与结核分枝杆菌 β clamp 有高亲和力的多肽 背景技术 ：
结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis) 是一类非常重要的人类病原体。 属 于放线菌目分枝杆菌科分枝杆菌属， 是一种抗酸革兰氏阳性菌。 它可侵犯全身各器官， 尤其 是肺部， 导致肺结核。结核病是一个重大的健康问题， 尤其是亚洲和非洲。目前， 结核病是 全球传染病中造成成人死亡的第二大元凶。 鉴于全球化、 跨国移民和旅游的上升趋势， 所有 国家都是耐多药结核病疫情的可能发生地。 因为结核菌的分裂周期长， 生长繁殖缓慢， 杀灭 很困难。现在常规的治疗方法需要花六到九个月。
结核分枝杆菌中最广泛存在的 H37Rv 菌株的全基因组含有 4,411,529 对碱基。其 中有生物功能的基因约 4000 个。其中 polymeraseIII 的 β 亚基， 也称为 βclamp， 是一个 环绕 DNA 的环形结构， 它可以结合聚合酶的 clamp loader， 也可以结合 polymerase 的核心 酶。 它们环绕到 DNA 上后， 会高速的滑动， 并带动结合在上面的 polymerase 核心酶沿着 DNA 高速运动， 从而使复制可以快速的进行， 是 DNA 复制的关键因子。因此寻找与 βclamp 结合 的多肽以阻止结核分枝杆菌的基因组 DNA 复制， 是结核分枝杆菌防治的一项新策略。
表面等离子共振 (surface plasmon resonance， SPR) 技术是目前国际上广泛用于 研究两种分子相互作用的手段。这种方法检测生物分子的相互作用时， 无需对生物分子进 行标记， 只需将一种生物分子固定在传感器芯片表面， 将与之相互作用的分子的溶液流过 芯片表面， 就可以检测两种分子的结合、 解离全过程。这种方法适用于多种生物体系， 包括 小分子化合物、 多肽、 蛋白质、 寡核苷酸、 寡聚糖、 病毒、 细胞等等。
目前的研究认为保守的 LF 氨基酸残基是与 βclamp 蛋白相互作用的关键位点。 发明内容 ：
本发明利用 SPR 技术研究了来源于结核分枝杆菌 H37Rv 菌株的 βclamp 蛋白 与多种多肽之间的相互作用， 得到了一段与 βclamp 蛋白有高亲和力的多肽， 其序列为 ： GTKKAEALGQFDLFGS(SEQ IDNO ： 1)， 其与 βclamp 蛋白的 KD 值为 16.0μM， 其中 GTKKAEA 是一 段 α 螺旋， LF 是传统认为对于结合 βclamp 蛋白很重要的保守氨基酸。本发明在找到了 与 βclamp 蛋白有高亲和力的多肽后， 比较了保守 LF 氨基酸 N 端有 α 螺旋的多肽与 LF 氨 基酸前没有完整 α 螺旋的多肽， 发现完整的 α 螺旋的存在能明显提高多肽与 βclamp 蛋 白的亲和力， 因此这个 LF 氨基酸 N 端的完整 α 螺旋结构对于多肽与 βclamp 蛋白的结合 非常重要。
在本发明中提供下列 ：
1、 一种能与结核分枝杆菌 DNA 聚合酶持续合成因子 βclamp 有高亲和力的低分子 量多肽序列， 其特征在于它是由一段 N- 端 α 螺旋结构和保守的 LF 氨基酸组成。
2、 1 所述的多肽序列， 其中所述 α 螺旋为 GTKKAEA 序列。
3、 1 所述的多肽序列， 其针对的 βclamp 蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID NO ： 2 所示 的氨基酸序列。
4、 1 所述的多肽序列， 其氨基酸序列为 GTKKAEALGQFDLFGS(SEQ ID NO ： 1)。5、 4 所述的多肽序列， 其与 βclamp 蛋白的 KD 值为 16.0μM。 6、 权利要求 1-5 中任一项所述的多肽序列在制备抗结核分枝杆菌治疗药物中的用途。 7、 权利要求 6 的用途， 其中所述结核分枝杆菌为 H37Rv 菌株。
附图简述 ：
图 1 是结核分枝杆菌 H37Rv 的 DNA 聚合酶持续合成因子 βclamp 的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 2)。它的 NCBIAccession No. 为 ： NP_214516。对应的基因名称为 dnaN。
图2： 多肽 1、 多肽 2、 多肽 3 与 βclamp 蛋白相互作用的 SPR 分析结果。
图3： 多肽 1 与 βclamp 蛋白相互作用的 KD 值分析。
具体实施方式
实施例 1
本发明提供上述多肽的实验方法 ：
1、 结核分枝杆菌 H37Rv 的 βclamp 蛋白的表达和纯化。
结 核 分 枝 杆 菌 βclamp 蛋 白 的 全 长 基 因 dnaN(SEQ ID NO ： 2) 被 克 隆 在 载 体 pQE30( 购于 Qiagen 公司 ) 上， 使用大肠杆菌表达菌株 BL21( 购于 Merck 公司 ) 表达。
挑取单克隆， 在含 50μg/ml Amp 的 5ml LB 中 37℃振摇过夜后， 取 2ml 接种到含 50μg/ml Amp 的 200ml LB 中摇至 OD600 约为 0.6， 再转接至 8 瓶含 50μg/ml Amp 的 750ml LB 中摇至 OD600 约为 0.6， 加入终浓度为 0.4mM 的 IPTG， 16℃诱导 18h， 离心收集菌体。
将 收 集 的 菌 体 超 声 破 碎， 4 ℃ 16000rpm 离 心 30min，取 上 清 过 用 loadingbuffer(20mM Tris-Cl pH7.9， 500mM NaCl， 5mM 咪 唑 ) 平 衡 好 的 Ni-NTA 柱， 用 loading buffer 继 续 冲 洗， 直 到 紫 外 检 测 仪 上 面 的 OD280 走 平 为 止。 然 后 用 wash buffer(20mM Tris-Cl pH7.9， 500mM NaCl， 100mM 咪 唑 ) 洗 杂 蛋 白，最 后 用 elution buffer(20mM Tris-Cl pH7.9， 500mM NaCl， 250mM 咪唑 ) 洗脱目的蛋白。
将得到的 βclamp 蛋白超滤浓缩， 换至低盐 buffer(20mM Tris-Cl pH7.9， 20mM NaCl)， 过 HitrapQ 预装柱 (GE healthcare)， 高盐 buffer 为 ： 20mMTris-Cl pH7.9， 1M NaCl。 收集主峰， 超滤浓缩。以同样的条件过 MonoQ 预装柱 (GE healthcare)。
将 得 到 的 蛋 白 超 滤 浓 缩， 换 至 凝 胶 过 滤 层 析 buffer(20mM Tris-Cl pH7.9， 100mMNaCl)， 过 Superdex 200 10/300GL 柱， 收 集 主 峰， 浓 缩 至 约 3mg/ml， 液 氮 速 冻， 存 -80℃冰箱。
2、 多肽的合成。
合成下列三种多肽并在其 N 端连接上 biotin 标记 ( 由上海强耀生物科技有限公 司合成并标记 )。
1) 多肽序列 ： GTKKAEALGQFDLFGS(SEQ ID NO ： 1)， 其中 GTKKAEA 为 α 螺旋 ；
2) 多肽序列 1) 的截短体 ： LGQFDLFGS(SEQ ID NO ： 3)， 含有 LF 保守氨基酸， 不含有 完整的 α 螺旋 ；
3) 随机序列 ： LMGDLKELLGPGCLGS(SEQ ID NO ： 4)， 其中 LMGDLKE 为 α 螺旋。
3、 SPR 实验分析多肽与结核分枝杆菌 βclamp 蛋白的亲和力。
使用 GE 公司的 Biocore 3000 仪器进行 SPR 实验分析。当光线从高折射率的介质进入低折射率的介质时， 一部分光线会在接触面上被反射。当入射角大于临界角的时候， 光线会发生全反射。但是， 当玻璃的表面覆盖一层薄的惰性金属膜 ( 如金 ) 时， 金属膜表 面的等离子体 (plasma) 发生振动， 一部分光会 “损失” 在金属膜上。当入射光的波矢量与 表面等离子体振子的频率一致的时候， 电子发生 “共振” ， 这种现象被称为表面等离子共振 (surface plasmon resonance)。 当反射光的强度达到最小值时的入射角， 被称为表面等离 子共振角 (θspr， surface plasmon resonance angle)。 SPR 随金属膜表面介质的折射率变 化而变化， 而折射率的变化则与结合在金属表面的分子质量成正比。 因此， 我们可以通过观 察表面等离子共振角， 来分析生物分子之间的相互作用。结果描绘为 RU(resonance unit) 对时间的图。
将结核分枝杆菌 βclamp 蛋白和上述三种合成的多肽 (SEQ ID NO ： 1、 SEQ ID NO ： 3 和 SEQ ID NO ： 4) 溶解在 buffer(20mM Tris-Cl pH7.5， 150mMNaCl， 1mM EDTA， 0.005 ％ 表面活性剂 P20)( 多肽的浓度约为 30nM) 中， 将上述三种多肽固定 ( 三种多肽各自的固 定量约为 600RU) 在 SA 芯片 ( 购于 GE 公司 ) 上， 使 βclamp 蛋白 ( 终浓度为 4μM) 流 过所述 SA 芯片， 测量其响应值 (RU)。结果见图 2。在图 2 中， 三条曲线依次表示多肽 序列 GTKKAEALGQFDLFGS(SEQ ID NO ： 1)、 多肽序列 LGQFDLFGS(SEQ ID NO ： 3)、 随机序列 LMGDLKELLGPGCLGS(SEQ ID NO ： 4) 与结核分枝杆菌 βclamp 蛋白相互作用的 SPR 响应值曲 线。由此， 得到亲和力最高的多肽序列为 ： GTKKAEALGQFDLFGS。 使 不 同 浓 度 的 结 核 分 枝 杆 菌 βclamp 蛋 白 (0， 1μM， 2μM， 4μM， 8μM， 16μM， 32μM， 64μM) 分别流过固定了多肽序列 ： GTKKAEALGQFDLFGS 的 SA 芯片 ( 购自 GE 公司 )( 固 定量约为 600RU)， 见图 3a， 用软件 Bioevaluation 分析其动力学常数， 得到 βclamp 蛋白与 该多肽的 KD 值为 16.0μM， 见图 3b。
鉴于结核分枝杆菌 βclamp 蛋白是结核分枝杆菌 DNA 复制系统的关键因子， DNA 聚合酶的核心酶只有与 βclamp 蛋白结合以后， 才能被 βclamp 蛋白带动， 在 DNA 上高速滑 动， 从而催化 DNA 的快速复制。因此， 多肽 GTKKAEALGQFDLFGS 与 βclamp 蛋白的高效结合 将阻止结核分枝杆菌的基因组 DNA 复制， 从而起到抑制结核杆菌的作用。此外， 相对于其它 结合于 βclamp 蛋白的多肽而言， 多肽 GTKKAEALGQFDLFGS 作为一种小分子量多肽， 价格上 比较经济， 而且由于分子量小， 比较容易将其传递到靶标， 从而提高抑制效率。
结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis) 是一类非常重要的人类病原体。 属 于放线菌目分枝杆菌科分枝杆菌属， 是一种抗酸革兰氏阳性菌。 它可侵犯全身各器官， 尤其 是肺部， 导致肺结核。结核病是一个重大的健康问题， 尤其是亚洲和非洲。目前， 结核病是 全球传染病中造成成人死亡的第二大元凶。 鉴于全球化、 跨国移民和旅游的上升趋势， 所有 国家都是耐多药结核病疫情的可能发生地。 因为结核菌的分裂周期长， 生长繁殖缓慢， 杀灭 很困难。现在常规的治疗方法需要花六到九个月。
结核分枝杆菌中最广泛存在的 H37Rv 菌株的全基因组含有 4,411,529 对碱基。其 中有生物功能的基因约 4000 个。其中 polymeraseIII 的 β 亚基， 也称为 βclamp， 是一个 环绕 DNA 的环形结构， 它可以结合聚合酶的 clamp loader， 也可以结合 polymerase 的核心 酶。 它们环绕到 DNA 上后， 会高速的滑动， 并带动结合在上面的 polymerase 核心酶沿着 DNA 高速运动， 从而使复制可以快速的进行， 是 DNA 复制的关键因子。因此寻找与 βclamp 结合 的多肽以阻止结核分枝杆菌的基因组 DNA 复制， 是结核分枝杆菌防治的一项新策略。
表面等离子共振 (surface plasmon resonance， SPR) 技术是目前国际上广泛用于 研究两种分子相互作用的手段。这种方法检测生物分子的相互作用时， 无需对生物分子进 行标记， 只需将一种生物分子固定在传感器芯片表面， 将与之相互作用的分子的溶液流过 芯片表面， 就可以检测两种分子的结合、 解离全过程。这种方法适用于多种生物体系， 包括 小分子化合物、 多肽、 蛋白质、 寡核苷酸、 寡聚糖、 病毒、 细胞等等。
目前的研究认为保守的 LF 氨基酸残基是与 βclamp 蛋白相互作用的关键位点。 发明内容 ：
本发明利用 SPR 技术研究了来源于结核分枝杆菌 H37Rv 菌株的 βclamp 蛋白 与多种多肽之间的相互作用， 得到了一段与 βclamp 蛋白有高亲和力的多肽， 其序列为 ： GTKKAEALGQFDLFGS(SEQ IDNO ： 1)， 其与 βclamp 蛋白的 KD 值为 16.0μM， 其中 GTKKAEA 是一 段 α 螺旋， LF 是传统认为对于结合 βclamp 蛋白很重要的保守氨基酸。本发明在找到了 与 βclamp 蛋白有高亲和力的多肽后， 比较了保守 LF 氨基酸 N 端有 α 螺旋的多肽与 LF 氨 基酸前没有完整 α 螺旋的多肽， 发现完整的 α 螺旋的存在能明显提高多肽与 βclamp 蛋 白的亲和力， 因此这个 LF 氨基酸 N 端的完整 α 螺旋结构对于多肽与 βclamp 蛋白的结合 非常重要。
在本发明中提供下列 ：
1、 一种能与结核分枝杆菌 DNA 聚合酶持续合成因子 βclamp 有高亲和力的低分子 量多肽序列， 其特征在于它是由一段 N- 端 α 螺旋结构和保守的 LF 氨基酸组成。
2、 1 所述的多肽序列， 其中所述 α 螺旋为 GTKKAEA 序列。
3、 1 所述的多肽序列， 其针对的 βclamp 蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID NO ： 2 所示 的氨基酸序列。
4、 1 所述的多肽序列， 其氨基酸序列为 GTKKAEALGQFDLFGS(SEQ ID NO ： 1)。5、 4 所述的多肽序列， 其与 βclamp 蛋白的 KD 值为 16.0μM。 6、 权利要求 1-5 中任一项所述的多肽序列在制备抗结核分枝杆菌治疗药物中的用途。 7、 权利要求 6 的用途， 其中所述结核分枝杆菌为 H37Rv 菌株。
附图简述 ：
图 1 是结核分枝杆菌 H37Rv 的 DNA 聚合酶持续合成因子 βclamp 的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 2)。它的 NCBIAccession No. 为 ： NP_214516。对应的基因名称为 dnaN。
图2： 多肽 1、 多肽 2、 多肽 3 与 βclamp 蛋白相互作用的 SPR 分析结果。
图3： 多肽 1 与 βclamp 蛋白相互作用的 KD 值分析。
具体实施方式
实施例 1
本发明提供上述多肽的实验方法 ：
1、 结核分枝杆菌 H37Rv 的 βclamp 蛋白的表达和纯化。
结 核 分 枝 杆 菌 βclamp 蛋 白 的 全 长 基 因 dnaN(SEQ ID NO ： 2) 被 克 隆 在 载 体 pQE30( 购于 Qiagen 公司 ) 上， 使用大肠杆菌表达菌株 BL21( 购于 Merck 公司 ) 表达。
挑取单克隆， 在含 50μg/ml Amp 的 5ml LB 中 37℃振摇过夜后， 取 2ml 接种到含 50μg/ml Amp 的 200ml LB 中摇至 OD600 约为 0.6， 再转接至 8 瓶含 50μg/ml Amp 的 750ml LB 中摇至 OD600 约为 0.6， 加入终浓度为 0.4mM 的 IPTG， 16℃诱导 18h， 离心收集菌体。
将 收 集 的 菌 体 超 声 破 碎， 4 ℃ 16000rpm 离 心 30min，取 上 清 过 用 loadingbuffer(20mM Tris-Cl pH7.9， 500mM NaCl， 5mM 咪 唑 ) 平 衡 好 的 Ni-NTA 柱， 用 loading buffer 继 续 冲 洗， 直 到 紫 外 检 测 仪 上 面 的 OD280 走 平 为 止。 然 后 用 wash buffer(20mM Tris-Cl pH7.9， 500mM NaCl， 100mM 咪 唑 ) 洗 杂 蛋 白，最 后 用 elution buffer(20mM Tris-Cl pH7.9， 500mM NaCl， 250mM 咪唑 ) 洗脱目的蛋白。
将得到的 βclamp 蛋白超滤浓缩， 换至低盐 buffer(20mM Tris-Cl pH7.9， 20mM NaCl)， 过 HitrapQ 预装柱 (GE healthcare)， 高盐 buffer 为 ： 20mMTris-Cl pH7.9， 1M NaCl。 收集主峰， 超滤浓缩。以同样的条件过 MonoQ 预装柱 (GE healthcare)。
将 得 到 的 蛋 白 超 滤 浓 缩， 换 至 凝 胶 过 滤 层 析 buffer(20mM Tris-Cl pH7.9， 100mMNaCl)， 过 Superdex 200 10/300GL 柱， 收 集 主 峰， 浓 缩 至 约 3mg/ml， 液 氮 速 冻， 存 -80℃冰箱。
2、 多肽的合成。
合成下列三种多肽并在其 N 端连接上 biotin 标记 ( 由上海强耀生物科技有限公 司合成并标记 )。
1) 多肽序列 ： GTKKAEALGQFDLFGS(SEQ ID NO ： 1)， 其中 GTKKAEA 为 α 螺旋 ；
2) 多肽序列 1) 的截短体 ： LGQFDLFGS(SEQ ID NO ： 3)， 含有 LF 保守氨基酸， 不含有 完整的 α 螺旋 ；
3) 随机序列 ： LMGDLKELLGPGCLGS(SEQ ID NO ： 4)， 其中 LMGDLKE 为 α 螺旋。
3、 SPR 实验分析多肽与结核分枝杆菌 βclamp 蛋白的亲和力。
使用 GE 公司的 Biocore 3000 仪器进行 SPR 实验分析。当光线从高折射率的介质进入低折射率的介质时， 一部分光线会在接触面上被反射。当入射角大于临界角的时候， 光线会发生全反射。但是， 当玻璃的表面覆盖一层薄的惰性金属膜 ( 如金 ) 时， 金属膜表 面的等离子体 (plasma) 发生振动， 一部分光会 “损失” 在金属膜上。当入射光的波矢量与 表面等离子体振子的频率一致的时候， 电子发生 “共振” ， 这种现象被称为表面等离子共振 (surface plasmon resonance)。 当反射光的强度达到最小值时的入射角， 被称为表面等离 子共振角 (θspr， surface plasmon resonance angle)。 SPR 随金属膜表面介质的折射率变 化而变化， 而折射率的变化则与结合在金属表面的分子质量成正比。 因此， 我们可以通过观 察表面等离子共振角， 来分析生物分子之间的相互作用。结果描绘为 RU(resonance unit) 对时间的图。
将结核分枝杆菌 βclamp 蛋白和上述三种合成的多肽 (SEQ ID NO ： 1、 SEQ ID NO ： 3 和 SEQ ID NO ： 4) 溶解在 buffer(20mM Tris-Cl pH7.5， 150mMNaCl， 1mM EDTA， 0.005 ％ 表面活性剂 P20)( 多肽的浓度约为 30nM) 中， 将上述三种多肽固定 ( 三种多肽各自的固 定量约为 600RU) 在 SA 芯片 ( 购于 GE 公司 ) 上， 使 βclamp 蛋白 ( 终浓度为 4μM) 流 过所述 SA 芯片， 测量其响应值 (RU)。结果见图 2。在图 2 中， 三条曲线依次表示多肽 序列 GTKKAEALGQFDLFGS(SEQ ID NO ： 1)、 多肽序列 LGQFDLFGS(SEQ ID NO ： 3)、 随机序列 LMGDLKELLGPGCLGS(SEQ ID NO ： 4) 与结核分枝杆菌 βclamp 蛋白相互作用的 SPR 响应值曲 线。由此， 得到亲和力最高的多肽序列为 ： GTKKAEALGQFDLFGS。 使 不 同 浓 度 的 结 核 分 枝 杆 菌 βclamp 蛋 白 (0， 1μM， 2μM， 4μM， 8μM， 16μM， 32μM， 64μM) 分别流过固定了多肽序列 ： GTKKAEALGQFDLFGS 的 SA 芯片 ( 购自 GE 公司 )( 固 定量约为 600RU)， 见图 3a， 用软件 Bioevaluation 分析其动力学常数， 得到 βclamp 蛋白与 该多肽的 KD 值为 16.0μM， 见图 3b。
鉴于结核分枝杆菌 βclamp 蛋白是结核分枝杆菌 DNA 复制系统的关键因子， DNA 聚合酶的核心酶只有与 βclamp 蛋白结合以后， 才能被 βclamp 蛋白带动， 在 DNA 上高速滑 动， 从而催化 DNA 的快速复制。因此， 多肽 GTKKAEALGQFDLFGS 与 βclamp 蛋白的高效结合 将阻止结核分枝杆菌的基因组 DNA 复制， 从而起到抑制结核杆菌的作用。此外， 相对于其它 结合于 βclamp 蛋白的多肽而言， 多肽 GTKKAEALGQFDLFGS 作为一种小分子量多肽， 价格上 比较经济， 而且由于分子量小， 比较容易将其传递到靶标， 从而提高抑制效率。
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