日本血吸虫信号转导蛋白SJWNT4基因的克隆、表达及应用.pdf

本发明公开了利用RACE技术从日本血吸虫19天童虫中首次扩增到一个Wnt家族基因，序列分析表明该基因的完整编码框含1311bp，编码436个氨基酸，理论分子量49.6kD。同源性分析结果表明，该基因的氨基酸序列具有典型Wnt家族蛋白特征，与日本三角涡虫、人Wnt4的氨基酸序列相似性分别达43％、37％，推测为血吸虫的Wnt4基因，命名为Sjwnt4(GenBanK登陆号DQ643829)。实时定量PCR分析显示该基因在14天童虫、19天童虫、31天成虫、44天雌虫及44天雄虫中均有表达，本发明构建了该基因的原核表达载体pGEX-4T-2-Sjwnt4，应用大肠杆菌系统进行了表达，表达蛋白以包涵体形式存在，Western印迹显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别。

权利要求书
1.  一种日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt-4基因的克隆和表达，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)材料
Trizol、GeneRacerTM Kit；Ex Taq Hot Start DNA聚合酶、限制性内切酶BamHI、Xho I、T4DNA连接酶、荧光定量PCR检测试剂盒和随机引物；羊抗鼠IgG-HRP抗GST单抗；羊抗兔IgG-HRP；逆转录酶；RNA酶抑制剂；SYBR Green I和Calibration；
(2)菌种、质粒及实验动物
质粒pGEX-4T-2、大肠杆菌DH5α、BL21 DE3由上海兽医研究所提供；pUCm-T载体；新西兰白兔雄性，2.5～3.0kg；日本血吸虫中国大陆株尾蚴由上海兽医研究所提供；新西兰白兔分别以腹部贴片法感染20000，5000，2000条血吸虫尾蚴，在14天、19天、31天和44天后剖杀，以肝门静脉灌注法收集虫体，液氮冻存备用；
(3)方法
①总RNA的提取取液氮中冻存的日本血吸虫19天童虫200mg，按Trizol试剂盒说明书进行总RNA的提取；
②RACE的引物设计和扩增
利用双向电泳结合肽质量指纹图谱技术获得一个Wnt家族蛋白的一段肽序列，以此肽序列为询问序列在日本血吸虫EST库中搜索到一个日本血吸虫的相应EST片断GenBankTM accession number AAM89872，长727bp，不含有完整的ORF，以该EST序列为模板设计合成RACE引物，3′RACE的两个巢式引物：3GSP1：
5′-TATGCTGTGGTCGAGGATTTAAACG-3′，3GSP2：
5′-GGTGTTGCAAAGTTGTCTGTAAAACA-3′；5′RACE的两个巢式引物：5GSP1：
5′-GGTGTTGCAAAGTTGTCTGTAAAACA-3′，5GSP2：
5′-TTGTCGTTTAAATCCTCGACCACAG-3′；
具体步骤按GeneRacerTM试剂盒操作手册进行，将RACE产物克隆到试剂盒提供的pCR4-TOPO载体中，挑选阳性克隆测序，利用DNAStar软件查找3′、5′RACE产物序列与原EST序列的重叠部分，将三段序列拼接；
③含ORF cDNA片断的扩增
根据拼接的cDNA序列设计引物F1和F2进行含ORF cDNA片断的扩增，F1：5′-CCGGGATCCATGAATCTAACTCAGCTAGAA-3′引入酶切位点BamH I加下划线；F2：5′-CGGCTCGAGTTAATTACATGTAGATATAAC-3′引入酶切位点Xho I；取3μl在3′RACE中反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件分别为94℃预变性5min，然后94℃、30s，55℃、30s，72℃、lmin30s，共30个循环，循环结束后72℃延伸10min，PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收，纯化后连pUCm-T载体，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，选单个菌落酶切鉴定，阳性质粒命名为pUCm-T-Sjwnt4并测序；
④生物信息学分析
将测序得到的cDNA在NCBI上进行相似性比对，利用NCBI上的ORF finder找出新基因的读码框；利用DNAstar软件对氨基酸残基数、组成、蛋白质相对分子量等参数进行分析；利用clustalW软件对不同物种Wnt蛋白进行多重比对；利用NetAcet软件进行糖基化位点预测，利用SYFPEITHI的MHCII表型在线预测工具进行T细胞表位预测；
⑤荧光实时定量RT-PCR
试验中选择血吸虫的持家基因α-微管蛋白为内参；分别提取14天和19天童虫、31天成虫、44天雄虫和44天雌虫总RNA，去除基因组DNA后利用随机引物合成cDNA第一链；荧光定量PCR引物：扩增Sjwnt4的引物：S1：5′-ACATACAAAATCGTCTGGTCTC-3′，S2：5′-GATGGTAAAGGCGATGTAGTC-3′，扩增片段长度214bp；扩增α-tubulin引物：T1：5′-CTGATTTTCCATTCGTTTG-3′，T2：5′-GTTGTCTACCATGAAGGCA-3′，扩增片段长度213bp；引物由上海生工合成，采用荧光染料法进行实时定量PCR，反应体系包括：5×R-PCR Buffer 5μl，250mM Mg2+0.3μl，10mM dNTP 0.75μl，10μM引物1.0μl，25×SYBR Green I 1.0μl，10-3×Calibration 1.0μl，5U/μl Ex Taq Hs 0.25μl，ddh2O 14.7μl，模板cDNA 1.0μl，共25μl；反应参数：95℃变性3min，95℃5s，58℃30s，40个循环，其中58℃30s结束时间点为荧光信号检测点，每个反应均做3孔重复；采用BIO-RAD公司iCyclerTM IQversion 3.0软件进行计算分析，以α-tubulin为内参标化反应结果，得出相对于每百万持家基因的目的基因含量；
⑥重组表达质粒的构建
从测序后确定的重组质粒pUCm-T-Sjwnt4中用限制性内切酶BamH I、Xho I切出Sjwnt4含ORF的cDNA片断，将该完整序列定向克隆于原核表达载体pGEX-4T-2的多克隆位点区，构建重组表达质粒pGEX-4T-2-Sjwnt4，并转化表达宿主菌BL21DE3；
⑦在大肠杆菌中的表达
将鉴定好的pGEX-4T-2-Sjwnt4/BL21DE3接种于液体LB培养基，37℃震荡培养，OD值为0.6时加终浓度为1mM的IPTG诱导表达。在IPTG诱导后0h，0.5h，1h，2h，4h，6h分别收集菌体，应用SDS-PAGE分析菌体蛋白，确定最佳诱导时间；
⑧Western blotting检测
将高表达时相菌体蛋白进行SDS-PAGE电泳，转移到硝酸纤维素膜上，分别用抗GST单抗或经pGEX-4T-2/BL21大肠杆菌裂解液吸附处理过的日本血吸虫成虫抗原免疫兔血清作一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠、羊抗兔IgG为二抗，DAB作为底物进行显色。

2.  根据权利要求1所述的一种日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt-4基因的克隆和表达，其特征在于所述的一种日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt-4基因的核苷酸和推测氨基酸序列如下：
  1 AATATGATGCTACTCCTTATGATGATTCAACATCAGCCAGTAGATTAAACAAAAATAATTACAACACTGAAGGATACCGTCGATCACCAA
 91 ATTCTGATTTACGTTTTGTTGAAGCATCAAAATCACAAGATTTGGATTATCCTCATACAAGTAAAAAATATATAAATTCAGACTTAAATA
181 CAAATAATTATAATCATGAACGA
204AATCTAACTCAGCTAGAACAAACGATTCAAGACATGAATAATAATGATAGTAACAATATAATGACATCAGAAACATTTGTTGGTGCC
     N  D  S  N  N  I  M  T  S  E  T  F  V  G  A  M  N  L  T  Q  L  E  Q  T  I  Q  D  M  N  N
294 GATGGAAAATTACAAATGAGTATATGCGATCATCCAAATGGATTTTTACGGAGACAAAAGAAATTATGCCGTCAGTATTTACATTTGATG
    D  G  K  L  Q  M  S  I  C  D  H  P  N  G  F   L  R  R  Q  K  K  L  C  R  Q  Y  L  H  L  M
384 GAGAGTGTAATCCGTGGTTATTTTATGGGTTTAAAAGAATGTGAATATCAATTTTCTGCACATCGATGGAATTGTCAGGGTCATAACTTA
     E  S  V  I  R  G  Y  F  M  G  L  K  E  C  E  Y  Q  F  S  A  H  R  W  N  C  Q  G  H  N  L
474 ACTATTCAAGCACCAACTAGTCGAAAACAGAAACGTTTAAGATATAGAGAATCTGAGTTGAAAAATGATATGGATAATTCACGAAGAAAA
      T  I  Q  A  P  T  S  R  K  Q  K  R  L  R  Y  R  E  S  E  L  K  N  D  M  D  N  S  R  R  K
 564 TCTGTACGTATACAAACATACTTAGACAAGCTTTTATCTAAAGGAACAAGAGAATCAGCTTATGTTTTGGCTGTTACATCCGCCGGTGTA
      S  V  R  I  Q  T  Y  L  D  K  L  L  S  K  G  T  R  E  S  A  Y  V  L  A  V  T  S  A  G  V
 654 TCACATGCAGTCACTAAAGCATGCAGTAGTGGTCTACATGATAACTGTGGATGTGACAGAACAATATACGATCATCCTAGAGAACCAAAT
      S  H  A  V  T  K  A  C  S  S  G  L  H  D  N  C  G  C  D  R  T  I  Y  D  H  P  R  E  P  N
 744 TTTGAATGGTCAGGATGTTCAGATAATATACATTTTGGAGCAGCATTTTCAAGACAATTTCTTGATGTACGAGAACGTAACAGACTGAAA
      F  E  W  S  G  C  S  D  N  I  H  F  G  A  A  F  S  R  Q  F  L  D  V  R  E  R  N  R  L  K
 834 CGTAATCCAAAATTAGGACTGACAAATTTACATAATAATCATGTGGGAAGACATATGGTAATCAATAAAATGGAAGTCCAGTGCAAATGT
     R  N  P  K  L  G  L  T  N  L  H  N  N  H  V  G  R  H  M  V  I  N  K   M  E  V  Q  C  K  C
 924 CATGGTGTAAGTGGTTCATGTGAAATGCGTACATGTTGGCGATCGTTACCGAAATTTCGGCATTTAGGTGCACAATTACAAGAAAGATTT
     H  G  V  S  G  S  C  E  M  R  T  C  W  R  S  L  P  K  F  R  H  L  G  A  Q  L  Q  E  R  F
1014 CATGAAGCAATACAAGTCACTTACATACAAAATCGTCTGGTCTCGATGAAAGCACTAGAACAATTAAGTAAAGAATCAAATGGAAACGCA
      H  E  A  I  Q  V  T  Y  I  Q  N  R  L  V  S  M  K  A  L  E  Q  L  S  K  E  S  N  G  N  A
1104 CTATTACTTTCTCATTCTGCATTATTATCATCAGTAGTATCAGGAGTATCATCATCCGATGAATTACCGGCATCACCGCGTATTAATAGA
      L  L  L  S  H  S  A  L  L  S  S  V  V  S  G  V  S  S  S  D  E  L  P  A  S  P  R  I  N  R
1194 AATGCGTTTGATACTTTAACTCGTTCTACATCATTGACTACATCGCCTTTACCATCACCAACTGAAAATGATTTGATTTATATTAGTGAA
      N  A  F  D  T  L  T  R  S  T  S  L  T  T  S  P  L  P  S  P  T  E  N  D  L  I  Y  I  S  E
1284 TCACCAACATTTTGTCATCATGATCCAAGATATGGTAGTATTGGTACATATGGTCGACAGTGTGATGAAAATTCTCAAGGTTTAAACAGT
      S  P  T  F  C  H  H  D  P  R  Y  G  S  I  G  T  Y  G  R  Q  C  D  E  N  S  Q  G  L  N  S
1374 TGTAATTATTTATGCTGTGGTCGAGGATTTAAACGACAAACGTTTGTTCAACAAGAGAGATGTGATTGTAAATTTCAGTGGTGTTGCAAA
      C  N  Y  L  C  C  G  R  G  F  K  R  Q  T  F  V  Q  Q  E  R  C  D  C  K  F  Q  W  C  C  K
1464 GTTGTCTGTAAAACATGTCGTAAAACAGTAGTTATATCTACATGTAATTATATATATATATAAGGTATCTTTTTATCGTTCGCAATC
     V  V  C  K  T  C  R  K  T  V  V  I  S  T  C  N  ＊
1554 ACTTTGTGTGTTTATTTTCATTTTCGTACAATGAACTCCCCTACCTCTGTAGATCTCTTCATAACTATTCCAAAAGTTCTTCCTTATTGC
1644 ATTTGTATTACAAAAGATCTGAATTAAAGTAACAACTCCTGATAATCCTAATCAAAAGCAAAACAAGTTAACTGAGTTTGCAGGGGATGA
1734 AGAAGATTTGAAAACATAAAATTTACTAAGTTGATGACAATTTACTCCAAAAAGGAAATAAGGAAACGATAAAGAATAACCGAAAGACAA
1824 TATATTATTGGTGAATTCACTGTGCTTAAAATAAAAATATCAAGAGAGAACAATCGAATTTGCACACGTTTTTCCTTTCTTCCTAAATTC
1914 TATCTTTCTATAACACTGTTTCTTGTATATGGTTATTTTCTCAATATACCGATTACATTGTGTATATTCTGTTTACAGTCAATTACTTAT
2004 TAAATCAGTCAGTAACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA                    。

3.  一种如权利要求1所述的日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt-4基因在制备防治血吸虫疾病药物中的应用。

说明书日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt-4基因的克隆、表达及应用
技术领域：
本发明属于基因技术领域，具体涉及一种日本血吸信号转导蛋白Sjwnt-4基因的克隆、表达及应用。
背景技术：
Wnts是一类从水螅、昆虫到脊椎动物中都能发现的分泌型糖蛋白，由细胞分泌出来后，与自身或邻近细胞的膜受体结合，激发下游的信号通路，调节核内靶基因的表达，决定细胞的分化命运，在动物发育中起着广泛的调节作用。Wnt蛋白异常的时空表达或异常的激活往往与肿瘤的发生有关。有研究表明，Wnt信号通路对哺乳动物生殖系统的正常发育起关键的调节作用，它主要参与了缪勒氏管及其派生器官的形成，调控卵泡的发育、排卵及黄体化，另外与正常妊娠的建立以及妊娠过程中乳腺的变化也有关。Wnt4是Wnt家族蛋白成员之一，在小鼠中，Wnt4对缪勒氏管的形成有关键意义，缺失Wnt4的雌、雄小鼠都没有缪勒氏管；Wnt4突变的雌鼠没有缪勒氏管的派生器官(即输卵管、子宫、子宫颈和阴道上部)；而沃尔夫管则继续存在。Wnt4缺失的雄性动物其睾丸的发育不受影响，但当发育着的雌性性腺中一旦缺失Wnt4信号，其结构和功能上都呈现一定的雄性化特征，性腺虽然定位在它们正确的部位，但其外形比正常的卵巢更圆，且像睾丸一样没有包被。此外，突变的性腺可以分化MIS(缪勒氏管抑制物质)及睾酮。在人类中，男性的染色体1p31～p35片断的二倍体导致了Wnt4增多，Wnt4的过量表达致使XY的男性具有了女性的表型。因此，Wnt4可能是一种性别表型的决定基因。
对血吸虫生长发育信号转导的研究是解和认识血吸虫生活特征的有效途径。但是到目前为止，对血吸虫生长发育信号转导系统的研究甚少，以致在开发高效候选疫苗分子和筛选新型药物的方面进展缓慢。而对血吸虫Wnt基因的研究国内外尚未有研究报道。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题在于设计血吸虫Wnt基因的有关表达。
本发明利用RACE技术首次克隆到编码日本血吸虫Wnt4蛋白的含ORF的cDNA序列，分析了该基因在日本血吸虫不同发育阶段中的表达情况，应用大肠杆菌进行了表达，并对表达产物进行了抗原性测定。
本发明提供了一种日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt-4基因的克隆和表达。
该方法包括下列步骤：
(1)材料
Trizol、GeneRacerTM Kit购自Invitrogen公司；Ex Taq Hot Start DNA聚合酶、限制性内切酶BamHI、XhoI、T4 DNA连接酶、荧光定量PCR检测试剂盒和随机引物购自TaKaRa生物工程(大连)有限公司；羊抗鼠IgG-HRP购自天根生化科技(北京)有限公司；抗GST单抗购自SIGMA公司；羊抗兔IgG-HRP购自华美生物工程公司；逆转录酶购自Stratagen公司；RNA酶抑制剂购自Promega公司；SYBR GreenI和Calibration购自BIO-RAD公司；
(2)菌种、质粒及实验动物
质粒pGEX-4T-2、大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)由本所(上海兽医研究所)提供，pUCm-T载体购自天根生化科技(北京)有限公司。新西兰白兔(雄性，2.5～3.0kg)购自上海罗泾飞达实验动物养殖场。日本血吸虫中国大陆株尾蚴由本所(上海兽医研究所)钉螺室提供。新西兰白兔分别以腹部贴片法感染20000，5000，2000条血吸虫尾蚴，在14天、19天、31天和44天后剖杀，以肝门静脉灌注法收集虫体，液氮冻存备用；
(3)方法
①总RNA的提取取液氮中冻存的日本血吸虫19天童虫200mg，按Trizol试剂盒说明书进行总RNA的提取；
②RACE的引物设计和扩增本实验室程国锋等利用双向电泳结合肽质量指纹图谱技术获得一个Wnt家族蛋白的一段肽序列，以此肽序列为询问序列在日本血吸虫EST库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)搜索到一个日本血吸虫的相应EST片断(GenBankTM accession number AAM89872)，长727bp，不含有完整的ORF。以该EST序列为模板设计合成RACE引物(由上海申能博采生物技术有限公司合成)。3′RACE的两个巢式引物：3GSP1：5′-TATGCTGTGGTCGAGGATTTAAACG-3′，3GSP2：5′-GGTGTTGCAAAGTTGTCTGTAAAACA-3′；5′RACE的两个巢式引物：5GSP1：5′-GGTGTTGCAAAGTTGTCTGTAAAACA-3′，5GSP2：5′-TTGTCGTTTAAATCCTCGACCACAG-3′；具体步骤按GeneRacerTM试剂盒操作手册进行。将RACE产物克隆到试剂盒提供的pCR4-TOPO载体中，挑选阳性克隆，由英俊生物技术有限公司测序。利用DNAStar软件查找3′、5′RACE产物序列与原EST序列的重叠部分，将三段序列拼接；
③含ORF cDNA片断的扩增根据拼接的cDNA序列设计引物(F1和F2)进行含ORF cDNA片断的扩增。F1：5′-CCGGGATCCATGAATCTAACTCAGCTAGAA-3′引入酶切位点BamHI(加下划线)；F2：5′-CGGCTCGAGTTAATTACATGTAGATATAAC-3′引入酶切位点(XhoI)(由上海申能博采生物技术有限公司合成)。取3μl在3′RACE中反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件分别为94℃预变性5min，然后94℃、30s，55℃、30s，72℃、1min30s，共30个循环，循环结束后72℃延伸10min。PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收，纯化后连pUCm-T载体，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，选单个菌落酶切鉴定，阳性质粒命名为pUCm-T-Sjwnt4并送英俊生物技术有限公司测序；
④生物信息学分析将测序得到的cDNA在NCBI上进行相似性比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)；利用NCBI上的ORF finder找出新基因的读码框；利用DNAstar软件对氨基酸残基数、组成、蛋白质相对分子量等参数进行分析；利用clustalW软件对不同物种Wnt蛋白进行多重比对；利用NetAcet软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetAcet/)进行糖基化位点预测。利用SYFPEITHI的MHCII表型在线预测工具(http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/)进行T细胞表位预测。
⑤荧光实时定量RT-PCR试验中选择血吸虫的持家基因α-微管蛋白(α-tubulin)为内参；分别提取14d和19d童虫、31d虫体、44d雄虫和44d雌虫总RNA，去除基因组DNA后利用随机引物合成cDNA第一链；荧光定量PCR引物：扩增Sjwnt4的引物：S1：5′-ACATACAAAATCGTCTGGTCTC-3′，S2：5′-GATGGTAAAGGCGATGTAGTC-3′，扩增片段长度214bp；扩增α-tubulin引物：T1：5′-CTGATTTTCCATTCGTTTG-3′，T2：5′-GTTGTCTACCATGAAGGCA-3′，扩增片段长度213bp；引物由上海生工合成，采用荧光染料法进行实时定量PCR，反应体系包括：5×R-PCR Buffer 5μl，250mM Mg2+ 0.3μl，10mM dNTP 0.75μl，10μM引物1.0μl，25×SYBR Green I 1.0μl，10-3×Calibration 1.0μl，5U/μl Ex Taq Hs 0.25μl，ddh2O 14.7μl，模板cDNA 1.0μl，共25μl；反应参数：95℃变性3min，95℃ 5s，58℃ 30s，40个循环，其中58℃ 30s结束时间点为荧光信号检测点，每个反应均做3孔重复；采用BIO-RAD公司iCyclerTM IQ version 3.0软件进行计算分析，以α-tubulin为内参标化反应结果，得出相对于每百万持家基因的目的基因含量；
⑥重组表达质粒的构建从测序后确定的重组质粒pUCm-T-Sjwnt4中用限制性内切酶BamHI、XhoI切出Sjwnt4含ORF的cDNA片断，将该完整序列定向克隆于原核表达载体pGEX-4T-2的多克隆位点区，构建重组表达质粒pGEX-4T-2-Sjwnt4，并转化表达宿主菌BL21(DE3)；
⑦在大肠杆菌中的表达将鉴定好的pGEX-4T-2-Sjwnt4/BL21(DE3)接种于液体LB培养基，37℃震荡培养，OD值为0.6时加终浓度为1mM的IPTG诱导表达。在IPTG诱导后0h，0.5h，1h，2h，4h，6h分别收集菌体，应用SDS-PAGE分析菌体蛋白，确定最佳诱导时间；
⑧Western blotting检测 将高表达时相菌体蛋白进行SDS-PAGE电泳，转移到硝酸纤维素膜上，分别用抗GST单抗或经pGEX-4T-2/BL21大肠杆菌裂解液吸附处理过的日本血吸虫成虫抗原免疫兔血清作一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠、羊抗兔IgG为二抗，DAB作为底物进行显色。
本发明的另一目的是提供了Sjwnt-4编码基因在制备防治血吸虫疾病药物中的应用。
本发明的SjWnt-4编码基因的克隆及生物信息学分析
本研究利用RACE技术对EST片断(GenBankTM登陆号为AAM89872)进行3′端和5′端延伸，分别经2轮PCR扩增，将PCR产物测序后拼接得到2044bp的DNA片断，进一步利用PCR技术克隆获得含完整阅读框的编码基因，其开放阅读框为1311bp，编码436个氨基酸，利用NCBI的Blast软件对该序列进行同源性搜索，结果与血吸虫其它已知基因无显著同源性，为血吸虫新基因。氨基酸序列的相似性比较结果显示与Wnt家族蛋白具有高度同源性，其中与Wnt4蛋白的同源性最高，并且对氨基酸序列进行分析也发现其具有十分典型的Wnt家族蛋白特征：整个蛋白序列中散在着100多个Wnt家族蛋白的保守位点；富含可交连形成二硫键的半胱氨酸残基，约23～24个保守的半胱氨酸，其中50％位于蛋白的羧基端；具有三个或四个糖基化位点，又选择了分别来自日本三角涡虫(登陆号BAD93239.1)、人(GeneBank登陆号NP_110388.2)、小鼠(GeneBank登陆号NP_033549.1)、尤金袋鼠(GeneBank登陆号AAY18780.1)、鸡(GeneBank登陆号JC2451)、线虫(GeneBank登陆号NP_493668.1)、果蝇(GeneBank登陆号NP_476810.1)的7个物种的Wnt4蛋白进行氨基酸序列的多重比对。结果显示，该基因所编码氨基酸序列与同属扁形动物门的日本三角涡虫的Wnt4相似性最高达43％(E＝1e-100)，与人Wnt4的相似性为37％(E＝9e-72)，其余皆在36％～38％之间。据此，推测该基因编码的蛋白为日本血吸虫Wnt4蛋白，将该基因命名为日本血吸虫wnt4(Sjwnt4)(GeneBank登陆号DQ643829)。
对该基因编码的氨基酸序列进行T细胞表位的预测结果显示该序列中含有多个可与特定HLA分子具较高结合效价的抗原肽段(表1)。
表1 Sjwnt4与HLA有较高结合效率的潜在的抗原肽
Table 1 The peptide binding to HLA with high efficiency in Sjwnt4


本发明SjWnt4基因的期别、性别表达分析
为了了解SjWnt4基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体的表达情况，提取14天童虫、19天童虫、31天成虫、44天雄虫和44天雌虫等阶段虫体总RNA，选择持家基因α-tubulin作为内参，利用荧光定量PCR法检测该基因在日本血吸虫几个不同发育阶段虫体的表达情况。实验结果表明，SjWnt4在日本血吸虫童虫、成虫及雌雄虫中均有表达(图1)，其中在19天童虫中表达量最高，44天雌虫表达量明显比雄虫高。
重组原核表达载体pGEX-4T-2-Sjwnt4的构建鉴定
经PCR、BamHI和XhoI双酶切鉴定(图2)和测序证实pGEX-4T-2-Sjwnt4重组表达质粒构建成功(图3)。
本发明Sjwnt4基因在大肠杆菌中表达
重组表达质粒pGEX-4T-2-Sjwnt4在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达，SDS-PAGE电泳结果显示，1mM IPTG诱导4h即达到最大表达量；重组蛋白分子量约为76kD，与预期结果相符(Sjwnt4蛋白推测分子量约为49.6kD，载体表达蛋白GST约26kD，故重组蛋白分子量约为75.6kD)(图4)。重组蛋白以包涵体形式存在，可溶于含8M尿素的PBS。
上述表达产物抗原性分析
以重组表达产物进行SDS-PAGE电泳，经电转移至NC膜上，分别用抗GST单抗和经pGEX-4T-2/BL21大肠杆菌蛋白吸附的日本血吸虫成虫抗原免疫血清作一抗进行Western blot，结果均在75kD处有一明显的识别条带(图5箭头处)，表明重组表达产物为GST融合蛋白且具有良好的抗原性。
上述结果表明Sjwnt4基因在日本血吸虫感染宿主后第14天童虫、19天童虫、31天虫体、44天雌虫和44天雄虫体内均有表达，但19d童虫的表达量显著的高于其它各个阶段；与此同时，该基因在44d雌虫中的表达量高于44d雄虫。从过去的研究已知日本血吸虫感染宿主后，在第15-16天雌雄虫合抱配对，雌雄虫合抱后卵黄腺开始发育，卵黄细胞分化，合成卵黄小滴；第22天雌虫体内表达卵壳蛋白；到第24天后长期保持排卵状态。上述Sjwnt4基因的表达状况分析结果显示，该基因的表达变化与血吸虫性别表型的发育变化密切相关，从一个侧面揭示了Wnt4基因在血吸虫生殖系统发育中的重要作用。这个结果与该基因在小鼠和小袋鼠中表达的生物学意义有一定的相似性。在小鼠中，Wnt4最初在肾管间充质及未分化的性腺中表达，它在两性未分化的性腺中都表达，但经过性别特异的分化后，在雄性性腺中Wnt4表达下降，而在雌性性腺中一直维持。在有袋动物如塔马尔沙袋鼠中，Wnt4 mRNA在未分化的两性性腺中都有表达；雌性小袋鼠Wnt4 mRNA在卵巢分化过程中表达水平显著上升，约在小鼠出生后9～13天后到达顶峰，然后当所有的雌性生殖细胞进入减数分裂后开始下降；雄性小袋鼠的Wnt4 mRNA表达水平在输精管形成后立即下降。因此，如果能通过人为干预，如使用RNAi干扰技术抑制血吸虫Wnt4的表达或者以Wnt4蛋白为药靶抑制它的活性，从而控制血吸虫性别发育、产卵，对减轻血吸虫病的病理损害，及阻断传播将有重要意义。
本发明首次克隆获得血吸虫Wnt4基因，为Wnt信号通路在血吸虫生长发育特别是生殖器官发育中的作用以及开发高效的抗血吸虫病的疫苗和筛选新型的抗血吸虫药物有较大的应用价值。
SjWnt-4的核苷酸和推测氨基酸序列。
1 AATATGATGCTACTCCTTATGATGATTCAACATCAGCCAGTAGATTAAACAAAAATAATTACAACACTGAAGGATACCGTCGATCACCAA
91 ATTCTGATTTACGTTTTGTTGAAGCATCAAAATCACAAGATTTGGATTATCCTCATACAAGTAAAAAATATATAAATTCAGACTTAAATA
181 CAAATAATTATAATCATGAACGA
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1464 GTTGTCTGTAAAACATGTCGTAAAACAGTAGTTATATCTACATGTAATTATATATATATATAAGGTATCTTTTTATCGTTCGCAATC
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1554 ACTTTGTGTGTTTATTTTCATTTTCGTACAATGAACTCCCCTACCTCTGTAGATCTCTTCATAACTATTCCAAAAGTTCTTCCTTATTGC
1644 ATTTGTATTACAAAAGATCTGAATTAAAGTAACAACTCCTGATAATCCTAATCAAAAGCAAAACAAGTTAACTGAGTTTGCAGGGGATGA
1734 AGAAGATTTGAAAACATAAAATTTACTAAGTTGATGACAATTTACTCCAAAAAGGAAATAAGGAAACGATAAAGAATAACCGAAAGACAA
1824 TATATTATTGGTGAATTCACTGTGCTTAAAATAAAAATATCAAGAGAGAACAATCGAATTTGCACACGTTTTTCCTTTCTTCCTAAATTC
1914 TATCTTTCTATAACACTGTTTCTTGTATATGGTTATTTTCTCAATATACCGATTACATTGTGTATATTCTGTTTACAGTCAATTACTTAT
2004 TAAATCAGTCAGTAACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
附图说明：
图1：实时定量RT-PCR检测SjWnt4基因在日本血吸虫不同期别和性别虫体中的表达；
14d：14天童虫；19d：19天童虫；31d：31天虫体；44d(M)：44天雄虫；44d(F)：44天雌虫。
图2：重组质粒pGEX-4T-2-Sjwnt4双酶切鉴定及PCR鉴定；
M1：DNA Marker DL15000；1：pGEX-4T-2-Sjwnt4重组质粒经BamHI、XhoI双酶切；2：pGEX-4T-2空载体经BamHI、XhoI双酶切；M2：DNA marker DL2000；3：pGEX-4T-2-Sjwnt4重组质粒PCR产物。
图3：pGEX-4T-2-Sjwnt4重组质粒示意图；
Fig 5 The recombinant plasmid pGEX-4T-2-Sjwnt4。
图4：SDS-PAGE分析pGEX-4T-2-Sjwnt4/BL21(DE3)不同时相的表达蛋白；
M：蛋白标准分子量；1、2、3、4、5、6：重组质粒pGEX-4T-2-Sjwnt4在IPTG诱导后0h，0.5h，1h，2h，4h，6h的表达产物；7：pGEX-4T-2-Sjwnt4不加IPTG培养6h的产物
图5：pGEX-4T-2-Sjwnt4重组蛋白的Western blot分析；
M：预染标准蛋白分子量；1：pGEX-4T-2-Sjwnt4未诱导产物；2：pGEX-4T-2-Sjwnt4诱导表达产物；a.：以鼠抗GST单抗为一抗进行的Western blot；b：以抗日本血吸虫成虫抗原兔血清作一抗进行的Western blot。
具体实施方式：
实施例1 日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt-4基因的克隆
1.实验材料
1.1材料
Trizol、GeneRacerTM Kit购自Invitrogen公司；Ex Taq Hot Start DNA聚合酶、T4 DNA连接酶购自TaKaRa生物工程(大连)有限公司。
1.2菌种、质粒及实验动物
大肠杆菌DH5α由本所提供，pUCm-T载体购自天根生化科技(北京)有限公司。新西兰白兔(雄性，2.5～3.0kg)购自上海罗泾飞达实验动物养殖场。日本血吸虫中国大陆株尾蚴由本所钉螺室提供。新西兰白兔分别以腹部贴片法感染20000，5000，2000条血吸虫尾蚴，在14天、19天、31天和44天后剖杀，以肝门静脉灌注法收集虫体，液氮冻存备用；
2.方法
2.1总RNA的提取取液氮中冻存的日本血吸虫19天童虫200mg，按Trizol试剂盒说明书进行总RNA的提取；
2.2 RACE的引物设计和扩增本实验室程国锋等利用双向电泳结合肽质量指纹图谱技术获得一个Wnt家族蛋白的一段肽序列，以此肽序列为询问序列在日本血吸虫EST库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)搜索到一个日本血吸虫的相应EST片断(GenBankTM accession number AAM89872)，长727bp，不含有完整的ORF。以该EST序列为模板设计合成RACE引物(由上海申能博采生物技术有限公司合成)。3′RACE的两个巢式引物：3GSP1：5′-TATGCTGTGGTCGAGGATTTAAACG-3′，3GSP2：5′-GGTGTTGCAAAGTTGTCTGTAAAACA-3′；5′RACE的两个巢式引物：5GSP1：5′-GGTGTTGCAAAGTTGTCTGTAAAACA-3′，5GSP2：5′-TTGTCGTTTAAATCCTCGACCACAG-3′；具体步骤按GeneRacerTM试剂盒操作手册进行。将RACE产物克隆到试剂盒提供的pCR4-TOPO载体中，挑选阳性克隆，由英俊生物技术有限公司测序。利用DNAStar软件查找3′、5′RACE产物序列与原EST序列的重叠部分，将三段序列拼接；
2.3含ORF cDNA片断的扩增根据拼接的cDNA序列设计引物(F1和F2)进行含ORF cDNA片断的扩增。F1：5′-CCGGGATCCATGAATCTAACTCAGCTAGAA-3′引入酶切位点BamHI(加下划线)；F2：5′-CGGCTCGAGTTAATTACATGTAGATATAAC-3′引入酶切位点(XhoI)(由上海申能博采生物技术有限公司合成)。取3μl在3′RACE中反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件分别为94℃预变性5min，然后94℃、30s，55℃、30s，72℃、1min30s，共30个循环，循环结束后72℃延伸10min。PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收，纯化后连pUCm-T载体，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，选单个菌落酶切鉴定，阳性质粒命名为pUCm-T-Sjwnt4并送英俊生物技术有限公司测序；
2.4生物信息学分析将测序得到的cDNA在NCBI上进行相似性比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)；利用NCBI上的ORF finder找出新基因的读码框；利用DNAstar软件对氨基酸残基数、组成、蛋白质相对分子量等参数进行分析；利用Genetool软件对不同物种Wnt蛋白进行多重比对；利用NetAcet软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetAcet/)进行糖基化位点预测。利用SYFPEITHI的MHCII表型在线预测工具(http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/)进行T细胞表位预测。
3.结果
利用RACE技术对EST片断(GenBankTM登陆号为AAM89872)进行3′端和5′端延伸，分别经2轮PCR扩增，将PCR产物测序后拼接得到2044bp的DNA片断，进一步利用PCR技术克隆获得含完整阅读框的编码基因，其开放阅读框为1311bp，编码436个氨基酸，利用NCBI的Blast软件对该序列进行同源性搜索，结果与血吸虫其它已知基因无显著同源性，为血吸虫新基因。氨基酸序列的相似性比较结果显示与Wnt家族蛋白具有高度同源性，其中与Wnt4蛋白的同源性最高，并且对氨基酸序列进行分析也发现其具有十分典型的Wnt家族蛋白特征：整个蛋白序列中散在着100多个Wnt家族蛋白的保守位点；富含可交连形成二硫键的半胱氨酸残基，约23～24个保守的半胱氨酸，其中50％位于蛋白的羧基端；具有三个或四个糖基化位点，又选择了分别来自日本三角涡虫(登陆号BAD93239.1)、人(GeneBank登陆号NP_110388.2)、小鼠(GeneBank登陆号NP_033549.1)、尤金袋鼠(GeneBank登陆号AAY18780.1)、鸡(GeneBank登陆号JC2451)、线虫(GeneBank登陆号NP_493668.1)、果蝇(GeneBank登陆号NP_476810.1)的7个物种的Wnt4蛋白进行氨基酸序列的多重比对。结果显示，该基因所编码氨基酸序列与同属扁形动物门的日本三角涡虫的Wnt4相似性最高达43％(E＝1e-100)，与人Wnt4的相似性为37％(E＝9e-72)，其余皆在36％～38％之间。据此，推测该基因编码的蛋白为日本血吸虫Wnt4蛋白，将该基因命名为日本血吸虫wnt4(Sjwnt4)(GeneBank登陆号DQ643829)。
实施例2
日本血吸虫Sjwnt4基因在大肠杆菌中的表达
1.实验材料
1.1材料限制性内切酶BamHI、XhoI、T4 DNA连接酶购自TaKaRa生物工程(大连)有限公司。
1.2菌种、质粒质粒pGEX-4T-2、BL21(DE3)由本所提供。
2.方法
2.1重组表达质粒的构建从测序后确定的重组质粒pUCm-T-Sjwnt4中用限制性内切酶BamHI、XhoI切出Sjwnt4含ORF的cDNA片断，将该完整序列定向克隆于原核表达载体pGEX-4T-2的多克隆位点区，构建重组表达质粒pGEX-4T-2-Sjwnt4，并转化表达宿主菌BL21(DE3)；
2.2在大肠杆菌中的表达将鉴定好的pGEX-4T-2-Sjwnt4/BL21(DE3)接种于液体LB培养基，37℃震荡培养，OD值为0.6时加终浓度为1mM的IPTG诱导表达。在IPTG诱导后0h，0.5h，1h，2h，4h，6h分别收集菌体，应用SDS-PAGE分析菌体蛋白，确定最佳诱导时间。
3.结果
重组表达质粒pGEX-4T-2-Sjwnt4在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达，SDS-PAGE电泳结果显示，1mM IPTG诱导4h即达到最大表达量；重组蛋白分子量约为76kD，与预期结果相符(Sjwnt4蛋白推测分子量约为49.6kD，载体表达蛋白GST约26kD，故重组蛋白分子量约为75.6kD)(图4)。重组蛋白以包涵体形式存在，可溶于含8M尿素的PBS。