一种洋水仙脱毒组培鳞茎的培养方法.pdf

本发明涉及一种洋水仙脱毒组培鳞茎的培养方法，属植物繁殖技术领域。该方法包括：培养基的配制、脱毒组培鳞茎的培养、病毒ELISA检测等步骤。本发明能快速对组培鳞茎苗实施高灵敏度的病毒检测，杜绝病毒的携带与传播，可比未脱毒鳞茎生长速度快、开花期早、花色鲜艳；脱毒鳞茎增殖快，其月增殖率可达3～5倍，适合工厂化育苗。可在洋水仙的提纯复壮及开发中推广应用。

权利要求书
1.  一种洋水仙脱毒组培鳞茎的培养方法，其特征在于按如下步骤进行：
(1)培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
1)基本培养基：子鳞茎诱导、增殖及鳞茎生长培养基用MS培养基；生根培养基用1/2 MS培养基；其中，蔗糖或白糖20～40g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～5.8；
2)子鳞茎诱导培养基：MS+BA 0.1～1mg/L和NAA 0.05～0.5mg/L；
3)子鳞茎增殖培养基：MS+BA 0.05～0.5mg/L和NAA 0.1～1mg/L；
4)鳞茎生长培养基：MS+BA 0.01～0.1mg/L和NAA 0.05～0.5mg/L；
5)生根培养基：1/2MS+NAA 0.1～0.5mg/L；
(2)洋水仙脱毒组培鳞茎的培养：
1)鳞茎低温处理：鳞茎经8℃低温处理2～4周；
2)鳞茎萌芽：将低温处理后的鳞茎放在25℃培养室内，培养1～2周，使鳞茎快速萌芽；
3)外植体的选取与灭菌：取3～5cm的鳞茎幼芽，经灭菌处理后，在无菌条件下，摘出0.2～0.3mm带1～2个叶原基的茎尖作为脱毒组培用外植体；
4)茎尖诱导培养：将外植体接种在子鳞茎诱导培养基上，在培养条件下培养1～2个月，从茎尖诱导形成幼芽或子鳞茎；
5)子鳞茎增殖培养：将幼芽或子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，在培养条件下培养30～45天至增殖出子鳞茎；根据对子鳞茎数量的需求，每隔30～45天按同样方法进行子鳞茎再增殖；
6)子鳞茎生长培养：将子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，在培养条件下培养30～45天使鳞茎长大到0.5～1cm；
7)生根培养：将长大的子鳞茎转接在生根培养基中，在培养条件下培养20～30天至子鳞茎上部长出叶片，基部长出数根根系；
8)移栽：当生根子鳞茎苗长高至3～5cm以上、长出5根以上根时，移栽至基质培养基，在培养条件下培养1～2个月后成苗；
(3)病毒ELISA检测：
将田间洋水仙发生的病毒，经扩增、克隆和原核表达所获得的相关病毒外壳蛋白，注射小鼠或家兔免疫并制备成病毒特异性抗血清后，对脱毒组培获得的鳞茎苗进行病毒ELISA检测。

2.  按权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
(1)基本培养基：子鳞茎诱导、增殖及鳞茎生长用MS培养基；生根用1/2MS培养基，其中，琼脂8g/L，pH为5.7；
(2)子鳞茎诱导培养基：蔗糖30g/L的MS+BA 0.5mg/L和NAA 0.1mg/L；
(3)子鳞茎增殖培养基：白糖为40g/L的MS+BA 0.1mg/L和NAA 0.5mg/L；
(4)鳞茎生长培养基：白糖为40g/L的MS+BA 0.05mg/L和NAA 0.1mg/L；
(5)生根培养基：白糖为20g/L的1/2MS+NAA 0.25mg/L。

3.  按权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的灭菌处理是，将鳞茎幼芽经75％酒精浸泡0.5～1.0分钟，再用0.1％升汞水溶液浸泡10～15分钟，最后用无菌水冲洗3～5次。

4.  按权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的各脱毒组培阶段的培养条件是，温度为25±2℃，光强为1500～2500Lx，光照时间为10h/d。

5.  按权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的移栽基质由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按体积比1∶2∶2配制而成。

说明书一种洋水仙脱毒组培鳞茎的培养方法
技术领域
本发明涉及植物脱毒组培快繁技术领域，尤其涉及一种洋水仙脱毒组培鳞茎的培养与检测方法。
背景技术
洋水仙(Narcisses)是从欧洲引入我国水仙新品种的统称，为石蒜科水仙属多年生草本植物。20世纪80年代后进行较大规模的引入，主要用于春季花展，少量盆栽作为年宵花使用。洋水仙与中国水仙相比，具有花大色艳，清香宜人等特点；大部分品种副花冠成喇叭状，且以黄色为多，因而又泛称为“喇叭水仙”或“黄水仙”。洋水仙又是优良的园林地被花卉作为切花使用。洋水仙一般通过分蘖的子球进行繁殖，每个母鳞茎可分蘖2～4个小鳞茎。但是，由于病毒侵染导致逐年退化，鳞茎变小，开花能力下降。
浙江省农业科学院从英国引进洋水仙新品种，拟通过脱毒组培技术大量繁殖脱毒鳞茎，以满足国内市场需要，同时克服病毒的危害和蔓延。我们从英国引进栽培于温室的洋水仙中发现，绝大部分植株均表现花叶和斑驳等症状。通过对病毒病原的普通生物学、血清学特征和基因组全序列的研究，首先鉴定、明确了侵染洋水仙的主要线状病毒有4个属的8个成员，包括马铃薯Y病毒属(genus Potyvirus)水仙黄条病毒(Narcissus yellow stripe virus，NYSV)，水仙迟季黄化病毒(Narcissus late season yellows virus，NLSYV)，水仙退化病毒(Narcissus degeneration virus，NDV)，虎眼万年青花叶病毒(Ornithogalum mosaic virus，OrMV)，香石竹潜隐病毒属(genus Carlavirus)水仙普通潜隐病毒(Narcissus common latent virus，NCLV)，水仙无症病毒(Narcissus symptomless virus，NSV)，柘橙病毒属(genus Macluravirus)水仙潜隐病毒(Narcissus latent virus，NLV)及马铃薯X病毒属(genusPotexvirus)水仙花叶病毒(Narcissus mosaic virus，NMV)等8种病毒，这8种病毒单独或复合侵染是引起洋水仙种质严重退化的重要原因之一；同时提出以田间洋水仙发生的病毒，经扩增、克隆和原核表达制备成病毒特异性抗血清，进而对洋水仙植株样品进行病毒ELISA检测的方法(Chen J etal.2006.Archives of Virology，151：2261-2267；Zheng HY et al.2006.Archives ofVirology，151：1667-1672；Chen J et al.2006.Archives of Virology，151：1673-1677；Chen J et al.2007.Archives of Virology，152：441-448；Chen J et al.2003，Journal of Phytopathology，151：26-29)。到目前为止有关洋水仙茎尖脱毒组培及病毒检测的研究尚未见报道。
发明内容
本发明目的是，针对现有洋水仙常规生产繁种技术中所存在的繁殖率低，带病毒率高，且通常呈多种线状病毒复合侵染，而又难以分离纯化等缺陷，提供一种能大量、快速繁殖鳞茎，又能脱除鳞茎所带病毒并经特异检测，以确保无毒的洋水仙鳞茎脱毒、组培与检测的配套方法。
本发明目的通过以下技术方案来实现。
一种洋水仙脱毒组培鳞茎的培养方法，按如下步骤进行：
(1)培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
1)基本培养基：子鳞茎诱导、增殖及鳞茎生长培养基用MS培养基；生根培养基用1/2MS培养基；其中，蔗糖或白糖20～40g/L，琼脂7～9g/L，pH5.6～5.8；
2)子鳞茎诱导培养基：MS+BA 0.1～1mg/L和NAA 0.05～0.5mg/L；
3)子鳞茎增殖培养基：MS+BA 0.05～0.5mg/L和NAA 0.1～1mg/L；
4)鳞茎生长培养基：MS+BA 0.01～0.1mg/L和NAA 0.05～0.5mg/L；
5)生根培养基：1/2MS+NAA 0.1～0.5mg/L；
(2)洋水仙脱毒组培鳞茎的培养：
1)鳞茎低温处理：鳞茎经8℃低温处理2～4周；
2)鳞茎萌芽：将低温处理后的鳞茎放在25℃培养室内，培养1～2周，使鳞茎快速萌芽；
3)外植体的选取与灭菌：取3～5cm的鳞茎幼芽，经灭菌处理后，在无菌条件40倍的双筒解剖镜下，摘出0.2～0.3mm带1～2个叶原基的茎尖作为脱毒组培用外植体；
4)茎尖诱导培养：将外植体接种在子鳞茎诱导培养基上，在培养条件下培养1～2个月，从茎尖诱导形成幼芽或子鳞茎；
5)子鳞茎增殖培养：将幼芽或子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，在培养条件下培养30～45天至增殖出子鳞茎；根据对子鳞茎数量的需求，每隔30～45天按同样方法进行子鳞茎再增殖；
6)子鳞茎生长培养：将子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，在培养条件下培养30～45天使鳞茎长大到0.5～1cm；
7)生根培养：将长大的子鳞茎转接在生根培养基中，在培养条件下培养20～30天至子鳞茎上部长出叶片，基部长出数根根系；
8)移栽：当生根子鳞茎苗长高至3～5cm以上、长出5根以上根时，移栽至基质培养基，在培养条件下培养1～2个月后成苗；
(3)病毒ELISA检测：
将田间洋水仙发生的病毒，经扩增、克隆和原核表达所获得的相关病毒外壳蛋白，注射小鼠或家兔免疫并制备成病毒特异性抗血清后，对脱毒组培获得的鳞茎苗进行病毒ELISA检测。
所述培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的各组分与每升所含重量为：
(1)基本培养基：子鳞茎诱导、增殖及鳞茎生长用MS培养基；生根用1/2MS培养基，其中，琼脂8g/L，pH为5.7；
(2)子鳞茎诱导培养基：蔗糖30g/L的MS+BA 0.5mg/L和NAA 0.1mg/L；
(3)子鳞茎增殖培养基：白糖为40g/L的MS+BA 0.1mg/L和NAA 0.5mg/L；
(4)鳞茎生长培养基：白糖为40g/L的MS+BA 0.05mg/L和NAA 0.1mg/L；
(5)生根培养基：白糖为20g/L的1/2MS+NAA 0.25mg/L。
所述的灭菌处理是将鳞茎幼芽经75％酒精浸泡0.5～1.0分钟，再用0.1％升汞水溶液浸泡10～15分钟，最后用无菌水冲洗3～5次。
所述各脱毒组培阶段的培养条件是，培养温度为25±2℃，光照光强为1500～2500Lx，光照时间为10h/d。
所述的移栽基质由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按体积比1∶2∶2配制而成。
本发明的有益效果是：
1)针对洋水仙花叶病毒病通常系由多种线状病毒复合侵染所致，并又难以分离、纯化的特点，采用由本发明人分离、鉴定明确的洋水仙8种花叶病毒外壳蛋白基因为病原，制备成病毒特异性抗血清后，所建立的ELISA检测技术体系，无需分离、纯化，即能快速对组培鳞茎苗实施是否带毒及带何种病毒的检测，可以杜绝所述病毒的携带与传播，以确保组培苗的安全质量；
2)建立的洋水仙脱毒组培快繁技术体系，脱毒效果好，脱毒鳞茎增殖快，其月增殖率可达3～5倍，其生根率和移栽成活率达100％，适合工厂化育苗，可商品化生产；
3)脱毒鳞茎可比未脱毒鳞茎生长速度快、开花期早、花色鲜艳。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。
BA：6-苄氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine)，美国进口国内分装，分析纯，纯度99.9％。
NAA：α-萘乙酸(1-Naphthylacetic acid)，美国进口国内分装，分析纯，纯度99.5％。
实施例1：
一种洋水仙脱毒组培鳞茎的培养方法，按如下步骤进行：
(1)培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基的组分与每升所含重量为：
1)基本培养基：子鳞茎诱导、增殖及鳞茎生长培养基用MS培养基，生根培养基用1/2 MS培养基；其中，琼脂为8g/L，pH为5.7；
2)子鳞茎诱导培养基：蔗糖30g/L的MS+BA 0.5mg/L和NAA 0.1mg/L；
3)子鳞茎增殖培养基：白糖40g/L的MS+BA 0.1mg/L和NAA 0.5mg/L；
4)鳞茎生长培养基：白糖40g/L的MS+BA 0.05mg/L和NAA 0.1mg/L；
5)生根培养基：白糖20g/L的1/2 MS+NAA 0.25mg/L。
(2)洋水仙脱毒组培鳞茎的培养：
1)鳞茎低温处理：鳞茎经8℃低温处理3周；
2)鳞茎萌芽：将低温处理后的鳞茎放在25℃培养室内，培养1～2周，使鳞茎快速萌芽；
3)外植体的选取与灭菌：取3～5cm的鳞茎幼芽，经75％酒精浸泡0.7分钟，再用0.1％升汞水溶液浸泡13分钟，最后用无菌水冲洗3～5次后，在无菌条件40倍的双筒解剖镜下，摘出0.2～0.3mm带1～2个叶原基的茎尖作为脱毒组培用外植体；
4)茎尖诱导培养：将外植体接种在子鳞茎诱导培养基上，在温度25±2℃，光强2000Lx，光照时间10h/d的条件下培养1～2个月，从茎尖诱导形成幼芽或子鳞茎；
5)子鳞茎增殖培养：将幼芽或子鳞茎转接到子鳞茎增殖培养基上，在同步骤4)培养条件下培养30～45天至增殖出子鳞茎；根据对子鳞茎数量的需求，每隔30～45天按同样方法进行子鳞茎再增殖；
6)子鳞茎生长培养：将子鳞茎转接到子鳞茎生长培养基上，在同步骤4)培养条件下培养30～45天使鳞茎长大到0.5～1cm；
7)生根培养：将长大的子鳞茎转接在生根培养基中，在同步骤4)培养条件下培养20～30天至子鳞茎上部长出叶片，基部长出数根根系；
8)移栽：当生根子鳞茎苗长高至3～5cm以上、长出5根以上根时，移栽至由泥炭∶珍珠岩∶蛭石按体积比1∶2∶2配制而成的基质培养基中，在同步骤4)培养条件下培养1～2个月后成苗；
(3)病毒ELISA检测：
1)洋水仙病毒病原种类的鉴定：
①取病样：取洋水仙花叶病害病样，-80℃储存备用；
②电镜观察：取病汁液经负染后，用电镜观察病毒粒子的形态；
③病毒种类RT-PCR检测和鉴定：对侵染洋水仙8种病毒的序列分别合成扩增各种病毒外壳蛋白基因的引物；以植物总RNA为模板，逆向引物(-)合成病毒第一链cDNA，进而以此cDNA为模板，采用TaKaRa公司LA TaqTMPCR体系或EX Taq DNA聚合酶体系，对各种病毒逐一进行RT-PCR检测；
2)病毒ELISA检测：
将田间洋水仙发生的病毒，经扩增、克隆和原核表达所获得的相关病毒外壳蛋白，注射小鼠或家兔免疫并制备成病毒特异性抗血清，对脱毒组培获得的鳞茎苗进行病毒ELISA检测：
(1)病毒外壳蛋白基因扩增、克隆和原核表达
应用上述RT-PCR技术扩增相关病毒的外壳蛋白基因，与TA载体连接克隆，然后经双酶切，产物与用同样双酶切的原核表达载体连接，连接产物转化BL21plysaE或plysaS，并经IPTG诱导表达，用SDS-PAGE检测病毒外壳蛋白基因的表达情况；
(2)抗血清的制备
(i)目的蛋白纯化
制备12％SDS-PAGE，浓缩胶不插梳子，浓缩胶上方留一定的空间用于加样；取适量表达菌体，加1.6mL1×SDS上样缓冲液，充分裂解后置100℃水浴10min，离心(10,000g)7min，上清液进行电泳；电泳完毕后，将凝胶置0.25M KCl 4℃染色0.5h，切下病毒外壳蛋白条带放入研钵研磨，加入适量1XSDS上样缓冲液，用5-20％梯度SDS-PAGE进行第2次电泳；电泳完毕后，将凝胶置0.25MKCl 4℃染色0.5h，切下目的条带。如果用于免疫小鼠，分装4份；如果用于家兔不需分装。-30℃保存。
(ii)免疫小鼠或家兔并制备抗血清
免疫小鼠：取一份含目的蛋白的凝胶于研钵，加入生理盐水(约2mL)充分研磨，用注射器注射小鼠，小鼠每只每次注射0.5mL；
免疫家兔：每只家兔蛋白用量是每只小鼠的4倍，每次注射2mL；7天后注射第二次，总共注射4次；最后一次注射后3天断头取血，制备抗血清；
(iii)吸附去除非目的蛋白产生的抗体
加1/4体积BL21 pLys S或BL21 pLys E菌体蛋白吸附抗血清中的抗BL21pLys S/BL21 pLys E菌体蛋白的抗体(根据目的蛋白是用BL21 pLys S菌株还是用BL21 pLys E菌株表达来决定使用何种菌体蛋白吸附)，2h后离心(10,000g)7min，吸取上清液，4℃保存；
吸附用菌体蛋白的制备：培养BL21 pLys S或BL21 pLys E 200mL，离心后将菌体悬浮于20mL PBS中，在冰浴条件下用超声波细胞粉碎机充分破碎菌体，离心(10,000g)7min，取上清即为菌体蛋白；
(iv)抗血清纯度检测
用Western blot的方法检测抗血清的纯度；
需要特别注意以下几点：第一，选用12％SDS-PAGE进行电泳，每只小鼠的抗血清需要3个泳道，分别为BL21 pLys S或BL21 pLys E菌体蛋白对照、诱导表达目的蛋白的菌体蛋白和标准蛋白Marker；第二，加一抗血清(即制备的小鼠抗血清)时每只小鼠的抗血清用一个培养皿，不要将不同小鼠的抗血清混在一起，推荐抗血清的用量为15mL一抗稀释液加25uL抗血清；第三，显色反应后对抗血清的纯度进行评估：如果BL21 pLys S或BL21 pLys E菌体蛋白对照泳道无显色条带，诱导表达目的蛋白的菌体蛋白泳道有显色条带，而且显色条带的位置与目的蛋白大小相一致，说明抗血清的纯度符合要求，个别情况下，BL21 pLys S或BL21 pLys E菌体蛋白对照泳道无显色条带，但诱导表达目的蛋白的菌体蛋白泳道有多条显色带，其中主要条带的位置与目的蛋白大小相一致，这种抗血清也可以用，因为这些细的条带可能是目的蛋白裂解造成的；第四，将检测合格的抗血清-30℃保存备用(加入适量叠氮钠)；
(3)ELISA检测技术
用建立的ELISA检测技术对洋水仙各脱毒组培阶段的鳞茎进行病毒种类及其含量检测。
(i)包被：称取病叶样品和健叶对照各0.2g，分别加入包被液各1mL研磨，离心(5,000g)后包被96孔板，每孔100μL，4℃，12h；
(ii)封闭：加封闭液，每孔150μL，37℃孵育1h；
(iii)加一抗：加入适当稀释的抗血清(ELISA缓冲液稀释)，37℃孵育2h；
(iv)加酶标二抗：加入1/5000的羊抗鼠IgG-碱性磷酸酶(Sigma，ELISA缓冲液稀释)，37℃孵育2h；
(v)加底物：1mg/mL的p-NPP(Sigma，溶于底物缓冲液，pH9.8)，37℃黑暗中孵育，分别在40min、1h和2h测OD405值；
注：除封闭为150μL/孔外，其余步骤均用100μL/孔，每步后用PBS-T注满微孔，洗板3次，每次3-5min；
试剂：
(i)包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6)：称Na HCO3 0.1465g，Na2CO3 0.0795g溶于40mL蒸馏水，溶解后定容至50mL，两周内使用；
(ii)封闭液：5g脱脂奶粉溶于100mL PBS-T中；
(iii)PBS-T：取10×PBS 40mL(10×PBS：在800mL蒸馏水中溶解80gNaCl、2g KCl、14.4g Na2 HPO4和2.4g K H2PO4，用HCl调节pH值至7.4，加蒸馏水定容至1L，高压蒸汽灭菌20min，保存于室温)，加入0.2mL Tween20，加蒸馏水定容至400mL；
(iv)ELISA缓冲液：称1g脱脂奶粉，2g PVP(Polyvinyl-Pyrrolidone，MW 40,000，Sigma)，溶于100mL PBS-T中；
(v)底物缓冲液：9.7mL二乙醇胺(Diethanolamine)，0.01g MgCl2，加入80mL去离子水，用HCl调节pH至9.8，再加水至100mL，用棕色瓶避光保存于黑暗中；
(vi)底物：称取p-NPP(p-Nitrophenyl Phosphate)2.5mg溶于2.5mL底物缓冲液中。
实施例2：
本实施例基本培养基中的琼脂为7g/L，pH为5.6；子鳞茎诱导培养基为：蔗糖20g/L的MS+BA 0.1mg/L和NAA 0.3mg/L；子鳞茎增殖培养基为：白糖20g/L的MS+BA 0.5mg/L和NAA 0.1mg/L；鳞茎生长培养基为：白糖30g/L的MS+BA 0.02mg/L和NAA 0.25mg/L；生根培养基为：白糖40g/L的1/2 MS+NAA 0.45mg/L；鳞茎经8℃、2周低温处理；鳞茎幼芽经75％酒精浸泡0.5分钟，0.1％升汞水溶液浸泡10分钟；诱导、增殖、生长、生根各阶段的培养条件为：温度25±2℃，光强1500 Lx，光照时间10h/d外；其余步骤工艺均同于实施例1。
实施例3：
本实施例基本培养基中的琼脂为9g/L，pH为5.8；子鳞茎诱导培养基为：蔗糖40g/L的MS+BA1mg/L和NAA 0.5mg/L；子鳞茎增殖培养基为：白糖30g/L的MS+BA 0.3mg/L和NAA 1mg/L；鳞茎生长培养基为：白糖20g/L的MS+BA0.09mg/L和NAA 0.5mg/L；生根培养基为：白糖30g/L的1/2 MS+NAA 0.1mg/L；鳞茎经8℃、4周低温处理；鳞茎幼芽经75％酒精浸泡1.0分钟，0.1％升汞水溶液浸泡15分钟；诱导、增殖、生长、生根各阶段的培养条件为：温度25±2℃，光强2500 Lx，光照时间10h/d外；其余步骤工艺均同于实施例1。
试验例：(病毒检测)
1、对照材料：从田间采集的病叶洋水仙自然分蘖的子球；
2、处理材料：以实施例1、2或3获得的脱毒组培鳞茎；
3、病毒ELISA检测：由于洋水仙常含有多种线状病毒复合侵染，通常病毒难以分离纯化，从而应用本发明人鉴定明确的8种洋水仙病毒外壳蛋白基因，经扩增、克隆和原核表达后获得的大量相关病毒外壳蛋白，用于小鼠或家兔免疫，制备而成的病毒特异性抗血清，供病毒ELISA检测之用；
4、检测结果如下表所示：
处理检测的结果对照阳性脱毒组培鳞茎阴性