生物素二氨基衍生物及其与大环螯合剂的缀合物.pdf

本发明描述式(I)化合物其中基团如说明书中所定义；其制备方法，及其制备与放射性核素的缀合物以用于人和动物的治疗和诊断(特别是对病理状况诸如肿瘤的诊断和治疗)的用途。

权利要求书
1.  式(I)化合物

其中
A是CH2或CO；
B是H、CHO或COOH；
条件是当A是CH2时，Q是-(CH2)n-基团，其中n是4至12的整数，此时R不存在；当A是CO时，Q选自-(CH2)a-CH(R-)-(CH2)b-，其中a和b独立地为0至n-1的整数，且R如以下所定义；
W是C1-C12亚烷基或C2-C12亚烯基直链或官能化的聚乙二醇；或C6-C10芳香族残基；或glycofuranose残基；或
W，单独或与支持-(CH2)c-NHR′和-(CH2)d-NHR″链的氮原子一起，是含有一或多个选自O、N、S的杂原子的5或6员杂环基；
当W是芳香族残基、杂环基或糖部分时，支持-(CH2)c-NHR′和-(CH2)d-NHR″链的氮原子可选地不存在且-(CH2)c-NHR′和-(CH2)d-NHR″链直接且独立地键合到该芳香族环和杂环的碳或氮原子或glycofuranose残基的氧原子；
c和d独立地为3至10的整数；
R′和R″独立地为-Λ，其中-Λ是式(II)大环：

其中Y相同或不同且选自氢、直链或支链C1-C4烷基、-(CH2)m-COOH，其中m是1至3的整数；
X是氢或-CH2-U基团，其中U选自甲基、乙基或对氨基苯基，或X是-(CHJ)o-Z基团，其中o是1至5的整数，J是氢、甲基或乙基，Z是含有一或多个选自O、N-R1和S的杂原子的5或6员杂环基，其中R1是氢原子或直链或支链C1-C4烷基；或Z选自-NH2、-NH-C(＝NH-)-NH2或-S-R2，其中R2是直链或支链C1-C4烷基；
p是整数2或3；
R选自直链或支链C1-C4烷基、环烷基、杂环或-(CH2)q-T，其中T选自S-CH3、-OH或-COOH，且q是0、1或2。

2.  权利要求1的式(I)化合物，其中独立地A是CH2，B是H，Q是-(CH2)n-，其中n是4至8的整数，优选6，c和d皆为3或6，R′和R″是-Λ，其中Y始终是-CH2-COOH；X是氢，且p是2。

3.  权利要求1或2的式(I)化合物与放射性同位素的复合物。

4.  权利要求3的复合物，其中放射性同位素选自Fe-52、Mn-52m、Co-55、Cu-64、Ga-67、Ga-68、Tc-99m、In-111、I-123、I-125、I-131、P-32、Sc-47、Cu-67、Y-90、Pd-109、Ag-111、I-131、Pm-149、Re-186、Re-188、At-211、Bi-212、Bi-213、Rh-105、Sm-153、Lu-177和Au-198。

5.  权利要求3或4的复合物，其中Q是-(CH2)n-，n是4至8的整数，优选6，Y是-CH2-COOH，且放射性同位素是Y-90。

6.  药物和/或诊断组合物，其含有权利要求1或2的化合物，与适当的载体和/或赋形剂相混合。

7.  权利要求1或2的化合物制备用于治疗肿瘤的药物的用途。

8.  药物和/或诊断组合物，其含有权利要求3、4或5中任一项的复合物与适当的载体和/或赋形剂的混合物。

9.  权利要求3、4或5中任一项的复合物作为抗癌放射性药物的用途。

10.  用于肿瘤的放射治疗或诊断的试剂盒，其特征在于该试剂盒的至少一个组成部分含有权利要求1的化合物或权利要求3的复合物。

说明书生物素二氨基衍生物及其与大环螯合剂的缀合物
发明领域
本文描述的发明涉及经修饰的生物素，其用于制备与放射性核素的缀合物，所述缀合物用于人和动物的诊断和治疗，特别是用于对病理状况诸如肿瘤的诊断和治疗。
发明背景
肿瘤治疗大多通过使用靶向破坏癌细胞的物质来实施。这可以用细胞毒性物质来实现，所述细胞毒性物质必须穿透进入肿瘤细胞方能发挥其完全功效，或藉由使用具有足够能量的辐射处理肿瘤细胞以杀死所述细胞。对该两种情况，主要的问题是以选择性的方式将物质递送至靶细胞，以避免对周围健康细胞的可能损伤。对于放射性药物(即携带放射性部分的物质)，选择性地将活性部分(即放射性部分)递送至肿瘤靶，尽可能避免放射性核素在体内扩散或与肿瘤周围的健康细胞相互作用的问题被认为是特别重要的。
对所有涉及的问题及迄今提出的解决方案的讨论，请读者参阅转让给NeoRx Corporation的美国专利5,283,342、5,608,060及5,955,605。
在这些文件中，尤其讨论了带有放射性核素的分子对机体代谢攻击的抗性的问题。特别是，最为仔细研究的案例是生物素分子，由于其众所周知的与抗生物素蛋白的相互作用，生物素是用于运送放射性核素至肿瘤细胞的首选之一。生物素经由接头与放射性核素螯合部分(例如四氮杂环十二烷四乙酸[DOTA]分子)结合。与使用生物素-DOTA缀合物相关的主要问题之一是含有生物素分子的复合物(其中生物素经由接头与放射性核素连接)对生物素酰胺酶(使该复合物中存在的肽键断裂的酶)的抗性。该肽键源自于螯合剂与生物素的结合。
在其期望的特征中，该复合物必须迅速且有效地自体内消除且必须足够小(分子量＜1000)而易于分布至细胞外液中，在那里复合物将结合肿瘤细胞。此外，复合物必须显示出经证实的体内稳定性，非肿瘤细胞摄取仅最低限度且迅速(肾脏)清除，而且必须不被代谢。
再者，螯合部分必须使得其不在体内被释出，因而能于体内运送潜在毒性的化合物。本领域的专家清楚地明了螯合部分释出放射性核素的问题，包括对身体完全为外来物的金属离子，其可被赋予多种类型的放射性甚至是高能量辐射，因而具有高度危害性。
在相同申请人的先前专利申请(WO 02/066075)中，我们小组报告了一种新颖的生物素-DOTA缀合物的合成以及对该新颖衍生物进行的结合、稳定性及亲和性研究。该新颖缀合物的新颖性在于酰胺羧基被还原为亚甲基基团，从而产生N-氨基己基生物素酰氨基衍生物(r-BHD)，其中酰胺被转化为仲胺而未影响涉及Av/Sav结合的生物素侧臂的长度。在该化合物中，DOTA配体经由四个N-乙酸侧臂之一直接与经还原的生物素六亚甲基二胺衍生物的氨基连接。
此外，r-BHD的合成灵活性能产生多种新颖的生物素衍生物，例如以两个DOTA螯合剂缀合到生物素的侧链，目的在于藉由运送更高辐射剂量至肿瘤而增加靶向放射性核素治疗的功效。
Axworthy Donald B.等人的美国专利申请2004/0241172公开了经由特定的接头而掺入两个DOTA基团的生物素衍生物，所述接头经由苄基而直接与DOTA分子的核心键合。对DOTA基团的这种修饰作用可降低螯合部分的结合能力。
为改进辐射/剂量比例，我们已设计并合成了一类新的生物素衍生物。
发明说明
本发明的主要目的是提供新颖的生物素衍生物，其能满足高辐射/剂量比的要求。
特别是，本发明在于一类新的生物素衍生物，其中每个生物素分子携带两个螯合基团。
以此方式使用相同摩尔量的生物素衍生物可使到达肿瘤细胞的放射性加倍。
因此，本文描述的发明的目的之一是如下的式(I)化合物：

其中
A是CH2或CO；
B是H、CHO或COOH；
条件是当A是CH2时，Q是-(CH2)n-基团，其中n是4至12的整数，此时R不存在；当A是CO时，Q选自-(CH2)a-CH(R-)-(CH2)b-，其中a和b独立地为0至n-1的整数，且R如以下所定义；
W是C1-C12亚烷基或C2-C12亚烯基直链或官能化的聚乙二醇；或C6-C10芳香族残基；或glycofuranose残基；或
W，单独或与支持-(CH2)c-NHR′和-(CH2)d-NHR″链的氮原子一起，是含有一或多个选自O、N、S的杂原子的5或6员杂环基；
当W是芳香族残基、杂环基或糖部分时，支持-(CH2)c-NHR′和-(CH2)d-NHR″链的氮原子可选地不存在且-(CH2)c-NHR′和-(CH2)d-NHR″链直接且独立地键合到该芳香族环和杂环的碳或氮原子或glycofuranose残基的氧原子；
c和d独立地为3至10的整数；
R′和R″独立地为-Λ，其中-Λ是式(II)大环：

其中Y相同或不同且选自氢、直链或支链C1-C4烷基、-(CH2)m-COOH，其中m是1至3的整数；
X是氢或-CH2-U基团，其中U选自甲基、乙基、对氨基苯基，或X是-(CHJ)o-Z基团，其中o是1至5的整数，J是氢、甲基或乙基，Z是含有一或多个选自O、N-R1和S的杂原子的5或6员杂环基，其中R1是氢原子或直链或支链C1-C4烷基；或Z选自-NH2、-NH-C(＝NH-)-NH2或-S-R2，其中R2是直链或支链C1-C4烷基；
p是整数2或3；
R选自直链或支链C1-C4烷基、环烷基、杂环或-(CH2)q-T，其中T选自S-CH3、-OH或-COOH，且q是0、1或2。
直链或支链C1-C4烷基表示甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基或叔丁基。
5或6员杂环是环中具有至少一个选自O、N-R1或S的杂原子的芳香族或非芳香族杂环，如2-、3-或4-吡啶基或2-、4-或5-咪唑基。
本发明的第一组优选的化合物是以下式(I)化合物：其中A是CH2，B是H，Q是-(CH2)n-，其中n是4至8的整数，优选6，c和d皆为3或6，R′和R″是-Λ，其中Y始终是-CH2-COOH；X是氢，且p是2。
本文描述的发明的另一目的是式(I)化合物与放射性同位素用于诊断和/或治疗应用。这些同位素的实例是Fe-52、Mn-52m、Co-55、Cu-64、Ga-67、Ga-68、Tc-99m、In-111、I-123、I-125、I-131、P-32、Sc-47、Cu-67、Y-90、Pd-109、Ag-111、Pm-149、Re-186、Re-188、At-211、Bi-212、Bi-213、Rh-105、Sm-153、Lu-177和Au-198。
本发明的第一组优选的复合物是以下那些：其中在式(I)化合物中，A是CH2，B是H，Q是-(CH2)n-，其中n是4至8的整数，优选6，c和d共同为3或6，R′和R″是-Λ，其中Y始终是-CH2-COOH；X是氢，p是2，且放射性同位素是Y-90。
本文描述的发明的其它目的是制备式(I)化合物及其与放射性药物的复合物的方法。
本文描述的发明的其它目的是药物和/或诊断组合物，其含有上述的式(I)化合物及其复合物。
本文描述的发明的其它目的是式(I)化合物及其与放射性同位素的复合物作为药物或诊断工具的用途，特别是制备用于肿瘤治疗或诊断的药物。
本文所述的发明的这些和其它目的将由以下部分及通过实验实施例加以详细说明。
依据下述的反应流程可制备本文所述发明的化合物，该反应流程包括步骤：
a)在生物素的羧基与H2N-Q-NH2二胺的伯胺基团之间形成酰胺键，如有必要另一个伯胺基团经适当地保护(例如藉由使用Boc基团)；或可选择地，使用α，ω-二氨基酸(即Lys)的α-α-NH2基团可进行偶合，其中ω-氨基适当地被保护；
b)令伯胺基团去保护；
c)若A是CH2基团，将酰胺基团还原为胺；
d)将该胺与式(III)的N-保护的N，N-取代的甘氨酸胺偶合，

该式(III)的N-保护的N，N-双取代的甘氨酸胺可通过本领域技术人员已知的方法制备；
其中V和L是适当的保护基且c和d独立为3至10；
e)与期望的式(II)螯合剂-Λ缀合。
生物素是可购得的商品，氨基酸Lys也是如此。H2N-Q-NH2二胺可在市场上购得，且在任何情况下可通过采用已知方法经数个步骤制备。
使用适当的保护基(如Boc或Fmoc)可轻易达成对伯胺基团的保护，且这些保护基均可从文献报道中找到(参阅例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，“Protectivegroups in organic synthesis”，3rd Ed.，J.Wiley & Sons，Inc.，New York，1999；Handbook of Reagents forOrganic Synthesis，“Oxidizing and Reducing Agents”，S.D.Burke和R.L.Danheiser编，J.Wiley & Sons，Inc.，New York，1999)。
可选地，依据上述的反应流程但缺少其中的步骤c可制备式(I)化合物(如果A是CO基团)。
依据肽合成的已知方法(P.Lloyd-Williams，F.Albericio，E.Giralt，“Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides andProteins”，CRC Press，Boca Raton，New York，1997)可完成对生物素的-COOH基团的活化；若使用α，ω-二氨基酸(即Ly s)进行偶合反应，则可遵循固相肽合成技术中已知的方法，通过将氨基酸锚定在适当的树脂上来进行该反应。
使用本领域已知的传统方法(例如Pa ganelli，Chinol等人European Journal of Nuclear Medicine Vol.26，No 4；April 1999；348-357所述)，进行本发明的化合物与放射性同位素的缀合反应以生成本发明所描述的复合物。
本发明的优选化合物之一是这样的，其中A是CH2，Q是-(CH2)n-(其中n优选是6)，c＝d是3或6，R′＝R″是-Λ(其中m是1)，Y始终是-CH2-COOH；X是氢，p是2(DOTA螯合剂)。
制备该优选化合物的方法包括下述的步骤：
a)在生物素的羧基与六亚甲基二胺(如果必要适当地经保护，例如藉由使用Boc基团)的伯胺基团之间形成酰胺键；
b)令六亚甲基二胺的胺基团去保护；
c)将酰胺基团还原为胺基团；
d)与式(III)胺(其中c＝d＝3或6，V＝L是Fmoc保护基)缀合；
e)令所得的胺去保护；
f)与螯合剂-Λ缀合。
本发明方法中的步骤a)是在生物素的羧基与六亚甲基二胺-Boc的伯胺基团之间形成酰胺键。将生物素用HATU处理以于原位生成极具活性的酯，该酯与六亚甲基二胺-Boc的胺基团反应以生成相关的酰胺。尤其用于固相肽合成的该活化机制需要碱性介质。为防止碱与活性酯反应，使用叔有机碱诸如二异丙基乙胺(DIPEA)或N-甲基吗啉(NMM)。为防止生物素与二胺链的两端结合，使用Boc(叔丁氧羰基)保护六亚甲基二胺的两个胺基团之一是必要的。经蒸发溶剂(DMF)及使用水进行沉淀后，自反应介质分离终产物。经于丙醇中再结晶析出后的产物藉由1H-NMR、元素分析及ES I-MS表征。反应产率约88％。
于步骤b)中，令生物素六亚甲基二胺-Boc溶解于AcOEt/HCl混合物(约3M)中以使Boc基团脱离。经除去该溶剂混合物后，将产物冷冻干燥以完全除去HCl。于碱性pH的水溶液中藉由再结晶析出以纯化样品，并藉由1H-NMR和TLC表征。
于步骤c)中，使用BH3THF还原酰胺基团。因该还原剂极具反应性，该过程必须于无水条件下进行。于反应前将起始物置于真空下并随后溶解于无水THF(经钠和二苯甲酮蒸馏)中。于氮气氛下回流反应混合物直至酰胺基团完全还原为止(藉由1H-NMR光谱监测)。经减压下蒸发溶剂后，将反应混合物用HCl水溶液处理。冷冻干燥该酸溶液后，藉由于碱性pH的水溶液中再结晶析出随后进行反相柱色谱以纯化产物。使用分析性TLC分析产物以显示其纯度。反应产率为约55％。
步骤d)提供于作为溶剂的NMP中藉由HATU/NMM系统活化，令经还原的生物素六亚甲基二胺与经保护的胺(III)进行缀合反应。
于步骤e)中，使用碱哌啶除去该Fmoc基团。
步骤f)提供两个DOTA基团的偶合，使用在水性介质中形成酰胺键的特定反应试剂进行：1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺氢氯化物(EDC)和磺基-NHS。将DOTA(相对于生物素衍生物为4摩尔当量)溶解于水中并调整至适宜主要活化四个羧基之一的pH值(G.Sabatino，M.Chinol，G.Paganelli，S.Papi，M.Chelli，G.Leone，A.M.Papini，A.DeLuca和M.Ginanneschi，J.Med.Chem.2003，46，3170-3173)。以此方式，我们可减少得到副产物的可能性。向该碱性溶液中加入磺基-NHS，最后加入EDC。于原位生成活性酯后，加入经还原的生物素六亚甲基二胺的N，N-双烷基氨基甘氨酸衍生物，检查溶液的pH是否维持约7.5。藉由SPE(固相萃取)预先纯化粗产物并藉由半制备型RP-HPLC进行纯化。
本发明的目的是药物或诊断组合物，其含有作为活性成份的至少一种式(I)化合物，其亦可为与放射性同位素的复合物形式，或在所述式(I)化合物的情况下，与其它用于治疗本发明所述疾病的活性成份(例如具有抗癌活性的其它产物)联合；亦可为单独的剂型或为适于联合治疗的形式。本发明的活性成份将为与制药技术惯用的适当载体和/或赋形剂(如“Remington′s Pharmaceutical SciencesHandbook”(最新版本)中所述那些)的混合物的形式。本发明的组合物应含有治疗上有效量的活性成份。本领域专家(例如临床医师或初级保健医师)将依据欲治疗的疾病类型和患者情况，或伴随其它活性成份的给药，来确定剂量。
药物组合物的实例是允许非肠道或局部区域给药的那些。适宜此目的的药物组合物是溶液、悬浮液、或有待在使用时重配的冻干形式。
本发明适于产业上使用的形式是用于癌症放射治疗的试剂盒，如例如欧洲专利0496074、Paganelli，Chinol等人在European Journalof Nuclear Medicine Vol.26，No 4，April 1999，348-357中发表的文章，美国专利5,968,405及相关文献中所述。
本发明的另一目的是藉由放射性用于肿瘤的治疗或诊断的试剂盒，其特征在于该试剂盒的至少一个组成部分含有式(I)化合物或其与适当的放射性同位素的复合物之一。
本发明的化合物可用于制备用于肿瘤的治疗和诊断的治疗剂和/或诊断剂。
本发明的化合物是用于制备用于肿瘤的治疗和诊断的治疗剂和/或诊断剂。
本发明的化合物，经与诊断和/或治疗用的放射性同位素(如上所述)结合后，可用于放射性标记抗生物素蛋白胶体制剂以用于不同的医药应用。
例如，它们可用于使用抗癌放射性药物的肿瘤治疗方法，如欧洲专利0496074、Paganelli，Chinol等人在European Journal ofNuclear Medicine Vol.26，No 4，April 1999，348-357中发表的文章，美国专利5,968,405及相关文献中所述那些。
以下实施例进一步说明本发明。
实施例
制备双DOTA-C3-化合物4
依循本文所述步骤制备化合物4。
合成经还原的生物素酰氨基己胺(r-BHD)-化合物1
化合物1的详细合成操作及理化性质描述于G.Sabatino，M.Chinol，G.Paganelli，S.Papi，M.Chelli，G.Leone，A.M.Papini，A.De Luca和M.Ginanneschi，J.Med.Chem.，2003，46，3170-3173的文章中。在Varian 400上于DMSO-d6溶液中记录本文报道的产物的NMR光谱。此实施例的N，N-双[3-(Fmoc-氨基)丙基]甘氨酸以硫酸钾盐形式购自Fluka(瑞士)。
合成与N，N-双[(3-氨基)丙基]甘氨酸的r-BHD缀合物-化合物2
将HATU(66.5mg，0.175毫摩尔，0.7摩尔当量)的NMP(0.5mL)溶液加入至N，N-双[3-(Fmoc-氨基)丙基]甘氨酸硫酸钾(115.5mg，0.15毫摩尔，0.6摩尔当量)和NMM(33.05μL，0.3毫摩尔，1.2摩尔当量)在NMP(1mL)中的溶液中。以5分钟的时间将该溶液逐滴加入至含有NMM(27.5μL，0.25毫摩尔，1摩尔当量)的r-BHD(化合物1)(100mg，0.25毫摩尔)在NMP(5mL)中的悬浮液中。室温下搅拌该反应混合物，藉由RP-HPLC监测反应(洗脱液：20分钟内30％至100％的B；tR＝13.4分钟)。2.5小时后，再次将化合物1(57.7mg，0.08毫摩尔，0.3摩尔当量)加入至反应混合物中。2.5小时后，中止反应并于减压下蒸发溶剂。于搅拌下将黄橙色油状物悬浮于0℃水中，得到白色沉淀物，经RP-CC纯化(LiChroprep RP-8，40-63μm；170×20mm；洗脱液：CH3CN/H2O/HCl＝50∶50∶0.1，1mL/分钟)得到化合物2(130mg；55％产率)。经T.L.C.检测(CH3CN/H2O/HCl＝50∶50∶0.1)，该Fmoc保护的双氨基衍生物(化合物2)似乎是纯的。
1H NMR(200MHz，DMSO)：δ9.63(br s，1H)，8.64(br s，3H)，7.87(d，4H)，7.65(d，4H)，7.43-7.27(m，8H)，6.41(d，2H)，4.31-4.14(m，8H)，3.85(s，2H)，3.14-3.03(m，11H)，2.82-2.76(m，4H)，2.6(d，2H)，1.76-1.25(m，20H)；ES I-MS(m/e)：计算值[M+H]+944.5，实测值944.5。
将该Fmoc保护的双胺衍生物(化合物2)(88mg，0.09毫摩尔)溶解于含有25％哌啶的DMF(5mL)中。将该溶液于室温保持搅拌达6小时并藉由RP-HPLC监测反应(洗脱液：20分钟内30至100％的B；tR＝16.7分钟)。减压下蒸发该反应混合物，将粗油状物溶解于最少量的MeOH中，并用Et2O沉淀。将所收集的固体用乙醚冲洗两次，溶解于水中并冷冻干燥，生成白色产物，经SPE(固相萃取；LiChroprepRP-18，25-40μm；170×20mm；洗脱液：H2O 100％-MeOH自4至100％)纯化。收集洗脱的级分并冷冻干燥，得到去保护的双胺(化合物3)(30mg，75％产率)。
1HNMR(200MHz，CDCl3)：δ8.12(br s，2H)，6.45(s，2H)，4.26(m，1H)，4.12(m，1H)，3.59-2.95(m，7H)，2.95-2.70(m，12H)，2.50(d，2H)，1.80-1.20(m，20H)；ESI-MS(m/e)：计算值[M+H]+443.6，实测值443.1。
化合物3与经活化的DOTA缀合以获得双DOTA-C3化合物4
将磺基-NHS(26mg，0.12毫摩尔)加入至DOTA·0.31H2O(49.2mg，0.12毫摩尔)的H2O(0.750mL)溶液中。然后利用0.1M NaOH调节pH至6.5，且于0℃下逐滴加入EDC(23mg，0.12毫摩尔)的H2O(0.5mL)溶液。
0℃下搅拌该反应混合物30分钟，随后在5分钟期间逐滴加入化合物3(15mg，0.03毫摩尔)的H2O(0.750mL)溶液(pH7.8)。
藉由RP-HPLC(洗脱液：30分钟内5至100％的B；tR＝16.4分钟)检验该反应。
2小时后，将反应混合物冷冻干燥并藉由SPE(固相萃取；LiChroprep RP-18，25-40μm；15×65mm；洗脱液：a)H2O；b)4％MeOH水溶液；c)100％MeOH)预先纯化粗化合物。对经萃取的级分的HPLC检验证实化合物4主要在级分c中。蒸发该甲醇溶液并藉由RP-HPLC(洗脱液：30分钟内5至30％的B；tR＝16.4分钟)纯化产物，得到白色固体的纯双DOTA(化合物4)(15mg，24％产率)。
ESI-MS：m/e计算值[M+H]+1272.7，实测值1272.7；[M-H]+1270.7，实测值1270.9。分析(C56H101N15O16S·6TFA·5H2O)C，H，N。
利用以上实施例所述的化合物进行标记试验、放射化学纯度分析及血清稳定性试验。
利用双DOTA-C3的MilliQ水溶液(2mg/mL)进行标记试验。将1.0mM的乙酸钠缓冲液(pH5.0)加入至双DOTA-C3中，随后加入比活性为1mC i/7.2μg的放射性同位素氯化物溶液(MCl3，M＝111In、90Y、177Lu)。最后于95℃下温育这些溶液30分钟。
使用硅胶瞬时薄层色谱(ITLC-SG)以测定放射化学纯度(RCP)。将一等份经放射性标记的混合物加入至摩尔过量的抗生物素蛋白和DTPA中，随后将一滴点在ITLC试条上并经盐水显影。利用Raadio-TLC装置分析该试条；此系统中，由双DOTA-C3和抗生物素蛋白形成的复合物留在原点，而未结合的放射性金属被DTPA复合并随溶剂前沿迁移。典型得到的RCP值是＞96％。
使用和不使用抗坏血酸(AA)作为自由基清除剂，进行稳定性测定。于37℃将经标记的分子的等份试样与4倍体积的盐水或AA溶液(4mg/mL于1.0M乙酸钠缓冲液pH5.0中)温育。于24和48小时进行稳定性研究并使用上述的ITLC-SG方法计算RCP值。结果显示在AA的存在下经放射性标记的M-双DOTA-C3对辐射分解稳定长达48小时。