进一步消毒。倒掉升汞溶液后，再用无菌水冲洗6次，置于无菌培养皿中干燥的无菌滤纸上，吸干表面水分。用利刀切成长1.5cm左右，每段有一个节的带芽茎段，以下端插入培养基中，节和腋芽露在培养基外，接种于培养基上。暗培养5天后转入光照培养。6天后，萌发培养基上外植体陆续萌动，长出嫩芽。
第二步：增殖培养：接种后30d，芽长2cm时，选健康无杂菌感染的芽连同外植体一起移入增殖培养基上进行繁芽培养。接种40天后，苗高5cm左右，具3-4个节，繁殖系数5.1，以后每35d更换一次培养基。
第三步：生根培养：当不定芽长到2cm，具3-4片叶时，将其切下，转接入生根培养基上，进行根的诱导，培养30天，开始长出不定根。
第四步：炼苗移栽：当试管苗株高4cm左右，根长3cm时，选择生长健壮，根系发达的植株进行炼苗移栽。先将幼苗移出组培室，置于荫蔽度(与日光下相比)70％左右的温室内闭瓶进行光照适应性锻炼3d，再将培养瓶盖打开一半，半开瓶炼苗1天，再开瓶炼苗一天。然后将苗取出，洗净根部培养基，移栽于装有珍珠岩∶红壤土∶河砂比例为1∶2∶1基质的塑料小花钵中，(其基质应为0.1％高锰酸钾溶液或0.1％菌绝杀处理24小时)，经喷雾(每100kg水+少量MS培养液+1支链霉素)洗净叶面和茎表面，待叶片表面无积水后，用透明塑料袋封好钵口，从第二天起，每天在封口塑料袋上刺一个筷子粗的孔，15天后去掉封口膜，进入正常生长。然后，移栽至与原产地环境相似的油茶權木林下。
其中：上述培养条件，培养基均由L9(34)正交试验、方差分析选出。
①萌发培养基：MS+ZT 1.0mg.L-1
②增殖培养基：MS+6BA 1.8mg.L-1
③生根培养基：1/2MS+IBA 0.8m.L-1
以上培养基均添加3％蔗糖，1.1％卡拉胶，PH5.8，培养温度25℃，自控日光灯光源，光强2000LX，光照时间14h.d-1.，增殖时每30d更换一次培养基。