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本发明提供包括异源多核苷酸序列的植物细胞，所述异源多核苷酸序列能够指导过量表达可逆糖基化多肽及或其功能部分。

权利要求书
1.   一种植物细胞，所述植物细胞包含异源多核苷酸序列，所述异源多核苷酸序列能够指导过量表达可逆糖基化多肽或其功能部分。

2.   权利要求1的植物细胞，其中所述异源多核苷酸是转录调节子，所述可逆糖基化多肽是内源可逆糖基化多肽。

3.   权利要求1的植物细胞，其中所述转录调节子是启动子或增强子。

4.   权利要求1的植物细胞，其中所述异源多核苷酸编码所述可逆糖基化多肽或其所述功能部分。

5.   权利要求4的植物细胞，其中所述可逆糖基化多肽是1类可逆糖基化多肽。

6.   权利要求5的植物细胞，其中所述可逆糖基化多肽由选自以下的序列编码：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：25-28。

7.   权利要求1的植物细胞，其中所述功能部分是SEQ ID NO：19-24的氨基酸270至末端。

8.   权利要求1的植物细胞，其中植物细胞形成植物组织部分或整株植物。

9.   权利要求1的植物细胞，所述植物细胞还包含另外的异源多核苷酸。

10.   权利要求1的植物细胞，其中所述另外的异源多核苷酸编码选自以下的分子：报道分子、抗病毒分子、病毒部分、除草剂抗性分子、生物性胁迫耐受分子、非生物性胁迫耐受分子、药物分子、生长诱导分子和生长抑制分子。

11.   一种改变植物组织的胞间连丝传导性的方法，该方法包括调节可逆糖基化多肽或其功能部分在植物组织细胞内的表达水平，从而改变植物组织中的胞间连丝传导性。

12.   权利要求11的方法，其中改变胞间连丝传导性是降低胞间连丝传导性。

13.   权利要求12的方法，其中降低胞间连丝传导性是通过增量调节所述细胞内所述可逆糖基化多肽的所述表达水平实现的。

14.   权利要求13的方法，其中所述增量调节是通过在植物组织中表达编码所述可逆糖基化多肽的异源多核苷酸实现的，所述可逆糖基化多肽与膨化多肽融合在一起。

15.   权利要求11的方法，其中改变胞间连丝传导性是增加胞间连丝传导性。

16.   权利要求15的方法，其中增加胞间连丝传导性是通过减量调节所述细胞内所述可逆糖基化多肽的所述表达水平实现的。

17.   权利要求16的方法，其中所述减量调节是通过与编码所述可逆糖基化多肽的多核苷酸序列至少部分互补的多核苷酸实现的。

18.   权利要求11的方法，其中所述可逆糖基化多肽由选自以下的序列编码：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：25-28。

19.   权利要求11的方法，其中所述功能部分是SEQ ID NO：19-24的氨基酸270至末端。

20.   一种抗植物病毒扩散的基因修饰植物组织，所述植物组织包含过量表达可逆糖基化多肽或其功能部分的细胞。

21.   权利要求20的基因修饰植物组织，其中所述可逆糖基化多肽是1类可逆糖基化多肽。

22.   权利要求21的基因修饰植物组织，其中所述可逆糖基化多肽由选自以下的序列编码：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：25-28。

23.   权利要求20的基因修饰植物组织，其中所述功能部分是SEQID NO：19-24的氨基酸270至末端。

24.   权利要求20的基因修饰植物组织，其中基因修饰植物选自番茄、马铃薯、黄瓜、水稻、玉米、小麦、燕麦、大麦、黑麦、大豆、低芥酸油菜、欧洲油菜和棉花。

25.   一种产生抗植物病毒扩散的植物组织的方法，该方法包括在植物组织的细胞内过量表达可逆糖基化多肽或其功能部分，从而产生抗植物病毒扩散的植物组织。

26.   权利要求25的方法，其中所述过量表达是通过将编码所述可逆糖基化多肽或其所述功能部分的核酸构建体导入所述细胞实现的。

27.   权利要求25的方法，其中所述可逆糖基化多肽是1类可逆糖基化多肽。

28.   权利要求27的方法，其中所述可逆糖基化多肽由选自以下的序列编码：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：25-28。

29.   权利要求25的方法，其中所述功能部分是SEQ ID NO：19-24的氨基酸270至末端。

30.   权利要求20的方法，其中所述植物组织选自以下的植物：番茄、马铃薯、黄瓜、水稻、玉米、小麦、燕麦、大麦、黑麦、大豆、低芥酸油菜、欧洲油菜和棉花。

31.   一种具有矮化表型的基因修饰植物，所述植物包含过量表达可逆糖基化多肽的细胞。

32.   权利要求31的基因修饰植物，其中所述可逆糖基化多肽是1类可逆糖基化多肽。

33.   权利要求32的基因修饰植物，其中所述可逆糖基化多肽由选自以下的序列编码：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：25-28。

34.   权利要求31的基因修饰植物，其中所述功能部分是SEQ IDNO：19-24的氨基酸270至末端。

35.   权利要求31的基因修饰植物，其中基因修饰植物选自番茄、马铃薯、黄瓜、水稻、玉米、小麦、燕麦、大麦、黑麦、大豆、低芥酸油菜、欧洲油菜和棉花。

36.   一种产生具有矮化表型的植物的方法，该方法包括在植物细胞内过量表达可逆糖基化多肽，从而产生具有矮化表型的植物。

37.   权利要求36的方法，其中所述过量表达是将编码所述可逆糖基化多肽或其所述功能部分的核酸构建体导入所述细胞实现的。

38.   权利要求36的方法，其中所述可逆糖基化多肽是1类可逆糖基化多肽。

39.   权利要求38的方法，其中所述可逆糖基化多肽由选自以下的序列编码：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：25-28。

40.   权利要求36的方法，其中所述功能部分是SEQ ID NO：19-24的氨基酸270至末端。

41.   权利要求36的方法，其中植物选自番茄、马铃薯、黄瓜、水稻、玉米、小麦、燕麦、大麦、黑麦、大豆、低芥酸油菜、欧洲油菜和棉花。

42.   一种防止病毒构建体向特定植物组织扩散的方法，该方法包括在特定植物组织中过量表达可逆糖基化多肽，从而防止病毒构建体向特定植物组织扩散。

43.   权利要求42的方法，其中病毒构建体是表达分子的病毒表达构建体。

44.   权利要求42的方法，其中所述特定植物组织是植物的商用部分。

45.   权利要求42的方法，其中所述植物的商用部分选自果实、种子、块茎、鳞茎、茎、根和花。

46.   权利要求43的方法，其中所述分子选自报道分子、抗病毒分子、病毒部分、除草剂抗性分子、生物性胁迫耐受分子、非生物性胁迫耐受分子、药物分子、生长诱导分子和生长抑制分子。

47.   权利要求43的方法，其中在所述特定植物组织中实现过量表达所述可逆糖基化多肽，使得所述分子能够累积在特定植物组织中。

48.   一种表达构建体，所述表达构建体包含至少编码可逆糖基化多肽的功能部分的第一多核苷酸序列。

49.   权利要求48的表达构建体，所述表达构建体还包含与所述第一多核苷酸序列在翻译时融合的第二多核苷酸序列。

50.   一种降低植物组织中胞间连丝传导性的方法，该方法包括在植物组织细胞内表达能够靶向胞间连丝的膨化多肽，从而降低植物组织中的胞间连丝传导性。

说明书用于产生胞间连丝传导性发生改变的植物的构建体和方法
发明领域与发明背景
本发明涉及具有胞间连丝传导性发生改变的植物及可用于产生这种植物的构建体和方法。
胞间连丝(Pd)是特化的膜通道，胞间连丝使相邻的植物细胞相互连接，并促进通过细胞壁进行直接的胞质细胞间转运。通过胞间连丝的转运介导许多过程，其中，信息传递使得发育协调、使光合作用产物从成熟组织运输到发育组织、响应病原体侵袭、系统性基因沉默等(有关综述见Ding等，1999；Zambryski和Crawford，2000；Haywood等，2002；Heinlein，2002；Heinlein和Epel，2004)。除正常功能外，胞间连丝被病毒和类病毒利用以进行感染的细胞间转移与远距离扩散(有关综述见Ding等，1999；Beachy和Heinlein，2000；Citovsky和Zambryski，2000；Gafni和Epel，2002；Heinlein和Epel，2004)。
在高等植物中，胞间连丝可以是单同轴通道(mono-coaxialtunnel)，称为简单胞间连丝，或者可以是分支的，形成相互连接的同轴通道网(Ehlers和Kollmann，2001)。在嫩叶(库叶)中，大多数胞间连丝是简单胞间连丝，而在成熟叶(源叶)中则即有简单胞间连丝又有分支胞间连丝(Oparka等，1999)。胞间连丝的外边界被与两个相邻细胞的质膜(PM)连成一体的膜划分出来。与外质膜同心的是被称为连丝微管的第二层膜，衍生自两个细胞的内质网(ER)膜并与之连为一体。同心膜之间是使相邻细胞的细胞质相互连接的套管(sleeve)。高分辨率电子显微图显示该套管内部为颗粒，这曾被不同地解释为嵌入质膜中(Ding等，1992)和/或嵌入连丝微管中(Botha等，1993)，或者全部存在于胞质套管(cytoplasmic sleeve)内(Overall，1999)。
与结构分析相反，有关胞间连丝生化组成的认识仍不完整，大多是因为难以分离出纯的无亚细胞膜污染物的胞间连丝。本发明的发明人以前曾经公开了分离含有嵌入胞间连丝的细胞壁的方法(Epel等，1996)。从由黄化玉米幼苗中胚轴制备的细胞壁组分提取的细胞壁缔合蛋白质(Wall associated protein，WAP)，用SDS-PAGE进行分离，该组分极其富含一条约41kDa的成分，制备抗该条带的抗血清。该抗血清(称为S-41)主要免疫定位在胞间连丝和高尔基体上(Epel等，1996)。有报道指出用3M NaCl或pH 11，但不能用2％Triton X-100，将使41kDa蛋白质从细胞壁组分中释放出来，表明该蛋白质是外周膜蛋白(Epel等，1996)。
当本申请的发明人将本发明付诸实施时，对编码用盐可提取的41kDa蛋白质的基因(本文称为SE-WAP41)进行了克隆和测序，结果显示它是可逆糖基化多肽(Reversibly Glycosylated Polypeptide，RGP)蛋白质家族的一员。当本申请的发明人进一步将本发明付诸实施时，还指出1类可逆糖基化多肽(本文亦称C1RGP)靶向胞间连丝并改变其传导性。因此，如本文将进一步描述的一样，本发明的发明人提出可逆糖基化多肽可用于调节植物病毒的扩散、改变植物形态以及用于其它商业上重要的应用中。
发明概述
本发明一方面提供植物细胞，该细胞包含异源多核苷酸序列，该序列能够指导过量表达可逆糖基化多肽或其功能部分。
本发明又一方面提供抗植物病毒扩散的基因修饰植物组织，该组织包含过量表达可逆糖基化多肽或其功能部分的细胞。
本发明另一方面提供改变植物组织的胞间连丝传导性的方法，该方法包括调节可逆糖基化多肽或其功能部分在植物组织细胞内的表达水平，从而改变植物组织的胞间连丝传导性。
本发明再一方面提供产生抵抗植物病毒扩散的植物组织的方法，该方法包括在植物组织的细胞内过量表达可逆糖基化多肽或其功能部分，从而产生抵抗植物病毒扩散的植物组织。
根据下述本发明优选实施方案的另一特征，异源多核苷酸是转录调节子，可逆糖基化多肽是内源可逆糖基化多肽。
根据所述优选实施方案的又一个特征，转录调节子是启动子或增强子。
根据所述优选实施方案的又一个特征，异源多核苷酸编码可逆糖基化多肽或其功能部分。
根据所述优选实施方案的又一个特征，可逆糖基化多肽是1类可逆糖基化多肽。
根据所述优选实施方案的又一个特征，可逆糖基化多肽由选自以下的序列编码：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：25-28。
根据所述优选实施方案的又一个特征，功能部分是SEQ ID NO：19-24的氨基酸270至末端(amino acids 270-end)。
根据所述优选实施方案的又一个特征，植物细胞/组织形成植物组织部分或整株植物。
根据所述优选实施方案的又一个特征，植物细胞/组织或植物还包含另外的异源多核苷酸。
根据所述优选实施方案的又一个特征，另外的异源多核苷酸编码选自以下的分子：报道分子、抗病毒分子、病毒部分、除草剂抗性分子、生物性胁迫耐受分子、非生物性胁迫耐受分子、药物分子、生长诱导分子和生长抑制分子。
根据所述优选实施方案的又一个特征，改变胞间连丝传导性是降低胞间连丝传导性。
根据所述优选实施方案的又一个特征，降低胞间连丝传导性是通过增量调节细胞中可逆糖基化多肽的表达水平实现的。
根据所述优选实施方案的又一个特征，增量调节是通过植物组织中表达编码可逆糖基化多肽的异源多核苷酸实现的，该可逆糖基化多肽与膨化多肽(bulking polypeptide)融合在一起。
根据所述优选实施方案的又一个特征，改变胞间连丝传导性是增加胞间连丝传导性。
根据所述优选实施方案的又一个特征，增加胞间连丝传导性是通过减量调节细胞中可逆糖基化多肽的表达水平实现的。
根据所述优选实施方案的又一个特征，减量调节是通过与编码可逆糖基化多肽的多核苷酸序列至少部分互补的多核苷酸实现的。
根据所述优选实施方案的又一个特征，植物选自番茄、马铃薯、黄瓜、水稻、玉米、小麦、燕麦、大麦、黑麦、大豆、低芥酸油菜(canola)、欧洲油菜(rape)和棉花。
根据所述优选实施方案的又一个特征，过量表达是通过将编码可逆糖基化多肽或其功能部分的核酸构建体导入细胞实现的。
本发明再一方面提供具有矮化表型的基因修饰植物，该植物包含过量表达可逆糖基化多肽的细胞。
根据所述优选实施方案的又一个特征，基因修饰植物选自番茄、马铃薯、黄瓜、水稻、玉米、小麦、燕麦、大麦、黑麦、大豆、低芥酸油菜、欧洲油菜和棉花。
本发明又一方面提供产生具有矮化表型的植物的方法，该方法包括在植物细胞内过量表达可逆糖基化多肽，从而产生具有矮化表型的植物。
本发明另再有一方面提供防止病毒构建体向特定植物组织扩散的方法，该方法包括在特定植物组织中过量表达可逆糖基化多肽，从而防止病毒构建体向特定植物组织扩散。
根据所述优选实施方案的又一个特征，病毒构建体是表达分子的病毒表达构建体。
根据所述优选实施方案的又一个特征，特定植物组织是植物的商用部分。
根据所述优选实施方案的又一个特征，植物的商用部分选自果实、种子、块茎、鳞茎、茎、根和花。
根据所述优选实施方案的又一个特征，所述分子选自报道分子、抗病毒分子、病毒部分、除草剂抗性分子、生物性胁迫耐受分子、非生物性胁迫耐受分子、药物分子、生长诱导分子和生长抑制分子。
根据所述优选实施方案的又一个特征，特定植物组织中过量表达可逆糖基化多肽使得该分子能够累积在特定植物组织中。
本发明又一方面提供表达构建体，该表达构建体包含至少编码可逆糖基化多肽的功能部分的第一多核苷酸序列。
根据所述优选实施方案的又一个特征，表达构建体还包含能够指导第一多核苷酸序列在植物细胞内表达的启动子序列。
根据所述优选实施方案的又一个特征，表达构建体还包含在翻译时与第一多核苷酸序列融合的第二多核苷酸序列。
根据所述优选实施方案的又一个特征，编码多肽的第二多核苷酸序列选自GUS、tdTomato(有关综述参见Wei Wen Su 2005)和GUS-tdTomato融合物。
本发明再一方面提供嵌合多核苷酸，该嵌合多核苷酸包含至少编码可逆糖基化多肽的功能部分的多核苷酸序列及与之连接的异源多核苷酸序列。
本发明另再有一方面提供降低植物组织的胞间连丝传导性的方法，该方法包括表达能够靶向植物组织细胞内胞间连丝的膨化多肽，从而降低植物组织中胞间连丝的传导性。
根据所述优选实施方案的又一个特征，膨化多肽包括胞间连丝寻靶部分。
根据所述优选实施方案的又一个特征，胞间连丝寻靶部分衍生自可逆糖基化多肽。
除非另有说明，否则所有本文所用科技术语都与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义相同。尽管在实际当中或在本发明检验中，可以使用类似于或等同于本文所述的方法和材料，但是下文记载了合适的方法和材料。万一发生抵触，则以本专利说明书(包括定义)为准。另外，所述材料、方法和实施例仅是示例性的，而不是限制性的。

附图简述
本文仅通过实施例并参考附图描述本发明。现在具体地参考附图细节，须强调的是，所给出的细节仅仅作为实例，是为了说明性地论述本发明的优选实施方案，并且所提供的这些详细资料是为了提供我们认为对本发明的原理和构思方面最有用和最易理解的描述。在这点上，我们没有试图以比基本理解本发明所必需的更为详细的方式来说明本发明的结构细节，附图中的说明，使本领域技术人员了解本发明的几种形式如何具体体现在实施中。
附图中：
图1a-c是蛋白质印迹分析，说明玉米(Zea mays L.cv.Jublee)细胞壁组分富含SE-WAP41。从可溶性组分(s)、膜组分(m)和细胞壁组分(w)提取的蛋白质用SDS-PAGE进行分离(6μg/泳道)，电印迹转印至硝酸纤维素膜上，用丽春红染色(左)，与S-41抗血清(中)或SR-41抗血清(右)反应。箭头表示41kDa。
图2a-c表示得自生长5天的黄化玉米幼苗(图2a)中胚轴切片的SE-WAP41 mRNA狭线印迹分析(图2b)。从中胚轴上段制备RNA样品：切片I含有中胚轴分生组织和最快速的细胞生长区；切片II还含有伸长区；切片III含有成熟的不分裂和不伸长细胞。核糖体26S rRNA探针用作加样对照(图2c)。
图3a-b表示暴露在光照下的黄化玉米幼苗的SE-WAP41 mRNA水平。图3a-将生长5天的黄化玉米幼苗暴露在白光下3小时、6小时和24小时，或者避光保持24小时。将从中胚轴上段1cm中提取的总RNA印迹(参见图2c)与SE-WAP41、肌动蛋白和26S-rRNA的cDNA杂交。核糖体26S rRNA探针用作加样对照。肌动蛋白mRNA水平降低是细胞分裂停止的指标。图3b是表示相对SE-WAP41 mRNA水平的直方图。计算各泳道相对于26S-rRNA强度的数值。
图4为序列同源性比较，表示SE-WAP41(SEQ ID NO：24)、AtRGP1(SEQ ID NO：19)、AtRGP2(SEQ ID NO：20)、AtRGP3(SEQ IDNO：21)、AtRGP4(SEQ ID NO：22)和PsRGP1(SEQ ID NO：23)共有高氨基酸序列同一性。用CLUSTAL X(Thompson等，1997)进行比对。黑框表示相同的氨基酸，灰框表示相似的氨基酸。
图5a-b表示通过土壤杆菌(Agrobacterium)在烟草表皮细胞48hpi中瞬时表达的AtRGP2:GFP的定位。图5a-沿细胞壁可以观察到点状荧光，为跨过相邻细胞共用细胞壁的成对荧光灶(Paired fluorescencefoci)。图5b-显示AtRGP2:GFP既在细胞质的荧光小体(代表高尔基体小囊泡)内，又在跨细胞壁的成对荧光灶内的数个切片图像。比例尺＝10μm。
图6a-h表示转基因烟草植物中AtRGP2:GFP和MPTMV:GFP的稳定表达。在表达AtRGP2:GFP(图6a)和MPTMV:GFP(图6b)的转基因植物中，叶表皮细胞呈现相同的荧光模式：点状荧光跨过细胞壁，为长条形，或为成对灶，或者看似细胞壁内部的单灶。(图6a)和(图6b)中白框内的区域是放大的插图。表达AtRGP2:GFP(图6d)和MPTMV:GFP(图6c)植物中的毛状体-表皮界面显示相同的荧光模式。表达AtRGP2:GFP的转基因烟草的毛状体(图6f)和叶肉(SM)细胞(图6h)中，仅在细胞间接触的细胞壁区域(黑色箭头)检测到荧光，无细胞间接触的细胞壁区域(白色箭头)则无荧光。为了强调细胞壁的划分，用关闭荧光通道来显示同一毛状体(图6e)和叶肉细胞(图6g)：黑色箭头表示有细胞间接触的细胞壁区域，而白色箭头表示无细胞间接触的细胞壁区域。SM表示叶肉细胞，而IS则表示胞间隙。比例尺＝20μm。
图7a-d表示AtRGP2:GFP和MPTMV:GFP、而不是GONST1:YFP保留在质壁分离细胞的细胞壁内。质壁分离前～72小时，胞质标记DsRed1(用红紫色表示)在叶表皮细胞中进行瞬时表达。DsRed1标记的细胞质在表达AtRGP2:GFP的转基因植物中，在质壁分离前紧贴着细胞壁(图7a)，在表达AtRGP2:GFP的转基因植物(图7b)和表达MPTMV:GFP的转基因植物(图7c)中，DsRed1标记的细胞质从质壁分离细胞的细胞壁上缩回。在AtRGP2:GFP(图7b)和MPTMV:GFP(图7c)转基因植物中，GFP融合蛋白(用绿色表示)保留在原生质体从细胞壁连接点缩回区域的细胞壁内。相比之下，在表达GONST1:YFP的转基因植物中，GONST1:YFP(用黄色表示)未保留在原生质体从细胞壁连接点缩回区域的细胞壁内(图7d)。比例尺＝20μm。
图8a-c表示与高尔基体缔合的蛋白质如何决定胞间连丝的去向。图8a-存在于高尔基体腔内的蛋白质暴露在围绕胞间连丝的细胞壁中。图8b-跨膜区的蛋白质到达划分胞间连丝的质膜上。图8c-与高尔基体膜细胞溶胶一侧在外周缔合的蛋白质到达面向胞间连丝胞质的胞质套管的质膜内侧。
图9是一系列拍摄的录像画面，显示烟草表皮细胞中瞬时表达的AtRGP2:GFP的高尔基体-小囊泡样迁移。
图10表示WT和过量表达转基因35S::AtRGP:GFP的烟草(N.tabacum)(NN)植物的形态差异。这里，WT是一种生长比转基因植株少一周的植株，但是两者都有相同数目的叶片-也就是说它们具有相同的生理年龄。转基因植物的节间比WT的短。
图11a-c显示接种TMV后4天烟草(NN)叶的坏死斑。图11a表示WT植株第三叶对的叶片，显示出数个规则的圆形病斑。图11b表示表达35S::AtRGP2:GFP转基因系1-6第三叶对的叶片；该叶片的病斑比WT的少，病斑形状不规则，尺寸较小。图11c表示模拟品处理的叶片，没有坏死斑或任何一点损伤。
图12a-c表示接种TMV的WT烟草(NN)和表达35S::AtRGP2:GFP的转基因NN植株第三叶对坏死斑的数目。统计每片接种叶(每株植物2片叶)的病斑数目并计算平均值，对13株WT和8株转基因植物的数值取平均值，并用SD表示(图12a)。尽管病斑数存在很大的可变性，但是WT植株的病斑数明显多于转基因系1-10的病斑数(图12b)。标准误的平均值见图12c(P＜0.05)。WT植株第二叶对的病斑数也多于第三叶对的病斑数(数据未显示)。
图13a-d表示接种TMV烟草(NN)植物叶片干的坏死斑。WT植株第二叶对(图13a)和第三叶对(图13b)的病斑大小相同，具有圆形和清晰的边缘；可以分辨出病斑的三个独特区域。相比之下，表达35S::AtRGP:GFP转基因系1-6(图13c)和转基因系1-10(图13d)第三叶对的病斑与图13a-b所示WT植物的病斑相比，似乎形状略不定形，尺寸较小。转基因植物的病斑没有清晰的边缘，彼此无法区分开。接种后21天，用立体显微镜对保存在4℃下的叶片的所有病斑进行拍照。每幅照片上的虚线条纹用毫米计量。所显示的所有病斑来自叶片背轴面，它们的形状相同，尺寸也来自背轴面(未显示)。
图14a-c表示接种TMV的WT和转基因(过量表达35S::AtRGP:GFP)烟草(NN)植物的坏死斑直径。测量3-4片接种的WT和两个转基因系第三叶对的坏死斑直径，平均值用SD表示。两个转基因系(1-6和1-10)的平均病斑直径小于WT植物的直径(图14a)。WT和两个转基因系之间病斑直径的差异有统计显著性(图14b)。除标准误外，相同的数据见图14c(P＜0.05)。
图15a-c表示AtRGP2:CFP与高尔基体标记GONST1:YFP的共定位。用瞬时共表达AtRGP2:CFP和GONST1:YFP的烟草叶表皮细胞的5片光学切片图像表示共定位。AtRGP2:CFP荧光见图15a，GONST1:YFP荧光见图15b，两者的荧光(重叠)见图15c。比例尺＝20μm。光学切片取自近角质层的上周细胞质，该处没有胞间连丝。图15右边缘气孔保卫细胞中所见荧光是自身荧光。
图16a-c表示AtRGP2:GFP与转基因烟草胞间连丝周围苯胺蓝染色的胼胝质的共定位。AtRGP2:GFP荧光见图16a，苯胺蓝染色的胼胝质荧光见图16b，两者的重叠见图16c。图像显示表皮细胞间细胞壁的切片。比例尺＝20μm。
图17a-b表示布雷菲德菌素A(Brefeldin A)对AtRGP2:GFP标记的高尔基体和胞间连丝的作用。用BFA处理(图17a)或用模拟品处理(图17b)的烟草叶表皮细胞背轴侧10片光学切片的图像。比例尺＝20μm。
优选实施方案的详述
本发明涉及具有胞间连丝传导性发生改变的植物以及产生该植物的方法和构建体。
参照附图和随附说明书，可以更好地理解本发明的原理和操作。
在详细说明本发明至少一个实施方案之前，应该了解本发明在其应用以下说明书或实施例中所作详细说明或示例时并无限制。本发明可能有其它实施方案，或者能够以各种方式实施或进行。同样，应当理解本文所用措辞和术语是为了说明目的，不应视为限制。
胞间连丝使相邻植物细胞相互连接，促进分子通过细胞壁进行直接胞质细胞间转运。
1960年代后期，Esau及同事用电子显微镜术，首次证实了病毒和胞间连丝间的直接关系，之后，大量研究证实了植物病毒利用胞间连丝作为细胞间扩散的管道。
在进行胞间连丝生物化学研究时，本发明的发明人发现41kDa蛋白质(Epel等，1996)，与胞间连丝的膜部分缔合。如本文实施例所记载，本发明的发明人证实这种蛋白质属于可逆糖基化多肽(RGP)蛋白质家族，这种蛋白质家族的成员能够改变胞间连丝传导性。
因此，本发明一方面提供改变植物组织的胞间连丝传导性的方法。
本文所用术语“改变胞间连丝传导性”是指增加或者降低胞间连丝内转运分子或病毒的能力。如本文下面将进一步描述的一样，本发明的发明人设计了数种改变胞间连丝传导性的方法。
该方法是通过调节植物组织细胞内可逆糖基化多肽(RGP)及其功能部分的表达水平实现的。
本文所用术语“植物组织”是指分离的植物组织(例如叶、根、花、茎或其部分等)，或者是指形成整株植物部分的植物组织。适用于本发明植物的实例包括但不限于番茄、马铃薯、黄瓜、水稻、玉米、小麦、燕麦、大麦、黑麦、大豆、低芥酸油菜、欧洲油菜和棉花。
调节可逆糖基化多肽表达水平可用来增加或者降低胞间连丝传导性。
可以通过增量调节植物细胞可逆糖基化多肽的表达水平的方法，产生胞间连丝传导性降低的植物组织或整株植物。
可以通过增量调节内源可逆糖基化多肽的表达，或者通过在植物细胞内表达外源可逆糖基化多肽或其功能部分，达到这种增量调节。
可以通过基因敲入法实现内源可逆糖基化多肽表达的增量调节。通过将强启动子导入内源可逆糖基化多肽基因的上游，就可以诱导可逆糖基化多肽编码基因过量表达。植物细胞基因敲入技术的有关综述见Tzfira和White(2005)。
目前优选外源可逆糖基化多肽或其功能部分的植物内表达。表达的可逆糖基化多肽可以是例如，AtRGP1(AF013627；SEQ ID NO：13)、AtRGP2(AF013628；SEQ ID NO：8)、AtRGP3(AF034255；SEQ ID NO：25)、AtRGP4(AF329280；SEQ ID NO：26)、PsRGP1(U31565；SEQ IDNO：27)和SE-WAP41(U89897；SEQ ID NO：28)，其它的可逆糖基化多肽见下表1。可逆糖基化多肽的功能部分包括在可逆糖基化多肽的C端部分内，例如SEQ ID NO：19-24的氨基酸270至末端(C端氨基酸)。
优选已表达的可逆糖基化多肽(或其功能部分)与膨化多肽(体积增大的多肽序列，实例见下)连接。通过在植物中表达多核苷酸序列，该序列包括至少编码可逆糖基化多肽的功能部分的序列，该序列与编码膨化多肽的序列(例如绿色荧光蛋白)在翻译时融合，可以有效地降低胞间连丝传导性。膨化多肽可引起胞质套管的尺寸减小，因此，产生微小屏障(nanobarrier)，这与融合蛋白的大小成比例。非常大的可逆糖基化多肽融合蛋白(例如与Gus、td-tomato、td-tomato：GUS融合的可逆糖基化多肽)可以用来逐步降低胞质套管(直径约10nm)的传导率，只允许小分子(例如简单糖)转运。外源可逆糖基化多肽或其部分的表达也可以用来使胞间连丝传导性降低到支持选择传导的某一点，例如允许大到已知尺寸或斯托克半径(Stokes radius)的分子转运。
如以下实施例部分所示，本发明的发明人首次提出，表达靶向胞间连丝的膨化多肽(例如GFP)的植物细胞以降低胞间连丝传导性为特征。因此，膨化多肽通过任何胞间连丝寻靶部分的胞间连丝寻靶可用来有效地降低胞间连丝传导性。
植物组织内源性可逆糖基化多肽(RGP)表达水平的减量调节可以用来增加胞间连丝传导性。可以通过本发明为任何植物内源性可逆糖基化多肽设定靶标，优选为1类可逆糖基化多肽，见下表1。
表1
 GenBank 检索号  GI  蛋白质描述  品种 AF013627， AAC50000， AAP68280  2317728，  2317729，  31711848  AtRGP1[可逆糖基化多肽-1]  拟南芥(Arabidopsis  thaliana) AF013628， AAC50001  2317730，  2317731  AtRGP2[可逆糖基化多肽-2]  拟南芥 AF034255， NP_187502， AAF07834  11863237，  30680679，  6403494  AtRGP3[可逆糖基化多肽-3  (RGP3)]  拟南芥 AF329280， AAO50727  14326033，  28827766  AtRGP4[推定UDP-葡萄糖]  拟南芥 BAD93611  62149103  [假定蛋白]  甜瓜(Cucumis melo) CAC83750  18077708  [可逆糖基化多肽]  陆地棉(Gossypium  hirsutum) AAT08665  47026881  [可逆糖基化多肽]  风信子(Hyacinthus  orientalis) AAT44738  48478827  [UDP-葡萄糖：蛋白质转葡糖  番茄(Lycopersicon
  基酶样蛋白S1UPTG1] esculentum)  CAA77235  4158221  [可逆糖基化多肽] 水稻(Oryza sativa)(印 度栽培种)  XP_479089  50939123  [推定可逆糖基化多肽] 水稻(日本栽培种)  CAA09469，  NP_919052  3646373，  34915190  [RGP1蛋白质] 水稻(日本栽培种)  AAR13306  38194918  [可逆糖基化蛋白] 菜豆(Phaseolus vulgaris)  O04300  34582497  [α-1，4-葡聚糖-蛋白合酶[形  成UDP](UDP-葡萄糖：蛋白  质转葡糖基酶)(UPTG)(可逆  糖基化多肽)] 豌豆(Pisum sativum)  CAH59419  53748445  [假定蛋白] 大车前(Plantago major)  Q8RU27  34582499  [α-1，4-葡聚糖-蛋白合酶[形成  UDP]2(UDP-葡萄糖：蛋白质  转葡糖基酶2)(UPTG 2)] 马铃薯(Solanum tuberosum)  Q9SC19  34582500  [α-1，4-葡聚糖-蛋白合酶[形成  UDP]1(UDP-葡萄糖：蛋白质  转葡糖基酶1)(UPTG 1)] 马铃薯  CAA77237  4158232  [可逆糖基化多肽] 小麦(Triticum aestivum)  T11576  7488888  [IIIa型膜蛋白cp-wap1 1-豇  豆] 豇豆(Vigna unguiculata)  T11577  7488889  [IIIa型膜蛋白cp-wap1 3-豇  豆] 豇豆  P80607  34588146  [α-1，4-葡聚糖-蛋白合酶[形成  UDP](UDP-葡萄糖：蛋白质转  葡糖基酶)(UPTG)  (Amylogenin)(高尔基体缔合  蛋白se-wap41)] 玉米(Zea mays)
可以用干扰转录和/或翻译的各种分子(例如反义RNA、siRNA、核糖核酸酶或DNA核酶)，在基因组水平和/或转录水平上，或者在蛋白质水平(用例如抗体、切割多肽的酶等)上，减量调节内源可逆糖基化多肽的表达水平。
下面是适于减量调节植物内源可逆糖基化多肽的表达水平和/或活性的非详尽的调节物/方法。
能够减量调节内源可逆糖基化多肽的调节物的一个实例是能够与可逆糖基化多肽表位特异性结合的抗体或抗体片段。本文所用术语“表位”是指抗原上的任何抗原决定簇，能与抗体互补位结合。
表位决定簇通常由分子(例如氨基酸或糖侧链)的化学活性表面集合组成，通常具有特殊的三维结构特征以及特殊的电荷特征。
在植物内产生多克隆抗体和单克隆抗体及其片段的方法是本领域众所周知的(参见例如Harlow和Lane，1988)。
可以通过DNA编码片段在植物内表达来制备本发明的抗体片段。
Fv片段包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)的缔合。这种缔合可以是非共价的，见Inbar等(1972)。或者，可变链可以通过分子间的二硫键连接，或者通过化学试剂(例如戊二醛)交联。优选Fv片段包含通过肽接头连接的VH链和VL链。通过构建包含编码VH区和VL区的DNA序列的结构基因，由寡核苷酸连接该基因，来制备这些单链抗原结合蛋白(sFv)。将结构基因插入表达载体，随后将载体导入植物细胞(下面将进一步描述植物可表达构建体)。
抗体片段的另一种形式是编码单一互补决定区(CDR)的肽。可以通过构建编码目标抗体CDR的基因获得CDR肽(“最小识别单位”)。例如，用聚合酶链式反应，由抗体产生细胞的RNA合成可变区，来制备这种基因。参见例如Larrick和Fry(1991)。
能够减量调节植物内源可逆糖基化多肽的另一种调节物是小干扰RNA(siRNA)分子，用于RNA干扰(RNAi)过程。RNAi为两步过程，第一步起始步骤，可能是通过dsRNA特异性核糖核苷酸酶的RNA酶III家族成员切酶的作用，以依赖ATP的方式加工(切割)dsRNA(直接导入或通过转基因或病毒)，将输入的双链(dsRNA)消化成21-23个核苷酸(nt)的小干扰RNA(siRNA)。连续切割反应使RNA降解成19-21bp双链体(siRNA)，每个都具有2个核苷酸3’突出端(Hutvagner和Zamore，2002和Bernstein，2001)。
第二步中，称为效应步骤，siRNA双链体与核酸酶复合物结合形成RNA诱导性沉默复合物(RISC)。依赖ATP的siRNA双链体解旋需要活化的RISC。然后，活化的RISC通过碱基对相互作用靶向同源转录物，从siRNA的3’端将mRNA切割成12个核苷酸的片段(Hutvagner和Zamore，2002；Hammond等，2001；Sharp，2001)。虽然切割机制有待阐明，但是研究表明，每个RISC都含有一种siRNA和RNA酶(Hutvagner和Zamore，2002)。
由于RNAi的显著效应，从而提示RNAi途径中的扩增步骤。可以通过输入dsRNA的复制产生较多siRNA，或者通过所形成的siRNA的复制，引起扩增。或者另外可以通过RISC的多次更新活动(multipleturnover event)实现扩增(Hammond等，2001；Sharp，2001；Hutvagner和Zamore，2002)。有关RNAi的更多信息，可参见以下综述：Tuschl(2001)；Cullen(2002)和Brantl，S.(2002)。
可以如下进行适用于本发明RNAi分子的合成。首先，在AUG起始密码子下游扫描RGP mRNA序列的AA二核苷酸序列。记录每次出现的AA和19个3’-相邻核苷酸作为可能的siRNA靶位点。优选siRNA靶位点选自可读框(ORF)，为非翻译区(UTR)，富含调节蛋白结合位点。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可能干扰siRNA内切核酸酶复合物的结合(Tuschl，2001)。然而，应当理解的是，定向非翻译区的siRNA也可能是有效的，如GAPDH所证实的一样，其中定向5’UTR的siRNA介导细胞GAPDH mRNA降低约90％，并且蛋白质水平完全被消除(www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html)。
其次，用任何序列比对软件，例如可得自NCBI服务器(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)的BlastN软件，将可能的靶位点与合适的基因组数据库(例如拟南芥、人、小鼠、大鼠等)进行比较。过滤掉与其它编码序列有显著同源性的推定靶位点。
选择合格的靶序列作为siRNA合成的模板。优选的序列为包括低G/C含量的序列，如与包括G/C含量高于55％的序列相比，被证实在介导基因沉默时更有效的序列。优选沿目标基因长度选择数个靶位点用于评价。为了更好地评价所选择的siRNA，优选结合使用阴性对照。优选阴性对照siRNA包括与siRNA相同的核苷酸组成，但与基因组缺少显著同源性。因此，优选使用合成siRNA核苷酸序列，前提条件是不与任何其它基因有任何显著同源性。
合适可逆糖基化多肽定向siRNA的示例是SEQ ID NO：32-33。
能够减量调节植物内源可逆糖基化多肽的另一种调节物是DNA核酶分子，它能够特异性地切割可逆糖基化多肽的mRNA转录物或DNA序列。DNA核酶为单链多核苷酸，能够切割单链和双链目标序列(Breaker和Joyce，1995；Santoro和Joyce，1997)。已经设计出DNA核酶的通用模型(“10-23”模型)。“10-23”DNA核酶具有15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域，两侧各与7-9个脱氧核糖核苷酸的底物识别域相接。这种类型的DNA核酶能在嘌呤：嘧啶连接点上有效地切割其底物RNA(Santoro和Joyce，1997)；有关DNA核酶的综述，可参见Khachigian，(2002)。
Joyce等(美国专利第6,326,174号)公开了识别单链和双链目标切割位点的合成工程DNA核酶的构建和扩增的实例。最近，观察到针对人尿激酶受体的类似设计的DNA核酶抑制尿激酶受体表达，并且成功地抑制结肠癌细胞的体内转移(Itoh，T.等，Abstract 409，AmericanSociety of Gene Therapy 5th Annual Meeting(美国基因治疗协会第五届年会第409号摘要)(www.asgt.org)，2002年6月5-9日，Boston，Mass.USA)。在另一项应用中，与bcr-ab1致癌基因互补的DNA核酶，在抑制白血病细胞致癌基因的表达，以及在降低慢性髓细胞性白血病(CML)和急性成淋巴细胞性白血病(ALL)病例的自体骨髓移植复发率中获得了成功。
用能够特异性地与编码可逆糖基化多肽的mRNA转录物杂交的反义多核苷酸，同样可以实现植物内源可逆糖基化多肽的减量调节。
在考虑对反义方法十分重要的两个方面的同时，必需获得能用于有效地减量调节可逆糖基化多肽的反义分子设计。第一个方面是将寡核苷酸递送到合适细胞的细胞质中，而第二个方面是寡核苷酸的设计，该寡核苷酸在植物细胞内与规定的mRNA特异性地结合，在某种意义上抑制其翻译。
根据说明目标mRNA和寡核苷酸结构变化能量学的热力学循环，可获得鉴定这些与其目标mRNA具有最高预测结合亲和性(highestpredicted binding affinity)的序列的算法(参见例如Walton等，1999)。
该算法已成功地用于实施细胞的反义方法。例如，Walton等人开发出的算法使得科学家能够成功设计出兔β珠蛋白(RBG)和小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)转录物的反义寡核苷酸。同一研究小组最近报道了细胞培养中，适当选择的针对三个模型目标mRNA(人乳酸脱氢酶A、人乳酸脱氢酶B和大鼠gp130)的寡核苷酸的反义活性，如动态PCR技术(kinetic PCR technique)的评价一样，证实了在几乎所有情况下都是有效的，包括具有磷酸二酯和硫代磷酸寡核苷酸化学成分的两种细胞类型的三个不同目标的测试。
另外，还发表了用体外系统设计和预测特异性寡核苷酸功效的几种方法(Matveeva等，1998)。
靶向RGP mRNA的合适反义寡核苷酸的示例是SEQ ID NO：34-35。
多项研究证实了植物细胞中反义寡核苷酸的可行性和活性[参见例如Tang等，2005；Smigocki，A.C.，Wilson，D.(2004)；Sheehy等，1988]。
因此，目前得到一致认同的是，上述反义技术领域的最新进展，已经产生了高度精确的反义设计算法和各种各样的寡核苷酸递送系统，使得普通技术人员能够设计和实施适于减量调节已知序列表达的反义方法，而无需借助过多的尝试实验法。
能够减量调节植物内源可逆糖基化多肽的另一种调节物是能够特异性地切割编码可逆糖基化多肽的mRNA转录物的核糖核酸酶分子。核糖核酸酶因切割编码目标蛋白质的mRNA而越来越多地被用于基因表达的序列特异性抑制(Welch，P.J.等(1998).The possibility ofdesigning ribozymes to cleave any specific target RNA has rendered themvaluable tools in both basic research and commercial applications(设计切割任何特定目标RNA的核糖核酸酶的可能性使之成为基础研究和商业应用中有价值的工具)(Lutzelberger和Kjems 2006))。
应当理解的是，至少可逆糖基化多肽催化部分或胞间连丝缔合部分的非功能性类似物，同样可以通过显性负调控作用，用作减量调节内源可逆糖基化多肽表达水平的调节物。
可以用几种已知方法中的一种，使导入植物细胞的核酸构建体内的上述增量调节物或减量调节物的每一种进行表达。然而，应当理解的是，这些调节物中的一些(例如抗体)还可以通过例如注射，直接导入植物细胞。
用来表达本发明增量调节物或减量调节物的核酸构建体，可以是任何植物能表达构建体。
合适表达载体的实例包括但不限于pCAMBIA载体(可得自CAMBIA公司)和Gateway载体(可得自Invitrogen公司)。
本发明构建体所用植物启动子可为组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或嵌合启动子。
组成型植物启动子的实例包括但不限于CaMV35S启动子、CaMV19S启动子、FMV34S启动子、甘蔗杆状病毒(sugarcanebacilliform badnavirus)启动子、CsVMV启动子、拟南芥ACT2/ACT8肌动蛋白启动子、拟南芥泛蛋白UBQ1启动子、大麦叶硫素BTH6启动子和水稻肌动蛋白启动子。
组织特异性启动子的实例包括但不限于菜豆属菜豆蛋白贮存蛋白启动子、DLEC启动子、PHS启动子、玉米醇溶蛋白贮存蛋白启动子、大豆的羽扇豆球蛋白γ启动子、AT2S1基因启动子、拟南芥的ACT11肌动蛋白启动子、油菜(Brassica napus)的napA启动子和马铃薯patatin基因启动子。
诱导型启动子是被特殊刺激(例如病理胁迫)诱导的启动子，包括但不限于病理胁迫中hsr203J和str246C活性物质。
优选本发明所用启动子为强组成型启动子，使得在植物转化后，实现构建体插入片段的过量表达。
有许多将核酸构建体导入单子叶植物和双子叶植物的方法(Potrykus，I.1991；Shimamoto等，1989)。这些方法依赖于核酸构建体或其部分稳定整合到植物基因组内，或者核酸构建体在瞬时表达的情况下，这些序列不会遗传给植物子代。
另外，存在几种方法，可将核酸构建体直接导入含DNA细胞器(例如叶绿体)的DNA内。
有两种主要方法来实现将外源序列(例如包括在本发明的核酸构建体内的外源序列)的基因组稳定地整合到植物基因组：
(i)土壤杆菌介导的基因转移(Klee等1987，Klee和Rogers(1989)；Gatenby，AA.(1989))。
(ii)直接DNA摄取：Paszkowski等，1989；包括用于原生质体直接摄取DNA的方法(Toriyama，K.等(1988))。通过对植物细胞短暂电休克(electric shock)诱导的DNA摄取(Zhang等，1988；Fromm等(1986))。通过粒子轰击将DNA注入植物细胞或组织内(Klein等，1988；McCabe等，1988；Sanford，1990)；使用微量移液管系统(Neuhaus等，1987；Neuhaus和Spangenberg，1990)或者通过DNA与萌发花粉直接温育(DeWet等，1985；Ohta，1986)。
土壤杆菌系统包括采用含有将整合到植物基因组DNA的规定DNA区段的质粒载体。植物组织的接种方法完全取决于植物品种和土壤杆菌递送系统。广泛应用的方法是叶盘法，可以用提供良好来源的引发整株植物分化的任何组织外植体进行(Horsch等，1988)。补充方法采用土壤杆菌递送系统与真空浸润相结合。土壤杆菌系统尤其可用于产生转基因双子叶植物。
有许多将DNA直接转移到植物细胞内的方法。在电穿孔方法中，原生质体被短暂暴露在强电场中。在显微注射方法中，用非常小的微量移液管将DNA机械地直接注入细胞内。在微粒轰击方法中，使DNA吸附在微粒(例如硫酸镁晶体、钨颗粒或金颗粒)上，微粒被物理加速送入细胞或植物组织中。
转化后使植物进行繁殖。植物繁殖最常见的方法是通过种子。然而，种子繁殖再生存在不足，这是因为植物遵循孟德尔定律规定的遗传变异，而种子是由植物产生的，所以农作物因杂合性(缺乏一致性)而产生这种不足。基本上，每粒种子在遗传上各不相同，每一粒都将按自身的独特性状生长。因此，优选所产生的转化植物，使得再生植物具有亲本转基因植物相同的性状和特征。因此，优选转化植物通过微繁殖(micropropagation)再生，这使得转化植物快速一致的繁殖。
瞬时表达方法，可用于瞬时表达本发明核酸构建体内所包括的分离的核酸，包括但不限于上述显微注射和轰击(但是在利于瞬时表达条件下)，以及病毒介导的表达，其中包装或未包装重组病毒载体(包括核酸构建体)被用于感染植物组织或细胞，使得在其中建立的繁殖重组病毒能表达非病毒核酸序列。
已经被用于植物宿主转化的病毒包括CaMV、TMV和BV。用植物病毒进行植物转化，可参见美国专利4,855,237(BGV)、EP-A 67,553(TMV)、日本公布申请号63-14693(TMV)、EPA 194,809(BV)、EPA278,667(BV)和Gluzman，Y.等，Communications in Molecular Biology：Viral Vectors(分子生物学通讯：病毒载体)，Cold Spring HarborLaboratory，New York，第172-189页(1988)。用于在许多宿主(包括植物)内表达外源DNA的假病毒颗粒参见WO 87/06261。
上述文献以及Dawson等，1989；Takamatsu 1987；French 1986和Takamatsu 1990例举了用于导入植物中和表达非病毒外源核酸序列的植物RNA病毒的构建。
当病毒是DNA病毒时，则可以构建成病毒本身。或者，首先将病毒克隆到细菌质粒中，以易于用外源DNA构建所需病毒载体。然后从质粒上切下病毒。如果病毒是DNA病毒，则可将细菌源的复制物与病毒DNA连接在一起，然后通过细菌复制。该DNA的转录和翻译将产生外壳蛋白，将给病毒DNA包上衣壳。如果病毒是RNA病毒，则一般将病毒克隆成为cDNA并插入质粒中。然后质粒用来进行所有的构建。通过转录质粒病毒序列，并翻译病毒基因以产生给病毒RNA包衣壳的外壳蛋白，来产生RNA病毒。
上述文献以及美国专利第5,316,931号例举了用于导入植物中和表达非病毒外源核酸序列(例如包括在本发明构建体内的核酸序列)的植物RNA病毒的构建。
在一个实施方案中，提供植物病毒核酸，其中从病毒核酸中剔除天然外壳蛋白编码序列，插入非天然植物病毒外壳蛋白编码序列和非天然启动子，优选非天然外壳蛋白编码序列的亚基因组启动子，所述植物病毒核酸能够在植物宿主内表达，包装重组植物病毒核酸和确保宿主被重组植物病毒核酸系统性感染。或者，可以通过在外壳蛋白基因内插入非天然核酸序列，使外壳蛋白基因钝化，从而产生蛋白质。重组植物病毒核酸可含有一个或多个额外的非天然亚基因组启动子。每个非天然亚基因组启动子能够在植物宿主内转录或表达相邻的基因或核酸序列，而且每个非天然亚基因组启动子彼此不能够重组，也不能与天然亚基因组启动子重组。如果包括一个以上的核酸序列，则可以紧接天然植物病毒亚基因组启动子或者天然和非天然植物病毒亚基因组启动子插入非天然(外源)核酸序列。非天然核酸序列在亚基因组启动子控制下，在宿主植物内转录或者表达，产生所需产物。
在第二个实施方案中，提供与第一个实施方案一样的重组植物病毒核酸，只是将天然外壳蛋白编码序列紧接一个非天然外壳蛋白亚基因组启动子，而不是紧接非天然外壳蛋白编码序列插入。
在第三个实施方案中，提供重组植物病毒核酸，其中天然外壳蛋白基因紧接其亚基因组启动子，并且在病毒核酸内插入一个或多个非天然亚基因组启动子。插入的非天然亚基因组启动子能够在植物宿主内转录或表达紧接的基因，而且不能够彼此重组及与天然亚基因组启动子重组。可以紧接非天然核酸序列插入非天然亚基因组植物病毒启动子，使所述序列在亚基因组启动子控制下，在宿主植物内转录或表达，产生所需产物。
在第四个实施方案中，提供与第三个实施方案一样的重组植物病毒核酸，只是天然外壳蛋白编码序列被非天然外壳蛋白编码序列替换。
病毒载体用由重组植物病毒核酸编码的外壳蛋白包衣壳，产生重组植物病毒。使用重组植物病毒核酸或重组植物病毒感染合适的宿主植物。重组植物病毒核酸能够在宿主内复制，在宿主内进行系统性扩散，并在宿主内转录或表达外源基因(分离的核酸)，产生所需的蛋白质。
因此，本发明提供可以用于产生具有胞间连丝传导性发生改变的植物的方法和构建体。
植物细胞胞间连丝传导性的改变可用于下列情况：
(i)病原体抗性-通过降低胞间连丝传导性，可以限制或隔离病毒在感染组织中扩散，因此降低病毒致病性和病毒对植物存活力的总体效果。
(ii)商业上有重要用途的多肽的病毒表达-表达可逆糖基化多肽或其部分的植物，或者可逆糖基化多肽-融合蛋白可用于商业上有重要用途的分子(例如胰岛素、内皮生长抑素、淋巴细胞生成素、抑蛋白酶肽)的病毒表达。胞间连丝传导性在某种意义上受可逆糖基化多肽、可逆糖基化多肽融合蛋白或其部分的限制，使得胞间连丝能够将由重组病毒表达的商业上有重要用途的产物转运至收获植物组织(例如果实)，同时将病毒颗粒截留在感染部位，因此，阻止病毒转运至植物的收获部分。
(iii)改变器官大小(果实/花/块茎等)-通过可逆糖基化多肽融合蛋白的组织特异性表达，可以改变特异性组织中胞间连丝的功能，因此影响糖的分配[参见Olesinski等，1996]。
本文所用术语“约”是指±10％。
根据以下实施例，本发明的其它目的、优势和新的特征对于本领域普通技术人员是显而易见的，这些实施例并不是限制性的。另外，本文上述的本发明各个不同的实施方案和方面，以及所附权利要求书部分所要求保护的范围都可以在下述实施例中找到实验支持。
实施例
下面参考以下实施例，并结合上述说明书，以非限制性方式对本发明进行说明。
实施例1
1类可逆糖基化多肽((C1)RGP)改变胞间连丝传导性
方法
植物材料
将玉米(Zea mays L.cv.Jublee)(Roger Bros.Co.，Idaho Falls，USA)种子浸泡过夜，25℃下，在潮湿的蛭石上避光生长5天。在25℃、长日照条件(16小时光照/8小时黑暗周期)下，将烟草(Nicotiana tabacumcv.Samson和Nicotiana tabacum cv.Xanthi)植物种在装有等体积土壤和蛭石(Pecka Hipper Gan，Rehovot，Israel)混合物的10cm盆中。
SE-WAP41的提取和微量测序
按文献方法(Epel等，1996)由黄化玉米幼苗中胚轴上段第一个1cm制备细胞壁组分(CW)。在4℃下，将40g新鲜组织的细胞壁组分在50ml SE-缓冲液(3M NaCl，5.6％17-巯基乙醇，50mM Hepes pH 7.4)中温育过夜，通过离心(12,000RPM，5分钟)从细胞壁组分中分离出盐提取的(SE)蛋白质。
然后，将沉淀的细胞壁用等体积(50ml)不含NaCl的提取缓冲液洗涤，通过上述离心法除去细胞壁，合并上清液。用100kDa超滤脱盐和浓缩后，切断转运(Amicon，Millipore，Billerica，USA)，蛋白质按文献方法(Epel等，1996)进行SDS-PAGE分离。从凝胶上切取41kDa条带(含有约11μg蛋白质)。在凝胶中用胰蛋白酶消化后，从凝胶中提取肽，进行RF-HPLC分离，用自动化Edman降解法(得自Eurosequence公司(Netherlands))进行微量测序。
从表达文库分离SE-WAP41
由得自生长5天的黄化玉米幼苗第一片叶中胚轴分生组织的含poly(A)RNA的ZAP II(Stratagene，La Jolla，USA)构建的cDNA文库，用按文献方法(Epel等，1996)得到的纯化S-41多克隆抗血清(1∶2000稀释)进行筛选。所用的S-41抗血清首先用A蛋白柱纯化，然后用连接有细菌总蛋白的琼脂糖凝胶4B柱纯化(Harlow和Lane，1988)。使用1∶4000稀释的碱性磷酸酶连接的山羊抗兔抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.，West Grove，PA)，在BCIP和NBT存在下，通过呈色反应，来鉴定由S-41识别的蛋白质表达噬菌斑(Sambrook等，1989)。所有DNA方法都通过标准技术进行(Sambrook等，1989)。在Stratagene ZAP切除方案后，将分离的噬菌体转化成质粒克隆。在含有所有分离克隆的噬菌斑的硝酸纤维素滤膜上，与用随机引物DNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)中的放射性18标记的任意选择的克隆cDNA，在高严格性条件下通过杂交对杂交组进行测定。采用简并正向引物5’-TTYTTYCANCCWTAYCAYCT-3’(SEQ ID NO：1)其中Y＝A或G，W＝A或T，N＝A或G或C或T，及与侧翼载体区序列互补的反向引物(反向T7引物5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′SEQ ID NO：2)，在分离的噬菌斑上通过PCR对克隆进行筛选。
抗重组SE-WAP41抗血清的制备
对于重组SE-WAP41的表达，用正向引物5’-CGAATTCATATGGCGGGCACGGTGACG-3’(SEQ ID NO：3)和分别包含侧翼NdeI和BamHI位点的反向引物5’-CCGGATCCTACTTTGGCCTTGCCATTTGC-3’(SEQ ID NO：4)，对cDNA进行PCR扩增，将PCR产物克隆到与聚His(His10 SEQ ID NO：5)融合的pET16(Novagen，Darmstadt，Germany)的相应位点上。将所得质粒pET16：SE-WAP41转化到BL21(DE3)细胞内，在对数期培养物中用2mM IPTG处理4小时，诱导His10：SE-WAP41表达。融合蛋白用Ni-NTA-琼脂糖微珠进行亲和纯化(Qiagen，Hilden，Germany)，用咪唑洗脱后，再用层析法纯化，结合蛋白用因子Xa(Sigma)在柱内从His尾标上切割下来。将纯化蛋白与完全弗氏佐剂(Difco Laboratories，Detroit MI，U.S.A)混合，将混合物注射到一月龄雌性New Zealand兔背部10-20个部位。随后的四次加强注射剂用不完全弗氏佐剂制备，注射间隔四周。
可溶性细胞组分和膜细胞组分的制备
对文献方法(Yahalom等，1991)加以改进，制备和分级分离细胞提取物：将从第一次匀浆得到的滤液与氮裂解轰击法(nitrogendisruption bomb)得到的滤液合并，于4℃离心(90,000xg)1小时。收集19上清液用于可溶性蛋白的分析。将沉淀重新悬浮于缓冲液HM/7.5(20mM Tris-HCl pH 7.5，0.25M蔗糖，10mM EGTA，2mM EDTA和1mM苯甲基磺酰氟[PMSF])，在相同条件下再次沉淀，用于提取膜蛋白。
RNA转录物狭线印迹分析
从黄化幼苗中胚轴的三个部位收获植物材料，在液氮中冷冻，用TRIzol试剂(GibcoBRL Life Technologies，Gaithersburg，USA)，按生厂商所述方法提取总RNA。10μg RNA用乙醛酸处理，用1.4％琼脂糖凝胶分离，被动地转移到Hybond-N尼龙滤膜(Amersham)上。在含有0.26M磷酸缓冲液(pH 7.2)、7％SDS、1mM EDTA、1％BSA的溶液中，与随机引物32P标记探针进行杂交，对于SE-WAP41(含有包括3’和5’非编码序列的全部cDNA)和玉米26S-rRNA在65℃下进行，对于大豆肌动蛋白在55℃下进行。在61℃下，滤膜依次用含有1％SDS的0.26M磷酸缓冲液(pH 7.2)、含有0.1％SDS的2xSSC和含有0.1％SDS的1XSSC洗涤。26S-rRNA基因用作加样对照。用Fuji BAS1000磷光影像分析仪(phosphoimager)(Fuji，Japan)进行扫描。
植物表达质粒的构建
为了产生质粒pBinGFP、pBinDsRed1和pBinCFP，将分别含有花椰菜花叶病毒35S启动子、Ω序列增强子(SEQ ID NO：6)、合成GFP(sGFP)基因(SEQ ID NO：29)(Chiu等，1996)或DsRed1基因(ClontechLaboratories Inc.)(SEQ ID NO：30)或ECFP基因(Cl ontech LaboratoriesInc.)(SEQ ID NO：31)以及一氧化氮合酶转录终止子(SEQ ID NO：7)的表达盒克隆到pBINPLUS(Vanengelen等，1995)的HindIII-EcoRI位点。为了构建质粒pBinAtRGP2:GFP和pBinAtRGP2:CFP，用含有XbaI位点和EcoRI位点的正向引物205’-TCTAGAATTCATGGTTGAGCCGGCGAATACTG-3’(SEQ ID NO：9)和含有XbaI位点的反向引物5’-TCTAGATACTGCTCTCAAGCTTTTGCCACTG-3’(SEQ ID NO：10)，使AtRGP2基因(SEQ ID NO：8)在不含终止密码子时通过PCR进行扩增，并分别克隆到存在于pBinGFP或pBinCFP的Ω增强子序列和sGFP/ECFP起始密码子之间唯一的XbaI位点上。采用EcoRI消化以验证AtRGP2在pBinAtRGP2:GFP和pBinAtRGP2:CFP中的方向。用5’-TCTAGAATTCATGGCGCAATTGTATTCTTCCGTG-3’(SEQ IDNO：11)正向引物和5’-TCTAGAATTTTTGCCTTTTGGTGCCTCAGC-3’(SEQ ID NO：12)反向引物，按相同方法构建质粒pBinAtRGP3:GFP。pBinAtRGP1:GFP的构建法相同，只是用含有AvrII位点和EcoRI位点的正向引物5’-CCTAGGAATTCATGGTTGAGCCGGCGAACAC-3’(SEQ ID NO：14)和含有AvrII  位点的反向引物5’-CCTAGGAGCTTTAGTGGGTGGGTTAAGCTC-3’(SEQ ID NO：15)，进行AtRGP1(SEQ ID NO：13)扩增，将AvrII-AtRGP1-AvrII片段克隆到pBinGFP唯一的XbaI位点上。用5’-CCTAGGAATTCATGGCGGGCTACAACCTCGAAGCTATC-3’(SEQ ID NO：16)正向引物和5’-CCTAGGCTTGGCCTTGACATCTTTGCCATCGCTC-3’(SEQ IDNO：17)反向引物，按与pBinAtRGP1:GFP相同的方法构建质粒pBinAtRGP4:GFP。
瞬时表达
用土壤杆菌叶片注射法(Agrobacterium leaf injection)，诱导瞬时表达(Lavy等，2002)。用1ml无针注射器，在烟草(N.tabacum cv.Samson或cv.Xanthi)叶片下表面注射带有规定质粒的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefacienes)菌株GV3101。瞬时表达的观测限于叶片下表面的表皮细胞。注射后24-48小时，检测GFP荧光。注射后～72小时检测DsRed1荧光。
烟草的稳定转化
为了产生表达AtRGP2:GFP或GONST1:YFP的转基因植物，用改进的叶盘法(Gallois和Marinho，1995)，通过带有pBinAtRGP2:GFP质粒或pBinGONST1:YFP质粒的根癌土壤杆菌菌株GV3101转化野生型烟草(N.tabacum cv.Samson)。使叶盘与土壤杆菌温育30分钟，用Murashugy Skoog培养基(含有2μg/ml细胞分裂素和0.8μg/ml IAA)洗涤，并接种到培养基中进行共培养。与Gallois和Marinho的培养基相反，生根培养基中不含激素。对T0植株叶片进行分析。
胼胝质染色及与AtRGP2:GFP共定位
叶片切段用0.1％苯胺蓝的DDW溶液和1M甘氨酸的混合物(PH＝9.5，体积比分别为2∶3，至少在使用前一天预混合)温育40分钟，使胼胝质染色。用DMRBE荧光光学显微镜(Leica)观察共定位；用BP340-380nm激发光滤光片，RKP 400二色镜(dichromatic mirror)和LP425nm发射光滤光片，观察苯胺蓝染色的胼胝质荧光；用BP450-490nm激发光滤光片，RKP 510二色镜和BP 515-560nm发射光滤光片，观察AtRGP2:GFP荧光。GFP和苯胺蓝单色照片用Zeiss LSM 5图像浏览器分别转换成红紫色和黄色，用Adobe Photoshop 7.0ME转换成彩色图像，分别得到白色背景的绿色图像和蓝色图像。
质壁分离
将稳定表达AtRGP2:GFP或MPTMV:GFP的叶片在30％甘油中温育，使之发生质壁分离。将叶切片放入显微镜载玻片上的质壁分离溶液中固定。在发生质壁分离前～72小时，通过土壤杆菌叶片注射，使DsRed1在叶片中瞬时表达。
用布雷菲德菌素A处理
在AtRGP2:GFP瞬时表达时，土壤杆菌注射后约22小时，在烟草叶片背轴面主脉一侧注射50μg/ml BFA的0.1％DMSO溶液，主脉相对的一侧则是注射0.1％DMSO的模拟品。用1ml无针注射器进行注射，以便完全注满表皮下的胞间隙。沿侧脉轴(baso-petal axis)，切取位于两侧与主脉距离相等，面积相同的叶段，用共焦显微术检测。在BFA/DMSO注射后2-5小时(土壤杆菌注射后24-27小时)，用CLSM对穿过叶表皮细胞厚0.9μm的光学切片进行扫描。被拍照的细胞不包括毛状体基部的大细胞，也不包括紧接气孔保卫细胞的小细胞。用4株植物的共4片叶，重复实验两次。在10个BFA处理细胞和10个模拟品处理细胞中，统计荧光标记的胞间连丝。在5个连续光学切片(表示接近中层细胞)中，对每个细胞中荧光标记的胞间连丝总数进行计数。
荧光共焦显微术
荧光共焦显微术用Zeiss R510共焦激光扫描显微镜进行。用设置为488nm的氩激光器进行GFP激发，用525nm±20nm BP-滤光片组合检测发射。用设置为458nm的氩激光器进行CFP激发，用500nm±25nmBP-滤光片检测发射。对于CFP如果使用YFP，则用设置为514nm的氩激光器进行YFP激发，用550nm±20nm BP-滤光片组合检测发射。对于DsRed1如果使用YFP，则用设置为488nm的氩激光器进行YFP激发，用525nm±20nm BP-滤光片组合检测发射。不同的YFP条件用来防止荧光通道之间的渗透(bleed-through)。用设置为543nm的氦-氖激光器进行DsRed1激发，用587.5nm±27.5nm BP滤光片检测发射。为了暴露叶肉以便成像，用手撕开叶片，以便撕开叶片切段下表面的表皮。用Zeiss LSM-5图像浏览器进行图像分析。
结果
SE-WAP41是可逆糖基化多肽蛋白
本发明的发明人之前曾公开了S-41免疫标记的胞间连丝和高尔基体(Epel等，1996)。因为该抗血清是针对SDS-PAGE凝胶的蛋白质条带产生的，所以可识别可能存在于条带中的不止一种蛋白质。此外，该抗血清与另外两种蛋白质发生交叉反应。为了在分子水平表征一种或多种被靶向胞间连丝的S-41识别的蛋白质，采用组合的实验方法。一种方法中，利用S-41筛选用mRNA产生的表达文库，mRNA得自生长5天的玉米幼苗分生组织。筛选约4.3×105噬斑形成单位得到40个被S-41识别的克隆。杂交实验显示，分离克隆代表两个称为H1和H2的杂交组，分别含有19个和21个克隆，表明S-41从表达文库中鉴定出两个独特的蛋白质。平行地，对S-41识别的纯化SE-WAP41，即盐可提取的41kDa细胞壁缔合蛋白质(Epel等，1996)进行微量测序，得到25个氨基酸长的序列：NLDFLGMWRPFFQPYHLIIVQDGDP(SEQ ID NO：18)。根据该序列合成简并引物，以鉴定编码SE-WAP41内部序列的分离克隆。在PCR反应中，简并引物与得自文库载体序列的反向引物结合使用，以鉴定之前采用S-41抗血清分离的克隆，该序列编码含有测序肽的蛋白质。鉴定出多个克隆，全都属于H1杂交组，证实了该杂交组编码SE-WAP41蛋白。用与插入片段两侧的载体序列互补的引物，通过另外的PCR反应，测定属于H1的各个克隆的插入片段长度，对具有最长插入片段的克隆进行测序。插入片段的可读框编码含有364个氨基酸的蛋白质，质量计算值为41,038道尔顿，与41kDa细胞壁缔合蛋白质匹配。预计基因产物含有之前通过SE-WAP41微量测序所获得的内部序列，证实了所述克隆编码SE-WAP41。将编码SE-WAP41蛋白的玉米基因序列存入EMBL和NCBI数据库(检索号U89897)。与可逆糖基化多肽蛋白质家族成员6SE-WAP41(pfam 03214)的高序列同源性，导致将SE-WAP41注释为可逆糖基化多肽蛋白质。对H2杂交组的代表进行测序，发现其编码醛缩酶蛋白(数据未显示)。用针对重组SE-WAP41产生的抗血清仅仅鉴定出细胞壁组分中含量极高的41kDa蛋白质。用大肠杆菌(E.coli)表达的SE-WAP41作为his尾标融合物来免疫兔。从一只兔中获得抗血清，称为SR-41，在蛋白质印迹分析中，对纯化重组蛋白表现出良好的免疫原性活性。对得自可溶组分、膜组分和细胞壁组分的SR-41蛋白质进行蛋白质印迹分析证实，与膜组分和可溶组分相比，细胞壁组分中SE-WAP41极其丰富(图1a-c)，膜组分和可溶组分的标记较弱，这提示SE-WAP41与这些组分的缔合水平较低。该蛋白质印迹分析还证实SR-41抗血清识别41kDa蛋白质(图1b)，但不识别S-41标记的其它主要条带(图1c)。
SE-WAP41mRNA表达水平在分生组织和伸长组织中最高
简单初生胞间连丝和次生胞间连丝的形成及其成为分支胞间连丝的变化主要发生在分生组织及扩展组织和/或伸长组织中(Ehlers和Kollmann，2001；Roberts和Oparka，2003)。如果SE-WAP41是胞间连丝缔合蛋白质(Pd associated protein)，则预期在黄化玉米幼苗中其表达在中胚轴节中应当最高，中胚轴是分生组织，该区正好在节的下方1-2厘米，是细胞进行强烈伸长的区域。因此，沿中胚轴发育梯度，对长为1cm的各段进行SE-WAP41mRNA表达水平的比较。用SE-WAP41 cDNA探针的RNA印迹分析显示，SE-WAP41转录水平在含有中胚轴节的区段最高，细胞扩展最强，转录水平并沿中胚轴发育梯度降低(图2a-c)。
在第二个实验系统中，进一步检测了细胞分裂与mRNA表达水平的相关性。将黄化幼苗暴露在光下引起中胚轴分生组织停止细胞分裂(Iino，1982；Yahalom等，1987)。黄化幼苗暴露在光下后，在不同时间，用RNA印迹分析检测玉米中胚轴的SE-WAP41 mRNA表达水平。暴露在光下后，3小时后SE-WAP41 mRNA水平降低2倍，6小时后降低3.5倍，24小时后降低10倍(图3b)。肌动蛋白mRNA水平显示出类似的降低(图3a)，表示细胞分裂停止。
瞬时表达的AtRGP:GFP与胞间连丝和高尔基体小囊泡缔合
用拟南芥基因进行了进一步研究，因为拟南芥基因组已被完整测序并注明了可读框。拟南芥基因组编码称为AtRGP1、AtRGP2、AtRGP3和AtRGP4的四个同源基因(分别为SEQ ID NO：19-21)，这些基因属于1类可逆糖基化蛋白(C1RGP)。这些拟南芥蛋白质与SE-WAP41呈高度的氨基酸序列同一性(图4)。氨基酸序列分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)显示，AtRGP2与SE-WAP41最为同源，共享87％氨基酸序列同一性。使AtRGP2编码序列与GFP编码序列融合，AtRGP2:GFP嵌合体用土壤杆菌叶片注射法，在烟草叶表皮细胞中进行瞬时表达。共焦显微术在侧表皮细胞的几个独特位点显示出荧光。在细胞壁的相对一侧检测到点状成对的荧光灶-与是胞间连丝缔合蛋白质的AtRGP2的模式一致(图5a-b)。还观察到整个细胞质中成小荧光灶的荧光(图5b)，小荧光灶通过液泡在整个细胞质中和沿胞质丝快速移动，某种程序上有高尔基体小囊泡的特征(图9)。将PsRGP1，一种与SE_WAP41和AtRGP蛋白共享高序列同一性的C1RGP(图4)免疫定位到反面高尔基体(Dhugga等，1997)：这支持AtRGP2:GFP移动灶代表高尔基体的推测。为了验证移动灶的确是高尔基体，使用与黄色荧光蛋白(Yellow Fluorescence protein)融合的高尔基体核苷酸糖转运蛋白1(Golgi Nucleotide Sugar Transporter 1，GenBank检索号NM_179621)(GONST1:YFP)，已经证实黄色荧光蛋白能标记高尔基体(Baldwin等，2001)。AtRGP2当与青色荧光蛋白(Cyan Fluorescence Protein)融合(AtRGP2:CFP)并与GONST1:YFP共表达时，显然与GONST1:YFP共定位(图15a-c)。细胞内大的无定形区域和细胞核内小区域内也可观察到荧光(数据未显示)，无定形区域显然代表在瞬时表达时，由细胞内产生的大量AtRGP2:GFP所产生的包含体。为了检测胞间连丝缔合是否是C1RGP的普遍特性，构建AtRGP1:GFP、AtRGP3:GFP和AtRGP4:GFP，并在烟草叶表皮细胞中进行瞬时表达。这些融合蛋白显示荧光模式在所有方面都与AtRGP2:GFP所表现的模式相同(数据未显示)，只是AtRGP1:GFP荧光水平低得多。这些荧光模式与是胞间连丝缔合蛋白的AtRGP1、AtRGP3和AtRGP4的一致。所检测的所有4个拟南芥可逆糖基化多肽蛋白的观测结果看来都与胞间连丝缔合，表明胞间连丝缔合是C1RGP成员的普遍特性。
稳定表达的AtRGP2:GFP与胞间连丝缔合
产生在花椰菜花叶病毒35S启动子控制下，组成型表达AtRGP2:GFP融合物的转基因烟草植物。这些植物中，AtRGP2:GFP荧光定位于细胞壁内的点状荧光灶(图6a)。该模式类似于组成型表达已知胞间连丝标记烟草花叶病毒移动蛋白的GFP融合物(MPTMV:GFP)的转基因烟草植物代表的模式(图6b)。毛状体基部的细胞壁尤其富含胞间连丝。表达转基因MPTMV:GFP的烟草植物显示特有的密集点状模式，其中这些胞间连丝是荧光标记的(图6c)。表达转基因AtRGP2:GFP的植物表示出相同模式(图6d)，支持AtRGP2位于胞间连丝的结论。AtRGP2:GFP荧光仅见于含有胞间连丝、两个细胞接触的细胞壁区域，而没有胞间连丝的细胞壁区域是未标记的，与毛状体细胞和叶肉细胞表现的一样。烟草毛状体为毛状结构，从表皮表面突出出来，由单行的数个细胞组成(图6e)。因此，烟草毛状体细胞既具有含有胞间连丝的细胞壁，这些细胞壁将两个细胞分隔开来，又具有侧边细胞壁，这些细胞壁仅与毛状体周围的空间接触，没有胞间连丝。叶肉细胞(图6g)，同样具有无细胞间接触的区域，其中细胞壁面向胞间隙并且没有胞间连丝，还具有细胞间接触区域，其中细胞壁含有胞间连丝。在毛状体细胞(图6f)和叶肉细胞(图6h)中，仅在细胞间有接触的细胞壁区域检测到荧光。细胞壁的这种区别性标记进一步表明，AtRGP2与胞间连丝缔合，或者与围绕胞间连丝的细胞壁鞘(wallsheath)缔合。为了验证细胞壁内的点状荧光灶的确代表胞间连丝，采用苯胺蓝染色的胼胝质。胼胝质已广泛用作胞间连丝标记(Baluska等，1999；Gorshkova等，2003和Bayer等，2004)。当表达AtRGP2:GFP的转基因烟草叶片用苯胺蓝染色时，明显与苯胺蓝染色胼胝质共定位的AtRGP2:GFP(图16a-c)，存在于胞间连丝周围。不表达GFP的野生型烟草，当用苯胺蓝染色，并在GFP条件下拍照时，显示没有荧光标记的胞间连丝(数据未显示)。同样，表达转基因AtRGP2:GFP的转基因烟草不用苯胺蓝染色，但在苯胺蓝条件下拍照时，也显示没有荧光标记的胞间连丝(数据未显示)。这些阴性对照实验证实，共定位不是GFP与苯胺蓝通道之间荧光渗透的结果。成熟的烟草组织中，在流动体(mobile bodies)中未检测到AtRGP2:GFP荧光，可能是在稳定表达过程中存在的稳态水平较低所致。
AtRGP2:GFP保留在质壁分离细胞的细胞壁内
叶片细胞的质壁分离引起细胞原生质体皱缩，以及质膜从细胞壁缩回，保留的胞间连丝嵌入到细胞壁中(Turner等，1994)。为了了解AtRGP2与胞间连丝的缔合，在表达转基因AtRGP2:GFP烟草植物的叶片中诱导质壁分离。使用荧光染料DsRed1(一种胞质标记)，在质壁分离过程中更好的显现缩回的细胞质和质膜。在稳定表达AtRGP2:GFP的转基因烟草植物的叶表皮细胞内瞬时表达DsRed1，然后使细胞质壁分离，从而对这些细胞的细胞质进行标记(图7a)。质壁分离后，AtRGP2:GFP荧光明显保留在细胞质开始与两侧细胞壁分离的细胞壁区域内(图7b)。该结果证实，点状部位不在周细胞质内，也不是质膜缔合的，但却嵌入细胞壁。这与在质壁分离的稳定表达MPTMV:GFP的转基因烟草植物中得到的结果类似(图7c)。为了检测任何稳定表达的高尔基体定位GFP融合蛋白是否与胞间连丝缔合，产生GONST1:YFP表达转基因烟草植物。当这些植物发生质壁分离时，无荧光保留在细胞壁内(图7d)。
布雷菲德菌素A抑制用AtRGP2:GFP标记胞间连丝
AtRGP GFP融合物既存在于胞间连丝内又存在于高尔基体内，引导本发明的发明人假设，C1RGP通过高尔基体递送到胞间连丝。布雷菲德菌素A(BFA)，一种高尔基体的破裂剂(有关综述见Nebenfuhr等，2002)，被用来检验该假设。在AtRGP2:GFP的瞬时表达过程中，用BFA处理的烟草叶片表皮细胞与未用BFA处理的细胞进行比较。BFA处理细胞显示荧光标记的高尔基体的数量减少(图17a-b)。统计5个连续的代表每个细胞中层的共焦切片的荧光标记灶，荧光标记灶在相距太近以致于不能个别分辨出来的纹孔场中含有标记的胞间连丝或胞间连丝束。平均起来，BFA处理细胞呈现24.4±2.95荧光标记的胞间连丝，而模拟品处理细胞呈现77.3±10.85荧光标记的胞间连丝。因此，当与未用BFA处理的细胞相比时，BFA处理细胞显示，荧光标记的胞间连丝的平均数目减少约3倍。成对样品T检验显示，结果具有显著性差异P＜0.001。在破坏高尔基体的BFA存在下，AtRGP2:GFP标记的胞间连丝数目较低的事实，结合AtRGP的GFP融合物标记高尔基体的观测结果，证实C1RGP在到达胞间连丝前要通过高尔基体。
实施例2
与绿色荧光蛋白融合的胞间连丝缔合蛋白AtRGP2的过量表达削弱转基因烟草植物中烟草花叶病毒在细胞间的扩散
本发明的发明人已经指出，拟南芥的1类可逆糖基化多肽((C1)RGP)是胞间连丝缔合蛋白，通过高尔基体递送至胞间连丝(Pd)(Sagi等，2005)。发明人还提供和分析了各种数据，数据表明该蛋白质是一种靶向内胞间连丝质膜的外高尔基体的外周缔合膜(outer Golgiperipherally-associated membrane)(Sagi等，2005)。
为了检验1类可逆糖基化多肽阻断胞间连丝传导的假设，给WT和过量表达GFP标记拟南芥(C1)AtRGP2(AtRGP2:GFP)的转基因烟草(NN)植物接种烟草花叶病毒(TMV)。在该烟草品系中，可以复制和在细胞间扩散的TMV病毒将引起超敏反应(HR)，这可用于病毒感染性和扩散的定量和定性分析。
材料与方法
在以下相同物理条件下，使烟草(N.tabacum cv Xanthi)(NN)植物，WT和两个独立的转基因系(对于35S::AtRGP2:GFP是纯合的)生长，并接种烟草花叶病毒(TMV)：温度～23℃，短日照外界(温室)光照条件，每日浇水。由于转基因系特定的发育延迟，因此在WT和转基因植物的相同生理年龄(4-5对叶)时接种(图1)。在WT植物萌发后生长2个月时接种，而转基因植物在萌发后生长2.5个月时接种。纯合转基因植物表现出矮化形态。
用免疫纯化的完整TMV颗粒进行(母液浓度1mg/ml)接种。该母液溶液用0.05M磷酸钠缓冲液(pH＝7)进一步稀释成最终工作浓度10ng/ml(接种物)。
选择第二、第三和/或第四对完全发育成熟的叶片用于接种。每株植物用病毒接种不超过4片叶。采用WT和转基因相对应的叶对接种，叶片尺寸大致相同。接种方法如下：将金刚砂(320粗砂)均匀撒在整个近轴叶表面上，然后将150μl TMV接种物液滴(10ng/ml)沿中脉接种，在叶表面上摩擦，30-60秒钟后，用自来水简单冲洗。对照(模拟品)用相同体积但仅磷酸钠缓冲液的溶液接种。
接种后4天，收获叶片，保存在4℃下。对叶片进行拍照，统计坏死斑数目。另测量WT和转基因系的病斑直径，在立体显微镜下拍照。
结果
给WT(13株)和转基因植物(每系8株)接种TMV。接种后4天(dpi)在WT和转基因植物中，坏死斑清晰可见。WT每片叶的病斑数比过量表达AtRGP2:GFP的转基因植物的多(图11a-c和12a-c)。
虽然WT和转基因系叶片之间的病斑数目可变性大，但是坏死斑数目间的差异(图12a-c)及其大小和形状的差异(图13a-d)仍清晰可见。
WT和转基因系1-10之间的差异有统计显著性(图12b)。病斑的形状和大小在WT和转基因植物之间存在差异(图13a-d和14a-c)。WT植物中坏死斑直径比两个转基因系(图14a)的大，而且这种差异有统计显著性(图14b)。
病斑数的可变性可能是由于金钢砂覆盖叶表面不均匀和/或接种时对叶片的压力不相等所致。然而，坏死斑的形状和大小在WT和转基因植物之间明显不同。WT植物具有特征性的圆形大病斑，有清晰的边缘，可以分辨出三个独特区域(图13a-b)。两个转基因系上的病斑尺寸较小，形状不规则，不如WT一样圆，有不清楚的弥散边缘(图13c-d)。WT植物第二对叶片上病斑的直径比第三对叶的大，数量也比第三对叶的多(图14a-c)。这是因为第二片叶发育时间长，比第三片叶大。因此，仅可比较WT和转基因植物中大小大致相同的第三对叶片(图12a-c和14a-c)。
结论
本研究公开了基因的克隆和测序，所述基因编码属于可逆糖基化多肽蛋白质家族pfam 03214的蛋白质[The Conserved DomainArchitecture Retrieval Tool(CDART)]。RGP pfam 03214是高度保守的植物特异性蛋白质家族，存在于单子叶植物(Gupta等，2000；Langeveld等，2002)和双子叶植物(Dhugga等，1997；Delgado等，1998；Bocca等，1999；Zhao和Liu，2002)中。该家族的成员在UDP-葡萄糖、UDP-木糖和UDP-半乳糖存在下进行可逆的自身糖基化(Dhugga等，1991；Dhugga等，1997；Delgado等，1998)；糖基化发生在Arg残基上(Singh等，1995)。疏水簇分析提示可逆糖基化多肽可能是糖基转移酶(glycotransferases)(Saxena和Brown，1999)。
可逆糖基化多肽被分为两类，本文称为C1RGP和C2RGP。有研究提示，C2RGP的成员类似于加工糖基转移酶，它含有两个保守域，称为A域和B域(Langeveld等，2002)。有研究提示，根据结构分析，SE-WAP41所属C1RGP的成员为非加工糖基转移酶，因为它们具有A域，但缺乏以加工糖基转移酶为特征的B域(Saxena和Brown，1999)。
最新数据提示该家族的成员，特别是C1RGP成员，可能起到UDP-糖载体的作用，导致假设它们在将UDP-糖从细胞质递送到高尔基体膜上的转运蛋白中发挥作用(Faik等，2000；Porchia等，2002)，在高尔基体膜上，跨膜-糖基转移酶12在将UDP-糖转运到高尔基体腔内时发挥作用。然而，没有提出C1RGP可由高尔基体转运到胞间连丝，并掺入胞间连丝中的可能性。本研究的结论是，C1RGP是胞间连丝缔合蛋白。细胞组分的分级分离实验显示，含有胞间连丝的细胞壁组分中富含SE-WAP41。稳定表达AtRGP2:GFP，或者瞬时表达AtRGP1:GFP、AtRGP2:GFP、AtRGP3:GFP和AtRGP4:GFP的烟草表皮细胞的共焦显微镜术显示，细胞壁相对两侧成对荧光灶的荧光模式类似于表达已知胞间连丝标记MPTMV:GFP的烟草细胞所表现的荧光模式。此外，表达转基因AtRGP2:GFP的烟草中，毛状体和叶肉细胞的共焦显微术显示，荧光灶仅存在于含有胞间连丝的细胞壁内，没有胞间连丝的细胞壁内则不存在。存在于胞间连丝周围的苯胺蓝-染色胼胝质与细胞壁内的AtRGP2:GFP荧光灶共定位证实，这些AtRGP2:GFP灶代表了胞间连丝。
质壁分离实验提供了进一步的支持。在质壁分离过程中，质膜随细胞质从细胞壁上脱离而缩回，但是嵌入细胞壁的胞间连丝则保持不动(Turner等，1994)。AtRGP2:GFP荧光保留在发生质壁分离表皮细胞的细胞壁内，甚至保留在从细胞壁两侧开始分离的细胞质区域内，该事实表明这些蛋白质是胞间连丝缔合的。GONST1:YFP，另一种高尔基体定位荧光融合蛋白，当在转基因烟草中稳定表达时，不与胞间连丝缔合，正如质壁分离所证实的一样，该事实表明与胞间连丝缔合对C1RGP是特异性，通过与任何高尔基体定位的荧光融合蛋白共有的某些默认途径(default pathway)是不会发生的。
因为胞间连丝合成主要发生在分生组织和生长组织中，所以预期C1RGP合成和与高尔基体缔合将发生在这些区域内。实际上，RNA印迹分析证实了这种相关性，在进行细胞分裂和伸长的区域内测得较高的SE-WAP41mRNA水平。
所有拟南芥C1RGP蛋白质似乎是胞间连丝缔合的事实，提示与胞间连丝缔合可能是C1 RGP的普遍特性。有证据提示高尔基体起载体作用，由它将C1 RGP递送到胞间连丝中，因为PsRGP1曾被免疫定位到反面高尔基体上(Dhugga等，1997)，拟南芥细胞悬液组分的分级分离数据表明，AtRGP1定位在高尔基体上(Delgado等，1998)。AtRGP2:GFP的瞬时表达显示，该荧光融合蛋白与流动体，即在细胞质内流动的高尔基体小囊泡缔合。通过AtRGP2:CFP与已知高尔基体标记GONST1:YFP共定位，来证实这些流动体是高尔基体小囊泡。在瞬时表达过程中，高尔基体破裂药(disrupting drug)BFA大大减少在整个细胞溶胶中所见的AtRGP2:GFP灶的数目，该事实进一步支持这些灶代表高尔基体小囊泡的结论。最重要的是，在高尔基体破裂剂BFA存在下，通过瞬时表达AtRGP2:GFP标记的胞间连丝减少约三倍，这证实了穿过高尔基体是AtGRP2:GFP靶向胞间连丝所必需的。由于已知高尔基体小囊泡参与初生胞间连丝和次生胞间连丝的形成，故认为高尔基体用作将C1RGP递送至胞间连丝的载体。
在高尔基体内与胞间连丝内，AtRGP2:GFP水平之间的显著性差异很可能是因为AtRGP2:GFP在胞间连丝内永久性累积，而在高尔基体中，蛋白质在转运中，通过高尔基体网络从合成位点穿梭到达胞间连丝的最终目的地。在瞬时表达过程中，细胞在非常短的时间内，异常地产生非常大量的AtRGP2:GFP，使得其能够作为与高尔基体缔合的荧光进行检测。不同细胞组分的蛋白质印迹，不仅在膜组分和细胞壁组分中检测到C1RGP，而且还在可溶组分中检测到C1RGP。然而，免疫金电子显微镜术检测发现，除与高尔基体缔合外，几乎没有细胞溶胶性的可逆糖基化多肽(Epel等，1996；Dhugga等，1997)。
高尔基体缔合蛋白质可存在于高尔基体腔内，具有穿过高尔基体膜的跨膜区，或者可在外周与高尔基体膜的细胞溶胶侧连接。对于通过高尔基体小囊泡递送到胞间连丝的蛋白质，这些可能性的一种都可能导致蛋白质到达胞间连丝内的不同目的地。如果高尔基体小囊泡与质膜融合，则它们的腔外溢到细胞壁内，而它们的细胞溶胶侧则面向细胞溶胶。因此，存在于高尔基体腔内的蛋白质可能外运到围绕着胞间连丝的细胞壁内(图8a)，而具有跨膜区的蛋白质则可能变成具有面向暴露在质外体域的高尔基体腔的胞间连丝质膜内在蛋白(图8b)，在外周与高尔基体膜的细胞溶胶侧缔合的蛋白质可能达到面向胞间连丝胞质套管的质膜内侧(图8c)。目前的生物信息数据(http://smart.embl-heidelberg.de/和http://psort.nibb.ac.jp)及生化数据表明豌豆、玉米和拟南芥C1RGP在外周与外高尔基体膜缔合(Dhugga等，1991；Epel等，1996；Dhugga等，1997；Delgado等，1998)。因此，非常有可能在高尔基体与胞间连丝质膜融合时，或者在胞间连丝附近，C1RGP可与面向胞间连丝胞质套管的质膜连接。
不论其功能都清楚的是，RGP，特别是C1RGP被转运到胞间连丝。对于这类蛋白质的所有成员而言都是事实，因为，正如本文所述，本文所用的所有AtRGP蛋白质当在烟草中表达时，都精确地靶向胞间连丝。因此可以断定，负责C1RGP靶向胞间连丝的信号和将它们递送到胞间连丝的机制都是普遍且是不依赖于品种的。
用病毒扩散模型和表型观察法，检测C1RPG在植物中的功能，特别是在胞间连丝中的功能。
对于将发生的超敏反应，在感染植物细胞中进行最初复制后，病毒必会复制并扩散到最少数目的细胞内。本发明转基因植物中，坏死斑数目减少以及病斑尺寸减小，表明C1RPG改变了胞间连丝传导性，因此抑制病毒颗粒通过胞间连丝的最初扩散。
这种抑制导致与转基因植物的WT植物相比，转基因植物中所观察到的坏死斑减少。另外，本发明的转基因植物在高度和节间长度上，也可从表型上与WT植物区分开来。
因此，本发明提供转基因植物，该转基因植物能够使病毒感染局部化，并且具有有商业价值的表型。
应当了解的是，为了清楚起见在不同的实施方案内容中加以描述的本发明的某些特征，同样也可合并起来在一个实施方案中提供。相反，为简明起见在一个实施方案内容中加以描述的本发明的各种特征，同样也可单独或以任何合适的再合并方式予以提供。
尽管本发明结合其具体的实施方案加以描述，但是明显的是许多替换、修改和变化对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，本发明包括所有落入所附权利要求书精神和大范围中的这些替换、修改和变动。本说明书所提及的所有出版物、专利、专利申请和GenBank检索号都通过引用全部结合到本说明书中，其程度与每个独立出版物、专利、专利申请和GenBank检索号具体而单独指明通过引用结合到本文中一样。另外，在本申请任何参考文献的引用或标示都不得解释为承认这样的参考文献都可作为本发明的现有技术获得。
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序列表
<110>Epel，Bernard L.
Sagi，Guy L.
<120>用于产生胞间连丝传导性发生改变的植物的构建体和方法
<130>31956
<160>35
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<220>
<221>其他特征
<222>(9)..(9)
<223>n为a、c、g或t
<400>1
ttyttycanc cwtaycayct                                  20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>2
taatacgact cac tataggg                          20
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>3
cgaattcata tggcgggcac ggtgacg                   27
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>4
ccggatccta ctttggcctt gccatttgc                 29
<210>5
<211>5711
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pET-16 N’His-tag质粒
<400>5
ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa  60
ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg 120
caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt 180
gcgggatatc cggatatagt tcctcctttc agcaaaaaac ccctcaagac ccgtttagag 240
gccccaaggg gttatgctag ttattgctca gcggtggcag cagccaactc agcttccttt     300
cgggctttgt tagcagccgg atcctcgagc atatgacgac cttcgatatg gccgctgctg     360
tgatgatgat gatgatgatg atgatgatgg cccatggtat atctccttct taaagttaaa     420
caaaattatt tctagagggg aattgttatc cgctcacaat tcccctatag tgagtcgtat     480
taatttcgcg ggatcgagat ctcgatcctc tacgccggac gcatcgtggc cggcatcacc     540
ggcgccacag gtgcggttgc tggcgcctat atcgccgaca tcaccgatgg ggaagatcgg     600
gctcgccact tcgggctcat gagcgcttgt ttcggcgtgg gtatggtggc aggccccgtg     660
gccgggggac tgttgggcgc catctccttg catgcaccat tccttgcggc ggcggtgctc     720
aacggcctca acctactact gggctgcttc ctaatgcagg agtcgcataa gggagagcgt     780
cgagatcccg gacaccatcg aatggcgcaa aacctttcgc ggtatggcat gatagcgccc     840
ggaagagagt caattcaggg tggtgaatgt gaaaccagta acgttatacg atgtcgcaga     900
gtatgccggt gtctcttatc agaccgtttc ccgcgtggtg aaccaggcca gccacgtttc     960
tgcgaaaacg cgggaaaaag tggaagcggc gatggcggag ctgaattaca ttcccaaccg    1020
cgtggcacaa caactggcgg gcaaacagtc gttgctgatt ggcgttgcca cctccagtct    1080
ggccctgcac gcgccgtcgc aaattgtcgc ggcgattaaa tctcgcgccg atcaactggg    1140
tgccagcgtg gtggtgtcga tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta aagcggcggt    1200
gcacaatctt ctcgcgcaac gcgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc tggatgacca    1260
ggatgccatt gctgtggaag ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc ttgatgtctc    1320
tgaccagaca cccatcaaca gtattatttt ctcccatgaa gacggtacgc gactgggcgt    1380
ggagcatctg gtcgcattgg gtcaccagca aatcgcgctg ttagcgggcc cattaagttc    1440
tgtctcggcg cgtctgcgtc tggctggctg gcataaatat ctcactcgca atcaaattca    1500
gccgatagcg gaacgggaag gcgactggag tgccatgtcc ggttttcaac aaaccatgca    1560
aatgctgaat gagggcatcg ttcccactgc gatgctggtt gccaacgatc agatggcgct    1620
gggcgcaatg cgcgccatta ccgagtccgg gctgcgcgtt ggtgcggata tctcggtagt    1680
gggatacgac gataccgaag acagctcatg ttatatcccg ccgttaacca ccatcaaaca    1740
ggattttcgc ctgctggggc aaaccagcgt ggaccgcttg ctgcaactct ctcagggcca    1800
ggcggtgaag ggcaatcagc tgttgcccgt ctcactggtg aaaagaaaaa ccaccctggc    1860
gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg    1920
acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgta agttagctca    1980
ctcattaggc accgggatct cgaccgatgc ccttgagagc cttcaaccca gtcagctcct    2040
tccggtgggc gcggggcatg actatcgtcg ccgcacttat gactgtcttc tttatcatgc    2100
aactcgtagg acaggtgccg gcagcgctct gggtcatttt cggcgaggac cgctttcgct    2160
ggagcgcgac gatgatcggc ctgtcgcttg cggtattcgg aatcttgcac gccctcgctc    2220
aagccttcgt cactggtccc gccaccaaac gtttcggcga gaagcaggcc attatcgccg    2280
gcatggcggc cgacgcgctg ggctacgtct tgctggcgtt cgcgacgcga ggctggatgg    2340
ccttccccat tatgattctt ctcgcttccg gcggcatcgg gatgcccgcg ttgcaggcca    2400
tgctgtccag gcaggtagat gacgaccatc agggacagct tcaaggatcg ctcgcggctc    2460
ttaccagcct aacttcgatc actggaccgc tgatcgtcac ggcgatttat gccgcctcgg    2520
cgagcacatg gaacgggttg gcatggattg taggcgccgc cctatacctt gtctgcctcc    2580
ccgcgttgcg tcgcggtgca tggagccggg ccacctcgac ctgaatggaa gccggcggca    2640
cctcgctaac ggattcacca ctccaagaat tggagccaat caattcttgc ggagaactgt    2700
gaatgcgcaa accaaccctt ggcagaacat atccatcgcg tccgccatct ccagcagccg    2760
cacgcggcgc atctcgggca gcgttgggtc ctggccacgg gtgcgcatga tcgtgctcct    2820
gtcgttgagg acccggctag gctggcgggg ttgccttact ggttagcaga atgaatcacc    2880
gatacgcgag cgaacgtgaa gcgactgctg ctgcaaaacg tctgcgacct gagcaacaac    2940
atgaatggtc ttcggtttcc gtgtttcgta aagtctggaa acgcggaagt cagcgccctg    3000
caccattatg ttccggatct gcatcgcagg atgctgctgg ctaccctgtg gaacacctac    3060
atctgtatta acgaagcgct ggcattgacc ctgagtgatt tttctctggt cccgccgcat    3120
ccataccgcc agttgtttac cctcacaacg ttccagtaac cgggcatgtt catcatcagt    3180
aacccgtatc gtgagcatcc tctctcgttt catcggtatc attaccccca tgaacagaaa    3240
tcccccttac acggaggcat cagtgaccaa acaggaaaaa accgccctta acatggcccg    3300
ctttatcaga agccagacat taacgcttct ggagaaactc aacgagctgg acgcggatga    3360
acaggcagac atctgtgaat cgcttcacga ccacgctgat gagctttacc gcagctgcct    3420
cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac    3480
agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt    3540
tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag tgtatactgg    3600
cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatatg cggtgtgaaa    3660
taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca    3720
ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg    3780
taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc    3840
agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc    3900
cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac    3960
tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc    4020
tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata    4080
gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc    4140
acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca    4200
acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag    4260
cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta    4320
gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg    4380
gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc    4440
agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt    4500
ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa    4560
ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat    4620
atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga    4680
tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac    4740
gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg    4800
ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg  4860
caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt  4920
cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctgc aggcatcgtg gtgtcacgct  4980
cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat  5040
cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta  5100
agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca  5160
tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat  5220
agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaac acgggataat accgcgccac  5280
atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa  5340
ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt  5400
cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg  5460
caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat  5520
attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt  5580
agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct  5640
aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc  5700
gtcttcaaga a                                                       5711
<210>6
<211>371
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>花椰菜花叶病毒35S启动子
<400>6
ctcagaagac cagagggcta ttgagacttt tcaacaaagg gtaatatcgg gaaacctcct   60
cggattccat tgcccagcta tctgtcactt catcgaaagg acagtagaaa aggaaggtgg  120
ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggctatc gttcaagatg cctctaccga  180
cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggaacatc gtggaaaaag aagacgttcc  240
aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc  300
acaatcccac tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat ttcatttgga  360
gaggacaggc t                                                       371
<210>7
<211>258
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>一氧化氮合酶转录终止子
<400>7
ctgcagatcg ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc   60
ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt  120
aatgcatgac gttatttatg agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt  180
aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt  240
catctatgtt actagatc                                                258
<210>8
<211>1401
<212>DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>8
gacccacgcg tccggtaaac catggttgag ccggcgaata ctgttggtct tccggtgaac   60
ccgactccgt tgctgaaaga tgagctcgat atcgtgattc cgactatcag aaacctcgat  120
ttcctcgaga tgtggaggcc ttttcttcag ccttaccatc tgatcatcgt ccaggacgga  180
gatccatcga agaagatcca tgtccctgaa ggttacgact acgagctcta caacaggaac  240
gacattaacc gaatcctcgg acctaaggct tcttgtatct cgtttaagga ttctgcttgt  300
cgatgctttg ggtacatggt gtctaagaag aagtatatct tcaccattga tgacgattgc  360
ttcgttgcca aggatccatc aggcaaagca gtgaacgctc ttgagcaaca catcaagaac  420
cttctctgcc catcgtctcc ctttttcttc aacaccttgt atgatcctta ccgtgaaggt  480
gctgatttcg tccgtggata ccctttcagt ctccgtgaag gtgtttccac tgctgtttcc  540
catggtcttt ggctcaacat ccctgactac gatgccccga cccaactcgt gaagcctaag  600
gagaggaaca ccaggtatgt ggatgctgtc atgaccaacc caaagggaac acttttccca  660
atgtgtggta tgaacttggc ttttgaccgt gatttgattg gcccggctat gtactttgtt  720
ctcatgggtg atggtcagcc tattggtcgt tacgacgata tgtgggctgg ttggtgcatc  780
aaggtgatct gtgaccactt gagcttggga gtgaagaccg gtttaccgta tatctaccac  840
agcaaagcga gcaacccttt tgttaacctg aagaaggaat acaagggaat cttctggcag  900
gaggagatca ttccgttctt ccagaacgca aagctatcga aagaagcagt aactgttcag  960
caatgctaca ttgagctctc aaagatggtc aaggagaagt tgagctcctt agacccgtac 1020
tttgacaagc ttgcagatgc catggttaca tggattgaag cttgggatga gcttaaccca 1080
ccagcagcca gtggcaaaag cttgagagca gtatgagcca aaaagaaaaa gccaccaaag 1140
ttttggttat ttttagctca aattatcgtt acttttaaat ttctgatttt acgaaccttt 1200
cttgcttttt ttacacattt gagtagtttt catcatcagt actttctcat tgtccggtta 1260
tggtttttgc atttggttta aatatcaccg gtttatttat aaacagtggt ggattagtag  1320
tactattttc tgagtttttt tctttgtttc attaataaaa aggccttttc ataggtgttt  1380
gcaattaaaa aaaaaaaaaa a                                            1401
<210>9
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>9
tctagaattc atggttgagc cggcgaatac tg                                 32
<210>10
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>10
tctagatact gctctcaagc ttttgccact g                                  31
<210>11
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>11
tctagaattc atggcgcaat tgtattcttc cgtg                               34
<210>12
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>12
tctagaattt ttgccttttg gtgcctcagc                                    30
<210>13
<211>1393
<212>DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>13
gacccacgcg tccgctcaaa tctccacaat cttttctctc caaattctct tctctctgaa   60
tcaatccaat catggttgag ccggcgaaca ccgttggaat tccggtgaac cacatcccat  120
tgttgaagga tgagctcgat atcgtgatcc ccacgatccg taacctcgat ttcctggaga  180
tgtggaggcc tttttttcag ccttaccatc tgattatcgt ccaagatgga gatccatcga  240
agaccattgc tgtccctgaa gggttcgatt acgaactcta caacaggaac gacatcaacc  300
gtatccttgg tcctaaagct tcctgcattt ccttcaagga ctctgcttgt cgttgcttcg  360
gctacatggt ctccaagaag aagtacatct tcactattga tgacgattgc ttcgttgcta  420
aggatccatc tggaaaagct gtgaacgctc ttgagcaaca catcaagaac cttctctgcc  480
catcaactcc atttttcttc aacaccttgt acgacccata ccgtgaaggt gctgacttcg  540
tccgtggata ccctttcagt ctccgtgagg gtgtttccac cgctgtttcc cacggtctgt  600
ggctcaacat ccctgattac gatgccccta cccaacttgt gaagcctaag gaaaggaaca  660
caaggtatgt ggatgctgtc atgaccatcc caaaggggac tcttttccct atgtgtggta  720
tgaacttggc ctatgaccgt gagctcattg gtccggctat gtactttggt ctcatgggtg  780
atggtcagcc tattggtcgc tacgacgata tgtgggctgg atggtgtatc aaggtgatct  840
gtgaccattt gggattggga gtgaagacag gtttgcccta catttaccac agcaaagcca  900
gcaacccgtt tgtgaacttg aagaaggagt acaagggaat cttctggcag gaggatatca  960
ttcctttctt ccagagccca aagctcacga aagaagctgt gacagttcaa caatgctaca 1020
tggagctgtc caagttggtg aaggagaagc taagccccat tgatccttac tttgacaagc 1080
ttgcagatgc tatggtcact tggattgaag cttgggatga gcttaaccca cccactaaag 1140
cttgagcagc aaaaaaacca ccaccgcagt tttggttatt agctcaacat atcatctatc 1200
ttctccgttt tgtttttgtt ttgtcttttc tcaaattttc cggcgattct tcagttcgtt 1260
tttaagttgc cggagtttat ttaaatagtg aatggtgtag ttctatttat gaccgagaca 1320
atctctcttt tgaggttttt cgtttttgtt tcaataataa aaaatcatat cccttaaaaa  1380
aaaaaaaaaa aaa                                                     1393
<210>14
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>14
cctaggaatt catggttgag ccggcgaaca c                                  31
<210>15
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>15
cctaggagct ttagtgggtg ggttaagctc                                    30
<210>16
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>16
cctaggaatt catggcgggc tacaacctcg aagctatc                           38
<210>17
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>单链DNA寡核苷酸
<400>17
cctaggcttg gccttgacat ctttgccatc gctc                               34
<210>18
<211>25
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>得自微量测序的肽序列
<400>18
Asn Leu Asp Phe Leu Gly Met Trp Arg Pro Phe Phe Gln Pro Tyr His
1               5                   10                  15
Leu Ile Ile Val Gln Asp Gly Asp Pro
            20                  25
<210>19
<211>357
<212>PRT
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>19
Met Val Glu Pro Ala Asn Thr Val Gly Ile Pro Val Asn His Ile Pro
1               5                   10                  15
Leu Leu Lys Asp Glu Leu Asp Ile Val Ile Pro Thr Ile Arg Asn Leu
            20                  25                  30
Asp Phe Leu Glu Met Trp Arg Pro Phe Phe Gln Pro Tyr His Leu Ile
        35                  40                  45
Ile Val Gln Asp Gly Asp Pro Ser Lys Thr Ile Ala Val Pro Glu Gly
    50                  55                  60
Phe Asp Tyr Glu Leu Tyr Asn Arg Asn Asp Ile Asn Arg Ile Leu Gly
65                  70                  75                  80
Pro Lys Ala Ser Cys Ile Ser Phe Lys Asp Ser Ala Cys Arg Cys Phe
                85                  90                  95
Gly Tyr Met Val Ser Lys Lys Lys Tyr Ile Phe Thr Ile Asp Asp Asp
            100                 105                 110
Cys Phe Val Ala Lys Asp Pro Ser Gly Lys Ala Val Asn Ala Leu Glu
        115                 120                 125
Gln His Ile Lys Asn Leu Leu Cys Pro Ser Thr Pro Phe Phe Phe Asn
    130                 135                 140
Thr Leu Tyr Asp Pro Tyr Arg Glu Gly Ala Asp Phe Val Arg Gly Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Phe Ser Leu Arg Glu Gly Val Ser Thr Ala Val Ser His Gly Leu
                165                 170                 175
Trp Leu Asn Ile Pro Asp Tyr Asp Ala Pro Thr Gln Leu Val Lys Pro
            180                 185                 190
Lys Glu Arg Asn Thr Arg Tyr Val Asp Ala Val Met Thr Ile Pro Lys
        195                 200                 205
Gly Thr Leu Phe Pro Met Cys Gly Met Asn Leu Ala Tyr Asp Arg Glu
    210                 215                 220
Leu Ile Gly Pro Ala Met Tyr Phe Gly Leu Met Gly Asp Gly Gln Pro
225                 230                 235                 240
Ile Gly Arg Tyr Asp Asp Met Trp Ala Gly Trp Cys Ile Lys Val Ile
                245                 250                 255
Cys Asp His Leu Gly Leu Gly Val Lys Thr Gly Leu Pro Tyr Ile Tyr
            260                 265                 270
His Ser Lys Ala Ser Asn Pro Phe Val Asn Leu Lys Lys Glu Tyr Lys
        275                 280                 285
Gly Ile Phe Trp Gln Glu Asp Ile Ile Pro Phe Phe Gln Ser Pro Lys
    290                 295                 300
Leu Thr Lys Glu Ala Val Thr Val Gln Gln Cys Tyr Met Glu Leu Ser
305                 310                 315                 320
Lys Leu Val Lys Glu Lys Leu Ser Pro Ile Asp Pro Tyr Phe Asp Lys
                325                 330                 335
Leu Ala Asp Ala Met Val Thr Trp Ile Glu Ala Trp Asp Glu Leu Asn
            340                 345                 350
Pro Pro Thr Lys Ala
        355
<210>20
<211>364
<212>PRT
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>20
Met Val Glu Pro Ala Asn Thr Val Gly Leu Pro Val Asn Pro Thr Pro
1               5                   10                  15
Leu Leu Lys Asp Glu Leu Asp Ile Val Ile Pro Thr Ile Arg Asn Leu
            20                  25                  30
Asp Phe Leu Glu Met Trp Arg Pro Phe Leu Gln Pro Tyr His Leu Ile
        35                  40                  45
Ile Val Gln Asp Gly Asp Pro Ser Lys Lys Ile His Val Pro Glu Gly
    50                  55                  60
Tyr Asp Tyr Glu Leu Tyr Asn Arg Asn Asp Ile Asn Arg Ile Leu Gly
65                  70                  75                  80
Pro Lys Ala Ser Cys Ile Ser Phe Lys Asp Ser Ala Cys Arg Cys Phe
                85                  90                  95
Gly Tyr Met Val Ser Lys Lys Lys Tyr Ile Phe Thr Ile Asp Asp Asp
            100                 105                 110
Cys Phe Val Ala Lys Asp Pro Ser Gly Lys Ala Val Asn Ala Leu Glu
        115                 120                 125
Gln His Ile Lys Asn Leu Leu Cys Pro Ser Ser Pro Phe Phe Phe Asn
    130                 135                 140
Thr Leu Tyr Asp Pro Tyr Arg Glu Gly Ala Asp Phe Val Arg Gly Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Phe Ser Leu Arg Glu Gly Val Ser Thr Ala Val Ser His Gly Leu
                165                 170                 175
Trp Leu Asn Ile Pro Asp Tyr Asp Ala Pro Thr Gln Leu Val Lys Pro
            180                 185                 190
Lys Glu Arg Asn Thr Arg Tyr Val Asp Ala Val Met Thr Asn Pro Lys
        195                 200                 205
Gly Thr Leu Phe Pro Met Cys Gly Met Asn Leu Ala Phe Asp Arg Asp
    210                 215                 220
Leu Ile Gly Pro Ala Met Tyr Phe Val Leu Met Gly Asp Gly Gln Pro
225                 230                 235                 240
Ile Gly Arg Tyr Asp Asp Met Trp Ala Gly Trp Cys Ile Lys Val Ile
                245                 250                 255
Cys Asp His Leu Ser Leu Gly Val Lys Thr Gly Leu Pro Tyr Ile Tyr
            260                 265                 270
His Ser Lys Ala Ser Asn Pro Phe Val Asn Leu Lys Lys Glu Tyr Lys
        275                 280                 285
Gly Ile Phe Trp Gln Glu Glu Ile Ile Pro Phe Phe Gln Asn Ala Lys
    290                 295                 300
Leu Ser Lys Glu Ala Val Thr Val Gln Gln Cys Tyr Ile Glu Leu Ser
305                 310                 315                 320
Lys Met Val Lys Glu Lys Leu Ser Ser Leu Asp Pro Tyr Phe Asp Lys
                325                 330                 335
Leu Ala Asp Ala Met Val Thr Trp Ile Glu Ala Trp Asp Glu Leu Asn
            340                 345                 350
Pro Pro Ala Ala Ser Gly Lys Ser Leu Arg Ala Val
        355                 360
<210>21
<211>362
<212>PRT
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>21
Met Ala Gln Leu Tyr Ser Ser Val Lys Pro Thr Pro Met Leu Lys Asp
1               5                   10                  15
Glu Leu Asp Ile Val Ile Pro Thr Ile Arg Asn Leu Asp Phe Leu Glu
            20                  25                  30
Met Trp Arg Pro Phe Phe Glu Gln Tyr His Leu Ile Ile Val Gln Asp
        35                  40                  45
Gly Asp Pro Ser Lys Val Ile Asn Ile Pro Val Gly Phe Asp Tyr Glu
    50                  55                  60
Leu Tyr Asn Arg Asn Asp Ile Asn Arg Ile Leu Gly Pro Lys Ala Ser
65                  70                  75                  80
Cys Ile Ser Phe Lys Asp Ser Ala Cys Arg Cys Phe Gly Tyr Met Val
                85                  90                  95
Ser Lys Lys Lys Tyr Ile Tyr Thr Ile Asp Asp Asp Cys Phe Val Ala
            100                 105                 110
Lys Asp Pro Thr Gly Lys Glu Ile Asn Ala Leu Glu Gln His Ile Lys
        115                 120                 125
Asn Leu Leu Ser Pro Ser Thr Pro His Phe Phe Asn Thr Leu Tyr Asp
    130                 135                 140
Pro Tyr Arg Asp Gly Ala Asp Phe Val Arg Gly Tyr Pro Phe Ser Met
145                 150                 155                 160
Arg Glu Gly Ala Ile Thr Ala Val Ser His Gly Leu Trp Leu Asn Ile
                165                 170                 175
Pro Asp Tyr Asp Ala Pro Thr Gln Leu Val Lys Pro Leu Glu Lys Asn
            180                 185                 190
Ser Arg Tyr Val Asp Ala Val Met Thr Ile Pro Lys Gly Thr Leu Phe
        195                 200                 205
Pro Met Cys Gly Met Asn Leu Ala Phe Asp Arg Glu Leu Ile Gly Pro
    210                 215                 220
Ala Met Tyr Phe Gly Leu Met Gly Asp Gly Gln Pro Ile Gly Arg Tyr
225                 230                 235                 240
Asp Asp Met Trp Ala Gly Trp Cys Val Lys Val Ile Cys Asp His Met
                245                 250                 255
Gly Trp Gly Val Lys Thr Gly Leu Pro Tyr Ile Trp His Ser Lys Ala
            260                 265                 270
Ser Asn Pro Phe Val Asn Leu Lys Lys Glu Tyr Asn Gly Ile Phe Trp
        275                 280                 285
Gln Glu Glu Ala Ile Pro Phe Phe Gln Ser Val Thr Leu Pro Lys Glu
    290                 295                 300
Cys Thr Ser Val Gln Gln Cys Tyr Leu 6lu Leu Ala Lys Leu Val Arg
305                 310                 315                 320
Glu Lys Leu Gly Lys Val Asp Pro Tyr Phe Ile Thr Leu Ala Thr Gly
                325                 330                 335
Met Val Thr Trp Ile Glu Ala Trp Glu Glu Leu Asn Ser Ala Glu Gly
            340                 345                 350
Thr Glu Ala Glu Ala Pro Lys Gly Lys Asn
        355                 360
<210>22
<211>364
<212>PRT
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>22
Met Ala Gly Tyr Asn Leu Glu Ala Ile Glu Ala Ala Pro Leu Lys Asp
1               5                   10                  15
Asp Leu Asp Ile Val Ile Pro Thr Ile Arg Ser Leu Asp Phe Leu Glu
            20                  25                  30
Gln Trp Arg Pro Phe Leu His His Tyr His Leu Ile Ile Val Gln Asp
        35                  40                  45
Gly Asp Pro Ser Ile Lys Ile Arg Val Pro Glu Gly Tyr Asp Tyr Glu
    50                  55                  60
Leu Tyr Asn Arg Asn Asp Ile Asn Arg Ile Leu Gly Pro Arg Ala Asn
65                  70                  75                  80
Cys Ile Ser Tyr Lys Asp Gly Gly Cys Arg Cys Phe Gly Phe Met Val
                85                  90                  95
Ser Lys Lys Lys Tyr Ile Tyr Thr Ile Asp Asp Asp Cys Phe Val Ala
            100                 105                 110
Lys Asp Pro Ser Gly Lys Asp Ile Asn Val Ile Ala Gln His Ile Lys
        115                 120                 125
Asn Leu Glu Thr Pro Ser Thr Pro His Tyr Phe Asn Thr Leu Tyr Asp
    130                 135                 140
Pro Phe Arg Asp Gly Thr Asp Phe Val Arg Gly Tyr Pro Phe Ser Leu
145                 150                 155                 160
Arg Glu Gly Val Gln Thr Ala Ile Ser His Gly Leu Trp Leu Asn Ile
                165                 170                 175
Pro Asp Tyr Asp Ala Pro Thr Gln Leu Val Lys Pro Arg Glu Arg Asn
            180                 185                 190
Thr Arg Tyr Val Asp Ala Val Met Thr Ile Pro Lys Arg Val Leu Tyr
        195                 200                 205
Pro Met Cys Gly Met Asn Leu Ala Phe Asn Arg Glu Leu Val Gly Pro
    210                 215                 220
Ala Met Tyr Phe Gly Leu Met Gly Glu Gly Gln Pro Ile Ser Arg Tyr
225                 230                 235                 240
Asp Asp Met Trp Ala Gly Trp Ala Ala Lys Val Val Cys Asp His Leu
                245                 250                 255
Gly Phe Gly Val Lys Thr Gly Leu Pro Tyr Leu Trp His Ser Lys Ala
            260                 265                 270
Ser Asn Pro Phe Val Asn Leu Lys Lys Glu His Lys Gly Leu His Trp
        275                 280                 285
Gln Glu Asp Met Val Pro Phe Phe Gln Asn Leu Arg Leu Ser Lys Glu
    290                 295                 300
Ser Asp Thr Ala Ala Lys Cys Tyr Met Glu Ile Ser Asn Met Thr Lys
305                 310                 315                 320
Glu Lys Leu Thr Lys Val Asp Pro Tyr Phe Glu Lys Leu Ala Asp Ala
                325                 330                 335
Met Val Val Trp Ile Glu Ala Trp Glu Glu Leu Asn Pro Pro Val Lys
            340                 345                 350
Lys Lys Gln Ser Asp Gly Lys Asp Val Lys Ala Lys
        355                 360
<210>23
<211>364
<212>PRT
<213>豌豆(Pisum sativum)
<400>23
Met Ala Ser Leu Pro Lys Pro Thr Pro Leu Leu Lys Asp Glu Leu Asp
1               5                   10                  15
Ile Val Ile Pro Thr Ile Arg Asn Leu Asp Phe Leu Glu Met Trp Arg
            20                  25                  30
Pro Phe Phe Glu Gln Tyr His Leu Ile Ile Val Gln Asp Gly Asp Pro
        35                  40                  45
Ser Lys Val Ile Lys Val Pro Glu Gly Phe Asp Tyr Glu Leu Tyr Asn
    50                  55                  60
Arg Asn Asp Ile Asn Arg Ile Leu Gly Pro Lys Ala Ser Cys Ile Ser
65                  70                  75                  80
Phe Lys Asp Ser Ala Cys Arg Cys Phe Gly Tyr Met Val Ser Lys Lys
                85                  90                  95
Lys Tyr Ile Tyr Thr Ile Asp Asp Asp Cys Phe Val Ala Lys Asp Pro
            100                 105                 110
Thr Gly His Glu Ile Asn Ala Leu Glu Gln His Ile Lys Asn Leu Leu
        115                 120                 125
Ser Pro Ser Thr Pro Phe Phe Phe Asn Thr Leu Tyr Asp Pro Tyr Arg
    130                 135                 140
Glu Gly Thr Asp Phe Val Arg Gly Tyr Pro Phe Ser Leu Arg Glu Gly
145                 150                 155                 160
Val Pro Thr Ala Val Ser His Gly Leu Trp Leu Asn Ile Pro Asp Tyr
                165                 170                 175
Asp Ala Pro Thr Gln Leu Val Lys Pro His Glu Arg Asn Thr Arg Phe
            180                 185                 190
Val Asp Ala Val Leu Thr Ile Pro Lys Gly Ser Leu Phe Pro Met Cys
        195                 200                 205
Gly Met Asn Leu Ala Phe Asn Arg Glu Leu Ile Gly Pro Ala Met Tyr
    210                 215                 220
Phe Gly Leu Met Gly Asp Gly Gln Pro Ile Gly Arg Tyr Asp Asp Met
225                 230                 235                 240
Trp Ala Gly Trp Cys Ile Lys Val Ile Cys Asp His Leu Gly Tyr Gly
                245                 250                 255
Val Lys Thr Gly Leu Pro Tyr Ile Trp His Ser Lys Ala Ser Asn Pro
            260                 265                 270
Phe Val Asn Leu Lys Lys Glu Tyr Lys Gly Ile Phe Trp Gln Glu Glu
        275                 280                 285
Ile Ile Pro Phe Phe Gln Ala Ala Thr Leu Ser Lys Asp Cys Thr Ser
    290                 295                 300
Val Gln Lys Cys Tyr Ile Glu Leu Ser Lys Gln Val Lys Glu Lys Leu
305                 310                 315                 320
Gly Thr Ile Asp Pro Tyr Phe Ile Lys Leu Ala Asp Ala Met Val Thr
                325                 330                 335
Trp Val Glu Ala Trp Asp Glu Ile Asn Asn Asn Lys Ser Glu Glu Thr
            340                 345                 350
Thr Ser Thr Lys Ala Ser Glu Val Ala Ala Thr Lys
        355                 360
<210>24
<211>364
<212>PRT
<213>玉米(Zea mays)
<400>24
Met Ala Gly Thr Val Thr Val Pro Gly Ser Ser Thr Pro Ser Thr Pro
1               5                   10                  15
Leu Leu Lys Asp Glu Leu Asp Ile Val Ile Pro Thr Ile Arg Asn Leu
            20                  25                  30
Asp Phe Leu Glu Met Trp Arg Ala Phe Phe Gln Pro Tyr His Leu Ile
        35                  40                  45
Ile Val Gln Asp Gly Asp Pro Thr Lys Thr Ile Lys Val Pro Glu Gly
    50                  55                  60
Phe Asp Tyr Glu Leu Tyr Asn Arg Asn Asp Ile Asn Arg Ile Leu Gly
65                  70                  75                  80
Pro Lys Ala Ser Cys Ile Ser Phe Lys Asp Ser Ala Cys Arg Cys Phe
                85                  90                  95
Gly Tyr Met Val Ser Lys Lys Lys Tyr Ile Tyr Thr Ile Asp Asp Asp
            100                 105                 110
Cys Phe Val Ala Lys Asp Pro Ser Gly Lys Asp Ile Asn Ala Leu Glu
        115                 120                 125
Gln His Ile Lys Asn Leu Leu Ser Pro Ser Thr Pro Phe Phe Phe Asn
    130                 135                 140
Thr Leu Tyr Asp Pro Tyr Arg Glu Gly Ala Asp Phe Val Arg Gly Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Phe Ser Leu Arg Glu Gly Ala His Thr Ala Val Ser His Gly Leu
                165                 170                 175
Trp Leu Asn Ile Pro Asp Tyr Asp Ala Pro Thr Gln Leu Val Lys Pro
            180                 185                 190
Lys Glu Arg Asn Glu Arg Tyr Val Asp Ala Val Met Thr Ile Pro Lys
        195                 200                 205
Gly Thr Leu Phe Pro Met Cys Gly Met Asn Leu Ala Phe Asp Arg Asp
    210                 215                 220
Leu Ile Gly Pro Ala Met Tyr Phe Gly Leu Met Gly Asp Gly Gln Pro
225                 230                 235                 240
Ile Gly Arg Tyr Asp Asp Met Trp Ala Gly Trp Cys Val Lys Val Ile
                245                 250                 255
Cys Asp His Leu Ser Leu Gly Val Lys Thr Gly Leu Pro Tyr Ile Trp
            260                 265                 270
His Ser Lys Ala Ser Asn Pro Phe Val Asn Leu Lys Lys Glu Tyr Lys
        275                 280                 285
Gly Ile Phe Trp Gln Glu Asp Ile Ile Pro Phe Phe Gln Asn Val Thr
    290                 295                 300
Ile Pro Lys Asp Cys Asp Thr Val Gln Lys Cys Tyr Ile Tyr Leu Ser
305                 310                 315                 320
Gly Gln Val Lys Glu Lys Leu Gly Thr Ile Asp Pro Tyr Phe Val Lys
                325                 330                 335
Leu Gly Asp Ala Met Val Thr Trp Ile Glu Ala Trp Asp Glu Leu Asn
            340                 345                 350
Pro Ser Thr Pro Ala Ala Ala Asn Gly Lys Ala Lys
        355                 360
<210>25
<211>1374
<212>DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>25
actctttctt ccttgtcgtt tcaaatggcg caattgtatt cttccgtgaa acccacgcca   60
atgttgaaag atgagctaga cattgtgata cctacgattc gaaacctcga cttccttgag  120
atgtggcgac ctttctttga gcagtatcat ttgatcattg ttcaagatgg tgatccttcg  180
aaagtcatca acattccagt agggtttgac tacgagctct acaacaggaa cgacatcaat  240
cgaatcttgg gtcccaaggc ctcttgcatt tccttcaagg actctgcttg tcgttgcttc  300
ggttacatgg tctccaaaaa gaagtacatc tacaccattg atgatgattg ctttgttgca  360
aaggatccaa cagggaaaga gatcaatgcg cttgagcagc atatcaagaa cctcttatct  420
ccatcaactc cgcatttctt taacacactt tatgatccat acagagatgg ggcagacttt  480
gttcgtggat accctttcag tatgcgcgaa ggtgccataa ccgcggtctc tcatggcctc  540
tggctcaaca ttcctgacta tgatgctccc actcagcttg tgaaacctct tgagaaaaat  600
tccaggtatg ttgatgcagt catgaccatt cccaaaggaa ctctttttcc tatgtgtggt  660
atgaaccttg cttttgaccg tgagctgatt ggtccggcta tgtactttgg gcttatgggt  720
gatggacagc caattggacg ctatgacgac atgtgggctg gttggtgtgt caaggtgata  780
tgtgaccaca tgggatgggg agtgaagacg ggtttgcctt acatatggca cagcaaagcc  840
agcaacccat tcgtgaacct gaaaaaggaa tacaacggaa tattttggca ggaagaggcg  900
attccgttct ttcaatccgt gactcttcct aaagagtgca cttcggtgca gcaatgctac  960
ctcgagctgg ccaagctcgt gagagagaaa cttgggaagg ttgatcctta cttcatcaca 1020
cttgcaactg gaatggtcac ctggatcgaa gcttgggagg agcttaactc cgcggaggga 1080
actgaggctg aggcaccaaa aggcaaaaat tagtaaagag aaggtcactg aataaggcaa 1140
atggtattgt ttactaggag aaaagggttt gagtcacatg tgcaaccctc tctgtttttc 1200
ttaatcataa tttgatttgc ttctgtcttt aatttcttgt catcagtatt tgtgttctca 1260
gtgcattgtc agtttgtcac aaaaagagaa ggtgtaatgt gctctatgca ttttgttttc 1320
tttaaggttt ctaaactctt tatctatgaa atatctatca ttcctatttt cctt       1374
<210>26
<211>1251
<212>DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>26
taagtaccaa aaatggcggg ctacaacctc gaagctatcg aagcggcacc tttgaaagac   60
gatctggata ttgtgatccc aaccatcaga agcctcgact ttctagagca atggagacca  120
tttttgcacc attaccacct gatcattgtc caagatggag acccttccat caagatccga  180
gttcccgagg gttatgacta cgagctctac aaccgtaatg atatcaacag gatccttggt  240
ccaagagcta attgtatctc ctacaaagat ggtggttgtc gctgctttgg cttcatggtt  300
tctaaaaaga agtatatcta caccattgat gatgattgct ttgtggcaaa ggatccaagt  360
gggaaagaca tcaatgtgat agctcagcac ataaagaacc ttgaaacacc ttcaacacca  420
cactacttca acactctcta tgaccctttt agagatggaa ctgatttcgt cagagggtat  480
cctttcagtc taagggaagg tgtccaaacc gccatatctc atggtctttg gctcaacatc  540
cctgactatg atgccccaac ccaacttgtg aagccccgcg aacgtaacac gaggtatgtg  600
gatgcagtaa tgacaattcc aaaaagagta ttgtacccaa tgtgtggtat gaatcttgct  660
ttcaatagag agcttgttgg acctgctatg tactttggac ttatgggtga aggccagccc  720
atttctcggt acgatgacat gtgggctggt tgggcagcaa aggtggtgtg tgaccacttg  780
ggctttgggg tcaagactgg tctgccgtat ctgtggcaca gcaaagccag taacccattc  840
gtgaacctga agaaagagca taagggactc cactggcaag aagatatggt tcctttcttc  900
caaaaccttc gtctctcgaa agaatctgac actgcagcta aatgttatat ggaaatttca   960
aatatgacaa aagaaaagct cactaaagtg gatccttact ttgagaagtt ggctgatgca  1020
atggtggttt ggattgaggc gtgggaggag cttaacccgc cggttaagaa gaagcagagc  1080
gatggcaaag atgtcaaggc caagtgatga agataatgag tgatcctatt gttgctaatg  1140
aataagtatg ttgtgagttt atagattata tgatattgta tttattttct ccattttgga  1200
agtgtgcgtt attatgaaat aatttggcat gtattaagcg tgattggaag a           1251
<210>27
<211>1298
<212>DNA
<213>豌豆(Pisum sativum)
<400>27
gcacgagcgc acttctcaac aatggcttcg ttacccaaac caactccact cttgaaagac    60
gaactcgaca tcgtcatccc tacgatccgt aaccttgatt tcctggagat gtggagaccc   120
ttttttgaac agtaccatct catcattgtt caagatggtg acccttctaa ggttatcaag   180
gttcctgaag gtttcgatta tgaactgtat aatcggaatg atatcaatag gatcttgggt   240
cctaaagctt cgtgtatctc cttcaaggat tcggcttgtc gttgctttgg gtatatggtt   300
tcgaagaaga agtatatcta caccattgat gatgattgct ttgttgctaa agacccaact   360
gggcatgaaa tcaatgcact tgagcagcac attaagaatc tccttagtcc atccactcca   420
tttttcttca acacccttta cgatccatac agagaaggta ctgatttcgt ccgtggatac   480
cctttcagtc ttcgtgaagg tgtccccact gccgtttctc acggcctttg gctcaacata   540
cctgattacg atgctccaac tcagcttgtc aagccccatg agaggaacac taggtttgtt   600
gatgctgttc tgaccattcc caaaggaagt ctgttcccca tgtgcggtat gaatctggca   660
tttaaccgtg aactgattgg acctgcaatg tacttcggac tcatgggtga tggtcagcct   720
attggacgct acgacgatat gtgggctgga tggtgcataa aggttatctg tgaccatttg   780
ggatatggag tgaaaaccgg actaccttac atttggcaca gcaaagcaag caacccattt   840
gttaatctga aaaaggagta caaaggtatc ttctggcaag aagagatcat tccatttttc   900
caagctgcaa ccctttcaaa agattgcacc tctgttcaga aatgctacat tgaactctcc   960
aagcaagtca aggagaaact tggaactatt gatccctatt tcatcaaact cgccgatgcc  1020
atggtcactt gggttgaagc ttgggatgag attaataaca acaaatctga agagacaact  1080
tcaaccaaag cttctgaggt tgctgctacc aagtgaaaca acttatagtt gatgaggaag  1140
agagtagttt tcaatcagtt ttattattgt tatcatattt gttagcatta tattatgatt  1200
cttgttgatt ttgctagatt ccagaacaat ttattgatat ttatgttatt aatatttata  1260
ttaaaaaaaa aaaaaaaaaaaaaaacctcg aggggggg                           1298
<210>28
<211>1480
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<400>28
aacctcctct gctctccccc acctcccggt ccggcagcag agagcggggg tgcagagaga    60
tcgagatccg gaggccgcga gtgggagcgc caccaccagt gtctgcggca atggcgggca   120
cggtgacggt cccggggtcg tcgaccccct ccacgccgct gctcaaggac gagctcgaca   180
tcgtgatccc gacgatccgc aacctcgact tcctggagat gtggcgggcc ttcttccagc   240
cctaccacct catcatcgtg caggacggcg acccgaccaa gaccatcaag gtgcccgagg   300
gcttcgacta cgagctctac aaccgcaacg acatcaaccg catcctcggg cccaaggcct   360
cctgtatctc cttcaaggac tccgcctgcc gctgcttcgg ctacatggtc tccaagaaga   420
agtacatcta caccatcgac gacgactgct tcgttgccaa ggacccatct ggcaaggata   480
tcaatgctct tgagcagcac atcaagaacc tcctcagccc atccaccccg ttcttcttca   540
acaccctgta cgacccctac cgtgagggtg ctgactttgt gcgtggatac cccttcagcc   600
tcagggaggg tgctcacacc gccgtctccc acggcctgtg gctgaacatc cctgactatg   660
atgctcccac acagctggtc aagcccaagg agaggaatga gaggtatgtt gatgctgtca   720
tgacaatccc caagggaacc ttgttcccca tgtgtggcat gaaccttgcc ttcgacaggg   780
atctcattgg ccctgctatg tactttggtc tcatgggtga tggccagccc atcggtcgct   840
acgacgacat gtgggcagga tggtgtgtga aggtcatctg cgaccacctg agcctgggag   900
tcaagactgg cctgccatac atctggcaca gcaaggctag caaccccttc gttaacttga   960
agaaggaata caagggcatc ttctggcagg aggacatcat ccccttcttc cagaacgtga  1020
ccatccccaa ggactgcgac accgtccaaa agtgctacat ctacctctct ggacaagtga  1080
aggagaagct gggcacgatt gacccctact ttgtcaagct cggtgacgcc atggtcacct  1140
ggatcgaggc ctgggatgag ctgaacccgt cgacccctgc cgccgcaaat ggcaaggcca  1200
agtagatgtg ccatcacttc ggcactggag tgaaaaagaa agtatgattg ggtcctgcct  1260
aggccccata gatatagctc ttttttgaga aggaagagag attaattcag cagcagcttt  1320
tataaattct ttgttgtcat gaagcaggtg gttcttttgt agttgatgaa agggatttgt  1380
cgtcgctatc gtttacataa ttcagacaat aattttatat tgtgtaattc tgagaatcaa  1440
agcactgttt gtgttatagc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa                        1480
<210>29
<211>729
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>sGFP
<400>29
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac     60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac    120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc    180
ctcgtgacca ccttcaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag    240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc    300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg    360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac    420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac    480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc    540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac    600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc    660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actcacggca tggacgagct gtacaagggg    720
atcctctag                                                            729
<210>30
<211>685
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>DsRed1
<400>30
cgccaccatg gtgcgctcct ccaagaacgt catcaaggag ttcatgcgct tcaaggtgcg   60
catggagggc accgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc  120
ctacgagggc cacaacaccg tgaagctgaa ggtgaccaag ggcggccccc tgcccttcgc  180
ctgggacatc ctgtcccccc agttccagta cggctccaag gtgtacgtga agcaccccgc  240
cgacatcccc gactacaaga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat  300
gaacttcgag gacggcggcg tggtgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggctg  360
cttcatctac aaggtgaagt tcatcggcgt gaacttcccc tccgacggcc ccgtaatgca  420
gaagaagacc atgggctggg aggcctccac cgagcgcctg tacccccgcg acggcgtgct  480
gaagggcgag atccacaagg ccctgaagct gaaggacggc ggccactacc tggtggagtt  540
caagtccatc tacatggcca agaagcccgt gcagctgccc ggctactact acgtggactc  600
caagctggac atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggagcagt acgagcgcac  660
cgagggccgc caccacctgt tcctg                                        685
<210>31
<211>727
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>ECFP
<400>31
cgccaccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga   60
gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc  120
cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg  180
gcccaccctc gtgaccaccc tgacctgggg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca  240
catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac  300
catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga  360
caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct  420
ggggcacaag ctggagtaca actacatcag ccacaacgtc tatatcaccg ccgacaagca  480
gaagaacggc atcaaggcca acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca  540
gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga  600
caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca  660
catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta  720
caagtaa                                                            727
<210>32
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SiRNA寡核苷酸
<400>32
ucgauaucgu gauuccgact a                                             21
<210>33
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SiRNA寡核苷酸
<400>33
gaagaccggu uuaccguaua t                21
<210>34
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<220>
<221>其他特征
<223>寡核苷酸具有硫代磷酸酯骨架
<400>34
cggtcttcac tcccaagctc a                21
<210>35
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反义寡核苷酸
<220>
<221>其他特征
<223>寡核苷酸具有硫代磷酸酯骨架
<400>35
tcccttgtat tccttcttc                   19