胸腺素Β4、类似物、异构体及其它衍生物在制备治疗眼睛和周围组织失调的药物中的应用.pdf

通过施用肌动蛋白-螯合的肽如胸腺素β4、胸腺素β4异构体或氧化的胸腺素β4而使眼睛退化得到抑制或被逆转，如可能与干眼综合症相关的眼睛退化。

权利要求书
1.  一种组合物在制备用于促进与干眼综合症、激光原位角膜磨镶术或激光屈光性角膜切削术相关的眼睛退化逆转或抑制与干眼综合症、激光原位角膜磨镶术或激光屈光性角膜切削术相关的眼睛退化的药物中的应用，所述组合物包括药学上可接受的载体、眼睛退化抑制性肌动蛋白结合多肽或眼睛退化抑制性肌动蛋白鳌合多肽，该多肽包括胶溶蛋白、维生素D结合蛋白、肌动结合蛋白、cofilin、蚕食蛋白、Dnasel、vilin、片段化蛋白、肌割蛋白、加帽蛋白、β-肌动蛋白、actobindin或acumentin，且所述多肽在所述药物中的重量百分比为0.001-10％。

2.  如权利要求1的应用，其中所述多肽在所述药物中的重量百分比为0.01-0.1％。

3.  如权利要求1的应用，其中所述多肽在所述药物中的重量百分比为0.05％。

4.  如权利要求1的应用，其中所述的药物为系统性给药药物。

5.  如权利要求1的应用，其中所述的药物为局部给药药物。

6.  如权利要求1的应用，其中所述药物的剂型为溶液、凝胶、乳膏、糊剂、洗剂、喷剂、悬浮液、分散剂、药膏、水凝胶或油膏制剂。

7.  如权利要求1的应用，其中所述的组合物为重组的或合成的。

说明书胸腺素β4、类似物、异构体及其它衍生物在制备治疗眼睛和周围组织失调的药物中的应用
本申请是申请日为2002年3月14日、申请号为02805917.4、发明名称为“用胸腺素β4(Tβ4)、类似物、异构体及其它衍生物治疗眼睛和周围组织失调的方法”发明专利申请的分案申请。
发明背景
相关申请的交叉引用
本发明要求以2001年3月15日递交的，申请号为60/275,645的美国临时申请为优先权。
1.发明领域
本申请涉及眼部失调，例如“干眼综合症”的治疗领域。
2.背景技术
称为“干眼综合症”的现象可能不仅因为眼部腺体正常老化而发生在高龄人群中，也可能由于其它退化性变化和环境因素而发生在任何年龄的人群中。眼睛的生理学、生化学和免疫学性质发生有害性变化，都会引起干眼综合症。
某些病人经受着由于眼泪的数量和质量下降而引起的眼部刺激所带来的经常性疼痛。这些病人有含沙的感觉，如得不到治疗，可能会导致角膜上形成疤痕或发生溃疡，并因此丧失视力。在许多情况下，共同作用产生正常眼泪的多种腺体失调，导致了干眼的发生。眼泪本身是由构成眼睛三层膜的物质的复合体而构成。非常薄的外层膜上包括了来自于眼睑内睑板腺(Meibomian glands)的脂质，以减少蒸发。泪腺产生了中间含水层，使眼泪的盐度和酸度保持在合适水平。中间层还载有抗体和其它免疫防御剂，以防止眼睛遭受感染。内粘液层帮助眼泪膜“粘”到角膜上，并保持完整。
造成干眼综合症有众多原因。泪腺的正常老化，以及特殊的疾病或失调，都可能会导致所产生的眼泪的量和条件的变化。例如，斯耶格伦氏(Sjogren’s)综合症是一种免疫系统失调，特征在于嘴、眼睛、以及其它粘液性膜发炎和干燥，泪腺受伤，并且受伤影响眼泪的产生。角膜的敏感性下降也可能会导致眼泪产生的量不足。称为“神经营养性角膜炎”的疾病，以及某些类型的隐形眼镜佩戴会导致缺乏敏感性。眼泪的过度蒸发也会导致干眼综合症。此类蒸发可能是由于“睑板腺炎”所导致，该“睑板腺炎”又是由眼睑内的睑板腺感染或发炎而导致的。眼睛异常大的人，以及患有甲状腺疾病的人，也可能会由于过渡蒸发而遭受干眼综合症。干眼也可能由不正常的面部解剖学特征或角膜内的不规整带来，其导致了眼泪在眼睛中的分布不均匀或不充分。某些病人患有干眼的原因在于服用了例如抗生素、抗组胺药、利尿剂、抗腹泻药等药物，该类药物能导致粘液性膜变干。荷尔蒙改变，例如可能与绝经和年龄增长过程相关的荷尔蒙改变，也会影响泪腺分泌的Tβ4，从而导致干眼形成和眼睛发炎。
已经报道了许多延缓和/或减少此类眼睛失调的方法。干眼的典型治疗方法是施用人造眼泪和油膏。这使眼睛得到了暂时的缓解，但通常不会停止或逆转对眼睛的伤害。以恢复眼泪中的电解质平衡，促进角膜恢复的滴眼液正处于开发中。有证据表明干眼可用荷尔蒙疗法或抗体进行治疗。此外，某些形式的干眼可通过在从眼睛往外排出眼泪的管道中置入微塞而得到治疗。对于严重的干眼，可佩戴称为“湿腔眼镜”的护目镜。
本领域中仍然需要改进的方法和组合物用于治疗干眼疾病。
发明概述
根据本发明，一种促进眼睛退化逆转或抑制眼睛退化，如与干眼综合症相关的眼睛退化的治疗方法，包括给患者施用有效量的组合物，该组合物包括含有氨基酸序列LKKTET的多肽或其具有眼睛退化抑制活性的保守性变体(conservative variant)。
发明详述
本发明基于一个发现，即肌动蛋白-鳌合的肽，例如胸腺素β4(Tβ4)和其它包括氨基酸序列LKKTET的肌动蛋白-鳌合肽或它们的保守性变体能促进眼睛退化的逆转或抑制眼睛退化，例如干眼综合症所导致的眼睛退化。可能的临床应用可包括由于发炎病症而引起的疾病，如干眼、葡萄膜炎、虹膜炎、白内障手术后发炎、激光原位角膜磨镶术(LASIK)或激光屈光性角膜切削术(PRK)，由于类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、莫伦氏(Mooren’s)溃疡、斯耶格伦氏综合症等引起的角膜溶化。还能用于治疗由细菌、病毒、分枝杆菌或真菌病原体引起的角膜炎。也能应用于治疗例如糖尿病引起的眼睛代谢疾病(角膜病和视网膜病)，或者是化学伤害、创伤和擦伤引起的眼睛疾病。
起初胸腺素β4被鉴定为一种蛋白质，其在体外的内皮细胞迁移和分化期间被向上调控。胸腺素β4最初从胸腺中分离出来，并在很多组织中被鉴定为普遍存在的，具有43个氨基酸，分子量为4.9kDa的多肽。此蛋白质具有多种作用，包括其在内皮细胞的分化和迁移中的作用，在T细胞分化，肌动蛋白鳌合以及血管形成中的作用。
在一种实施方式中，本发明提供了一种以促进干眼综合症逆转或抑制干眼综合症为目的的治疗方法，其包括给予患者有效量的组合物，该组合物包括一种能刺激生成含有氨基酸序列LKKTET能抑制眼睛退化的多肽或其具有眼睛退化抑制活性的保守性变体的试剂，优选为胸腺素β4，胸腺素β4的异构体，氧化的胸腺素β4或胸腺素β4的拮抗剂。
本发明促进了眼睛和周围组织的发炎性、退化性、免疫性和其它类病症的愈合和逆转。
本发明中使用的组合物包括胸腺素β4(Tβ4)，Tβ4异构体，氧化的Tβ4，包括氨基酸序列LKKTET的多肽或其具有眼睛退化抑制活性的保守性变体。国际申请号PCT/US99/17282(列与此以作参考)公开了Tβ4的异构体，和氨基酸序列LKKTET及其具有眼睛退化抑制活性的保守性变体，这些都可用于本发明中。国际申请PCT/GB99/00833(WO 99/49883)公开了可用于本发明中的氧化的胸腺素β4，列与此以作参考。尽管此处本发明主要描述了Tβ4和Tβ4的异构体，应该理解的是，以下的描述可等效地适用于氨基酸序列LKKTET，其具有眼睛退化抑制活性的保守性变体，以及氧化的胸腺素β4。
在一种实施方式中，本发明提供了一种促进眼睛退化逆转或抑制眼睛退化，例如和干眼综合症相关的眼睛退化的治疗方法。该方法包括对患者施用有效量的一种组合物，该组合物包括了含有氨基酸序列LKKTET的抑制眼睛退化的多肽或其具有眼睛退化抑制活性的保守性变体。给药方式可为局部给药或系统性给药。局部给药包括将含有Tβ4的溶液、洗剂、药膏、凝胶、乳膏、糊剂、喷剂、悬浮液、分散剂、水凝胶、油膏或油和眼睛接触。系统性给药包括如静脉内、腹膜内、或肌内注射包含Tβ4或Tβ4异构体的组合物。给药对象可以是任何哺乳动物，优选是人。
本发明的组合物可以每日或隔天给药，每天一次或多次给药，如每天2、3、4或更多次。
已经鉴定出Tβ4异构体，其中有约70％、约75％、约80％或更多与公知的Tβ4氨基酸序列相同。此类异构体包括如Tβ4ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15。与Tβ4相类似，Tβ10和Tβ15显示了能与肌动蛋白鳌合。Tβ4、Tβ10和Tβ15与其他的异构体一起共有氨基酸序列LKKTET，其参与调控肌动蛋白的鳌合或结合。尽管不愿限于某一特殊的理论，Tβ4异构体的活性可部分归结于使肌动蛋白聚合的能力。例如，Tβ4能调节眼睛中肌动蛋白的聚合(如β-胸腺素通过鳌合游离的G-肌动蛋白使F-肌动蛋白解聚)。因此Tβ4调控肌动蛋白聚合的能力的原因全部或部分在于通过LKKTET序列结合或鳌合肌动蛋白。正如用Tβ4一样，其它结合或鳌合肌动蛋白或调控肌动蛋白聚合的蛋白质，包括具有氨基酸序列LKKTET的Tβ4异构体，都可能单独或与Tβ4结合使用而减少干眼综合症，如此处所列举。
因此，特别地可预期已知的Tβ4异构体，例如Tβ4ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15，以及其它未鉴定的Tβ4异构体将会是本发明的方法中很有用的。此类Tβ4异构体在本发明的方法中，包括对患者的实践方法中都是很有用的。因此本发明进一步提供了药物组合物，包括Tβ4和Tβ4的异构体Tβ4ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15，以及药学上可接受的载体。
此外，具有鳌合或结合能力的其它蛋白质，或者是能移动肌动蛋白或调控肌动蛋白聚合的蛋白质，正如在适宜的鳌合、结合、移动或聚合实验中所证明的，或在调控肌动蛋白结合的氨基酸序列例如LKKTET的存在下所鉴定的蛋白质也可被类似地应用于本发明的方法中。此类蛋白质包括胶溶蛋白(gelsolin)，维生素D结合蛋白(DBP)，肌动结合蛋白(profilin)，cofilin，蚕食蛋白(depactin)，Dnasel，vilin，片段化蛋白(fragmin)，肌割蛋白(severin)，加帽蛋白(capping protein)，β-肌动蛋白(β-actinin)，actobindin以及acumentin。该类方法包括在患者体内实施的方法，本发明进一步提供了药物组合物，包括此处所列的胶溶蛋白，维生素D结合蛋白(DBP)，肌动结合蛋白，cofilin，蚕食蛋白，Dnasel，vilin，片段化蛋白，肌割蛋白，加帽蛋白，β-肌动蛋白，actobindin以及acumentin。因此，本发明包括可使干眼综合症减少的含有氨基酸序列LKKTET的多肽及其保守性变体的应用。
如此处所采用的，术语“保守性变体”或其文法上的变异体(grammatical variations)是指氨基酸残基被其它生物学上相似的残基取代。保守性变体的例子包括将一个疏水残基如异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或蛋氨酸替换另一个疏水残基，将一个极性残基替换另一个极性残基，如将精氨酸替换赖氨酸，谷氨酸替换天(门)冬氨酸，或将谷酰胺替换天门冬酰胺等类似替代。
Tβ4定位于多种组织和细胞类型，因此，可加入刺激Tβ4产生的试剂或包含一组合物的试剂以实现从组织和/或细胞产生Tβ4。该类试剂包括生长因子族的成员，例如类胰岛素生长因子(IGF-1)，血小板衍生的生长因子(PDGF)，表皮生长因子(EGF)，转换生长因子β(TGF-β)，基本纤维原细胞生长因子(bFGF)，胸腺素α1(Tα1)以及血管内皮生长因子(VEGF)。更优选地，试剂为转换生长因子β(TGF-β)或其它TGF-β总科的其它成员。本发明的Tβ4组合物通过细胞外基质沉积作用，细胞内迁移和对发炎细胞因子的向下调控实现连接组织生长，从而可降低干眼综合症。
此外，帮助或激励降低干眼综合症的试剂可以与Tβ4或Tβ4异构体一起加入组合物中。此类试剂包括血管生成剂，生长因子，指导细胞分化的试剂、促进细胞迁移以及刺激眼中细胞外基质物质供给的试剂。非限定性的例子为，Tβ4或Tβ4异构体可以单独或与下列试剂一起混合添加：有效量的VEGF，KGF，FGF，PDGF，TGFβ，IGF-1，IGF-2，IL-1，前胸腺素α和胸腺素α1。
本发明还包括一种药物组合物，其包括在药学上可接受载体内的治疗有效量的Tβ4或Tβ4异构体。此类载体包括上述所列肠胃外给药的载体。
抑制或促进干眼综合症逆转的实际剂量或试剂、制剂或组合物取决于诸多因素，包括患者的身材尺寸和健康情况。然而，本领域的普通技术人员可根据上面文献PCT/US99/17282，在此引用的参考文献中公开的决定临床剂量的方法和技术的教导，从而决定合适的使用剂量。Tβ4，或其类似物、异构体或衍生物，可用治疗干眼或相似疾病的有效量进行给药。例如，Tβ4的给药剂量范围在0.1到50微克之间，更优选为1到25微克之间。Tβ4可以一次性给药治疗，或每日给药，一日两次，一日三次等，或隔日给药等等，直到获得预期的效果。
合适的局部给药制剂包括重量百分比浓度在0.001到10％之间的Tβ4或Tβ4异构体，优选为0.01到0.1％，最优选为0.05％。
此处描述的治疗方法涉及包括Tβ4或本发明其他化合物的试剂或组合物的各种给药途径或传输，包括任何对患者的常规给药技术(非限定性的例子包括局部给药，定位给药，或系统给药)。使用或包含Tβ4或本发明其它化合物的方法和组合物可以通过与药学上可接受的非毒性赋形剂或载体相混合制成药物组合物。
本发明包括与Tβ4肽或其功能片段相互作用的抗体的应用。提供了基本上由具有不同抗原决定基特异性的巨集(pooled)单克隆抗体组成的抗体，且提供了不同的单克隆抗体制剂。单克隆抗体可由本领域公知的方法，如上文的PCT/US99/17282所公开的方法，由包括蛋白质片段的抗原制备而得。本发明中使用的术语抗体包括单克隆和多克隆抗体。
在另一种实施方式中，本发明提供一种治疗患者的方法，其为给患者施用有效量的Tβ4基因表达调控剂。术语“调控”指当Tβ4过度表达时，抑制或压制其表达；当Tβ4表达不够时，诱发其表达。术语“有效量”是指对调控Tβ4基因表达有效的Tβ4试剂量，可导致与Tβ4有关的干眼综合症的症状减轻。调控Tβ4或Tβ4异构体基因表达的试剂为，例如多核苷酸。多核苷酸可以为反义多核苷酸，三股螺旋多核苷酸(a triplex agent)或核酶。例如，可利用指向Tβ4结构基因区或启动子区域的反义多核苷酸。
在另一种实施方式中，本发明提供了一种利用调节Tβ4活性的化合物的方法。影响Tβ4活性的化合物(例如拮抗剂和激动剂)包括肽，拟生肽(peptidomimetics)，多肽，化学化合物，矿物质如锌类，以及生物试剂。
当不受限于任何特定的理论时，可认为本发明能够促进干眼综合症相关的眼退化的逆转或抑制干眼综合症相关的眼退化，其通过诱导末端的脱氧核苷酸转移酶(非-模板导向的DNA聚合酶)，从而降低一种或多种发炎细胞因子的水平，并作为内皮细胞的趋化因子，也因此抑制由年龄增长或其他退化因素或环境因素所引起的眼内退化性变化或促进其逆转。
实施例1
测试年龄在40岁以下的健康年轻人和年龄超过40岁的老龄人群的Tβ4水平。结果发现在健康年轻人的眼泪中存在高水平的Tβ4，而随着年龄的增长以及绝经期的到来，眼泪中Tβ4显著下降。可见，干眼综合症和眼睛炎症的发生可归结于眼泪中缺乏Tβ4。因此，施用Tβ4可减轻炎症，促进发炎的眼睛和粘膜愈合，并通过产生眼泪的眼腺的愈合而刺激眼泪的产生。
实施例2
用直径2mm的环钻切割WhatmanTM滤纸(尺寸50)圆盘。将滤纸盘浸入1.0N的NaOH溶液中，并施用于异氟烷(isoflourane)麻醉的小鼠的中心角膜上达30秒钟。然后用10ml PBS冲洗眼睛，接下来用Tβ4(5mg-5ml)或相似体积的PBS(作为对照)局部给药，每日两次，共七日。七日以后，PBS处理和Tβ4处理的眼睛之间呈现出明显的差异。PBS处理的眼睛显示出明显的水肿和发炎的角膜，且出现明显的眼前房积血和强烈的发炎性细胞渗透。与此相反，Tβ4处理的角膜表现出基质水肿减轻，以及基质层更规则排列。与用PBS处理的眼睛相比，用Tβ4处理的前面片段整体解剖的完整性从外观上来看更为标准。
在用PBS和Tβ4处理的第七天，进行透射电镜分析(transmission electronmicroscopic analysis)。用Tβ4处理的角膜显现出上皮细胞间的连接排列更规则，而细胞层之间的空包形成更少。类似地，PBS处理的角膜在基质消化和水肿区表现出明显的发炎渗透性，然而用Tβ4处理的角膜基质表现出完整性，胶原质层分布更规则。