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1、10申请公布号CN104176732A43申请公布日20141203CN104176732A21申请号201410413576022申请日20140820C01B31/0420060171申请人南京工业大学地址210009江苏省南京市新模范马路5号72发明人谢婧婧刘婷婷宋天顺郭亭王德斌朱振刚74专利代理机构南京苏高专利商标事务所普通合伙32204代理人肖明芳54发明名称一种生物催化制备石墨烯的方法57摘要本发明公开了一种生物催化制备石墨烯的方法，该方法包括如下步骤1将枯草芽孢杆菌B168活化，离心收集菌体，用M9简单培养基重悬；2将步骤1中所得的枯草芽孢杆菌菌体与氧化石墨烯悬浮液混合，并加入电。
2、子介体维生素K3的溶液，进行生物还原反应；3将步骤2中经过生物还原反应的混合体系静置、离心后得到石墨烯，经清洗、沉淀，冷冻干燥后得到成品。与希瓦氏菌还原制备石墨烯的方法相比，本发明方法制备的石墨烯具有较低的缺陷和无序性，且具有环境污染小，安全可靠，操作简单等优点。51INTCL权利要求书1页说明书6页附图5页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图5页10申请公布号CN104176732ACN104176732A1/1页21一种生物催化制备石墨烯的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤1将枯草芽孢杆菌B168活化，离心收集菌体，用M9简单培养基重悬；2将步骤1。
3、中所得的枯草芽孢杆菌菌体与氧化石墨烯悬浮液混合，并加入电子介体维生素K3的溶液，进行生物还原反应；3将步骤2中经过生物还原反应的混合体系静置、离心后得到石墨烯，经清洗、沉淀，冷冻干燥后得到成品。2根据权利要求1所述的生物催化制备石墨烯的方法，其特征在于，步骤1中，枯草芽孢杆菌B168的活化条件为将菌种接种到固体培养基上，在37的恒温培养箱中活化12H，用接种环挑取单菌落于5ML液体培养基中，37、200RPM/MIN的恒温摇床培养12H；活化所用的固体培养基成分为酵母膏5G/L，蛋白胨10G/L，NACL10G/L，可溶性淀粉10G/L，琼脂粉18G/L；活化所用的液体培养基为酵母膏5G/L，。
4、蛋白胨10G/L，NACL10G/L，可溶性淀粉10G/L，溶剂为水。3根据权利要求1所述的生物催化制备石墨烯的方法，其特征在于，步骤1中，所述的M9简单培养基成分为NA2HPO47H2O128G/L，K2HPO43G/L，NACL05G/L，NH4CL1G/L，MGSO4024G/L，CACL200111G/L，葡萄糖4G/L，溶剂为水。4根据权利要求1或3所述的生物催化制备石墨烯的方法，其特征在于，步骤1中，活化后的枯草芽孢杆菌B168用M9简单培养基清洗、重悬，控制菌体的OD6000210。5根据权利要求1所述的生物催化制备石墨烯的方法，其特征在于，步骤2中，所述的氧化石墨烯悬浮液，溶剂。
5、为无菌水，溶质氧化石墨烯的浓度为2510MG/ML；所述的氧化石墨烯悬浮液预先经过超声分散处理，超声时间为40120MIN，超声温度为室温。6根据权利要求1所述的生物催化制备石墨烯的方法，其特征在于，步骤2中，所述的维生素K3的溶液，溶剂为无水乙醇、氯仿或四氯化碳；溶质维生素K3的浓度为15MG/ML。7根据权利要求1所述的生物催化制备石墨烯的方法，其特征在于，步骤2中，枯草芽孢杆菌菌体与氧化石墨烯悬浮液混合的体积比为11020，电子介体维生素K3的终浓度为15G/ML。8根据权利要求1所述的生物催化制备石墨烯的方法，其特征在于，步骤2中，生物还原反应的条件为厌氧条件下培养0510H，温度为2。
6、537。9根据权利要求1所述的生物催化制备石墨烯的方法，其特征在于，步骤3中，离心方法为离心转速800012000R/MIN，离心时间1580MIN；清洗方法为依次采用稀盐酸、乙醇和水反复清洗，其中稀盐酸的浓度为015MOL/L，乙醇的体积百分浓度为7080；冷冻干燥方法为干燥温度为2080，真空度160PA，干燥时间为1224H。权利要求书CN104176732A1/6页3一种生物催化制备石墨烯的方法技术领域0001本发明涉及一种用生物催化法还原氧化石墨烯制备石墨烯的方法，属于生物材料领域。背景技术0002石墨烯是一种新型的二维纳米材料，是已知的世上最薄、最坚硬的纳米材料，它几乎是完全透明的。
7、。由于石墨烯具有高的比表面积、突出的导热性能和力学性能及其非凡的电子传递性能等一系列的优异的性质，所以制备高质量和高产量的石墨烯一直是人们关注的焦点。石墨烯的研究热潮也吸引了国内外材料制备研究的兴趣，石墨烯材料的制备方法已报道的有机械剥离法、化学氧化法、晶体外延生长法、化学气相沉积法、有机合成法和碳纳米管剥离法等。氧化还原法制备成本低廉且容易实现，目前被认为是制备石墨烯的最佳方法。即石墨氧化变成氧化石墨，再在超声条件下得到分散的氧化石墨烯溶液，再通过化学还原剂还原获得石墨烯。但它的缺点是宏量制备容易带来废液污染和制备的石墨烯存在一定的缺陷等问题。在还原氧化石墨烯过程中，为了减少环境污染，提高石。
8、墨烯性能，微生物还原开始引起人们的关注，目前已发现的有希瓦氏菌SHEWANELLA，大肠杆菌ESCHERICHIACOLI，节杆菌LATINNAMEARTHROBACTERSPCONNANDDIMMICK等等。0003已有很多相关文献报道，希瓦氏菌可以用来还原氧化石墨烯为石墨烯，而且有很好的效果如EVERETTCSALAS发表的REDUCTIONOFGRAPHENEOXIDEVIABACTERIALRESPIRATION；GUANGFEILIU发表的QUINONEMEDIATEDMICROBIALSYNTHESISOFREDUCEDGRAPHENEOXIDEWITHPEROXIDASELIKE。
9、ACTIVITY。虽然希瓦氏菌法制备的石墨烯相对于化学法制备的在结构和性能上有很大的进步,但它是人畜共患的条件致病菌，通常分布于淡水和海洋中。它对环境安全有一定的潜在威胁，对生物还原制备石墨的扩大化有一定的制约性，而且在制备石墨烯的过程中必须将废弃的希瓦氏菌进行集中灭菌处理，这增加了制备过程的步骤。SATYANARAYANAREDDY等人研究BIOLOGICALSYNTHESISOFGOLDANDSILVERNANOPARTICLESMEDIATEDBYTHEBACTERIABACILLUSSUBTILIS表明，枯草芽孢杆菌BACILLUSSUBTILIS可以分泌一些蛋白，能够使氯金酸盐和银离。
10、子发生氧化还原反应生成金纳米粒子和银纳米粒子。而且它是一类重要的工业用微生物，主要用于各类工业用酶制剂的表达生产。因其有长期制备发酵食品的历史，是非致病的一种非病原微生物，不产毒素和致热致敏蛋白质，故为一种食品安全的菌种。相对于希瓦氏菌而言，更为安全可靠。发明内容0004本发明所要解决的技术问题是提供一种生物催化制备石墨烯的方法。0005为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下0006一种生物催化制备石墨烯的方法，该方法包括如下步骤00071将枯草芽孢杆菌B168活化，离心收集菌体，用M9简单培养基重悬；说明书CN104176732A2/6页400082将步骤1中所得的枯草芽孢杆菌菌体与氧。
11、化石墨烯悬浮液混合，并加入电子介体维生素K3的溶液，进行生物还原反应；00093将步骤2中经过生物还原反应的混合体系静置、离心后得到石墨烯，经清洗、沉淀，冷冻干燥后得到成品。0010步骤1中，所述的枯草芽孢杆菌B168为ATCC23857。0011步骤1中，枯草芽孢杆菌B168的活化条件为将菌种接种到固体培养基上，在37的恒温培养箱中活化12H，用接种环挑取单菌落于5ML液体培养基中，37、200RPM/MIN的恒温摇床培养12H；活化所用的固体培养基成分为酵母膏5G/L，蛋白胨10G/L，NACL10G/L，可溶性淀粉10G/L，琼脂粉18G/L；活化所用的液体培养基为酵母膏5G/L，蛋白胨。
12、10G/L，NACL10G/L，可溶性淀粉10G/L，溶剂为水。0012步骤1中，所述的M9简单培养基成分为NA2HPO47H2O128G/L，K2HPO43G/L，NACL05G/L，NH4CL1G/L，MGSO4024G/L，CACL200111G/L，葡萄糖4G/L，溶剂为水。0013步骤1中，活化后的枯草芽孢杆菌B168用M9简单培养基清洗、重悬，控制菌体的OD6000210。0014步骤2中，所述的氧化石墨烯悬浮液，溶剂为无菌水，溶质氧化石墨烯的浓度为2510MG/ML；所述的氧化石墨烯悬浮液预先经过超声分散处理，超声时间为40120MIN，超声温度为室温。0015步骤2中，所述的维。
13、生素K3的溶液，溶剂为乙醇、氯仿或四氯化碳；溶质维生素K3的浓度为15MG/ML；若长时间不用，可在4下保存。0016步骤2中，枯草芽孢杆菌菌体与氧化石墨烯悬浮液混合的体积比为11020，电子介体维生素K3的终浓度为15G/ML。0017步骤2中，生物还原反应的条件为厌氧条件下培养0510H，温度为2537。0018步骤3中，离心方法为离心转速800012000R/MIN，离心时间1580MIN；清洗方法为依次采用稀盐酸、乙醇和水反复清洗，其中稀盐酸的浓度为015MOL/L，乙醇的体积百分浓度为7080；冷冻干燥方法为干燥温度为2080，真空度160PA，干燥时间为1224H。0019有益效果。
14、本发明方法与现有技术相比具有如下优势00201、本法利用食品安全，生长条件温和的枯草芽孢杆菌对氧化石墨烯进行还原，通过枯草芽孢杆菌分泌的还原酶及其电子传递特性，同时利用外加电子介体维生素K3，使其更好的进行电子传输，实现氧化石墨烯的还原。与过往技术相比，本法制得的石墨烯的拉曼光谱中，G峰红移更远，达到1569CM1。可以看出与过往技术相比，本法降低了石墨烯的结构缺陷，最大限度的保持了石墨烯原有的优异特性。00212、与过往技术相比，本方法的一大优势在于反应迅速，耗时短。本方案中所用的枯草芽孢杆菌经过夜活化，反应05H后就有很明显的现象，10H后即可基本反应完全。且本发明方案中所用的枯草芽孢杆菌。
15、直接接种于培养基活化即可，无需做其它处理，步骤简单。附图说明0022图1是本发明所公开的工艺的流程示意图。0023图2A是本发明实施例1生物催化制备石墨烯的效果对比图空白氧化石墨烯，说明书CN104176732A3/6页5VK3还原氧化石墨烯，微生物还原氧化石墨烯，微生物和VK3共同还原氧化石墨烯，反应时间均为5MIN。0024图2B是本发明实施例1生物催化制备石墨烯的效果对比图空白氧化石墨烯，VK3还原氧化石墨烯，微生物还原氧化石墨烯，微生物和VK3共同还原氧化石墨烯，反应时间均为30MIN。0025图2C是本发明实施例1生物催化制备石墨烯的效果对比图空白氧化石墨烯，VK3还原氧化石墨烯，微。
16、生物还原氧化石墨烯，微生物和VK3共同还原氧化石墨烯，反应时间均为10H。0026图3是本发明实施例1生物催化制备石墨烯的OD600对比图。0027图4是本发明实施例1生物催化制备石墨烯的拉曼光谱对比图。0028图5A5D是本发明实施例1生物催化制备石墨烯的XRD对比图。其中，图5A是空白氧化石墨烯，图5B是VK3还原氧化石墨烯，图5C是微生物还原氧化石墨烯，图5D是微生物和VK3共同还原氧化石墨烯，反应时间均为10H。具体实施方式0029根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。。
17、0030实施例10031本发明一种生物催化制备石墨烯，包括以下制备步骤0032第一步，细菌悬浮液的制备。将活化好的枯草芽孢杆菌B168进行离心收集菌体，10000R/MIN转速离心10MIN。用灭过菌的基本培养基M9重悬，再次离心收集菌体，10000R/MIN转速离心10MIN，以去除原有的培养基。重复以上操作一次。最后用M9培养基重悬，并调节OD05。其中枯草芽孢杆菌培养基中包括酵母膏5G/L，蛋白胨10G/L，NACL10G/L，可溶性淀粉10G/L。M9培养基中包括NA2HPO47H2O128G/L，K2HPO43G/L，NACL05G/L，NH4CL1G/L，MGSO4024G/L，C。
18、ACL200111G/L，葡萄糖4G/L。其中的MGSO4、CACL2、葡萄糖要和其他成分分开灭菌。所有的培养基选用高压灭菌锅121，蒸汽压为01MPA，灭菌时间15MIN。0033第二步，VK3溶液的配置。准确称取10MGVK3粉末到灭过菌的50ML的洁净离心管中，加入10ML无水乙醇，振荡混匀，使其充分溶解。0034第三步，氧化石墨烯预处理。称取0055G单层氧化石墨烯片状固体到灭过菌的50ML的洁净离心管中，加入10ML灭过菌的去离子水。在250W的超声波清洗机中，于室温下超声处理至氧化石墨烯全溶，得到分散性能较好的氧化石墨烯棕色悬浮液。0035第四步，向灭过菌的25ML的厌氧小瓶子中加。
19、入95ML第一步中制备的细菌悬浮液，加入10L第二步中制备的VK3，再加入05ML第三步中制备的氧化石墨烯悬浮液，混匀。每瓶通入3MIN的N2，以除去溶解氧。在室温静置10H，进行生物催化反应。并适时取样，时刻观察反应过程中OD600的变化过程。0036第五步，将第四步生物催化完毕的反应液静置，10000R/MIN转速离心30MIN；向获得的混合物沉淀中加入1MOL/L稀盐酸100ML，搅拌均匀，室温下静置1H；以10000R/MIN转说明书CN104176732A4/6页6速离心30MIN，倾去上清液，用80乙醇溶液清洗沉淀，搅拌均匀，室温下静置1H，10000R/MIN转速离心30MIN，。
20、倾去上清液，最后用去离子水清洗沉淀，如上重复3次，最后用去离子水洗到中性为止，将沉淀置于真空冷冻干燥箱中，50，真空度160PA，干燥时间为24H，得到纯净的石墨烯。0037如图2所示，同时添加了枯草芽孢杆菌B168和VK3的样品瓶中氧化石墨烯悬浮液基本全部变黑，且有黑色颗粒物质析出，而两者都不添加或只添加其中一种的样品瓶中没有很大变化，说明枯草芽孢杆菌B168和VK3共同作用下，氧化石墨烯得到了很好的还原。而且在反应05H时，效果已经非常明显。通过适时取样，测定OD600的吸光度值得到的变化曲线如图3所示，从图中明显可以看出，在反应初期，OD600值迅速上升，说明反应速度很快，反应到10小时。
21、时，OD600值基本不再变化，反应基本结束。0038对得到的枯草芽孢杆菌B168和VK3共同还原的氧化石墨烯进行拉曼光谱测试，结果如图4所示。同时添加了枯草芽孢杆菌B168和VK3催化还原氧化石墨烯制备的石墨烯在1350CM1和1569CM1左右分别出现了D峰和G峰两个特征峰。与用希瓦氏菌还原制备的石墨烯见参考文献GONGMINGWANG,FANGQIAN,CHADWSALTIKOV,YONGQINJIAOMICROBIALREDUCTIONOFGRAPHENEOXIDEBYSHEWANELLANANORES2011,46563570相比，D/G明显要小，表明枯草芽孢杆菌催化还原氧化石墨烯制备。
22、的石墨烯具有较低的缺陷和无序性。0039图5为本发明得到的石墨烯的XRD图，从图中可以看出，枯草芽孢杆菌B168和VK3共同作用的情况下，氧化石墨烯被还原的效果最好。0040实施例20041一种生物催化制备石墨烯的方法，包括以下制备步骤0042第一步，细菌悬浮液的制备。将活化好的枯草芽孢杆菌B168进行离心收集菌体，10000R/MIN转速离心10MIN。用灭过菌的基本培养基M9重悬，再次离心收集菌体，10000R/MIN转速离心10MIN，以去除原有的培养基。重复以上操作一次。最后用M9培养基重悬，并调节OD05。其中枯草芽孢杆菌培养基中包括酵母膏5G/L，蛋白胨10G/L，NACL10G/。
23、L，可溶性淀粉10G/L。M9培养基中包括NA2HPO47H2O128G/L，K2HPO43G/L，NACL05G/L，NH4CL1G/L，MGSO4024G/L，CACL200111G/L，葡萄糖4G/L。其中的MGSO4、CACL2、葡萄糖要和其他成分分开灭菌。所有的培养基选用高压灭菌锅121，蒸汽压为01MPA，灭菌时间15MIN。0043第二步，VK3溶液的配置。准确称取10MGVK3粉末到灭过菌的50ML的洁净离心管中，加入10ML无水乙醇，振荡混匀，使其充分溶解。0044第三步，氧化石墨烯预处理。称取0055G单层氧化石墨烯片状固体到灭过菌的50ML的洁净离心管中，加入10ML灭过。
24、菌的去离子水。在250W的超声波清洗机中，于室温下超声处理至氧化石墨烯全溶，得到分散性能较好的氧化石墨烯棕色悬浮液。0045第四步，向灭过菌的25ML的厌氧小瓶子中加入95ML第一步中制备的细菌悬浮液，加入10L第二步中制备的VK3，再加入05ML第三步中制备的氧化石墨烯悬浮液，混匀。每瓶通入3MIN的N2，以除去溶解氧。在室温静置05H，进行生物催化反应。0046第五步，将第四步生物催化完毕的反应液静置，10000R/MIN转速离心30MIN；向获得的混合物沉淀中加入1MOL/L稀盐酸100ML，搅拌均匀，室温下静置1H；以10000R/MIN转速离心30MIN，倾去上清液，用80乙醇溶液清。
25、洗沉淀，搅拌均匀，室温下静置1H，10000R/说明书CN104176732A5/6页7MIN转速离心30MIN倾去上清液，最后用去离子水清洗沉淀，如上重复3次，最后用去离子水洗到中性为止，将沉淀置于真空冷冻干燥箱中，50，真空度160PA，干燥时间为24H，得到纯净的石墨烯。0047实施例30048本发明一种生物催化制备石墨烯，包括以下制备步骤0049第一步，细菌悬浮液的制备。将活化好的枯草芽孢杆菌B168进行离心收集菌体，10000R/MIN转速离心10MIN。用灭过菌的基本培养基M9重悬，再次离心收集菌体，10000R/MIN转速离心10MIN，以去除原有的培养基。重复以上操作一次。最后。
26、用M9培养基重悬，并调节OD05。其中枯草芽孢杆菌培养基中包括酵母膏5G/L，蛋白胨10G/L，NACL10G/L，可溶性淀粉10G/L。M9培养基中包括NA2HPO47H2O128G/L，K2HPO43G/L，NACL05G/L，NH4CL1G/L，MGSO4024G/L，CACL200111G/L，葡萄糖4G/L。其中的MGSO4、CACL2、葡萄糖要和其他成分分开灭菌。所有的培养基选用高压灭菌锅121，蒸汽压为01MPA，灭菌时间15MIN。0050第二步，VK3溶液的配置。准确称取10MGVK3粉末到灭过菌的50ML的洁净离心管中，加入10ML无水乙醇，振荡混匀，使其充分溶解。0051。
27、第三步，氧化石墨烯预处理。称取0055G单层氧化石墨烯片状固体到灭过菌的50ML的洁净离心管中，加入10ML灭过菌的去离子水。在250W的超声波清洗机中，于室温下超声处理至氧化石墨烯全溶，得到分散性能较好的氧化石墨烯棕色悬浮液。0052第四步，向灭过菌的25ML的厌氧小瓶子中加入19ML第一步中制备的细菌悬浮液，加入20L第二步中制备的VK3，再加入1ML第三步中制备的氧化石墨烯悬浮液，混匀。每瓶通入3MIN的N2，以除去溶解氧。在室温静置10H，进行生物催化反应。0053第五步，将第四步生物催化完毕的反应液静置，10000R/MIN转速离心30MIN；向获得的混合物沉淀中加入1MOL/L稀盐。
28、酸100ML，搅拌均匀，室温下静置1H；以10000R/MIN转速离心30MIN，倾去上清液，用80乙醇溶液清洗沉淀，搅拌均匀，室温下静置1H，10000R/MIN转速离心30MIN倾去上清液，最后用去离子水清洗沉淀，如上重复3次，最后用去离子水洗到中性为止，将沉淀置于真空冷冻干燥箱中，50，真空度160PA，干燥时间为24H，得到纯净的石墨烯。0054实施例40055本发明一种生物催化制备石墨烯，包括以下制备步骤0056第一步，细菌悬浮液的制备。将活化好的枯草芽孢杆菌B168进行离心收集菌体，10000R/MIN转速离心10MIN。用灭过菌的基本培养基M9重悬，再次离心收集菌体，10000R。
29、/MIN转速离心10MIN，以去除原有的培养基。重复以上操作一次。最后用M9培养基重悬，并调节OD10。其中枯草芽孢杆菌培养基中包括酵母膏5G/L，蛋白胨10G/L，NACL10G/L，可溶性淀粉10G/L。M9培养基中包括NA2HPO47H2O128G/L，K2HPO43G/L，NACL05G/L，NH4CL1G/L，MGSO4024G/L，CACL200111G/L，葡萄糖4G/L。其中的MGSO4、CACL2、葡萄糖要和其他成分分开灭菌。所有的培养基选用高压灭菌锅121，蒸汽压为01MPA，灭菌时间15MIN。0057第二步，VK3溶液的配置。准确称取10MGVK3粉末到灭过菌的50ML。
30、的洁净离心管中，加入10ML无水乙醇，振荡混匀，使其充分溶解。0058第三步，氧化石墨烯预处理。称取0055G单层氧化石墨烯片状固体到灭过菌的50ML的洁净离心管中，加入10ML灭过菌的去离子水。在250W的超声波清洗机中，于室温下说明书CN104176732A6/6页8超声处理至氧化石墨烯全溶，得到分散性能较好的氧化石墨烯棕色悬浮液。0059第四步，向灭过菌的25ML的厌氧小瓶子中加入95ML第一步中制备的细菌悬浮液，加入10L第二步中制备的VK3，再加入1ML第三步中制备的氧化石墨烯悬浮液，混匀。每瓶通入3MIN的N2，以除去溶解氧。在室温静置10H，进行生物催化反应。0060第五步，将第。
31、四步生物催化完毕的反应液静置，10000R/MIN转速离心30MIN；向获得的混合物沉淀中加入1MOL/L稀盐酸100ML，搅拌均匀，室温下静置1H；以10000R/MIN转速离心30MIN，倾去上清液，用80乙醇溶液清洗沉淀，搅拌均匀，室温下静置1H，10000R/MIN转速离心30MIN倾去上清液，最后用去离子水清洗沉淀，如上重复3次，最后用去离子水洗到中性为止，将沉淀置于真空冷冻干燥箱中，50，真空度160PA，干燥时间为24H，得到纯净的石墨烯。0061实施例50062本发明一种生物催化制备石墨烯，包括以下制备步骤0063第一步，细菌悬浮液的制备。将活化好的枯草芽孢杆菌B168进行离心。
32、收集菌体，10000R/MIN转速离心10MIN。用灭过菌的基本培养基M9重悬，再次离心收集菌体，10000R/MIN转速离心10MIN，以去除原有的培养基。重复以上操作一次。最后用M9培养基重悬，并调节OD02。其中枯草芽孢杆菌培养基中包括酵母膏5G/L，蛋白胨10G/L，NACL10G/L，可溶性淀粉10G/L。M9培养基中包括NA2HPO47H2O128G/L，K2HPO43G/L，NACL05G/L，NH4CL1G/L，MGSO4024G/L，CACL200111G/L，葡萄糖4G/L。其中的MGSO4、CACL2、葡萄糖要和其他成分分开灭菌。所有的培养基选用高压灭菌锅121，蒸汽压为。
33、01MPA，灭菌时间15MIN。0064第二步，VK3溶液的配置。准确称取10MGVK3粉末到灭过菌的50ML的洁净离心管中，加入10ML无水乙醇，振荡混匀，使其充分溶解。0065第三步，氧化石墨烯预处理。称取0055G单层氧化石墨烯片状固体到灭过菌的50ML的洁净离心管中，加入10ML灭过菌的去离子水。在250W的超声波清洗机中，于室温下超声处理至氧化石墨烯全溶，得到分散性能较好的氧化石墨烯棕色悬浮液。0066第四步，向灭过菌的25ML的厌氧小瓶子中加入19ML第一步中制备的细菌悬浮液，加入20L第二步中制备的VK3，再加入1ML第三步中制备的氧化石墨烯悬浮液，混匀。每瓶通入3MIN的N2，。
34、以除去溶解氧。在室温静置05H，进行生物催化反应。0067第五步，将第四步生物催化完毕的反应液静置，10000R/MIN转速离心30MIN；向获得的混合物沉淀中加入1MOL/L稀盐酸100ML，搅拌均匀，室温下静置1H；以10000R/MIN转速离心30MIN，倾去上清液，用80乙醇溶液清洗沉淀，搅拌均匀，室温下静置1H，10000R/MIN转速离心30MIN倾去上清液，最后用去离子水清洗沉淀，如上重复3次，最后用去离子水洗到中性为止，将沉淀置于真空冷冻干燥箱中，50，真空度160PA，干燥时间为24H，得到纯净的石墨烯。说明书CN104176732A1/5页9图1图2A说明书附图CN104176732A2/5页10图2B图2C图3说明书附图CN104176732A103/5页11图4图5A说明书附图CN104176732A114/5页12图5B图5C说明书附图CN104176732A125/5页13图5D说明书附图CN104176732A13。