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1、(10)申请公布号 CN 102653795 A (43)申请公布日 2012.09.05 CN 102653795 A *CN102653795A* (21)申请号 201210158195.3 (22)申请日 2012.05.21 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 南京师范大学 地址 210046 江苏省南京市栖霞区亚东新城 区文苑路 1 号 (72)发明人 尹绍武 朱晓平 祝斐 胡亚丽 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207 代理人 卢亚丽 (54) 发明名称 一种泰国笋壳鱼和本地笋壳鱼鱼苗的鉴别引 物和方法 (5。
2、7) 摘要 本发明属于水产养殖学领域 DNA 标记领域， 具体涉及应用微卫星标记对泰国笋壳鱼 ( 云斑 尖塘鳢Oxyeleotrismarmoratus）和本地笋壳鱼 ( 河川沙塘鳢Odontobutispotamophila) 鱼苗进 行鉴别。本发明的一对引物序列如 SEQIDNo.8 和 SEQIDNo.9 所示。鉴定时用上述引物对待鉴别样 本进行 PCR 扩增， 再用 1% 琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行检测， EB 染色， 250bp 大小条带的为泰 国笋壳鱼， 300bp 大小条带的为本地笋壳鱼 ； 本发 明所获得的微卫星引物， 在云斑尖塘鳢群里和河 川沙塘鳢群体中均能稳定扩增，。
3、 结果稳定， 条带清 晰， 且操作简单方便， 成本低， 实用性强。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 3 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种用于泰国笋壳鱼和本地笋壳鱼鱼苗鉴别的引物， 其特征在于所述引物序列如 下 ： F ： TCCAATCAGGCAGTAAGCAG ； R ： GGGACATCAGGACCAACTCT。 2. 一种泰国笋壳鱼和本地笋壳鱼鱼苗的鉴别方法， 其特征在于， 包括下列步骤 ： （1） 用权利要求 1 。
4、所述引物对待鉴别样本进行扩增， 获得 PCR 产物 ； （2） 用 1% 琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行检测， EB 染色， 250bp 大小条带的为泰国笋 壳鱼， 300bp 大小条带的为本地笋壳鱼。 权 利 要 求 书 CN 102653795 A 2 1/5 页 3 一种泰国笋壳鱼和本地笋壳鱼鱼苗的鉴别引物和方法 技术领域 0001 本发明属于水产养殖学领域 DNA 标记技术在生产实践中的应用， 具体涉及应 用微卫星标记对泰国笋壳鱼 ( 云斑尖塘鳢Oxyeleotris marmoratus） 和本地笋壳鱼 ( 河川 沙塘鳢Odontobutis potamophila) 鱼苗进行鉴。
5、别。 背景技术 0002 云 斑 尖 塘 鳢 （Oxyeleotris marmoratus）俗 名 泰 国 笋 壳 鱼 (Marble goby)， 属 鲈 形 目 （Pereifomes） 、 鰕 虎 鱼 亚 目 (Gobioidei)、 塘 鳢 科 （Eleotridae） 、 尖 塘 鳢 属 （Oxyeleotris） ， 是塘鳢科鱼类中体型最大、 生长最快的名贵淡水鱼种。云斑尖塘鳢是原产 于泰国、 越南、 马来西亚等东南亚国家， 同时也是这些国家出口创汇的优良品种之一。由于 该鱼具有花纹漂亮、 味道鲜美、 口感嫩滑， 营养丰富等特点， 深受我国沿海城市及港、 澳、 台 消费者的欢迎。。
6、我国自上世纪八十年代从东南亚引种以来， 现已成为我国南方沿海地区的 重要淡水养殖对象。近年来， 随着养殖规模的扩大， 越冬成本的降低以及养殖技术的成熟， 该鱼的养殖正在长江中下游省份等地兴起， 并有逐年扩大和向北延伸的趋势。 0003 河川沙塘鳢 (Odontobutis potamophila)， 隶属于鲈形目 (Perciformes)、 鰕虎鱼 亚目 (Gobioidei)、 塘鳢科 (Odontobutidae)、 沙塘鳢属 (odontobutis)， 俗名塘鳢鱼， 也被 江苏等地的人们称为本地笋壳鱼， 是一种较为名贵的小型经济鱼类。 其主要分布于长江中、 下游及沿江各支流， 闽江水。
7、系， 钱塘江水系， 偶见黄河水系。 河川沙塘鳢因其肉质细嫩、 味道 鲜美、 肌间刺少， 深受江浙、 沪、 闽等地人们的喜爱。同时， 该鱼也是江苏省特色水产业中具 有良好发展前景的鱼类品种之一。 0004 由于云斑尖塘鳢和河川沙塘鳢各具特色， 并且市场需求量与日俱增， 所以江苏等 地两种鱼的养殖规模也在逐年扩大， 苗种需求量也随之大幅度的增加， 但随之而来的是苗 种的来源问题。由于云斑尖塘鳢和河川沙塘鳢在鱼苗阶段相似度十分高， 即使是养殖经验 丰富的渔民用肉眼也很难将其分辨开来。 所以， 在经济利益的趋势下， 国内笋壳鱼苗种市场 鱼龙混杂。 云斑尖塘鳢为我国从东南亚国家引进品种， 个体虽大， 但。
8、耐寒能力远不及河川沙 塘鳢， 且在水温低于 10 度的野外条件下难以存活， 而河川沙塘鳢则多为野生， 家养则需要 对其进行驯化， 且最大个体仅为 200g 左右， 目前， 该鱼在长江下游省份人工规模化繁育成 功， 且养殖面积不断扩大。 若养殖者不慎将品种搞错， 势必造成后期处理不当， 如此一来， 对 养殖户造成的经济损失将不可估量。 因此， 在养殖前景广阔但鱼苗市场混杂的背景下， 迫切 需要一种将两种笋壳鱼鱼苗鉴别开来的技术， 避免养殖失误发生在源头。 0005 基因组中的微卫星 DNA 以孟德尔方式遗传， 呈共显性表达， 且同时具有分布广、 遗 传信息含量高和便于 PCR 检测等优点， 已被。
9、广泛用于鱼类亲缘关系鉴定、 遗传多样性分析、 遗传连锁图构建及系统进化等方面的研究。研究表明， 微卫星侧翼序列在属内种间和有较 近亲缘关系的属间相当保守， 而且在基因组中有部分微卫星位点在亲缘关系较远的分类群 间也有一定保守性。 微卫星侧翼序列的保守性使得在某一物种中开发出的微卫星引物应用 于相关的近缘物种成为可能。 说 明 书 CN 102653795 A 3 2/5 页 4 发明内容 0006 本发明提供一种泰国笋壳鱼和本地笋壳鱼鱼苗的鉴别方法。借助分子手段 (1 对 微卫星引物 ) 快速将两种鱼苗鉴别开， 避免因为苗种选取不当给养殖户带来经济损失。 0007 本发明的基本原理是 ：（1）。
10、 用高效磁珠富集法大量开发云斑尖塘鳢微卫星引物 ； （2） 从所开发引物中选取在云斑尖塘鳢群体中能够稳定扩增且不具有多态性的数对微卫 星引物用于河川沙塘鳢群体的扩增 ；（3） 筛选出在河川沙塘鳢群体中亦能明显扩增， 但扩 增条带位置明显不同于云斑尖塘鳢的微卫星引物， 用于云斑尖塘鳢和河川沙塘鳢鱼苗的鉴 别。 0008 本发明筛选出一对种用于泰国笋壳鱼和本地笋壳鱼鱼苗鉴别的引物， 命名为 H228, 引物序列如下 ： F ： TCCAATCAGGCAGTAAGCAG（SEQ ID No.8） ； R ： GGGACATCAGGACCAACTCT（SEQ ID No.9） 。 0009 用上述 H。
11、228 引物鉴别泰国笋壳鱼和本地笋壳鱼鱼苗的方法， 包括下列步骤 ： （1） 用 H228 引物对待鉴别样本进行扩增， 获得 PCR 产物 ； （2） 用 1% 琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物进行检测， EB 染色， 250bp 大小条带的为泰国笋 壳鱼， 300bp 大小条带的为本地笋壳鱼 ； 本发明所述的 H228 引物是按照以下步骤获得的 ： 1. 基因组 DNA 的提取 ( 云斑尖塘鳢 群体、 河川沙塘鳢群体) ； 2.磁珠富集法筛选云斑尖塘鳢微卫星微点 ； 3.筛选在云斑尖塘鳢 群体中呈单态位点 ； 4. 用单态位点引物扩河川沙塘鳢群体 ； 5. 筛选出 1 对在两个群体均能 稳定扩。
12、增， 且片段大小明显不同的引物， 用于云斑尖塘鳢和河川沙塘鳢鱼苗的鉴别。 0010 所述步骤 1, 基因组 DNA 的提取包括 ： 剪取实验鱼的尾鳍 0.10.2g， 采取常规 酚 - 氯法提取基因组 DNA ； 核酸蛋白测定仪测定其纯度及浓度， 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 完 整性。 0011 所述步骤 2， 磁珠富集法筛选云斑尖塘鳢微卫星微点 ： 将云斑尖塘鳢基因组 DNA 经 Bsp143限制性内切酶进行酶切后连接接头， PCR 扩增后进行磁珠富集， 富集产物经克隆 后对阳性克隆测序。 0012 所述步骤 3， 筛选在云斑尖塘鳢群体中呈单态位点 ： 对测序结果中含有微卫星微 点的序列进行。
13、引物设计， 引物合成后在云斑尖塘鳢群体中进行 PCR 扩增， 扩增产物经 6% 聚 丙烯酰胺凝胶电泳筛选， 选出只扩增出一条清晰条带， 即呈现单态的微卫星引物。 0013 所述步骤 4， 用单态位点引物扩河川沙塘鳢群体 ： 用筛选出来的引物对河川沙塘 鳢群体进行PCR扩增， 扩增过程中， 退火温度、 MgCl2浓度等条件与云斑尖塘鳢群体扩增完全 相同。 0014 所述步骤 5， 筛选出在两个群体均能稳定扩增， 且片段大小明显不同的引物， 用于 云斑尖塘鳢和河川沙塘鳢鱼苗的鉴别 ： 用 1% 琼脂糖凝胶电泳同时检测云斑尖塘鳢群体和 河川沙塘鳢群体 PCR 扩增产物， 筛选出能够对云斑尖塘鳢群体和。
14、河川沙塘鳢群体进行鉴别 的微卫星引物。 0015 本发明所获得的微卫星引物 H228（退火温度 51） ， 在云斑尖塘鳢群里和河川沙 塘鳢群体中均能稳定扩增， 结果稳定， 条带清晰， 只需用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测就可看到 说 明 书 CN 102653795 A 4 3/5 页 5 明显差异， 且操作简单方便， 成本低， 实用强， 对养殖生产很有帮助。 附图说明 0016 图1 ： H13在云斑尖塘鳢群体中扩增的部分结果(聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选单态引 物 ) 图 2 ： H228 微卫星标记在部分云斑尖塘鳢群体和河川沙塘鳢群体中的扩增结果 ( 琼脂 糖凝胶电泳筛选鉴别引物 )。 具体实施方。
15、式 0017 1. 基因组 DNA 的提取 ( 云斑尖塘鳢群体、 河川沙塘鳢群体 ) ： 1） 取实验鱼的尾鳍 0.10.3g 加入 450L DNA 抽提缓冲液 (10 mmol/L Tris-HCl， 5 mmol/L EDTA， 75 mmol/L NaCl)， 混匀后依次加入 SDS 和蛋白酶 K 至终浓度分别为 0.5% 和 200 g/mL， 然后于 55水浴消化过夜。 0018 2） 加入等体积饱和苯酚、 苯酚 / 氯仿 / 异戊醇 (25:24:1)、 氯仿 / 异戊醇 (24:1) 各抽提一次。每次抽提均轻柔混合 10 分钟后， 4， 12000rpm 离心 20 分钟， 取。
16、上清。 0019 3） 将所得上清液加入 2.5 mol/L NaCl( 终浓度为 0.2 mol/L) 和预冷的 2 倍体积 的无水乙醇沉淀， 12000rpm离心20分钟取沉淀 ； 用70%乙醇漂洗2次后在室温下自然干燥， 待乙醇挥发后溶于200L的TE中， 置于4冰箱备用。 在核酸蛋白测定仪上测定其纯度及 浓度， 琼脂糖凝胶电泳检测。 0020 2. 磁珠富集法筛选云斑尖塘鳢微卫星微点 ： 1） 将云斑尖塘鳢基因组 DNA 经Bsp143四种粘末端限制性内切酶进行单酶切反应。 筛选出酶切片段主要分布在 400-1200bp 范围的酶切体系。酶切体系 ： 基因组 DNA 8g， 10buf。
17、fer 4L， 内切酶 5U， 总体积 40L。反应条件为 ： 37恒温水浴 5h， 酶切结束后 65 水浴20分钟终止反应。 取5L酶切产物琼脂糖凝胶检测。 使用Axygen公司的AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒回收酶切产物。 0021 2） 将回收的 DNA 两端接上磷酸化接头 Linker A， 接头序列为 ： Linker A 5 -GCGGTACCCGGGAAGCTTGG-3 （SEQ ID No.1） 3 -CGCCATGGGCCCTTCGAACCCTAG-p-5 （SEQ ID No.2） 接头长链粘末端 （5 端） 带磷酸根。 取酶切后回收DNA 14L， 加入Linke。
18、r A(100M)2L， 连接 buffer 2L， T4 连接酶， 总体积 20L， 16连接过夜。连接产物经 AxyPrep DNA 试剂 盒回收， 去除多余的接头， 使用 40L 洗脱液洗脱， 取 5L 电泳检测。 0022 3）剩余的洗脱液用于 Pre-PCR， 一共作 10 管 PCR， 每个反应管中加入 10Taq buffer 2L， dNTP（2mM） 1L， MgCl2（25mM） 1.5L， 引物 Primer I（10M） 1L， Taq 酶 1U， 模 板 DNA3.5L， 总体积为 20L。Primer I 的序列为 ： 5 -GCGGTACCCGGGAAGCTTGG。
19、-3 （SEQ ID No.3） 。PCR 反应为 12 个循环， 每个循环包括 ： 94变性 30s， 63退火 30s， 72延伸 60s。 反应结束后取少量预 PCR 产物琼脂糖电泳检测。剩余约 200L 反应液经 AxyPrep DNA 试剂 盒回收， 洗脱于 40L 的洗脱液中。 0023 4） 生物素探针与文库杂交， 链霉素磁珠富集及 Post-PCR ： 取全部 40L 的 DNA 洗脱液， 加 ddH2O 460L， 将反应管置于 95水浴变性 5 分钟 ； 同时将 50M 的生物素探针 说 明 书 CN 102653795 A 5 4/5 页 6 Biotin（CA） 3L 。
20、加入另一 EP 管中， 并加入 20SSC（8.8g NaCl， 4.4g 柠檬酸钠， 配置成 100mL 溶液， 调节 pH 7.2 后灭菌） 13L， 68预热， 加入完成变性步骤的 DNA 溶液并继续 68保温杂交 10 分钟， 之后放置室温冷却。生物素探针 Biotin(CA) 的序列如下 ： Biotin-5 -ATAGAATATCACACACACACACACACACACACACACACACA-3 （SEQ ID No.4） 用磁珠 ( Promega) 进行片段富集， 磁珠使用前需要洗涤 ： 轻弹管底， 悬浮磁珠， 利用磁 架 Separation Stand 收集， 弃溶液 ； 。
21、往管中加入 300L 0.5SSC， 轻弹管底混匀， 磁架收 集后弃溶液 （洗涤 3 次） ； 加入 100L 0.5SSC 并重悬磁珠待用。在洗涤完毕的磁珠管中 加入全量杂交好的 DNA 溶液， 每 1-2 分钟颠倒混匀一次， 混匀 5-10 次 ； 利用磁架收集磁珠， 吸出溶液留存 （防止磁珠失效造成实验失败， 如 Post-PCR 反应失败可用此留存溶液与新磁 珠反应） ， 使用 300L0.1SSC 洗涤磁珠， 洗涤 4 次， 最后一次尽可能吸尽溶液 ； 加入 100L ddH2O， 重悬磁珠， 95水浴 5 分钟， 利用磁架收集磁珠， 将 DNA 溶液转入新管 ； 利用真空干燥 仪或。
22、烘箱将 100LDNA 液浓缩至 20L 左右。 0024 Post-PCR 一共作 5 管， 每个反应管中加入 10Taq buffer 2L， dNTP（2mM） 1L， MgCl2（25mM） 1.5L， 引物 Primer I（10M） 1L， Taq 酶 1U， 模板 DNA 4L， 总体积为 20L。 PCR 反应为 12 个循环， 每个循环包括 ： 94变性 30s， 63退火 30s， 72延伸 60s。PCR 反 应液取少量琼脂糖电泳检测， 其余经 AxyPrep DNA 试剂盒回收， 洗脱于 40L 的洗脱液中并 使用核酸蛋白仪测量 DNA 浓度。 0025 3. 筛选在云。
23、斑尖塘鳢群体中呈单态位点 ： 1) 根据所得DNA的浓度， 调节外源DNA与T载体的比例 ： 载体DNA与插入片段摩尔数之 比范围为 1 ： 2-10。连接体系为 ： 外源 DNA 1-4L， T 载体 （0.03pmol） 1L， 连接 buffer 5L， 总体积 10L， 16连接过夜。 0026 2） 将全量 10L 连接液加入 100L DH5a 感受态细胞中， 冰上放置 30 分钟 ； 42热 激 60s 后立即冰上放置 1 分钟 ； 加入 900L LB 培养基， 37 100rpm 震荡培养 60 分钟 ； 取 100L 菌液均匀铺在含有 X-gal(40L,20mg/mL)、。
24、 IPTG（7L， 200mg/mL） 、 Amp（终浓度 60g/ mL） 的 90mL 琼脂平板上， 待液体被琼脂板完全吸收后， 37培养 12-15 小时 ； 挑取单个白色 菌落， 接种于 500L 含有 60g/mL Amp 的 LB 液体培养基中， 220rpm 振荡培养 3 小时。 0027 3） 使用 M13 和 RV-M 引物做菌液 PCR， 检测细菌克隆是否含有插入片段， 反应条件 为 10Taq buffer 1L， dNTP（2mM） 0.5L， MgCl2（25mM） 0.8L， 引物 +（10M） 0.3L， 引 物 -（10M） 0.3L， Taq 酶 0.5U， 。
25、菌液 0.5L， 总体积为 10L。PCR 反应为 25 个循环， 每个 循环包括 ： 94变性 30s， 56退火 30s， 72延伸 60s。琼脂糖凝胶电泳检测， 选取扩增片 段 400-1200bp 范围的阳性克隆做二次 PCR 筛选。 0028 M13 ： 5 -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3 （SEQ ID No.5） RV-M ： 5 -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3 （SEQ ID No.6） 4） 二次筛选采用 M13、 RV-M 引物中的一条与 PrimerII-CA 组成一对引物， 一共两个组 合 ： M13 + PrimerII。
26、-CA， RV-M + PrimerII-CA 。反应条件为 10Taq buffer 1L， dNTP （2mM） 0.5L， MgCl2（25mM） 0.8L， 引物 +（10M） 0.3L， 引物 -（10M） 0.3L， Taq 酶 0.5U， 菌液 0.5L， 总体积为 10L。PCR 反应为 25 个循环， 每个循环包括 ： 94变性 30s， 56退火 30s， 72延伸 60s。琼脂糖凝胶电泳检测， 选取出现扩增片段的对应菌液送生物公司测序。 0029 PrimerII-CA ： 5 -CACACACACACACACACACACACA-3 （SEQ ID No.7） 说 明 书。
27、 CN 102653795 A 6 5/5 页 7 5） 用 Primer 5.0 对含有微卫星位点的序列设计引物， 引物由上海捷瑞生物工程有限 公司合成。引物合成后用于云斑尖塘鳢群体 PCR 扩增。体系为 ： 10Taq buffer 2L， dNTP （2mM） 2L， MgCl2（25mM） 1.5L， 引物 +（10M） 1L， 引物 -（10M） 1L， Taq 酶 1U， 模板 DNA1L， 加灭菌双蒸水补足 20L 体系。PCR 程序为 94预变性 5min， 94变性 30sec， 退火 30sec， 72延伸 30sec， 反应 30 个循环， 最后 7延伸 5min。 00。
28、30 6） PCR 扩增产物经 8% 聚丙烯酰胺凝胶电泳， 功率 80W， 电泳 1.5h， 硝酸银染色， 相 机拍照， 筛选出在云斑尖塘鳢群体中呈单态的多对微卫星引物， 以 H13 为例， 效果如图 1 所 示。 0031 4. 用单态位点引物扩河川沙塘鳢群体 ： 用上一步筛选出来的微卫星引物对河川沙塘鳢群体进行 PCR 扩增， 反应条件和体系 与在云斑尖塘鳢群体中完全相同， 即体系为 ： 10Taq buffer 2L， dNTP（2mM） 2L， MgCl2 （25mM） 1.5L， 引物 +（10M） 1L， 引物 -（10M） 1L， Taq 酶 1U， 模板 DNA1L， 加灭菌双。
29、蒸 水补足 20L 体系。PCR 程序为 94预变性 5min， 94变性 30sec， 退火 30sec， 72延伸 30sec， 反应30个循环， 最后7延伸5min。 虽然微卫星侧翼序列具有相当的保守性， 但由于 河川沙塘鳢与云斑尖塘鳢不属于同属鱼类， 仍有部分引物无法在河川沙塘鳢群体中扩增。 0032 5. 筛选出 1 对在两个群体均能稳定扩增， 且片段大小明显不同的引物， 用于云斑 尖塘鳢和河川沙塘鳢鱼苗的鉴别 ： 将在两个群体中均有稳定扩增的PCR产物用1%琼脂糖凝 胶电泳检测， EB 染色， 筛选出条带清晰， 位置明显不同， 能够用于云斑尖塘鳢和河川沙塘鳢 鱼苗的鉴别的一对微卫星。
30、引物， 命名为 H228， 引物序列如 SEQ ID No.8 和 SEQ ID No.9 所 示。 H228微卫星标记在云斑尖塘鳢群体和河川沙塘鳢群体中的扩增结果如图2， 250bp大小 的为泰国笋壳鱼， 300bp 大小的为本地笋壳鱼。 说 明 书 CN 102653795 A 7 1/3 页 8 SEQUENCE LISTING 南京师范大学 一种泰国笋壳鱼和本地笋壳鱼鱼苗的鉴别引物和方法 9 PatentIn version 3.3 1 20 DNA 人工序列 1 gcggtacccg ggaagcttgg 20 2 24 DNA 人工序列 2 cgccatgggc ccttcgaac。
31、c ctag 24 3 20 DNA 人工序列 3 gcggtacccg ggaagcttgg 20 序 列 表 CN 102653795 A 8 2/3 页 9 4 41 DNA 人工序列 4 atagaatatc acacacacac acacacacac acacacacac a 41 5 24 DNA 人工序列 5 cgccagggtt ttcccagtca cgac 24 6 24 DNA 人工序列 6 gagcggataa caatttcaca cagg 24 7 24 DNA 人工序列 7 cacacacaca cacacacaca caca 24 8 20 序 列 表 CN 102653795 A 9 3/3 页 10 DNA 人工序列 8 tccaatcagg cagtaagcag 20 9 20 DNA 人工序列 9 gggacatcag gaccaactct 20 序 列 表 CN 102653795 A 10 1/1 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102653795 A 11 。