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1、(10)申请公布号 CN 102653797 A (43)申请公布日 2012.09.05 CN 102653797 A *CN102653797A* (21)申请号 201210170783.9 (22)申请日 2012.05.29 C12Q 1/68(2006.01) C12R 1/35(2006.01) (71)申请人 江苏省农业科学院 地址 210014 江苏省南京市钟灵街 50 号 (72)发明人 杜改梅 刘茂军 邵国青 白方方 冯志新 熊祺琰 (74)专利代理机构 南京众联专利代理有限公司 32206 代理人 周新亚 (54) 发明名称 用于检测猪鼻支原体的 LAMP 试剂盒及其制。
2、 备和使用方法 (57) 摘要 本发明属于卫生检验领域， 涉及一种用于检 测猪鼻支原体的 LAMP 试剂盒及其建立的方法和 应用。 该试剂盒主要包含由四条LAMP引物的LAMP 反应液和阳性模板及核酸染料组成。经检测验 证， 本发明试剂盒具有良好的特异性、 灵敏度， 扩 增快速、 高效， 且鉴定简便。本发明的检测体系在 60 -62等温条件下， 能快速、 方便、 高效、 高特 异、 高灵敏度地检测到猪鼻支原体， 不需要复杂仪 器， 能较好满足对猪鼻支原体的现场检测， 为兽医 安全卫生的检测提供了新的技术平台， 能较好的 满足目前对猪场养殖现场检测的迫切需要， 易于 大范围推广应用， 具有广阔的。
3、市场前景和较大的 经济、 社会效益。 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 9 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 3 页 说明书 9 页 附图 2 页 1/3 页 2 1. 一种用于检测猪鼻支原体的 LAMP 试剂盒， 其特征在于包含如下组分 ： （1） LAMP 反 应 液 ： 所 述 LAMP 反 应 液 中 的 每 24l LAMP 反 应 液 的 配 制 比 例 为 ： 10ThermoPol buffer 2.5L、 100 mM MgSO4 0.51.5l、 8M Betaine 0.52.0L、 10mM dN。
4、TPs 2 3.5L、 10M 上游引物 F3 0.25 2L、 10M 下游引物 B3 0.25 2L、 40M 内 上游引物 FIP 0.25 2L、 40M 内下游引物 BIP 0.25 2L、 8U/L Bst DNA 聚合酶大片 段 0.5 2.0L、 用灭菌 ddH2O 补至 24L ； （2） 阳性模板 ： 猪鼻支原体 pMD-18 T/P37 核酸 ； （3） 核酸染料 ： SYBR Green I。 2.如权利要求1所述的用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒， 其特征在于所述的每24l LAMP 反应液的优选配制比例为 ： 10ThermoPol buffer 2.5L、 10。
5、0 mM MgSO4 1.0l、 8M Betaine 2.0L、 10mM dNTPs 2L、 10M上游引物 F3 0.5L、 10M下游引物 B3 0.5L、 40M 内上游引物 FIP 0.5L、 40M内下游引物 BIP 0.5L、 8U/L Bst DNA聚合酶大片段1.5L、 用灭菌 ddH2O 补至 24L。 3.如权利要求1或2所述的用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒， 其特征在于所述上游 引物 F3、 下游引物 B3、 内上游引物 FIP、 内下游引物 BIP 分别为 1F3、 1B3、 1FIP、 1BIP 组成的 第一套引物， 或2F3、 2B3、 2FIP、 2BIP。
6、组成的第二套引物， 或3F3、 3B3、 3FIP、 3BIP组成的第三 套引物， 所述 1F3、 1B3、 1FIP、 1BIP 或 2F3、 2B3、 2FIP、 2BIP 或 3F3、 3B3、 3FIP、 3BIP 的序列分 别如下 ： 下表中的排序序号中的 1 4 为第一套引物， 5 8 为第二套引物， 9 12 为第三套引 物。 权 利 要 求 书 CN 102653797 A 2 2/3 页 3 4. 一种用于检测猪鼻支原体的 LAMP 试剂盒的制备方法， 其特征在于其方法的步骤如 下 ： （1） 从基因数据库检索获得猪鼻支原体特异性P37基因序列， 通过BLAST软件进行同源 。
7、性分析， 获得猪鼻支原体特异性 P37 基因序列的保守部分 DNA 序列 ； （2） 设计 LAMP 引物 ； 将所得猪鼻支原体特异性 P37 基因序列的保守部分 DNA 序列， 依 据LAMP引物设计原则筛选设计了3套上游引物F3、 下游引物B3、 内上游引物FIP、 内下游引 物BIP组成的LAMP引物， 即1F3、 1B3、 1FIP、 1BIP组成的第一套引物， 或2F3、 2B3、 2FIP、 2BIP 组成的第二套引物， 或 3F3、 3B3、 3FIP、 3BIP 组成的第三套引物 ； （3）配置 LAMP 反应液 ： 所述 LAMP 反应液中含有 ： 10ThermoPol b。
8、uffer、 MgSO4、 Betaine、 dNTPs、 上游引物 F3、 下游引物 B3、 内上游引物 FIP、 内下游引物 BIP、 Bst DNA 聚 合酶大片段和灭菌 ddH2O ； 其配制比例为 ： 每 24l LAMP 反应液中含有 ： 10ThermoPol buffer 2.5L ； 100 mM MgSO4 0.5-1.5l ； 8M Betaine 0.5-2.0L ； 10mM dNTP 2-3.5L ； 10M 上 游 引 物 F3 0.25-2L ； 10M 下 游 引 物 B3 0.25-2L ； 40M 内 上 游 引 物 FIP 0.25-2L ； 40M内下。
9、游引物 BIP 0.25-2L ； 8U/L Bst DNA聚合酶大片段0.5-2.0L ； 用灭 权 利 要 求 书 CN 102653797 A 3 3/3 页 4 菌 ddH2O 补至 24L ； 所述上游引物 F3、 下游引物 B3、 内上游引物 FIP、 内下游引物 BIP 分别为 1F3、 1B3、 1FIP、 1BIP 组成的第一套引物， 或 2F3、 2B3、 2FIP、 2BIP 组成的第二套引物， 或 3F3、 3B3、 3FIP、 3BIP 组成的第三套引物 ； （4） 制备阳性模板 ： 用第三套上游引物 3F3 和第一套下游引物 1B3 为引物， 以猪鼻支原 体基因组D。
10、NA为模板进行PCR扩增， 扩增产物克隆入pMD-18 T载体获得猪鼻支原体pMD-18 T/P37 核酸为阳性模板 ； （5） 用1F3、 1B3、 1FIP、 1BIP组成的第一套引物， 或2F3、 2B3、 2FIP、 2BIP组成的第二套引 物， 或3F3、 3B3、 3FIP、 3BIP组成的第三套引物中的任一套作为上游引物F3、 下游引物B3、 内 上游引物 FIP、 内下游引物 BIP， 与 10ThermoPol buffer、 MgSO4、 Betaine、 dNTPs、 Bst DNA 聚合酶大片段和灭菌 ddH2O 配制好 LAMP 反应液， 猪鼻支原体 pMD-18 T。
11、/P37 核酸为阳性模 板， 和商品化的SYBR Green I核酸染料组装成盒即为用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒。 5. 一种用于检测猪鼻支原体的 LAMP 试剂盒的使用方法， 其特征在于其方法的步骤如 下 ： 首次使用或间隔时间较长后首次使用检测猪鼻支原体的 LAMP 试剂盒时， 应先用试剂 盒中的阳性模板检验试剂盒中的 LAMP 反应液的有效性， 其检验方法的步骤如下 ： （1） 取试剂盒中的阳性模板即猪鼻支原体 pMD-18 T/P37 核酸 1L， 再取试剂盒中的 24L LAMP 反应液， 将 1L 阳性模板加入到 24L LAMP 反应液中， 经瞬时离心混匀得阳性模 板反应液。
12、 ； （2） 将阳性模板反应液置 60 62恒温 40min 进行 LAMP 扩增， 然后经 80 5min 进 行酶的灭活 ； 取出扩增反应管， 对阳性模板和 LAMP 反应液的有效性进行判定 ； 在确认 LAMP 反应液有效的情况下， 再对待测样品的核酸进行是否含有猪鼻支原体的 检测， 其检测方法的步骤如下 ： （1） 提取待测样品的核酸 ； （2） 取 1L 待测样品的核酸， 再取试剂盒中的 24L LAMP 反应液， 将 1L 待测样品的核 酸加入到 24L LAMP 反应液中， 经瞬时离心混匀得待测样品反应液 ； （3） 将待测样品反应液置 60 -62恒温 40min 进行 LAM。
13、P 扩增， 然后 80 5min 进行 酶的灭活 ； 取出扩增反应管， 对待测样品的核酸进行是否含有猪鼻支原体进行判定 ； 对上述的检验和检测结果的判定方法为如下方法之一或其结合 ： （1） 在扩增反应管的 LAMP 产物中加入试剂盒中的适量的核酸染料 1SYBR Green I， 根据反应液的颜色变化的结果判断为 ： 如颜色变绿说明待测样品中存在猪鼻支原体， 棕色 说明待测样品中不存在猪鼻支原体 ； （2） 或取5-8L LAMP产物进行1.5%琼脂糖电泳观察， 如观察到梯状条带则说明待测样 品中存在猪鼻支原体， 没有梯状条带则说明待测样品中不存在猪鼻支原体 ； （3） 或将 LAMP 产物。
14、进行 7000r/min 离心 5min， 观察， 如出现沉淀则说明待测样品中存 在猪鼻支原体、 没有沉淀则说明待测样品中不存在猪鼻支原体。 权 利 要 求 书 CN 102653797 A 4 1/9 页 5 用于检测猪鼻支原体的 LAMP 试剂盒及其制备和使用方法 技术领域 0001 本发明属卫生检验领域， 涉及一种用于检测猪鼻支原体的试剂盒， 特别涉及一种 用于检测猪鼻支原体的 LAMP 试剂盒及其建立方法和应用。 背景技术 0002 猪鼻支原体 （Mycoplasma hyorhinis，Mh） 是猪呼吸道的常在菌， 但病原的全身侵 害将导致多浆膜炎、 关节炎等疾病的发生。猪鼻支原体除。
15、了污染各种细胞， 引起猪病， 近年 来被发现其与人胃癌、 大肠癌有高度相关性， 已经被认为是一种新的人传染病的病原。 与猪 肺炎支原体相似， 猪鼻支原体能够黏附到猪呼吸道上部和下部有纤毛的上皮细胞上。呼吸 道内一些猪鼻支原体的菌株能够引起肺炎。 此外， 猪鼻支原体感染能够引发中耳炎， 当存在 于咽鼓管内的支原体黏附到上皮细胞的纤毛上时可能会损害黏液纤毛器官。 当其与其它细 菌， 如多杀性巴氏杆菌和化脓隐秘杆菌共同感染时， 可能会使感染上移。 呼吸道疾病的发生 多是由猪鼻支原体与呼吸道其他病原， 如猪繁殖呼吸综合征病毒 （PRRSV） 协同感引起， 偶尔 单独由猪鼻支原体感染引起。 0003 在。
16、检测方面， 国内外已建立了多种血清学检测方法， 如免疫琼扩和间接血凝等， 但 免疫琼扩和间接血凝法存在着灵敏度不高等问题。 由于缺乏简单、 快速的检测方法， 该病原 在人群中的感染情况尚不清楚。因此， 该病原检测方法的研究将是流行病学研究的关键。 0004 环介导等温扩增技术 （LAMP） 是由 T.Notomi(2000) 发明的一种新型核酸扩增 技术， 该技术依赖 4 条特异设计的引物和一种具有链置换特性的 DNA 聚合酶， 在等温条件 下可以高效、 快速、 高特异地扩增靶序列。今年来， 国外已将该技术广泛应用于病原体的检 测。Masaki Imai 等人 （2007） 利用 LAMP 建。
17、立了禽流感病毒的实验室确诊体系 ； Nobuyuki Hayashi 等人 （2007） 针对四种香酒酵母的 ITS 序列设计了 LAMP 特异性引物， 建立了高效 的 LAMP 检测体系。LAMP 还可以用于检测其他与人类相关的病毒， 如病毒性出血性败血症 （VHS） 、 巨细胞病毒 （CMV） 、 造血组织坏死病毒 （IHHNV） 、 番茄黄化曲叶病毒等。LAMP 还可以 用于对动物早期胚胎性别鉴定等。目前国内外均未见有用于检测猪鼻支原体的 LAMP 试剂 盒及在猪鼻支原体检测中的应用。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种使用方便、 敏感度高、 鉴定简便的用于检测猪鼻支原 体的 。
18、LAMP 试剂盒。 0006 本发明的另一个目的是为检测猪鼻支原体的 LAMP 试剂盒提供一种使用方便、 敏 感度高、 鉴定简便的检测猪鼻支原体的 LAMP 试剂盒的制备方法。 0007 本发明的再一个目的是为检测猪鼻支原体的 LAMP 试剂盒提供一种正确的使用方 法。 0008 本发明的主要目的所述的用于检测猪鼻支原体的 LAMP 试剂盒， 其结构主要由 LAMP 反应液、 阳性模板和核酸染料组成， 具体如下所述 ： 说 明 书 CN 102653797 A 5 2/9 页 6 （1） LAMP 反 应 液 ： 所 述 LAMP 反 应 液 中 的 每 24l LAMP 反 应 液 的 配 。
19、制 比 例 为 ： 10ThermoPol buffer 2.5L、 100 mM MgSO4 0.51.5l、 8M Betaine 0.52.0L、 10mM dNTPs 2 3.5L、 10M 上游引物 F3 0.25 2L、 10M 下游引物 B3 0.25 2L、 40M 内 上游引物 FIP 0.25 2L、 40M 内下游引物 BIP 0.25 2L、 8U/L Bst DNA 聚合酶大片 段 0.5 2.0L、 用灭菌 ddH2O 补至 24L ； （2） 阳性模板 ： 猪鼻支原体 pMD-18 T/P37 核酸 ； （3） 核酸染料 ： SYBR Green I。 0009 。
20、如上所述的每 24l LAMP 反应液的优选配制比例为 ： 10ThermoPol buffer 2.5L、 100 mM MgSO4 1.0l、 8M Betaine 2.0L、 10mM dNTPs 2L、 10M上游引物 F3 0.5L、 10M下游引物 B3 0.5L、 40M内上游引物 FIP 0.5L、 40M内下游引物 BIP 0.5L、 8U/L Bst DNA 聚合酶大片段 1.5L、 用灭菌 ddH2O 补至 24L ； 上述的上游引物 F3、 下游引物 B3、 内上游引物 FIP、 内下游引物 BIP 分别为 1F3、 1B3、 1FIP、 1BIP 组成的第一套引物， 。
21、或 2F3、 2B3、 2FIP、 2BIP 组成的第二套引物， 或 3F3、 3B3、 3FIP、 3BIP 组成的第三套引物， 所述 1F3、 1B3、 1FIP、 1BIP 或 2F3、 2B3、 2FIP、 2BIP 或 3F3、 3B3、 3FIP、 3BIP 的序列分别如下 ： 下表中的排序序号中的 1 4 为第一套引物， 5 8 为第二套引物， 9 12 为第三套引 物。 0010 本发明的另一个目的是提供一种用于检测猪鼻支原体的 LAMP 试剂盒的制备方法， 其 方法的步骤如下 ： （1） 从基因数据库检索获得猪鼻支原体特异性P37基因序列， 通过BLAST软件进行同源 性分析。
22、， 获得猪鼻支原体特异性 P37 基因序列的保守部分 DNA 序列 ； 说 明 书 CN 102653797 A 6 3/9 页 7 （2） 设计 LAMP 引物 ； 将所得猪鼻支原体特异性 P37 基因序列的保守部分 DNA 序列， 依 据LAMP引物设计原则筛选设计了3套上游引物F3、 下游引物B3、 内上游引物FIP、 内下游引 物BIP组成的LAMP引物， 即1F3、 1B3、 1FIP、 1BIP组成的第一套引物， 或2F3、 2B3、 2FIP、 2BIP 组成的第二套引物， 或 3F3、 3B3、 3FIP、 3BIP 组成的第三套引物 ； （3）配置 LAMP 反应液 ： 所述。
23、 LAMP 反应液中含有 ： 10ThermoPol buffer、 MgSO4、 Betaine、 dNTPs、 上游引物 F3、 下游引物 B3、 内上游引物 FIP、 内下游引物 BIP、 Bst DNA 聚 合酶大片段和灭菌 ddH2O ； 其配制比例为 ： 每 24l LAMP 反应液中含有 ： 10ThermoPol buffer 2.5L ； 100 mM MgSO4 0.5-1.5l ； 8M Betaine 0.5-2.0L ； 10mM dNTP 2-3.5L ； 10M 上 游 引 物 F3 0.25-2L ； 10M 下 游 引 物 B3 0.25-2L ； 40M 内。
24、 上 游 引 物 FIP 0.25-2L ； 40M内下游引物 BIP 0.25-2L ； 8U/L Bst DNA聚合酶大片段0.5-2.0L ； 用灭 菌 ddH2O 补至 24L ； 所述上游引物 F3、 下游引物 B3、 内上游引物 FIP、 内下游引物 BIP 分别为 1F3、 1B3、 1FIP、 1BIP 组成的第一套引物， 或 2F3、 2B3、 2FIP、 2BIP 组成的第二套引物， 或 3F3、 3B3、 3FIP、 3BIP 组成的第三套引物 ； （4） 制备阳性模板 ： 用第三套上游引物 3F3 和第一套下游引物 1B3 为引物， 以猪鼻支原 体基因组DNA为模板进行。
25、PCR扩增， 扩增产物克隆入pMD-18 T载体获得猪鼻支原体pMD-18 T/P37 核酸为阳性模板 ； （5） 用1F3、 1B3、 1FIP、 1BIP组成的第一套引物， 或2F3、 2B3、 2FIP、 2BIP组成的第二套引 物， 或3F3、 3B3、 3FIP、 3BIP组成的第三套引物中的任一套作为上游引物F3、 下游引物B3、 内 上游引物 FIP、 内下游引物 BIP， 与 10ThermoPol buffer、 MgSO4、 Betaine、 dNTPs、 Bst DNA 聚合酶大片段和灭菌 ddH2O 配制好 LAMP 反应液， 猪鼻支原体 pMD-18 T/P37 核酸。
26、为阳性模 板， 和商品化的SYBR Green I核酸染料组装成盒即为用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒。 0011 本发明的再一个目的是为用于检测猪鼻支原体的 LAMP 试剂盒提供一种正确的使 用方法， 其具体步骤如下 ： 首次使用或间隔时间较长后首次使用检测猪鼻支原体的 LAMP 试剂盒时， 应先用试剂 盒中的阳性模板检验试剂盒中的 LAMP 反应液的有效性， 其检验方法的步骤如下 ： （1） 取试剂盒中的阳性模板即猪鼻支原体 pMD-18 T/P37 核酸 1L， 再取试剂盒中的 24L LAMP 反应液， 将 1L 阳性模板加入到 24L LAMP 反应液中， 经瞬时离心混匀得阳性模 。
27、板反应液 ； （2） 将阳性模板反应液置 60 62恒温 40min 进行 LAMP 扩增， 然后经 80 5min 进 行酶的灭活 ； 取出扩增反应管， 对阳性模板和 LAMP 反应液的有效性进行判定 ； 在确认 LAMP 反应液有效的情况下， 再对待测样品的核酸进行是否含有猪鼻支原体的 检测， 其检测方法的步骤如下 ： （1） 提取待测样品的核酸 ； （2） 取 1L 待测样品的核酸， 再取试剂盒中的 24L LAMP 反应液， 将 1L 待测样品的核 酸加入到 24L LAMP 反应液中， 经瞬时离心混匀得待测样品反应液 ； （3） 将待测样品反应液置 60 -62恒温 40min 进行。
28、 LAMP 扩增， 然后 80 5min 进行 酶的灭活 ； 取出扩增反应管， 对待测样品的核酸进行是否含有猪鼻支原体进行判定 ； 对上述的检验和检测结果的判定方法为如下方法之一或其结合 ： 说 明 书 CN 102653797 A 7 4/9 页 8 （1） 在扩增反应管的 LAMP 产物中加入试剂盒中的适量的核酸染料 1SYBR Green I， 根据反应液的颜色变化的结果判断为 ： 如颜色变绿说明待测样品中存在猪鼻支原体， 棕色 说明待测样品中不存在猪鼻支原体 ； （2） 或取5-8L LAMP产物进行1.5%琼脂糖电泳观察， 如观察到梯状条带则说明待测样 品中存在猪鼻支原体， 没有梯状。
29、条带则说明待测样品中不存在猪鼻支原体 ； （3） 或将 LAMP 产物进行 7000r/min 离心 5min， 观察， 如出现沉淀则说明待测样品中存 在猪鼻支原体、 没有沉淀则说明待测样品中不存在猪鼻支原体。 0012 本发明具有下列突出的优点 ： 1） 高特异性 ： 4 条引物对靶序列 6 个特异区域的识别保证了 LAMP 扩增的高度特异性， 即 LAMP 能从相差仅一个核苷酸的基因标本中， 找出相应的靶序列进行扩增 （图 2） 。 0013 2） 高敏感度 ： LAMP 灵敏度比 PCR 高， 灵敏度可达 10 拷贝 （图 3 和图 4） 。 0014 3） 鉴定简便 ： 扩增反应结束后。
30、， 加入 SYBR Green I 肉眼就可以根据反应液的颜色 变化初步判断结果 ： 绿色说明待测样品中存在猪鼻支原体， 橙色则说明待测样品中不存在 猪鼻支原体。 0015 4） 操作简单 ： 用 LAMP 试剂盒， 只要将检测样品 （待测核酸） 和试剂混合后一起放入 60 -62水浴锅 40min， 然后放入 80的水浴锅 5 分钟就可以利用观察、 离心和琼脂糖电 泳等简单方法判定结果。 0016 本发明的检测体系可以在等温条件下， 快速、 方便、 高效、 高特异性、 高灵敏度地检 测到猪鼻支原体， 不需要复杂仪器， 为公共卫生的检测提供了新的技术平台， 能较好的满足 目前对医学临床和兽医临。
31、床等的现场检测的迫切需要， 易于大范围推广应用， 具有广阔的 市场前景和较大的经济、 社会效益。 附图说明 0017 图 1 为本发明所述试剂盒的构建及使用方法示意图。 0018 图 2 为猪鼻支原体 LAMP 检测体系的特异性检测结果电泳图 : 其中， M.DNA Marker ； 1 泳道为阴性对照 ； 2 泳道为猪鼻支原体质粒 ； 3-12 泳道分别为 ： 副猪嗜血杆菌DNA、 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌DNA模板、 猪链球菌DNA模板、 多杀性巴氏杆 菌 DNA 模板、 鸡毒支原体 DNA 模板、 猪肺炎支原体 DNA 模板、 絮状支原体 DNA 模板、 蓝耳病毒 cDNA 模板、 圆环。
32、病毒 DNA 模板、 猪瘟病毒 cDNA 模板。 0019 图 3 和图 4 为猪鼻支原体 LAMP 检测体系的敏感度验证电泳图 : 图 3 中， M.DNA Marker ； 1-6 泳道分别为以 1012、 1010、 108、 106、 104、 102稀释度的猪鼻支 原体质粒 ； 7 泳道为猪鼻支原体 DNA ； 8 泳道为阴性对照 ； 9 泳道为 DNA Marker。 0020 图 4 中， M.DNA Marker ； 1 泳道为猪鼻支原体 DNA ； 2-8 泳道分别为以 1011、 109、 107、 105、 103、 101、 100拷贝的猪鼻支原体质粒 ； 9 泳道为阴。
33、性对照 ； M 泳道为 DNA Marker。 具体实施方式 0021 本发明所述试剂盒的构建及使用方法如图 1 所示。具体的构建和使用方法如下 ： 实施例 1 1. 特异性 DNA 序列查找 说 明 书 CN 102653797 A 8 5/9 页 9 从 GenBank 数据库检索获得多株猪鼻支原体基因租序列， 通过 BLAST 软件进行同源性 分析即找到特异性的保守靶序列进行 LAMP 引物设计。 0022 2.LAMP 引物设计 通过专门的 LAMP 引物设计软件 Primer design 4.0 （http:/primerexlorer.jp; Eiken Chemical Co.。
34、 Ltd, Janpan） 和 Primer Premier 6.0 设计引物， 设计的具体引物见 下表 （3 套引物， 每套 4 条， 排序序列 1-4 为第一套， 5-8 为第二套， 9-12 为第三套） 。 0023 3. 猪鼻支原体 pMD-18 T/P37 基因重组质粒构建 用上述的第三套引物中的上游引物 3F3 和第一套引物中的下游引物 1B3 为引物， 以猪 鼻支原体基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增， 猪鼻支原体基因组 DNA 可用常用的猪鼻支原体 CVCC 361 菌株进行提取， 扩增产物克隆入 pMD-18 T 载体， 提取质粒经 LAMP 鉴定阳性， 即可 作为阳性。
35、模板。 0024 4. 建立检测体系 主要由 LAMP 反应液、 阳性模板和核酸染料组成， 具体如下所述 ： （1） 调配 LAMP 反应液 ： 所述 LAMP 反应液中的每 24l LAMP 反应液的配制比例举例如 下 ： 10ThermoPol buffer 2.5L、 100 mM MgSO4 0.5l、 8M Betaine 0.5L、 10mM dNTPs 2L、 10M 上游引物 F3 L、 10M 下游引物 B3 0.25L、 40M 内上游引物 FIP 0.25L、 40M 内下游引物 BIP 0.25L、 8U/L Bst DNA 聚合酶大片段 0.5L、 用灭菌 ddH2O。
36、 补至 24L ； 或 ： 10ThermoPol buffer 2.5L、 100 mM MgSO4 1.5l、 8M Betaine 2.0L、 10mM dNTPs 3.5L、 10M 上游引物 F3 2L、 10M 下游引物 B3 2L、 40M 内上游引物 FIP 2L、 说 明 书 CN 102653797 A 9 6/9 页 10 40M 内下游引物 BIP 2L、 8U/L Bst DNA 聚合酶大片段 2.0L、 用灭菌 ddH2O 补至 24L ； 或 ： 10ThermoPol buffer 2.5L、 100 mM MgSO4 1.0l、 8M Betaine 1.0L。
37、、 10mM dNTPs 3L、 10M上游引物 F3 1L、 10M下游引物 B3 1L、 40M内上游引物 FIP 1L、 40M 内下游引物 BIP 1L、 8U/L Bst DNA 聚合酶大片段 1L、 用灭菌 ddH2O 补至 24L ； 或 ： 10ThermoPol buffer 2.5L、 100 mM MgSO4 0.5l、 8M Betaine 0.5L、 10mM dNTPs 2L、 10M上游引物 F3 2L、 10M下游引物 B3 2L、 40M内上游引物 FIP 2L、 40M 内下游引物 BIP 2L、 8U/L Bst DNA 聚合酶大片段 2.0L、 用灭菌 。
38、ddH2O 补至 24L ； 或 ： 10ThermoPol buffer 2.5L、 100 mM MgSO4 1.5l、 8M Betaine 2.0L、 10mM dNTPs 3.5L、 10M 上游引物 F3 0.25L、 10M 下游引物 B3 0.25L、 40M 内上游引物 FIP 0.25L、 40M 内下游引物 BIP 0.25L、 8U/L Bst DNA 聚合酶大片段 0.5L、 用灭菌 ddH2O 补至 24L ； 或 ： 10ThermoPol buffer 2.5L、 100 mM MgSO4 1.5l、 8M Betaine 2.0L、 10mM dNTPs 3.。
39、5L、 10M 上游引物 F3 1L、 10M 下游引物 B3 1L、 40M 内上游引物 FIP 1L、 40M 内下游引物 BIP 1L、 8U/L Bst DNA 聚合酶大片段 1.0L、 用灭菌 ddH2O 补至 24L ； 或 ： 10ThermoPol buffer 2.5L、 100 mM MgSO4 1.0l、 8M Betaine 2.0L、 10mM dNTPs 2L、 10M 上游引物 F3 0.5L、 10M 下游引物 B3 0.5L、 40M 内上游引物 FIP 0.5L、 40M 内下游引物 BIP 0.5L、 8U/L Bst DNA 聚合酶大片段 1.5L、 用。
40、灭菌 ddH2O 补 至 24L ； 或 ： 10ThermoPol buffer 2.5L、 100 mM MgSO4 1.5l、 8M Betaine 0.5L、 10mM dNTPs 2L、 10M 上游引物 F3 0.5L、 10M 下游引物 B3 0.5L、 40M 内上游引物 FIP 0.5L、 40M 内下游引物 BIP 0.5L、 8U/L Bst DNA 聚合酶大片段 2.0L、 用灭菌 ddH2O 补 至 24L ； 或 ： 10ThermoPol buffer 2.5L、 100 mM MgSO4 1.5l、 8M Betaine 0.5L、 10mM dNTPs 3.5。
41、L、 10M 上游引物 F3 0.5L、 10M 下游引物 B3 0.5L、 40M 内上游引物 FIP 0.5L、 40M 内下游引物 BIP 0.5L、 8U/L Bst DNA 聚合酶大片段 0.5L、 用灭菌 ddH2O 补 至 24L ； 总之 ： 在 10ThermoPol buffer 2.5L、 100 mM MgSO4 0.5 1.5l、 8M Betaine 0.5 2.0L、 10mM dNTPs 2 3.5L、 10M 上游引物 F3 0.25 2L、 10M 下游引物 B3 0.25 2L、 40M 内上游引物 FIP 0.25 2L、 40M 内下游引物 BIP 0。
42、.25 2L、 8U/L Bst DNA 聚合酶大片段 0.5 2.0L 范围内均可调配， 最后用灭菌 ddH2O 补至 24L 即可。 0025 （2） 以猪鼻支原体 pMD-18 T/P37 核酸基因重组质粒为阳性模板 ； （3） 选用 SYBR Green I 作核酸染料。 0026 5. 分析检测体系的灵敏性、 特异性 其检测程序为 ： （1） 取试剂盒中的阳性模板即猪鼻支原体 pMD-18 T/P37 核酸 1L， 再取试剂盒中的 24L LAMP 反应液， 将 1L 阳性模板加入到 24L LAMP 反应液中， 经瞬时离心混匀得阳性模 板反应液 ； （2） 将阳性模板反应液置 60。
43、 62恒温 40min 进行 LAMP 扩增， 然后经 80 5min 进 行酶的灭活 ； 取出扩增反应管， 对阳性模板和 LAMP 反应液的有效性进行判定 ； 说 明 书 CN 102653797 A 10 7/9 页 11 在确认 LAMP 反应液有效的情况下， 再对待测样品的核酸进行是否含有猪鼻支原体的 检测， 其检测方法的步骤如下 ： （1） 提取待测样品的核酸 ； （2） 取 1L 待测样品的核酸， 再取试剂盒中的 24L LAMP 反应液， 将 1L 待测样品的核 酸加入到 24L LAMP 反应液中， 经瞬时离心混匀得待测样品反应液 ； （3） 将待测样品反应液置 60 -62恒。
44、温 40min 进行 LAMP 扩增， 然后 80 5min 进行 酶的灭活 ； 取出扩增反应管， 对待测样品的核酸进行是否含有猪鼻支原体进行判定 ； 对上述的检验和检测结果的判定方法为如下方法之一或其结合 ： （1） 在扩增反应管的 LAMP 产物中加入试剂盒中的适量的核酸染料 1SYBR Green I， 根据反应液的颜色变化的结果判断为 ： 如颜色变绿说明待测样品中存在猪鼻支原体， 棕色 说明待测样品中不存在猪鼻支原体 ； （2） 或取5-8L LAMP产物进行1.5%琼脂糖电泳观察， 如观察到梯状条带则说明待测样 品中存在猪鼻支原体， 没有梯状条带则说明待测样品中不存在猪鼻支原体 ； 。
45、（3） 或将 LAMP 产物进行 7000r/min 离心 5min， 观察， 如出现沉淀则说明待测样品中存 在猪鼻支原体、 没有沉淀则说明待测样品中不存在猪鼻支原体。 0027 本发明的用于检测猪鼻支原体的 LAMP 试剂盒， 以副猪嗜血杆菌、 猪传染性胸膜肺 炎放线杆菌、 猪链球菌、 多杀性巴氏杆菌、 鸡毒支原体、 猪肺炎支原体、 絮状支原体、 蓝耳病 毒、 猪圆环病毒、 猪瘟病毒等十种与猪鼻支原体相近的细菌、 病毒的DNA或cDNA为模板检测 体系的特异性， 由图 2 结果显示。本发明方法只能扩增猪鼻支原体而不能检测到其他非目 标细菌、 病毒的 DNA 或 cDNA， 证实所建立的 LA。
46、MP 具有良好的特异性 ； 以 1012、 1011100拷 贝的猪鼻支原体为模板进行 LAMP 敏感性试验， 由图 3 和图 4 结果显示， 本发明的 LAMP 检测 试剂盒的灵敏度为 101拷贝， 证实所建立的 LAMP 具有良好的灵敏度 ； 比较 LAMP 检测方法与 套式 PCR 检测方法的符合率， 用 LAMP 检测方法将 23 份临床样品进行检测， 同时与套式 PCR 检测结果相比较， 结果表明 LAMP 检测阳性符合率为 100%。 0028 序列表 ： SEQUENCE LISTING 江苏省农业科学院 用于检测猪鼻支原体的 LAMP 试剂盒及其制备方法 说明书 00 2012。
47、-04-09 12 PatentIn version 3.5 1 25 DNA 人工合成 1 说 明 书 CN 102653797 A 11 8/9 页 12 cttctttgtt aacttcttta tctcc 25 2 23 DNA 人工合成 2 ttttaaagct atctctgtca caa 23 3 44 DNA 人工合成 3 aggatgtatc agttagtcaa ggtcaaccaa gcttctgaaa cacc 44 4 45 DNA 人工合成 4 catgatatag caaatgctat tggcggaggt agcttttttg ctcaa 45 5 20 DNA 人工合成 5 aaacactcca acatcatacg 20 6 18 DNA 人工合成 6 cgcacatcca aacgcata 18 7 50 DNA 人工合成 7 tcagcaacaa aaccttttga aactagaatt ggattagtta ctataagtgc 50 8 46 说 明 书 CN 102653797 A 12 9/9 页 13 DNA 人工合成 8 gttatgtgtt caagcaaaag aacctctgca gatacattgg gaactt 46 9 24 DNA 人工合成 9 ggttaacact ttttctaaac actc 24。